CN117377686A - 用于治疗骨关节炎、类风湿性关节炎以及关节和肌腱病症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了与连接蛋白43半通道结合以抑制或阻断通道开放的抗体。本文还公开了用抑制或阻断Cx43半通道开放的抗体来检测或治疗骨关节炎、类风湿性关节炎以及肌腱病症和损伤的方法。

Description

用于治疗骨关节炎、类风湿性关节炎以及关节和肌腱病症的 组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月13日提交的美国临时申请号63/136,753在申请日的权益。该在先提交申请的内容据此全文以引用方式并入本文。
对序列表的引用
本文递交的序列表是2022年1月12日创建的名称为“21105_0082P1_SL.txt”的文本文件，其大小为32,768字节，该序列表据此依据37C.F.R.§1.52(e)(5)以引用方式并入本文。
背景技术
连接蛋白(Connexin)半通道在细胞和组织功能中起重要作用，连接蛋白半通道的功能异常可能涉及各种病理病状，诸如本文所描述的那些病理病状。因此，仍然需要用于治疗与半通道活性相关的病理病状的其他疗法，以及用于鉴定这类疗法的方法。
骨关节炎是最常见的关节炎，全球有数百万人患有此病。骨关节炎可能损害任何关节，但最常影响手、膝盖、髋部和脊柱中的关节。目前可用的疗法与疼痛管理有关。还存在治疗骨关节炎的需求。
发明内容
本文公开了治疗或预防受试者的骨关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的肌腱病症或肌腱损伤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的骨关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的肌腱病症或肌腱损伤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的骨关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的肌腱病症或肌腱损伤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了降低MMP13或胶原X水平的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了减轻受试者的软骨退化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了减轻受试者的滑膜炎症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了降低MMP13或胶原X水平的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了减轻受试者的软骨退化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了减轻受试者的滑膜炎症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了降低MMP13或胶原X水平的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了减轻受试者的软骨退化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了减轻受试者的滑膜炎症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的软骨下骨硬化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的软骨下骨硬化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的软骨下骨硬化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了减轻或改善受试者的骨关节炎的一种或多种症状的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了减轻或改善受试者的骨关节炎的一种或多种症状的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了减轻或改善受试者的骨关节炎的一种或多种症状的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
本文公开了重组连接蛋白43(Cx43)半通道结合抗体或其片段。在一些方面中，抗体包含对应于SEQ ID NO:19的第一VH CDR或其片段、对应于SEQ ID NO:20的第二VH CDR或其片段、对应于SEQ ID NO:21的第三VH CDR或其片段、对应于SEQ ID NO:31的第一VL CDR或其片段、对应于SEQ ID NO:32的第二VL CDR或其片段和对应于SEQ ID NO:33的第三VLCDR或其片段。在一些方面中，抗体或其片段可以是人源化抗体。在一些方面中，抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或基因修饰的IgG类抗体，其包含对应于SEQ ID NO:19的第一VHCDR、对应于SEQ ID NO:20的第二VH CDR、对应于SEQ ID NO:21的第三VH CDR、对应于SEQID NO:31的第一VL CDR、对应于SEQ ID NO:32的第二VL CDR和对应于SEQ ID NO:33的第三VL CDR。在一些方面中，抗体可以是IgG类抗体，其中IgG类抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类抗体。在一些方面中，抗体包含与SEQ ID NO:58至少90％相同的VH氨基酸序列或其片段和/或与SEQ ID NO:60至少90％相同的VL氨基酸序列或其片段。在一些方面中，抗体可以包含根据SEQ ID NO:58的VH氨基酸序列或其片段和/或根据SEQ ID NO:60的VL氨基酸序列或其片段。
本申请通篇讨论了本发明的其他方面。关于本发明的一个方面所讨论的任何方面也适用于本发明的其他方面，反之亦然。在此描述的每个方面被理解为适用于本发明的其他方面的本发明的方面。考虑本文讨论的任何方面可以关于本发明的任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详述中变得显而易见。然而，应该理解，虽然指示本公开的具体实施方案，但是详细描述和具体实施例仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本公开的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图描述
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括来进一步说明本发明的某些方面。可通过参考一个或多个这些附图结合本文提出的说明书实施方案的详细描述更好地理解本发明。
图1A至图1D示出M1抗体处理保持了软骨完整性。图1A是手术过程、注射过程和评估过程的时间线图。图1B示出了用盐水或M1抗体处理过的小鼠的番红O/固绿组织染色的代表性图像。比例尺，200μm。图1C示出了在DMM手术后8周，内侧股骨髁(MFC，上图)和内侧胫骨平台(MTP，下图)的国际骨关节炎研究学会(OARSI)平均分数。图1D示出了通过关节的三级切片得出的MTP和MFC的总OARSI分数。*P<0.05，**P<0.01，n＝每组8至13只小鼠。
图2A至图2B示出M1抗体处理减轻了滑膜炎。图2A示出了用盐水或Cx43抗体处理过的小鼠的滑膜炎评分的代表性图像。M，半月板；L，滑膜衬里细胞。图2B示出了DMM手术后8周滑膜炎的汇总程度。*P<0.05，n＝每组8至13只小鼠。
图3A至图3B示出M1抗体处理降低了关节软骨中的胶原X(Col X)水平。图3A示出了接受外科DMM手术并用盐水或Cx43抗体处理过的小鼠关节软骨基质中免疫组织化学染色的ColX的代表性图像。比例尺，50μm。图3B示出了ColX阳性软骨细胞百分比的定量。*P<0.05，n＝每组5只小鼠。
图4A至图4B示出M1抗体处理降低了关节软骨中的基质金属蛋白酶13(MMP13)水平。图4A示出了接受外科DMM手术并用盐水或Cx43抗体处理过的小鼠关节软骨基质中免疫组织化学染色的MMP13的代表性图像。比例尺，50μm。图4B示出了MMP13阳性软骨细胞百分比的定量。*P<0.05，n＝每组5只小鼠。
图5A至图5E示出抑制Cx43半通道防止软骨下骨硬化。图5A示出了胫骨平台的内侧和外侧软骨下骨隔室的代表性二维微计算机断层摄影(μCT)图像。分析软骨下小梁骨的骨体积分数(BV/TV)(图5B)、骨小梁厚度(Tb.Th)(图5C)、骨小梁间隙(Tb.Sp)(图5D)和骨矿物质密度(BMD)(图5E)，结果表明，用Cx43抗体处理后DMM小鼠的软骨下骨硬化减轻。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。n＝每组6至8只小鼠。
图6A至图6C示出，M1抗体处理改善了骨关节炎相关的疼痛症状(冯·弗雷细丝试验)。在手术后4周(图6B)和8周(图6A和图6C)进行机械敏感性行为评估。通过冯·弗雷细丝试验测量后爪的缩回阈值。*P<0.05，n＝每组9至20只小鼠。
图7A至图7F示出，M1抗体处理改善了骨关节炎相关的疼痛症状(旷场试验)。在手术后4周(图7B和图7E)和8周(图7A、图7C、图7D和图7F)进行旷场行为评估。图7A至图7C示出了10分钟测试期内的总行进距离，图7D至图7F示出了10分钟测试期内的总休息时间。*P<0.05，n＝每组9至20只小鼠。
图8A至图8B示出M1抗体主要与滑膜结合。图8A示出了体内抗体结合评估过程的时间线图。图8B示出了制备并用缀合Alexa Fluor 594的抗人IgG二抗进行免疫标记的冷冻组织切片。比例尺，100μm。
图9A至图9B示出M1抗体与滑膜巨噬细胞共定位。图9A示出了用巨噬细胞标记物CD68进行免疫标记的切片，Cx43抗体与CD68在滑膜区中共定位。比例尺，10μm。图9B示出了来自图9A(右图)的白框的放大视图。比例尺，5μm。
图10A至图10B示出M1抗体与滑膜成纤维细胞共定位。图10A示出了用成纤维细胞标记物骨膜蛋白进行免疫标记的组织切片，M1抗体与骨膜蛋白在滑膜区中共定位。比例尺，10μm。图10B示出了来自图10A(右图)的白框的放大视图。比例尺，5μm。
图11A至图11C示出在DMM手术后递送到滑膜的M1抗体抑制了半通道开放。图11A示出了在DMM手术后30分钟用盐水或M1抗体处理的小鼠。在处理后两周，从尾静脉注射伊文思蓝。制备冷冻切片，通过荧光显微镜评价半通道对染料的摄取。图11B示出通过NIH ImageJ软件对来自右膝(进行过DMM手术)滑膜区的伊文思蓝强度和来自左膝(未手术)滑膜区的伊文思蓝强度之比进行量化。比例尺，50μm。**P<0.01，n＝每组4只小鼠。图11C示出了由用Cx43抗体进行免疫标记的盐水处理小鼠制备的冷冻切片。比例尺，50μm。
图12A至图12C示出单次M1抗体注射改善了软骨完整性。图12A示出了手术过程、注射过程和评估过程的时间线图。图12B示出了用盐水或M1抗体处理过的小鼠的番红O/固绿组织染色的代表性图像。比例尺，200μm。图12C示出了在DMM手术后8周，内侧股骨髁(MFC，上图)和内侧胫骨平台(MTP，下图)的国际骨关节炎研究学会(OARSI)平均分数。*P<0.05，**P<0.01，n＝每组3至7只小鼠。
图13A至图13B示出了单次注射抗体后关节软骨中MMP13水平降低的情况。图13A示出了接受外科DMM手术并用盐水或M1抗体处理过的小鼠关节软骨基质中免疫组织化学染色的MMP13的代表性图像。图13B示出了软骨细胞中MMP13染色强度的定量。*P<0.05，n＝每组5至6只小鼠。
图14A至图14B示出单次注射M1抗体减轻了疼痛相关行为。图14A示出在手术后8周通过冯·弗雷细丝试验测量后爪的缩回阈值。图14B示出了在手术后8周进行的旷场行为评估。对10分钟测试期内的总行进距离(左图)和总休息时间(右图)进行了分析。*P<0.05，n＝每组6至8只小鼠。
图15示出了提出的骨关节炎模型。骨关节炎是一种影响所有关节组织的疾病，包括关节软骨的进行性退化、软骨下骨重塑、骨赘形成和滑膜炎症。发炎滑膜中的活化滑膜细胞产生分解代谢和促炎介质，这些介质导致负责软骨分解的蛋白水解酶过量产生。膝关节滑膜包含表达Cx43的巨噬细胞和成纤维细胞。施用M1抗体阻断半通道开放和炎性细胞因子释放，因此减轻软骨分解、软骨下骨硬化和疼痛症状。
图16A至图16C示出延迟的抗Cx43半通道抗体(M1抗体)处理减轻了滑膜炎。图16A示出了手术过程、注射过程和评估过程的时间线。图16B示出了用盐水或抗Cx43半通道抗体(M1抗体)处理过的小鼠的滑膜炎评分的代表性图像。图16C示出了DMM手术后8周的滑膜炎程度(滑膜炎分数)。*P<0.05，n＝每组6只小鼠。
图17A至图17B示出抗Cx43半通道抗体(M1抗体)阻断了RAW264.7细胞和SW982细胞中的Cx43半通道开放。图17A示出用LPS和Cx43E2抗体或CBX(100μM)处理小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞。通过荧光显微镜和NIH Image J软件测定并定量EtBr染料摄取水平。B)用IL1β和Cx43E2抗体或CBX(100μM)处理人滑膜成纤维细胞SW982细胞。通过荧光显微镜和NIHImage J软件测定并定量EtBr染料摄取水平。所示数据为平均值±SEM。****，P<0.0001。
图18示出抗Cx43半通道抗体(M1抗体)抑制炎性基因在LPS诱导下在RAW264.7细胞中表达。在有Cx43E2抗体或没有该抗体的情况下将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞预孵育30分钟，之后用0.1μg/ml LPS孵育4小时。制备RNA提取物，用qRT-PCR分析COX2、Adamts4、MMP3/13和IL6 mRNA的表达。*P<0.05，**P<0.01。
图19示出抗Cx43半通道抗体(M1抗体)抑制炎性基因在IL1β诱导下在SW982细胞中表达。在有Cx43E2抗体或没有该抗体的情况下将人滑膜成纤维细胞SW982细胞预孵育30分钟，之后用1ng/ml IL1β孵育14小时。制备RNA提取物，用qRT-PCR分析COX2、Adamts4/5、MMP3/13和NOS2 mRNA的表达。*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
通过参考特定的实施方案的以下详细描述和其中所包括的实施例，以及参考附图和其先前和以下描述可以更容易理解所公开的方法和组合物。
应理解，除非另有说明，否则所公开的方法和组合物不限于具体的合成方法、具体的合成技术或特定的试剂，并且因此这些可以变化。还应理解本文使用的术语仅出于描述特定的实施方案的目的并且不意图具有限制性。
本文所提到的所有公布通过引用并入本文以公开和描述与公布所引用相关的方法和/或材料。本文所讨论的公布仅为其在本申请的申请日之前的公开而提供。本文中的任何内容均不得解释为承认本公开无权凭借在先公开早于这个公布。此外，本文提供的公布日期可能与实际公布日期不同，这可能需要单独确认。
定义
应当理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并非旨在限定本发明的范围，本发明的范围只受所附权利要求书限定。
必须注意的是，除非上下文另外清楚指出，否则如本文和随附权利要求书中所用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数个指代对象。
如本文所用，当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含/包括(comprising)”结合使用时，词语“一(a)”或“一(an)”可意指“一个(种)”，但其也符合“一个(种)或多个(种)”、“至少一个(种)”及“一个(种)或一个(种)以上”的含义。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、情况或材料可发生或可不发生或存在，并且描述包括其中事件、情况或材料发生或存在的情况和其中不发生或不存在的情况。
如本文所用的词语“或”是指特定列表中的任何一个成员，并且还包括该列表成员的任意组合。权利要求书中术语“或”的使用用于指“和/或”，除非明确指出仅指替代物或替代物相互排斥，尽管本公开支持仅指替代物和“和/或”的定义。
在本申请通篇中，术语“约”用于指示一个值包括用于确定所述值的装置或方法的误差标准偏差。
范围可在本文中表达为自“约”一个特定值起和/或至“约”另一个特定值止。除非上下文另外明确指出，否则当表达、还特别考虑并认为公开的范围是自一个特定值起和/或至另一个特定值止的范围。类似地，在通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解，除非上下文另外明确指出，否则具体值形成另一个应认为公开的特别考虑的实施方案。应进一步理解，除非上下文另外明确指出，否则每个范围的端点相对于另一个端点并独立于另一个端点均为重要的。最后，应理解，除非上下文另外明确指出，否则明确公开的范围内包含的所有单个值和值的子范围也被特别考虑，并且应认为公开。无论是否在特定情况下明确公开这些实施方案中的一些或所有，前述内容均适用。
贯穿本说明书的描述和权利要求书，词“包括”和所述词的变型诸如“包含/包括(comprising/comprises)”意指“包括但不限于”并且不旨在排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。具体地，在被叙述为包括一个或多个步骤或操作的方法中，特别考虑每个步骤包括所列出的事物(除非步骤包括限制性术语，诸如“由......组成”)，这意指每个步骤并非旨在排除例如步骤中未列出的其他添加剂、组分、整数或步骤。
如本申请和权利要求书中所用，词语“包含”(以及包含的任何形式，例如“包括”和“含有”)、“具有”(以及具有的任何形式，例如“有”和“具备”)、“包括”(以及包括的任何形式，例如“涵盖”和“包含”)或“含有”(以及含有的任何形式，例如“包含”和“涵盖”)是包括性的或开放式的且不排除额外的、未提及的要素或方法步骤。
“抑制”、“抑制”和“抑制”意指减少或降低活性、水平、反应、病状、疾病或其他生物参数。这可以包括但不限于活性、反应、病状或疾病的完全消融。这还可以包括，例如，与天然或对照水平相比，活性、反应、病状或疾病的10％抑制或降低。因此，在一些方面中，与天然或对照水平相比，抑制或降低可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于两者之间的任何降低量。在一些方面中，与天然或对照水平相比，抑制或降低是10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90％-100％。在一些方面中，与天然或对照水平相比，抑制或降低是0％-25％、25％-50％、50％-75％或75％-100％。
如本文所用，“调节”是指活性或功能或数量的变化。变化可以是活性、功能或数量的增加或减少、增强或抑制。
“提升”和“促进”是指活性、反应、病状、疾病或其他生物参数的增加。这可以包括但不限于活性、反应、病状或疾病的开始。这还可以包括，例如，与天然或对照水平相比，活性、反应、病状或疾病增加10％。因此，在一些方面中，与天然或对照水平相比，增加或提升可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多，或介于两者之间的任何提升量。在一些方面中，与天然或对照水平相比，增加或提升是10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90％-100％。在一些方面中，与天然或对照水平相比，增加或提升是0％-25％、25％-50％、50％-75％或75％-100％或更多，诸如200％、300％、500％或1000％。在一些方面中，与天然或对照水平相比，增加或提升可以是大于100％，诸如与天然或对照水平相比，增加或提升100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或更多。
“治疗(Treatment/treating)”是指向受试者施用或施加治疗剂(例如，本文所描述的抗Cx43抗体)或对受试者实施程序或方式，目的是获得疾病或健康相关病状的治疗益处。例如，治疗可以包括施用药学上有效量的抗体或其片段，来抑制或阻断Cx43半通道开放。
如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓解、改善、缓和特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征，延迟其发作，抑制或减缓其进展，降低其严重程度和/或降低其发病率。可向未表现出疾病、病症和/或病状的迹象的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病状的早期迹象的受试者施用治疗，目的是降低发展出与所述疾病、病症和/或病状相关的病理的风险。例如，疾病、病症和/或病况可以是骨关节炎、类风湿性关节炎，以及肌腱和关节的病症和损伤。
如本文所用，术语“受试者”是指所施用的靶标，例如人类。因此，所公开方法的受试者可以是脊椎动物，诸如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。术语“受试者”还包括家养动物(例如，猫、犬等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、果蝇等)。在一些方面中，受试者为哺乳动物。在另一个方面中，受试者为人类。所述术语不表示特定的年龄或性别。因此，旨在涵盖成人、儿童、青少年和新生儿受试者，以及胎儿，无论是雄性还是雌性。
如本文所用，术语“患者”是指受到病况、疾病或病症的折磨的受试者。术语“患者”包括人类和兽医受试者。在本发明所公开方法的一些方面中，“患者”已被诊断患有骨关节炎、类风湿性关节炎，以及肌腱和关节的病症和损伤。在本发明所公开方法的一些方面中，诸如在施用步骤之前，“患者”已被诊断为需要治疗(例如，治疗骨关节炎、类风湿性关节炎，以及肌腱和关节的病症和损伤)。
如本文所用，术语“氨基酸”和“氨基酸同一性”是指20种天然存在的氨基酸中的一种或可在所公开的任何抗体、变体或片段中的任何非天然类似物。因此，如本文所用的“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸。例如，出于本发明的目的，高苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被认为是氨基酸。“氨基酸”还包括氨基酸残基，诸如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是(R)或(S)构型。在一些方面中，氨基酸呈(S)或L-构型。如果使用非天然存在的侧链，那么可以使用非氨基酸取代基，例如以防止或延迟体内降解。
术语“片段”可以指与参考蛋白质或核酸基本相同并保留参考的生物活性的蛋白质或核酸分子的一部分(例如，至少5、10、25、50、100、125、150、200、250、300、350、400或500个等氨基酸或核酸)。在一些方面中，片段或部分保留了本文描述的参考蛋白质或核酸的至少50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的生物活性。此外，参考肽的片段可以是参考多肽的连续或邻近部分(例如，十个氨基酸长的参考肽的片段可以是所述肽内的任何2至9个邻近残基)。
术语“变体”可以意指与参考序列在某些方面的差异，而不仅仅是简单地缺失一个或多个N端和/或C端氨基酸残基。当变体包括氨基酸残基的取代时，取代可被认为是保守的或非保守的。保守取代是以下组内的那些取代：Ser、Thr和Cys；Leu、Ile和Val；Glu和Asp；Lys和Arg；Phe、Tyr和Trp；和Gln、Asn、Glu、Asp和His。变体可以包含至少一种取代和/或至少一种添加，还可以存在至少一种缺失。变体还可包括一个或多个非天然存在的残基。例如，其可以在任何位置处(包括半胱氨酸的位置处)包括硒代半胱氨酸(例如，硒代-L-半胱氨酸)。许多其他“非天然”氨基酸取代基是本领域已知的，并且可以从商业来源获得。非天然存在的氨基酸的实例包括D-氨基酸、具有连接至半胱氨酸的硫原子的乙酰氨基甲基的氨基酸残基、聚乙二醇化的氨基酸和式NH2(CH2)nCOOH的ω氨基酸(其中n为2-6)、中性氨基酸、非极性氨基酸，诸如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。苯甘氨酸可以取代Trp、Tyr或Phe；瓜氨酸和蛋氨酸亚砜是中性、非极性的，半胱氨酸是酸性的，并且鸟氨酸是碱性的。脯氨酸可以被羟基脯氨酸取代，并且保留赋予脯氨酸的特性的构象。
取代变体通常含有在蛋白质内的一个或多个位点处一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可以被设计成调节多肽的一种或多种特性，而具有或不具有其他功能或特性的损失。取代可以是保守的，即一种氨基酸被形状和电荷相似的一种氨基酸取代。保守取代是本领域众所周知的，包括例如：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸盐变为天冬氨酸盐；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。或者，取代可以是非保守的，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守变化通常涉及用化学性质不同的残基取代一个残基，例如用极性或带电荷的氨基酸取代非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。
“单链可变片段(scFv)”意指包含抗体重链和轻链可变区的蛋白质。scFv可以是包含可变重链、接头和可变轻链的融合蛋白。在一些方面中，接头可以是长度可以为约8至20个氨基酸的短而灵活的片段。例如，可以使用(G4S)n(n＝1、2、3或4)。
术语“单克隆抗体”(单克隆抗体)是指从基本同质的抗体群体中获得的抗体或类似抗体群体，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体，包括但不限于，单克隆抗体可以通过Kohler和Milstein首先描述的杂交瘤方法(Nature,256:495-497,1975)或通过重组DNA方法制得。
术语“嵌合抗体”(或“嵌合免疫球蛋白”)是指包含与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的重链和/或轻链的分子，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要其表现出所需的生物活性(Cabilly等人(1984),见下文；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851)。
术语“人源化抗体”是指含有来自非人类(例如，鼠)抗体以及人类抗体的序列的抗体形式。人源化抗体可包括来自相同或不同物种的保守氨基酸取代或非天然残基，这些不会显着改变其结合和/或生物活性。这类抗体是含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(供体抗体)的CDR的残基置换，所述非人类物种诸如具有所需特性的小鼠、大鼠、骆驼、牛、山羊或兔。此外，人源化抗体可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。进行这些修饰是以进一步改进和最大化抗体性能。因此，一般而言，人源化抗体可以包含全部或基本上全部的至少一个可变结构域(并且在一个方面中，两个可变结构域)，其中全部或基本全部的高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环并且全部或基本上全部的FR区都是人类免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选地还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，或人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分(参见，例如，Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利号0,125,023B1；Boss等人，美国专利号4,816,397；Boss等人，欧洲专利号0,120,694B1；Neuberger,M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger,M.S.等人，欧洲专利号0,194,276B1；Winter，美国专利号5,225,539；Winter，欧洲专利号0,239,400B1；Padlan,E.A.等人，欧洲专利申请号0,519,596A1；Queen等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第86卷:10029-10033)。
如本文所用，术语“M1H”是指从杂交瘤克隆中克隆的抗体。“M1”是指杂交瘤单克隆1，并且“H”是指可变重链。
如本文所用，术语“M1M7K”是指从杂交瘤克隆M1和M7鉴定的可变轻链。
如本文所用，术语“抗原”是能够由抗体或T细胞受体结合的分子。在一些方面中，除抗体之外的结合部分可以被工程化以特异性结合抗原，例如适体、高亲和性多聚体(avimer)等。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”用于包括完整抗体和其结合片段/节段。如本文所用，术语“抗体”旨在泛指任何免疫结合剂，诸如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和基因修饰的IgG以及包含保留抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。抗体可选自由以下组成的组：嵌合抗体、亲和力成熟抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人类抗体或抗原结合抗体片段或天然或合成配体。通常，片段与其来源的完整抗体竞争特异性结合抗原。片段包括单独的重链、轻链、Fab、Fab’F(ab’)2、Fabc和Fv。片段/节段通过重组DNA技术产生，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离产生。术语“抗体”还包括化学缀合至或表达为与其他蛋白质的融合蛋白的一个或多个免疫球蛋白链。术语“抗体”还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如，Songsivilai和Lachmann,Clin Exp Immunol 79:315-21,1990；Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-53,1992。
术语“抗体”可包括五种不同类别的人类免疫球蛋白，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。在一些方面中，所公开的抗体可以是IgG类抗体，其可以分类为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的4个亚类。在一些方面中，所公开的抗体可以是IgA类抗体，其可以分类为IgA1和IgA2的2个亚类。免疫球蛋白的基本结构由2条同源L链(轻链)和2条同源H链(重链)组成。免疫球蛋白类别和亚类由H链决定。在一些方面中，一种或多种抗体或其变体或片段可以是IgG4。
在保持抗原结合特异性时，可以提高IgG4的抗体稳定性。在一些方面中，可以通过例如用谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、赖氨酸(K)、苏氨酸(T)、甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)取代IgG4的精氨酸(R)来改善抗体。
术语“分离的”可以指基本上不含其来源的细胞材料、细菌材料、病毒材料或培养基(当通过重组DNA技术产生时)或化学前体或其他化学物质(化学合成时)的核酸或多肽。此外，分离的化合物是指可以作为分离的化合物施用于受试者的化合物；换句话说，如果化合物粘附在柱上或包埋在琼脂糖凝胶中，那么不能简单地将其视为“分离的”。此外，“分离的核酸片段”或“分离的肽”是不是作为片段天然存在和/或通常不处于功能状态的核酸或蛋白质片段。
本发明的部分(诸如抗体、抗体片段、多肽、肽、抗原或免疫原)可以共价或非共价地缀合或连接至其他部分，诸如佐剂、蛋白质、肽、支持物、荧光部分或标记。术语“缀合物”或“免疫缀合物”广泛用于定义一个部分与另一种药剂的有效结合，并且并不旨在仅指任何类型的有效结合，并且尤其不限于化学“缀合”。
术语“提供”是根据其通常的含义“供应或提供以供使用”而使用的。在一些方面中，通过施用蛋白质直接提供蛋白质，而在其他方面中，通过施用编码蛋白质的核酸有效地提供蛋白质。在某些方面中，本发明考虑包含核酸、抗原、肽和/或表位的各种组合的组合物。
短语与靶标的“特异性结合”或对靶标的“特异性免疫反应性”是指在存在其他生物制剂的异质群体的情况下决定分子存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，特定分子优先结合特定靶标并且不会大量结合样品中存在的其他生物制剂。在这种条件下抗体与靶标的特异性结合需要根据其对靶标的特异性来选择抗体。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白质特异性免疫反应的单克隆抗体。参见，例如，Harlow和Lane,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press,1988，关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术性和科学性术语具有与本公开方法和组合物所属领域中的技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本发明方法和组合物的实践或测试中可使用与本文中所描述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料，但特别有用的方法、装置和材料如所描述。本文中引述的公布及其中引述的材料在此特别地通过引用并入。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这个公开。不承认任何参考文献构成先前技术。参考文献的论述内容陈述了作者所主张的观点，并且申请人保留对所引用文件的准确性和相关性提出质疑的权利。应明确理解的是，虽然本文提到了许多公布，但这种引用并不构成承认这些文献中的任何一个构成本领域公知常识的一部分。
各种细胞能够通过蛋白质连接蛋白形成的半通道和间隙连接相互通讯并与细胞外环境通讯。连接蛋白在全身普遍表达。六个连接蛋白组成一个半通道，并且两个半通道组成一个间隙连接通道。间隙连接是位于相邻细胞之间的质膜中的一组通道，其介导细胞间通讯。半通道是独立于间隙连接通道的实体。半通道允许细胞内隔室和细胞外环境之间的分子交换。
骨关节炎(OA)是一种关节疾病，其特征在于关节软骨的进行性退化、软骨下骨重塑和滑膜炎症，其引起疼痛和活动受限。连接蛋白43(Cx43)在肌肉骨骼系统中充当稳态调节因子，其表达在OA患者的软骨和滑膜组织中增加。Cx43可能促成分解代谢因子和炎性因子产生，并加剧关节破坏。Cx43形成半通道(HC)，这些半通道介导小分子(诸如ATP和前列腺素E2(PGE2))释放到细胞外环境中。生理条件下HC开放的概率低；HC的活化由多种因子调节，包括促炎细胞因子。本文描述了特异性抑制Cx43 HC活性的抗体(例如，M1抗体)。
抗体
本文公开了抗连接蛋白43抗体(本文也称为“抗Cx43抗体”或“抗CX43抗体”)。本文公开了可以抑制或阻断半通道(特别是Cx43半通道)开放的抗连接蛋白43抗体。本文公开了可以激活或刺激半通道(特别是Cx43半通道)开放的抗连接蛋白43抗体。
申请号PCT/US2017/019605(WO 2017-147561)提供了可以用于本发明所公开方法的抗Cx43抗体、CDR序列、重链和轻链序列、编码所述抗体的核酸序列和所述抗体结合的表位序列的实例，该申请据此以引用方式并入本文以教导相同的内容。
生成了抗Cx43抗体，并识别了产生Cx43结合抗体的克隆。生成了抗Cx43抗体，并识别了产生Cx43结合抗体的克隆。本文公开了包含下表中所示CDR序列的抗Cx43抗体，连同每种所表征抗体的配对。抗Cx43抗体序列的DNA和氨基酸两者的实例连同每种所表征抗体的正确配对也在下表中示出。抗Cx43抗体的实例包括但不限于M1抗体和M2抗体。M1抗体抑制或阻断Cx43半通道的开放。M2抗体激活、刺激和/或增强Cx43半通道的开放。
如本文所用，“M1抗体”是指包含以下部分的抗体：可变重链，所述可变重链包含具有SEQ ID NO:58中示出的序列的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:60中示出的序列。
如本文所用，“M2抗体”是指包含以下部分的抗体：可变重链，所述可变重链包含具有SEQ ID NO:58中示出的序列的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:63中示出的序列。
还公开了人源化抗Cx43抗体。例如，本文公开了人源化M1和M2抗体。
表1：两种功能性抗Cx43抗体的重链和轻链配对。
抗体名称 重链 轻链
M1(HmAb1) M1H M1K1或M1K1a
M2(HmAb2) M1H M1M7K
表2：来自所生成的杂交瘤的抗Cx43抗体的抗体链序列。
克隆的可变结构域如下图所示。
表3.本发明所公开的抗Cx43抗体的多个部分的DNA序列。可变重链(粗体)和可变轻链(下划线)。
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抗Cx43抗体的多个部分的附加DNA序列可以是PCT/US2017/019605(WO 2017/147561)中所公开的抗Cx43抗体的多个部分的一个或多个DNA序列，该专利由于其有关抗Cx43抗体的多个部分的DN A序列的教导内容特此以引用方式并入本文。
表4.本发明所公开的抗Cx43抗体的多个部分的氨基酸序列。可变重链(粗体)和可变轻链(下划线)。
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抗Cx43抗体抗Cx43抗体的多个部分的附加氨基酸序列可以是PCT/US2017/019605(WO 2017/147561)中所公开的抗Cx43抗体的多个部分的一个或多个氨基酸序列，该专利由于其有关抗Cx43抗体的多个部分的氨基酸序列的教导内容特此以引用方式并入本文。
如本文所用的术语“CDR”是指(例如，抗Cx43抗体)的抗体可变结构域的互补决定区。“CDR”是散布在更保守的区域内的高变区，称为“框架区”(FR)。
Kabat等人(1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,United States Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda)已经开发了对包括在CDR中的残基的系统鉴定。在一些方面中，可变轻链(VL)CDR在本文中定义为包括SEQ ID NO:60的第27至32位(CDR1)、第50至56位(CDR2)和第91至97位(CDR3)处的残基。在一些方面中，可变重链(VH)CDR在本文中定义为包括SEQ ID NO:58的第27至33位(CDR1)、第52至56位(CDR2)和第95至102位(CDR3)处的残基。
本文公开的CDR还可包括变体。通常，个别变体CDR之间的氨基酸同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。因此，“变体CDR”是与本发明的亲本CDR(例如，SEQ ID NO:19、20、21、31、32或33)或参考CDR具有特定同一性并且共享生物学功能，包括但不限于亲本CDR(例如，SEQ ID NO:19、20、21、31、32或33)的特异性和/或活性的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的CDR。例如，“变体CDR”可以是与本发明的亲本或参考CDR相比含有1、2、3或4个氨基酸变化并且共享或改善了亲本CDR的生物学功能、特异性和/或活性的序列。
在一些方面中，与亲本或参考CDR相比，本文公开的任何CDR序列可包括单一氨基酸变化。在一些方面中，与亲本或参考CDR相比，本文公开的任何CDR序列可包括至少两个氨基酸变化。在一些方面中，氨基酸变化可以是从半胱氨酸残基变为另一种氨基酸。在一些方面中，氨基酸变化可以是从甘氨酸残基变为另一种氨基酸。个别变体CDR之间的氨基酸同一性可以是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。因此，“变体CDR”可以是与本发明的亲本CDR具有特定同一性并且共享生物学功能，包括但不限于亲本CDR的特异性和/或活性的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。例如，亲本CDR序列可以是SEQ ID NO:19、20、21、31、32和/或33中的一个或多个。变体CDR序列可以与SEQ ID NO:19、20、21、31、32和/或33中的任一个至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体CDR序列也可以共享亲本CDR的特异性和/或活性的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
如本文所讨论，本文公开的任何抗体的氨基酸序列的微小变化被考虑为涵盖在本公开中，条件是氨基酸序列的变化与亲本序列保持至少75％，更优选至少80％、90％、95％，最优选99％序列同一性。在一些方面中，考虑了保守氨基酸置换。保守置换是发生在侧链相关的氨基酸家族中的那些置换。基因编码的氨基酸一般分为家族：(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族是：丝氨酸和苏氨酸是脂肪族羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺的家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂肪族家族；以及苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸是芳香族家族。例如，可以合理地预期，亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸被谷氨酸、苏氨酸被丝氨酸单独置换或类似的氨基酸被结构相关的氨基酸置换不会对所得分子的结合或特性具有重大影响，特别是在置换不涉及框架位点内的氨基酸的情况下。通过测定多肽衍生物的比活性，可以很容易地确定氨基酸变化是否会产生功能性肽。测定是本领域普通技术人员已知的。
在一些方面中，氨基酸取代可以是以下的那些氨基酸：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质络合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(4)赋予或修改这类类似物的其他物理化学或功能性特性。在一些方面中，可以在重链、轻链或两者的非CDR序列中进行单个或多个氨基酸取代(优选为保守氨基酸取代)。在一些方面中，可以在重链、轻链或两者的一个或多个CDR序列中进行一个或多个氨基酸取代。
已经开发了许多用于化学标记和增强抗体及其常见片段(包括Fab和F(ab’)2片段)的特性的方法。先前已经实现了某些抗体二硫键的某种选择性还原，产生了可以在特定位点标记的抗体和抗体片段，从而增强了其的效用和特性。使用温和还原选择性还原F(ab’)2片段中存在的两个铰链二硫键是有用的。在一些方面中，半胱氨酸和甲硫氨酸容易受快速氧化的影响，这可能负面地影响保护基团在合成和随后的肽纯化期间的裂解。在某些情况下，用于抗体生产的肽中的半胱氨酸残基可能影响抗体的亲和力，因为游离半胱氨酸在体内并不常见，并且因此可能无法被天然肽结构识别。在一些方面中，所公开的抗体及其片段包含这样的序列，其中位于CDR外部的半胱氨酸(例如，在重链、轻链或两者的非CDR序列中)被取代。在一些方面中，半胱氨酸可以被丝氨酸置换并且甲硫氨酸可以被正亮氨酸(Nle)置换。肽上或所公开抗体或其片段之一中的多个半胱氨酸残基可能易于形成二硫键，除非将还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT))添加至缓冲液中或半胱氨酸残基可被丝氨酸残基置换。
虽然用于引入氨基酸序列变异的位点或区域是预先确定的，但突变本身不需要预先确定。例如，为了优化给定位点处突变的性能，可以在靶密码子或区域进行随机诱变，并且针对所需活性的最佳组合筛选表达的抗原结合蛋白CDR变体。在具有已知序列的DNA中的预定位点处进行取代突变的技术是众所周知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。使用如本文所描述的抗原结合蛋白活性的测定来进行突变体的筛选。
氨基酸取代通常是单个残基；插入通常将为大约从约一(1)至约二十(20)个氨基酸残基的数量级，尽管可以容许相当大的插入。缺失范围为从约一(1)至约二十(20)个氨基酸残基，但在某些情况下缺失可能更大。
取代、缺失、插入或其任何组合可用于获得最终的衍生物或变体。这些变化是在少数氨基酸上进行的，以最小化分子的改变，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。但是，在某些情况下可以容忍更大的变化。
“片段抗原结合片段(Fab)”是结合至抗原的抗体的区域。如本文所用的“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以单独指这个区域，或者在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白或本文概述的任何其他抗体实施方案的上下文中指这个区域。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于其在Chi结构域的C端处包括额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸残基。恒定结构域的半胱氨酸残基带有一个游离的硫醇基团。F(ab')2抗体片段是由铰链区中的半胱氨酸残基连接的成对Fab'片段。抗体片段的其他化学偶联也是本领域已知的。
如本文所用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”意指包含单个抗体的VL和VH结构域的多肽。Fv区是含有由一个重链和一个轻链可变结构域组成的完整抗原识别和结合位点的最小片段。每个可变结构域的三个CDR相互作用以定义VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总的来说，六个CDR赋予抗体抗原结合特异性。如本领域已知的，“单链”抗体或“scFv”片段是当抗体的VH和VL结构域包括在识别并结合抗原的单一多肽链中时形成的单链Fv变体。通常，单链抗体包括VH和VL结构域之间的多肽接头，其允许scFv形成用于抗原结合的所需三维结构(参见，例如，Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,113:269-315.1994)。
如本文所用，所谓“框架”或“框架区”是指不包括定义为CDR的那些区域的抗体可变结构域区域。每个抗体可变结构域框架可以进一步细分为由CDR分隔的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留与抗原(例如，Cx43半通道)特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL/VK、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab片段，其可以是具有部分铰链区的Fab(参见Fundamental Immunology(Paul编,第3版1993)；(iv)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(v)Fv片段，其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；(vi)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体，含有单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。
术语“特异性结合”或“免疫特异性结合”并非旨在指示抗体与其预期靶标排他性地结合。相反，如果抗体对其预期靶标的亲和力比其对非靶分子的亲和力高约5倍，那么抗体“特异性结合”。适当地，不存在与非所需物质的显着交叉反应或交叉结合。例如，抗体对靶分子的亲和力将是其对非靶分子的亲和力的至少约5倍，诸如10倍，诸如25倍，尤其是50倍，且特别是100倍或更多倍。在一些实施方案中，抗体或其他结合剂与抗原之间的特异性结合意指至少106M-1的结合亲和力。抗体可以例如以至少约107M-1，诸如108M-1至约109M-1、约109M-1至约1010M-1或约10-10M-1至约1011M-1的亲和力结合。抗体可以例如以50nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、100pM或更小或更优选10pM或更小的EC50结合。在一些方面中，抗体可以约60μg/ml、59μg/ml、58μg/ml、57μg/ml、56μg/ml、55μg/ml、54μg/ml、53μg/ml、52μg/ml、51μg/ml、50μg/ml或更小的EC50结合。在一些方面中，抗体可以约50μg/ml、49μg/ml、48μg/ml、47μg/ml、46μg/ml、45μg/ml、44μg/ml、43μg/ml、42μg/ml、41μg/ml、40μg/ml或更小的EC50结合。在一些方面中，抗体可以约40μg/ml、39μg/ml、38μg/ml、37μg/ml、36μg/ml、35μg/ml、34μg/ml、33μg/ml、32μg/ml、31μg/ml、30μg/ml或更小的EC50结合。
在一些方面中，本文所描述的抗体可以与其预期靶标特异性结合。在一些方面中，本文所描述的抗体没有异位结合(off site binding)。例如，本文所述的抗体仅在特定靶位点处与其预期靶标结合，而不结合也不分布到心脏、肝脏和脊髓。
本文所描述的抗体可以是变体，包括但不限于片段(例如，四聚抗体的Fab片段或F(ab')2片段)、scFv或双抗体的片段，或凭借一个或多个氨基酸残基的添加和/或取代而不同的四聚抗体、scFv、双抗体或其片段的变体。抗体部分可以进一步工程化为例如双-双抗体(di-diabody)。
如本领域公知的，某些类型的抗体片段可以通过“全长”抗体的酶促处理产生。用木瓜蛋白酶消化产生两个相同的Fab片段(各自具有单个抗原结合位点)，和残留的Fc片段。Fab片段也含有轻链的恒定结构域和重链的Chi结构域。相比之下，胃蛋白酶消化产生具有两个抗原结合位点的F(ab')2片段并且仍然能够交联抗原。
在一些方面中，抗体可以是双抗体。双抗体是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。每个片段包含连接至VL结构域的VH结构域。然而，由于结构域之间的接头太短而不允许其在同一条链上配对，因此连接的Vh-Vl结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448,1993中。
在一些方面中，考虑了以下抗Cx43抗体或其片段：该抗体或其片段与Cx43蛋白的至少一部分结合并抑制或阻断Cx43半通道开放，因而与Mmp13和胶原X水平降低、滑膜炎程度降低或滑膜炎症减轻以及软骨完整性改善或软骨退化减轻相关联。在一些方面中，考虑了以下抗体或其片段：该抗体或其片段与Cx43蛋白的至少一部分结合并抑制或阻断Cx43半通道开放，因而降低Mmp13水平和胶原X水平、降低滑膜炎程度或减轻滑膜炎症，并且改善软骨完整性或减轻软骨退化。在一些方面中，抗Cx43抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或人源化抗体。因此，通过已知方式并且如本文所描述，可以产生对Cx43蛋白、一个或多个其相应表位或任何前述的缀合物具有特异性的多克隆或单克隆抗体、抗体片段和结合结构域和CDR(包括任何前述的工程化形式)，无论此类抗原或表位是从天然来源分离的还是天然化合物的合成衍生物或变体。表位序列的实例在申请号PCT/US2017/019605(WO 2017-147561)中有所描述，该申请由于其有关本文所公开的抗Cx43抗体及其片段可以结合的表位序列的教导内容特此以引用方式并入本文。
合适的抗Cx43抗体片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，其由VL、VH、CL和CH1结构域组成；(ii)“Fd”片段，其由VII和Cm结构域组成；(iii)“Fv”片段，其由单一抗体的VL和VH结构域组成；(iv)“dAb”片段，其由VH结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，一种包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VII结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域缔和以形成结合结构域；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利号5,091,513)；(ix)通过基因融合构建的双抗体、多价体或多特异性片段(美国专利申请公开20050214860)。Fv、scFv或双抗体分子可以通过并入连接VH和VL结构域的二硫键来稳定。还可以制备包含接合至CH3结构域的scFv的微型抗体(Hu等人,1996)。
还考虑了抗体样结合肽模拟物。Liu等人(2003)描述了“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，其是作为精简抗体的肽，并且具有血清半衰期更长以及合成方法更简单的某些优点。
动物可以接种抗原，诸如Cx43胞外结构域蛋白，以产生对Cx43蛋白具有特异性的抗体。通常，抗原与另一个分子结合或缀合以增强免疫反应。如本文所用，缀合物是与用于在动物中引发免疫反应的抗原结合的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质的物质。在动物体内响应抗原接种而产生的抗体包含由产生B淋巴细胞的各种个别抗体制成的各种不同的分子(多克隆抗体)。多克隆抗体是抗体物种的混合群体，每个物种都可以识别同一抗原上的不同表位。鉴于动物体内多克隆抗体产生的正确条件，动物血清中的大多数抗体将识别动物已经免疫的抗原化合物上的集体表位。这种特异性通过亲和纯化进一步增强，以仅选择识别所关注的抗原或表位的那些抗体。
如本文所提供，单克隆抗体是抗体的单一物种，其中每个抗体分子识别相同的表位，因为产生抗体的细胞源自单个B淋巴细胞细胞系。产生单克隆抗体(MAb)的方法通常与用于制备多克隆抗体的方法相同。在一些方面中，啮齿动物(诸如小鼠和大鼠)用于产生单克隆抗体。在一些方面中，兔、绵羊或蛙细胞用于产生单克隆抗体。大鼠的使用是众所周知的并且可以提供某些优点。小鼠(例如，BALB/c小鼠)是常规使用的并且通常提供高百分比的稳定融合。
杂交瘤技术涉及将来自先前用Cx43抗原免疫的小鼠的单个B淋巴细胞与永生性骨髓瘤细胞(通常是小鼠骨髓瘤)融合。这种技术提供了一种无限期繁殖单个产生抗体的细胞的方法，使得可以产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构上相同的抗体(单克隆抗体)。
血浆B细胞可以从免疫兔的新鲜制备的兔外周血单核细胞中分离，并进一步选择用于Cx43结合细胞。在富集产生抗体的B细胞后，可以分离总RNA并合成cDNA。来自重链和轻链的抗体可变区的DNA序列可以被扩增，构建到噬菌体展示Fab表达载体中，并且转化到大肠杆菌中。Cx43特异性结合Fab可通过多轮富集淘选选出并进行测序。选定的Cx43结合命中可以在人类胚胎肾(HEK293)细胞(Invitrogen)中使用哺乳动物表达载体系统以兔和兔/人类嵌合形式表达为全长IgG，并且使用具有快速蛋白质液相色谱(FPLC)分离单元的蛋白质G树脂纯化。
在一些方面中，抗Cx43抗体可以是嵌合抗体，例如包含来自移植到异源非人类、人类或人源化序列(例如框架和/或恒定结构域序列)的非人类供体的抗原结合序列的抗体。已经开发出用人源的类似结构域置换单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域的方法，从而使外源抗体的可变区保持完整。或者，可以在针对人类免疫球蛋白基因转基因的小鼠中产生“完全人类”单克隆抗体。还开发了通过重组构建具有啮齿类动物(例如小鼠)和人类氨基酸序列的抗体可变结构域将单克隆抗体的可变结构域转化为更多人类形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，只有高变CDR源自小鼠单克隆抗体，并且框架和恒定区源自人类氨基酸序列(参见美国专利号5,091,513和6,881,557)。据认为，用在人类抗体的相应位置中发现的氨基酸序列置换啮齿动物特有的抗体中的氨基酸序列将降低治疗使用期间不良免疫反应的可能性。产生抗体的杂交瘤或其他细胞也可能发生基因突变或其他变化，这可能会或可能不会改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性。
在各种动物物种中产生多克隆抗体以及产生各种类型的单克隆抗体的方法(包括人源化的、嵌合的和完全人类的)是本领域众所周知的并且是高度可预测的。例如，以下美国专利和专利申请提供了对这些方法的描述：美国专利申请号2004/0126828和2002/0172677；和美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253 5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；和6,891,024。本文和其中引用的所有专利、专利申请公布和其他公布在此通过引用并入本申请中。
抗体可以从任何动物来源产生，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是绵羊、鼠类(例如，小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。此外，更新的技术允许从人类组合抗体库中开发和筛选人类抗体。例如，噬菌体抗体表达技术允许在没有动物免疫的情况下产生特异性抗体，如美国专利号6,946,546中所描述，其通过引用并入本文。这些技术进一步描述于：Marks(1992)；Stemmer(1994)；Gram等人(1992)；Barbas等人(1994)；和Schier等人(1996)。
完全可以预期，抗Cx43抗体将具有中和或抵消Cx43效应的能力，而不管动物物种、单克隆细胞系或其他抗体来源如何。某些动物物种可能不太适合产生治疗抗体，因为其更可能由于补体系统通过抗体的“Fc”部分活化而引起过敏反应。然而，完整抗体可以被酶促消化成“Fc”(补体结合)片段，以及具有结合结构域或CDR的抗体片段。Fc部分的去除降低了抗原抗体片段引发不良免疫反应的可能性，并且因此，不具有Fc的抗体可能优先用于预防性或治疗性治疗。如本文所描述，抗体也可以构建为嵌合的或部分或完全人源的，以便减少或消除由于向动物施用已经在其他物种中产生的或具有来自其他物种的序列的抗体而导致的不利的免疫学后果。
蛋白质可以是重组的，也可以是体外合成的。或者，可以从细菌中分离出非重组或重组蛋白质。还考虑可以在组合物和方法中实施含有这种变体的细菌。因此，不需要分离蛋白质。
考虑在组合物中每毫升含有约0.001mg与约10mg之间的总多肽、肽和/或蛋白质。因此，组合物中蛋白质的浓度可为约以下、至少约以下或至多约以下：0.001mg/ml、0.010mg/ml、0.050mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml、5.5mg/ml、6.0mg/ml、6.5mg/ml、7.0mg/ml、7.5mg/ml、8.0mg/ml、8.5mg/ml、9.0mg/ml、9.5mg/ml、10.0mg/ml或更多(或其中可推导出的任何范围)。其中，约以下、至少约以下或至多约以下可以是结合Cx43的抗体：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
抗Cx43抗体或优选地抗Cx43抗体的免疫学部分可以与其他蛋白质一起化学缀合至融合蛋白或表达为融合蛋白。出于本说明书和所附权利要求书的目的，所有这些融合蛋白均包括在抗体或抗体的免疫学部分的定义中。
本文描述了针对Cx43的抗Cx43抗体和抗Cx43抗体样分子、多肽和肽，其与至少一种药剂连接以形成抗体缀合物或有效负荷。为了增加抗体分子作为诊断或治疗剂的功效，可以将抗体连接或共价结合或络合到至少一种所需分子或部分。这种分子或部分可以是但不限于至少一种效应分子或报道分子。效应分子包含具有所需活性，例如细胞毒活性的分子。已与抗体连接的效应分子的非限制性实例包括毒素、治疗酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。相比之下，将报道分子定义为可以使用测定检测到的任何部分。与抗体缀合的报道分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色粒子或配体，诸如生物素。
本领域已知几种将抗体连接或缀合到其缀合物部分的方法。一些连接方法涉及使用金属螯合络合物，例如采用有机螯合剂，例如二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)；乙烯三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或连接到抗体的四氯-3-6-二苯基甘脲-3。单克隆抗体也可以在偶联剂(诸如戊二醛或高碘酸盐)的存在下与酶反应。在这些偶联剂的存在下或通过与异硫氰酸酯反应来制备具有荧光素标记物的缀合物。
在一些方面中，本文所描述的抗Cx43抗体可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：包含SEQ ID NO:19的序列的互补决定区1(CDR1)；包含SEQ IDNO:20的序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:21的序列的CDR3。表2示出了抗Cx43抗体的重链CDR的实例。重链的附加CDR序列可以是申请号PCT/US2017/019605(WO 2017-147561)中所公开的一种或多种重链CDR序列，该申请由于其有关重链CDR序列的教导内容特此以引用方式并入本文。
在一些方面中，本文所描述的抗Cx43抗体可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：包含SEQ ID NO:31的序列的互补决定区1(CDR1)；包含SEQ IDNO:32的序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:33的序列的CDR3。表2示出了抗Cx43抗体的轻链CDR的实例。轻链的附加CDR序列可以是申请号PCT/US2017/019605(WO 2017-147561)中所公开的一种或多种轻链CDR序列，该申请由于其有关轻链CDR序列的教导内容特此以引用方式并入本文。
在一些方面中，本文所描述的抗Cx43抗体可以包含重链免疫球蛋白可变区和轻链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：包含SEQ ID NO:19的序列的互补决定区1(CDR1)；包含SEQ ID NO:20的序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:21的序列的CDR3，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：包含SEQ ID NO:31的序列的互补决定区1(CDR1)；包含SEQ IDNO:32的序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:33的序列的CDR3。
在一些方面中，本文所描述的抗Cx43抗体可以包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:19、20或21中示出的序列具有至少90％同一性的序列(参见，表2)。在一些方面中，本文所描述的抗Cx43抗体包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:19、20或21中示出的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
在一些方面中，本文所描述的抗Cx43抗体可以包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:31、32或33中示出的序列具有至少90％同一性的序列(参见，表2)。在一些方面中，本文所描述的抗Cx43抗体包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:31、32或33中示出的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
本文公开了编码包含SEQ ID NO:52的序列的M1H的核酸序列。本文公开了编码包含SEQ ID NO:54的序列的M1K1的核酸序列。
本文公开了编码包含可变重链的M1H的核酸序列，所述可变重链包含与SEQ IDNO:52中示出的序列具有至少90％同一性的序列(参见，表3)。在一些方面中，M1H包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:52中示出的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
本文公开了编码包含可变轻链的M1K1的核酸序列，所述可变轻链包含与SEQ IDNO:54中示出的序列具有至少90％同一性的序列(参见，表3)。在一些方面中，M1K1包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:54中示出的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
本文公开了编码包含重链免疫球蛋白可变区的M1H区的核酸序列，所述重链免疫球蛋白可变区包含：包含SEQ ID NO:16的序列的CDR1；包含SEQ ID NO:17的序列的CDR2；包含SEQ ID NO:18的序列的CDR3。
本文公开了编码包含轻链免疫球蛋白可变区的M1K1区的核酸序列，所述可变区轻链免疫球蛋白可变区包含：包含SEQ ID NO:28的序列的CDR1；包含SEQ ID NO:29的序列的CDR2；包含SEQ ID NO:30的序列的CDR3。
本文公开了编码包含重链免疫球蛋白可变区和轻链免疫球蛋白可变区的抗Cx43抗体的核酸序列，所述重链免疫球蛋白可变区包含：包含SEQ ID NO:16的序列的CDR1；包含SEQ ID NO:17的序列的CDR2；包含SEQ ID NO:18的序列的CDR3，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：包含SEQ ID NO:28的序列的CDR1；包含SEQ ID NO:29的序列的CDR2；包含SEQ IDNO:30的序列的CDR3。
本文公开了与人类Cx43结合的抗Cx43抗体或其片段。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段包含以下可变重链：所述可变重链包含与表2或表4中所提供的可变重链氨基酸序列之一具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段包含以下可变重链：所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:58中示出的序列。
本文公开了与人类Cx43结合的抗Cx43抗体或其片段。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段包含以下可变轻链：所述可变轻链包含与表2或表4中所提供的可变轻链氨基酸序列之一具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段包含以下可变轻链：所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:60中示出的序列。
本文公开了与人类Cx-43半通道结合的抗Cx43抗体或其片段。在一些方面中，抗Cx-43抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗Cx-43抗体包含：可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:58中示出的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:60中示出的序列。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段包含M1H区。在一些方面中，M1H区包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：包含SEQ ID NO:19的序列的CDR1；包含SEQ ID NO:20的序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:21的序列的CDR3。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段包含M1K1区。在一些方面中，M1K1区包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：包含SEQ ID NO:31的序列的CDR1；包含SEQ ID NO:32的序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:33的序列的CDR3。
在一些情况下，本发明所公开的抗Cx43抗体或其片段还包含标签序列。
本文公开了编码本发明所公开的抗Cx43抗体或其片段的核酸序列。例如，公开了包含可变重链的核酸序列，所述可变重链包含与SEQ ID NO:52中示出的序列具有至少90％同一性的序列。本文公开了编码本发明所公开的抗Cx43抗体或其片段的核酸序列。例如，本文公开了包含可变重链的核酸序列，所述可变重链包含SEQ ID NO:52中示出的序列。本文还公开了包含可变轻链的核酸序列，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:54中示出的序列具有至少90％同一性的序列。还公开了包含可变轻链的核酸序列，所述可变轻链包含SEQ IDNO:54中示出的序列。
本文公开了包含以下的核酸序列：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:52中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:54中示出的序列具有至少90％同一性的序列。公开了包含以下的核酸序列：可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:52中示出的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:54中示出的序列。
本文公开了能够编码包含可变重链的单链可变片段的核酸序列，所述可变重链包含与SEQ ID NO:52中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
公开了能够编码包含可变轻链的单链可变片段的核酸序列，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:54中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
公开了能够编码包含以下的单链可变片段的核酸序列：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
在一些情况下，本发明所公开的抗Cx43抗体或其片段可以具有双特异性。例如，抗体或其片段可以包含：包含SEQ ID NO:58的重链和轻链的第一Fab区和包含SEQ ID NO:60的重链和轻链的第二Fab区，其中第一和第二Fab区可以不同。
在一些情况下，这些双特异性抗Cx43抗体可以具有三功能性。
在一些情况下，本发明所公开的抗Cx43抗体或其片段可以是小鼠的、人类的、人源化的、嵌合的，或者前述项的组合。
在一些情况下，本发明所公开的抗Cx43抗体或其片段是单克隆的。
在另外的实施方案中，根据这些实施方案所述使用的抗Cx43抗体可以是国际(PCT)专利公布号WO 2015-027120或WO 2017-147561中所描述的那些抗体中的任一种，前述专利公布由于其有关制造或表达抗体的抗体、载体和细胞的教导内容以引用方式并入本文。
在一些方面中，第一重链区可以包含具有SEQ ID NO:2的残基13至37的氨基酸序列的氨基酸序列；具有对应于SEQ ID NO:2的残基46至66的氨基酸序列的第二重链区；以及包含具有SEQ ID NO:2的残基97至116的氨基酸序列的氨基酸序列的第三重链区。
在一些方面中，本文公开的抗体可包括全长抗Cx43抗体、抗体片段、单链抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体和抗体融合物和其片段。
方法
本文公开了治疗或预防受试者的骨关节炎的方法。本文公开了治疗或预防受试者的类风湿性关节炎的方法。本文公开了治疗或预防受试者的肌腱病症或肌腱损伤的方法。本文公开了治疗或预防受试者软骨下骨硬化的方法。本文公开了减轻或改善受试者的骨关节炎的一种或多种症状的方法。本文公开了减轻或改善受试者的类风湿性关节炎症状的一种或多种症状的方法。本文公开了减轻或改善受试者的肌腱病症或肌腱损伤的一种或多种症状的方法。本文公开了减轻或改善受试者的软骨下骨硬化的一种或多种症状的方法。本文公开了降低受试者的MMP13或胶原X水平的方法。本文公开了减轻受试者的软骨退化的方法。本文公开了减轻受试者的滑膜炎症的方法。
本文公开了治疗或预防受试者的骨关节炎的方法。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:19的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:20的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:21的序列的互补决定区(CDR3)或其变体。在一些方面中，抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:31的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:32的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:33的序列的互补决定区3(CDR3)或其变体。在一些方面中，与亲本CDR相比，所述重链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3或者所述轻链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸，或甘氨酸变为另一种氨基酸。在一些方面中，所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQID NO:33中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:19具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:21具有至少60％同一性的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:32具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:33具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ IDNO:33中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段可以包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:19相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区2，其包含与SEQ ID NO:20相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区3，其包含与SEQ ID NO:21相比具有单一氨基酸变化的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:31相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区1，其包含与SEQ ID NO:32相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区1，其包含与SEQ ID NO:33相比具有单一氨基酸变化的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的类风湿性关节炎的方法。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ IDNO:19的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:20的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:21的序列的互补决定区(CDR3)或其变体。在一些方面中，抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:31的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:32的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:33的序列的互补决定区3(CDR3)或其变体。在一些方面中，与亲本CDR相比，所述重链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3或者所述轻链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸，或甘氨酸变为另一种氨基酸。在一些方面中，所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQID NO:33中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:19具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:21具有至少60％同一性的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:32具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:33具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ IDNO:33中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段可以包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:19相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区2，其包含与SEQ ID NO:20相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区3，其包含与SEQ ID NO:21相比具有单一氨基酸变化的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:31相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区1，其包含与SEQ ID NO:32相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区1，其包含与SEQ ID NO:33相比具有单一氨基酸变化的序列。
本文公开了治疗或预防受试者的肌腱病症或肌腱损伤的方法。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:19的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:20的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:21的序列的互补决定区(CDR3)或其变体。在一些方面中，抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:31的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:32的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:33的序列的互补决定区3(CDR3)或其变体。在一些方面中，与亲本CDR相比，所述重链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3或者所述轻链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸，或甘氨酸变为另一种氨基酸。在一些方面中，所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ IDNO:21中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ IDNO:19具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:21具有至少60％同一性的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区1，其包含与SEQ IDNO:32具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:33具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段可以包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:19相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区2，其包含与SEQ ID NO:20相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区3，其包含与SEQ ID NO:21相比具有单一氨基酸变化的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:31相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区1，其包含与SEQ ID NO:32相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区1，其包含与SEQ ID NO:33相比具有单一氨基酸变化的序列。
本文公开了降低MMP13或胶原X水平的方法。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:19的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:20的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:21的序列的互补决定区(CDR3)或其变体。在一些方面中，抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ IDNO:31的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:32的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:33的序列的互补决定区3(CDR3)或其变体。在一些方面中，与亲本CDR相比，所述重链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3或者所述轻链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸，或甘氨酸变为另一种氨基酸。在一些方面中，所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:19具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:21具有至少60％同一性的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:32具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:33具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段可以包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:19相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区2，其包含与SEQ ID NO:20相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区3，其包含与SEQ ID NO:21相比具有单一氨基酸变化的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:31相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区1，其包含与SEQ ID NO:32相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区1，其包含与SEQ ID NO:33相比具有单一氨基酸变化的序列。
本文公开了减轻受试者的软骨退化的方法。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:19的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:20的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:21的序列的互补决定区(CDR3)或其变体。在一些方面中，抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ IDNO:31的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:32的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:33的序列的互补决定区3(CDR3)或其变体。在一些方面中，与亲本CDR相比，所述重链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3或者所述轻链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸，或甘氨酸变为另一种氨基酸。在一些方面中，所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:19具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:21具有至少60％同一性的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:32具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:33具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段可以包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:19相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区2，其包含与SEQ ID NO:20相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区3，其包含与SEQ ID NO:21相比具有单一氨基酸变化的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:31相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区1，其包含与SEQ ID NO:32相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区1，其包含与SEQ ID NO:33相比具有单一氨基酸变化的序列。
本文公开了减轻受试者的滑膜炎症的方法。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:19的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:20的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:21的序列的互补决定区(CDR3)或其变体。在一些方面中，抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ IDNO:31的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:32的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:33的序列的互补决定区3(CDR3)或其变体。在一些方面中，与亲本CDR相比，所述重链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3或者所述轻链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸，或甘氨酸变为另一种氨基酸。在一些方面中，所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:19具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:21具有至少60％同一性的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:32具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:33具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段可以包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:19相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区2，其包含与SEQ ID NO:20相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区3，其包含与SEQ ID NO:21相比具有单一氨基酸变化的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:31相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区1，其包含与SEQ ID NO:32相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区1，其包含与SEQ ID NO:33相比具有单一氨基酸变化的序列。
本文公开了治疗或预防受试者软骨下骨硬化的方法。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ IDNO:19的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:20的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:21的序列的互补决定区(CDR3)或其变体。在一些方面中，抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:31的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:32的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:33的序列的互补决定区3(CDR3)或其变体。在一些方面中，与亲本CDR相比，所述重链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3或者所述轻链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸，或甘氨酸变为另一种氨基酸。在一些方面中，所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQID NO:33中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:19具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:21具有至少60％同一性的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:32具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:33具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ IDNO:33中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段可以包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:19相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区2，其包含与SEQ ID NO:20相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区3，其包含与SEQ ID NO:21相比具有单一氨基酸变化的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:31相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区1，其包含与SEQ ID NO:32相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区1，其包含与SEQ ID NO:33相比具有单一氨基酸变化的序列。
本文公开了减轻或改善受试者的骨关节炎的一种或多种症状的方法。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ IDNO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:19的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:20的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:21的序列的互补决定区(CDR3)或其变体。在一些方面中，抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:31的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:32的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:33的序列的互补决定区3(CDR3)或其变体。在一些方面中，与亲本CDR相比，所述重链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3或者所述轻链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸，或甘氨酸变为另一种氨基酸。在一些方面中，所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ IDNO:21中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ IDNO:19具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:21具有至少60％同一性的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:32具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:33具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ IDNO:32中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段可以包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ IDNO:19相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区2，其包含与SEQ ID NO:20相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区3，其包含与SEQ ID NO:21相比具有单一氨基酸变化的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:31相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区1，其包含与SEQ ID NO:32相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区1，其包含与SEQ ID NO:33相比具有单一氨基酸变化的序列。
在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体(即，抗Cx43抗体)或其片段。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中列出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
在一些方面中，所述方法可以降低MMP13水平或胶原X水平。在一些方面中，所述方法可以减轻软骨退化。在一些方面中，所述方法可以减轻滑膜炎症。在一些方面中，所述方法可以减轻或改善骨关节炎、类风湿性关节炎、肌腱病症或肌腱损伤或者软骨下骨硬化的一种或多种症状。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含：重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:19具有至少60％同一性的序列；第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20具有至少60％同一性的序列；和第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:21具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含：轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31具有至少60％同一性的序列；第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:32具有至少60％同一性的序列；和第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:33具有至少60％同一性的序列。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含：重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:19相比具有单一氨基酸变化的序列；第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20相比具有单一氨基酸变化的序列；和第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:21相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含：轻链免疫球蛋白可变决定区，所述轻链免疫球蛋白可变决定区包含：第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31相比具有单一氨基酸变化的序列；第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:32相比具有单一氨基酸变化的序列；和第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:33相比具有单一氨基酸变化的序列。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:19的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:20的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:21的序列的互补决定区(CDR3)或其变体。在一些方面中，与亲本CDR相比，重链CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是甘氨酸残基变为另一种氨基酸。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:31的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:32的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:33的序列的互补决定区3(CDR3)或其变体。在一些方面中，与亲本CDR相比，轻链CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是甘氨酸残基变为另一种氨基酸。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列具有至少60％同一性的序列；互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，与亲本CDR相比，轻链CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是甘氨酸残基变为另一种氨基酸。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列具有至少60％同一性的序列；互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，与亲本CDR相比，轻链CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是甘氨酸残基变为另一种氨基酸。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，与亲本CDR相比，轻链CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是甘氨酸残基变为另一种氨基酸。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，与亲本CDR相比，轻链CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸。在一些方面中，至少一个氨基酸取代可以是甘氨酸残基变为另一种氨基酸。
本文公开了降低或减少炎性基因表达的方法。本文公开了降低或减少受试者的炎性基因表达的方法。在一些方面中，所述方法可以包括降低或减少滑膜巨噬细胞中的炎性基因表达。在一些方面中，所述方法可以包括降低或减少成纤维细胞中的炎性基因表达。在一些方面中，一种或多种炎性基因的表达可以降低或减少。在一些方面中，一种或多种炎性基因可以是MMP3/13、环氧合酶2(COX2)、具有血小板反应蛋白1型基序4的ADAM金属肽酶(Adamts4)或IL6。
在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，所述方法可包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:19的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQID NO:20的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:21的序列的互补决定区(CDR3)或其变体。在一些方面中，抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)包含SEQ ID NO:31的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；b)包含SEQ ID NO:32的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或c)包含SEQ ID NO:33的序列的互补决定区3(CDR3)或其变体。在一些方面中，与亲本CDR相比，所述重链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3或者所述轻链免疫球蛋白可变区的所述CDR1、CDR2或CDR3中的任一者可以包含至少一个氨基酸取代。在一些方面中，至少一个氨基酸取代是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸，或甘氨酸变为另一种氨基酸。在一些方面中，所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列具有至少60％同一性的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:19具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区3，其包含与SEQ IDNO:21具有至少60％同一性的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31具有至少60％同一性的序列；ii)第二互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:32具有至少60％同一性的序列；和iii)第三互补决定区1，其包含与SEQ IDNO:33具有至少60％同一性的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ IDNO:20中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，抗体或其片段可以包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。在一些方面中，所述抗体或其片段可以包含：a)重链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:19相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区2，其包含与SEQ ID NO:20相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区3，其包含与SEQ ID NO:21相比具有单一氨基酸变化的序列；以及b)轻链免疫球蛋白可变区，其包含：i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:31相比具有单一氨基酸变化的序列；ii)第二互补区1，其包含与SEQ ID NO:32相比具有单一氨基酸变化的序列；和iii)第三互补区1，其包含与SEQ ID NO:33相比具有单一氨基酸变化的序列。
在一些方面中，本文公开的任何方法可以包括向受试者施用有效量的编码抗Cx43抗体或其片段的表达载体。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段能够以药学上可接受的组合物施用。在一些方面中，所述药物组合物可以被冻干。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以全身施用。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以在静脉内、皮内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部施用。在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以是人源化抗体或其人源化片段。在一些方面中，抗Cx43抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或基因修饰的IgG类抗体，其包含对应于SEQ ID NO:19的第一VH CDR、对应于SEQ ID NO:20的第二VH CDR、对应于SEQID NO:21的第三VH CDR、对应于SEQ ID NO:31的第一VL CDR、对应于SEQ ID NO:32的第二VL CDR和对应于SEQ ID NO:33的第三VL CDR。在一些方面中，该抗体可以是IgG类抗体，其中IgG类抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类抗体。
在一些方面中，本文公开的任何方法还可以包括至少将第二治疗剂或第二疗法施用于受试者。在一些方面中，第二治疗剂可以是非甾体抗炎药(NSAID)、葡糖胺、软骨素补充剂或它们的组合。在一些方面中，第二疗法可以是关节置换手术。在一些方面中，可以将第二治疗剂和第二疗法施用于受试者。
在一些方面中，在本文公开的任何方法中，抗Cx43抗体或其片段可以与Cx43半通道结合。在一些方面中，在本文公开的任何方法中，抗Cx43抗体或其片段可以抑制或阻断Cx43半通道的开放。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段还可以包含标签序列。
在一些方面中，抗Cx43抗体或其片段可以是Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。
在一些方面中，骨关节炎的一种或多种症状可以是疼痛。骨关节炎症状的实例包括但不限于关节僵直、活动度(灵活性)减小和肿胀。
在一些方面中，类风湿性关节炎症状的一种或多种症状可以是疼痛。类风湿性关节炎症状的实例还包括但不限于关节僵直、压痛、体重减轻、发热、疲劳或疲倦、虚弱。
在一些方面中，肌腱或关节病症可以是幼年型关节炎、肌腱炎、肌腱变性、腱膜炎、腱鞘炎、痛风或纤维肌痛。在一些方面中，肌腱病症或肌腱损伤的一种或多种症状可以是疼痛。肌腱病症或肌腱损伤症状的实例包括但不限于肿胀、僵直、压痛、发红和关节活动受限。
在一些方面中，软骨下骨硬化的一种或多种症状可以是疼痛。软骨下骨硬化症状的实例包括但不限于僵直和丧失灵活性、摩擦感、硬肿块或骨刺。
疾病治疗
本文公开了可以用于治疗或预防受试者的骨关节炎、类风湿性关节炎、肌腱病症或肌腱损伤或者软骨下骨硬化的抗体及其片段。抑制或阻断Cx43半通道的信号传导可以通过任何合适的药物或治疗剂来实现，以降低MMP13或胶原X水平、减轻软骨退化，以及/或者减轻滑膜炎症。在一些方面中，药物或治疗剂可以是抗Cx43抗体。
本文所描述的药物组合物可以足以延迟、减少或优选地防止临床疾病发作的量施用于受试者(例如，人类患者)。因此，在一些方面中，患者可以是人类患者。在治疗应用中，组合物能够以足以至少部分地改善体征或症状或者抑制(并且优选地阻止)病症、其并发症和后果的症状进展的量施用于已经患有或被诊断患有骨关节炎、类风湿性关节炎、肌腱病症或肌腱损伤或者软骨下骨硬化，或者骨关节炎、类风湿性关节炎、肌腱病症或肌腱损伤或者软骨下骨硬化的一种或多种症状的受试者(例如，人类患者)。将足够实现此的量定义为“治疗有效量”。组合物(例如，药物组合物)的治疗有效量可以是实现治愈的量，但是所述结果只是可以实现的几个结果中的一个。如前所述，治疗有效量包括提供治疗的量，在该治疗中，延迟、阻碍或预防疾病、病症、病况或损伤的发作或进展，或者改善疾病、病症、病况或损伤或者疾病、病症、病况或损伤的症状，或者可以降低疾病、病症、病况或损伤的频率。症状中的一种或多种可能不太严重。可以加快被治疗的个体中的恢复。例如，治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、肌腱病症或肌腱损伤或者软骨下骨硬化可以涉及例如降低MMP13水平、降低胶原X水平、减轻软骨退化、减轻滑膜炎症，或者减轻或预防疼痛。
在一些方面中，关节或肌腱病症可以是幼年型关节炎、肌腱炎、肌腱变性、腱膜炎、腱鞘炎、痛风或纤维肌痛。
对骨末端起缓冲作用的保护性软骨随时间推移而磨损时，骨关节炎发生。在一些方面中，骨关节炎可能损害或影响任何关节。在一些方面中，关节可以是手、膝盖、髋部、脊柱、脚、颈或肩中的关节。
类风湿性关节炎可能是一种自身免疫病症。在一些方面中，类风湿性关节炎可能损害或影响任何组织和/或任何关节。在一些方面中，组织可以是关节。在一些方面中，关节可以是手、脚、膝盖、髋部、肩和肘中的关节。在一些方面中，类风湿性关节炎可能损害各种各样的身体系统。在一些方面中，类风湿性关节炎可能损害或影响皮肤、眼睛、肺、心脏和血管。
软骨下骨硬化是软骨表面正下方的骨骼硬化，通常出现在骨关节炎后期。在一些方面中，软骨下骨硬化可能在承重关节处发现。在一些方面中，软骨下骨硬化可以在膝盖、髋部、手、脚或脊柱中发现。
本文公开了治疗关节炎患者或预防与关节炎或软骨下骨硬化相关联的软骨退化的方法。在一些方面中，关节炎可以是骨关节炎或类风湿性关节炎。本文还公开了治疗或预防受试者的肌腱病症或肌腱损伤或者软骨下骨硬化的方法。在一些方面中，在施用步骤之前，受试者已被诊断患有关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨下骨硬化或者肌腱病症或肌腱损伤。
可以将本文所述组合物配制成包含治疗有效量的本文所公开的抗体或其片段。在一些方面中，本文所公开的抗体或其片段可以包含在药物制剂内。在一些方面中，药物制剂可以是单位剂量制剂。
施加至哺乳动物(例如，人类)的本文公开的方法中使用的任何抗Cx43抗体或其片段的治疗有效量或剂量可由本领域普通技术人员在考虑年龄、体重、性别、受试者症状的严重程度和选择的特定组合物或施用途径、施用的其他药物以及主治医师的判断中的个体差异来确定。可以预期所需剂量中的变化。剂量水平的变化可以使用标准经验路线进行优化来进行调整。施用于患者的药物组合物的特定剂量将取决于多种考虑因素(例如，癌症症状的严重程度)、受试者的年龄和身体特征以及本领域中的普通技术人员已知的其他考虑因素。可以使用本领域中的普通技术人员已知的临床方法确定剂量。抗半通道抗体的治疗有效剂量可引起一种或多种疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加，或预防由于疾病折磨所致的损伤或残疾。治疗有效量的治疗化合物或抗体可以降低MMP13水平或胶原X水平、减轻软骨降解、减轻滑膜炎症，或以其他方式改善受试者的症状。
用本文提供的任何组合物治疗的持续时间可以是从短至一天到长至宿主寿命(例如，许多年)的任何时间长度。例如，组合物可以一周一次(例如，持续4周至许多个月或数年)；一月一次(例如，持续三个月至十二个月或持续许多年)；或一年一次(持续5年、10年或更长时间)施用。还应注意，治疗频率可以是可变的。例如，本发明的组合物可以每天、每周、每月或每年一次(或两次、三次等)施用。
可以将如本文公开的总有效量的抗体或组合物作为单剂量，或作为推注或通过在相对较短的时段内输注施用于受试者，或可以使用其中多个剂量在更长的时段内施用的分级治疗方案施用。或者，足以维持血液中治疗有效浓度的连续静脉内输注也在本公开的范围内。
本文所述的抗Cx43抗体、其片段或组合物可以与其他治疗模式结合施用于需要治疗的受试者。本发明化合物可以在用其他药剂或方案治疗之前、同时或之后给予。例如，本文所公开的抗Cx43抗体可以单独施用或与用于治疗关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨下骨硬化或者肌腱病症或肌腱损伤的标准疗法结合施用。在一些方面中，本文所述的任何抗Cx43抗体或组合物可以连同非甾体抗炎药(NSAID)、葡糖胺和软骨素补充剂、关节置换手术或它们的组合一起施用或使用。
药物组合物
本文公开了组合物，例如药物组合物，所述组合物包含与药学上可接受的载体一起配制的以下一种物质或以下物质的组合：单克隆抗体，或者其抗原结合部分或片段。此类组合物可以包含以下一种物质或以下物质的组合：(例如，两种或更多种不同的)本文所述的抗体、抗体片段或免疫缀合物。例如，本文所述的药物组合物可以包含与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的抗体或其抗体片段的组合。
本文公开了包含如本文所述的任何抗Cx43抗体或其片段与药学上可接受的载体的药物组合物。本文还公开了用作药物或用于治疗或预防骨关节炎、类风湿性关节炎、肌腱病症或肌腱损伤、软骨下骨硬化、降低MMP13或胶原X水平、减轻软骨退化或减轻滑膜炎症的疗法中的抗Cx43抗体或药物组合物。
本发明的药物组合物也可以作为联合疗法，即与其他药剂联合施用。例如，该联合疗法可以包括与至少一种其他治疗剂或疗法组合的抗半通道抗体。
如本文所用，短语“药学上可接受的载体”包括生理学上兼容的任何溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体可以适用于静脉内、肌肉内、皮下或肠胃外施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物(即抗体或免疫缀合物)可以包被在一种材料中，以保护化合物免受酸和其他可能使化合物失活的自然条件的作用。
本发明的药物组合物中可以采用的适合水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适合混合物、植物油(诸如橄榄油)，以及可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可以例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散液的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。用于药学活性物质的这种介质和药剂的用途是本领域中熟知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不兼容，考虑将其用于本发明的药物组合物中。补充性有效化合物也可并入组合物中。
治疗组合物在制造和储存的条件下通常必须是无菌的和稳定的。组合物可被配制为适于高药物浓度的溶液、微乳液、脂质体或其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合的混合物。可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散液的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在很多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，诸如糖类、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)引起可注射组合物的延长吸收。
可通过将活性化合物以要求的量与本文列举的一种成分或成分组合一起并入适合的溶剂中，根据需要，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和来自本文列举的那些成分的所需其他成分的无菌溶媒中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是产生活性成分外加来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥(冻干)。
可与载体材料组合以产生单剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，按照100％计，这个量将范围介于约0.01％至约99％的活性成分，优选地约0.1％至约70％，最优选地约1％至约30％的活性成分以及药学上可接受的载体。
调整剂量方案以提供所需的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，几个分次剂量可以随时间施用或剂量可以按比例减少或增加，如由治疗情况的紧急程度所指示。为便于施用和剂量均匀，配制剂量单位形式的肠胃外组合物是特别有利的。本文使用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位含有经计算可产生所需治疗效果的与所需药物载体结合的预定量的活性化合物。本发明剂量单位形式的规格由以下决定且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，和(b)用于治疗个体敏感性的这种活性化合物的配制技术中固有的局限性。
对于抗体的施用，剂量范围介于为0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至15mg/kg、15mg/kg至20mg/kg或20mg/kg至25mg/kg宿主体重。在一些方面中，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。在一些方面中，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重、15mg/kg体重、20mg/kg体重、25mg/kg体重或30mg/kg体重或在1-30mg/kg的范围内。在一些方面中，剂量可以是约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg/kg体重。在一些方面中，剂量可以是5mg/kg体重。在一些方面中，剂量可以是15mg/kg体重。在一些方面中，剂量可以是20mg/kg体重。在一些方面中，剂量可以是25mg/kg体重。示例性的治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一个月一次、每三个月一次或每三至六个月一次施用。本发明的抗半通道抗体的优选施用方案包括通过静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中使用以下施用方案中的一种给予抗体：(i)每四周，持续六个剂量，随后是每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重一次，随后是每三周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时施用两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况下，施用的每种抗体的剂量在所指示的范围内。抗体通常在多种情况下施用。单次剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不规律的，如测量患者内针对靶抗原的抗体的血液水平所指示。在一些方法中，调整剂量以实现约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中约25-300μg/ml。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得有效实现特定患者、组合物和施用模式的所需治疗反应的活性成分的量，而对患者没有毒性。所选剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本文公开的特定组合物的活性；施用途径；施用时间；所采用的特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料；所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和既往病史；以及医学领域中众所周知的类似因素。
本文所公开的任何组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种方法，经由一种或多种施用途径来施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或施用模式将根据所需结果而变化。在一些方面中，本文所公开的抗体施用途径包括但不限于静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内注射和输注。
联合治疗。本文所述的组合物和方法可以涉及用对抗Cx43的抗体或其抗体片段(例如，抗Cx43抗体或其片段)与第二或附加治疗剂或疗法组合来抑制或阻断Cx43半通道开放，从而例如降低MMP13或胶原X水平，保护、减轻或防止软骨退化，减轻滑膜炎症，减轻或改善骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨下骨硬化或者肌腱病症或肌腱损伤的一种或多种症状。这种疗法可以用于治疗与Cx43介导的滑膜炎症、软骨退化或者MMP13或胶原X水平升高相关联的任何疾病。例如，该疾病可以是骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨下骨硬化或者肌腱病症或肌腱损伤。
这些方法和组合物(包括联合疗法)增强另一种抗炎剂、治疗剂或疗法的治疗或保护作用，以及/或者增加另一种抗炎剂、治疗剂或疗法的治疗作用。治疗和预防方法和组合物能够以能有效地实现期望效果的组合量提供，该期望效果诸如：降低MMP13或胶原X水平、减轻软骨退化、减轻滑膜炎症，以及/或者减轻或改善骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨下骨硬化或者肌腱病症或肌腱损伤的一种或多种症状。这个过程可能涉及使细胞与抗体或抗体片段以及第二疗法接触。可以使组织、肿瘤或细胞与包含一种或多种药剂(即，抗体或抗体片段，或者第二治疗剂)的一种或多种组合物或药物制剂接触，或者通过使组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物提供：1)抗体或抗体片段，2)第二治疗剂，或者3)抗体或抗体片段和第二治疗剂两者。另外，预期这种联合疗法可以与手术疗法(例如，关节置换手术)结合使用。
术语“接触”和“暴露”在应用于细胞时，在本文中用于描述将治疗构建体和第二治疗剂递送到靶细胞或与靶细胞直接并列放置的过程。例如，为了实现期望的结果，可以将两种药剂以对该期望的结果有效的组合量递送到细胞。
抗Cx43抗体或其片段可以在相对于第二治疗剂或疗法之前、期间、之后施用，或者以相对于第二治疗剂或疗法的各种组合施用。施用间隔可以范围介于同时到几分钟到几天到几周。在其中抗体或抗体片段与第二治疗剂或疗法分开提供给患者的方面中，通常将确保每次递送时间之间有相当长的时段未到期，使得这两种化合物将仍然能够对患者施加有利的联合作用。在此类情况下，设想可以在彼此相隔约12小时至24小时或72小时内，更具体地，彼此相隔约6小时至12小时内向患者提供抗体疗法和第二治疗剂或疗法。在某些情况下，可能需要显著延长治疗时段，其中在各自施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
在一些方面，一个疗程可以持续1-90天或更长时间(这个范围包括中间天数)。考虑可以在第1天至第90天(这个范围包括中间天数)的任何一天或其任何组合给予一种药剂，并且在第1天至第90天(这个范围包括中间天数)的任何一天或其任何组合给予另一种药剂。在一天(24小时时期)内，可以给予患者一次或多次药剂施用。此外，在一个疗程后，预期可以有一段时间不施用第二治疗剂或疗法。这个时段可能持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长时间(这个范围包括中间天数)，这取决于患者的病状，诸如其的预后、强度、健康等。预期将根据需要重复治疗周期。
在一些方面中，本文所公开的抗Cx43抗体或其片段可以在手术后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更多天施用。在一些方面中，手术可以是内侧半月板失稳手术。在一些方面中，手术可以是用于治疗骨关节炎的一类手术。在一些方面中，手术可以是软骨置换手术(例如，人工内假体)或关节成形术。在一些方面中，手术可以是肌腱修复手术。在一些方面中，手术可以与治疗类风湿性关节炎相关联。在一些方面中，手术可以是关节置换术、关节融合术或滑膜切除术。在一些方面中，本文所公开的抗Cx43抗体或其片段可以间隔一天或多天施用一次或多次。在一些方面中，本文所公开的抗Cx43抗体或其片段的第二次、第三次、第四次、第五次等施用可以间隔1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一些方面中，本文所公开的抗Cx43抗体或其片段可以间隔一周或多周施用一次或多次。在一些方面中，本文所公开的抗Cx43抗体或其片段的第二次、第三次、第四次、第五次等施用可以间隔1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在一些方面中，本文所公开的抗Cx43抗体或其片段可以间隔一个月或多个月施用一次或多次。在一些方面中，本文所公开的抗Cx43抗体或其片段的第二次、第三次、第四次、第五次等施用可以间隔1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月。在一些方面中，本文所公开的抗Cx43抗体或其片段能够以多种时间间隔，间隔数天、数周、数月或这些时间间隔的任何组合施用一次或多次。
可以采用各种组合。对于下面的实例，抗体疗法是“A”，第二治疗剂或疗法是“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/BB/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/AB/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A。
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本文公开的任何化合物或疗法将遵循施用这些化合物的一般方案。因此，在一些方面中，可以存在监测可归因于联合疗法的毒性的步骤。
试剂盒和诊断
本文公开了包括一种或多种治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂的试剂盒。在一些方面中，该试剂盒可以用于制备和/或施用本文所公开的疗法。试剂盒可以包括一个或多个密封小瓶，所述小瓶含有本文公开的任何药物组合物。试剂盒可以包括例如至少一种抗Cx43抗体或其片段，以及用于制备、配制和/或施用一种或多种本文所公开的组合物的组分或者执行本发明方法的一个或多个步骤的试剂。在一些方面中，试剂盒还可以包括合适的容器，其可以是不会与试剂盒的组分发生反应的容器，诸如埃普多夫管、测定板、注射器、瓶子或管。容器可由可灭菌材料制成，诸如塑料或玻璃。
试剂盒还可包括概述本文所阐述的方法的程序步骤的指令单，并且将遵循与本文所描述或本领域普通技术人员已知的基本相同的程序。指令信息可以在含有机器可读指令的计算机可读媒体中，当使用计算机执行所述指令时，使得显示递送药物有效量的治疗剂的真实或虚拟程序。
实施例
本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成了其实践的优选模式。然而，鉴于本公开，本领域的技术人员应理解可在不背离本发明的精神和范围的情况下在公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍获得类似或相似的结果。
实施例1-通过阻断连接蛋白43半通道来抑制骨关节炎进展
在原代小鼠软骨细胞中，溴化乙锭染料摄取测定表明，M1抗体阻断了IL-1β处理诱导的HC开放。为了研究Cx43半通道在OA进展中的功能，通过内侧半月板失稳(DMM)手术在雄性C57BL/6小鼠中诱导创伤后OA模型。在术后8周内，通过腹膜内注射施用M1抗体或盐水两次。通过组织学和免疫组织化学分析软骨退化和滑膜炎症。与盐水组相比，如通过OARSI评分系统量化的，M1抗体处理显著改善软骨完整性、降低滑膜炎程度，并且降低Mmp13水平和胶原X水平。对软骨下骨硬化的微计算机断层摄影(μCT)显示，在抑制Cx43半通道后，BV/TV、Tb.Th减小，而Tb.Sp增大。此外，冯·弗雷细丝试验和旷场试验显示，在M1抗体处理后，DMM小鼠中OA相关的疼痛症状得到改善，而在用盐水处理和用抗体处理的假手术小鼠之间没有观察到差异。结果还显示，M1抗体主要定位于滑膜区，并且在施用M1抗体后甚至超过2周也检测到信号。体内染料摄取和免疫荧光测定进一步验证了M1抗体在阻断表达Cx43的滑膜细胞内由OA诱导的半通道开放中的作用。综上所述，这些结果表明用M1抗体靶向Cx43半通道是一种可以用于减轻OA进展期间关节的分解代谢和炎性环境的治疗策略。由于作用机制相似，M1抗体疗法可能适用于类风湿性关节炎(RA)以及其他肌腱病症和损伤。
材料和方法。动物和手术模型。所用小鼠为C57BL/6背景小鼠。将小鼠饲养在采用12小时:12小时光/暗循环的温度控制室内，使其处于特定的无病原体条件下。小鼠自由采食饲料和水。
对小鼠右膝关节进行内侧半月板失稳(DMM)手术(Glasson SS等人，Osteoarthritis and cartilage.2007；15(9):1061-9)。简言之，在髌骨远端至胫骨平台近端上做一个3mm的纵向切口。用15号刀片切开紧邻髌骨腱内侧的关节囊，用微型虹膜剪剪开关节囊。然后对髁间区域上的脂肪垫进行钝性剥离，暴露髁间区域，从而提供对内侧半月板的半月板胫骨韧带的可视化。钝性剥离时脂肪垫的轻微出血受到来自吸收矛的压力控制。用微型手术刀，刀片朝近端侧向切开内侧半月板胫骨韧带，造成内侧半月板失稳(DMM)。进行假手术，实现韧带可视化，但未横断。
组织学检查。在诱导骨关节炎(OA)后8周，将从DMM手术小鼠和假手术小鼠分离的股骨和胫骨置于4％多聚甲醛中固定2天，然后用10％ EDTA(pH 7.5)脱钙3周。将样品包埋在石蜡中，在载玻片上收集5μm厚的切片。切片在二甲苯中脱蜡，之后进行一系列分级醇洗。为了确定软骨恶化的程度，用番红O/固绿将切片染色。进行OARSI评分以评价膝关节关节软骨的破坏程度(Glasson SS等人，Osteoarthritis and cartilage.2010；第18卷增刊3：S17-23)。具体地讲，通过关节的三级切片分析内侧股骨髁和内侧胫骨平台两者，并将OA的严重程度表示为整个关节的平均分数和总分数。
根据滑膜增厚和滑膜增生来确定滑膜炎的程度，评分范围为0至3(0，未患滑膜炎；1，轻度滑膜炎；2，中度滑膜炎；3，重度滑膜炎)(Krenn V等人，Pathology,research andpractice.2002；198(5):317-25；以及Huesa C等人，Annals of the rheumaticdiseases.2016；75(11):1989-97.进行盲法组织形态学评估。
免疫组织化学。使用ABC(抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物)免疫染色测定试剂盒(Vector Laboratories，PK-6101)。简言之，使用柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)在65℃下对骨组织切片进行抗原暴露，持续2小时以便将MMP13染色，然后使用胰蛋白酶消化缓冲液(pH7.8)在37℃下进行抗原暴露，持续30分钟以便将胶原X染色。然后在室温下用山羊正常血清处理骨组织切片20分钟，以阻断非特异性背景染色。组织切片用抗MMP13多克隆抗体(1:200稀释度，Abcam，ab39012)染色，或用抗胶原X单克隆抗体(1:100稀释度，ThermoFisher，14-9771-82)在4℃下标记过夜。然后，将切片与生物素标记的二抗和VECTASTAINABC试剂一起孵育30分钟。将样品置于PBS缓冲液中洗涤，然后置于DAB(SK4100)色原溶液(Vector Laboratories，Burlingame,CA,USA)中显色。然后在室温下用VECTOR苏木精(H-3401)复染组织5分钟。然后对载玻片进行脱水、清洁和封固。使用Keyence显微镜(BZ-X710，Keyence,Osaka,Japan)对切片拍照。使用NIH Image J软件对MMP13或Col X阳性软骨细胞的百分比进行定量。
免疫荧光染色。分离的股骨和胫骨在4％多聚甲醛中固定2天，之后用10％ EDTA(pH 7.5)脱钙3周，接着在30％蔗糖/PBS中脱水3天。将样品包埋在Tissue-Tek CRYO OCT化合物(Thermo Fisher Scientific,Pittsburgh,PA,USA)中，在载玻片上收集12μm厚的切片。将切片封闭，然后用2％山羊血清、2％鱼皮明胶、0.025％ Triton X-100和1％牛血清白蛋白的PBS溶液进行透化。切片在4℃下与亲和纯化的抗Cx43(CT)抗体(1:100)一起孵育过夜(Cherian PP等人，The Journal of biological chemistry.2003；278(44):43146-56)，与合适的二抗接触1小时。使用Vectashield封固介质(H-1000，Vector Lab)封固载玻片。使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM770，Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)进行共聚焦荧光成像。
动物行为测试。用冯·弗雷0.007至2号细丝测量缩爪阈值。将小鼠放置在悬挂在金属丝网上方的丙烯酸室(5.5cm×10cm)中，在实验前让其适应测试设备30分钟。小鼠不动时，将冯·弗雷细丝压贴在鼠爪的跖面上，直到细丝弯曲并最长保持3秒钟。如果在施加细丝时鼠爪急剧缩回，则记录为阳性反应。移走细丝后立即发生缩足反射也被视为阳性反应(Chaplan SR等人，Journal of neuroscience methods.1994；53(1):55-63；以及Bonin RP等人，Molecular pain.2014；10:26)。测试从0.4号细丝开始，根据上下法推进。
自发活动度用旷场试验进行分析。将小鼠放入25x25x25 cm室的中央，允许其自由探索。实验进行10分钟。通过计算机分析对总行进距离和静止时间进行测量。记录小鼠行为，使用ANY-maze行为跟踪软件(Stoelting Co.,Wood Dale,IL,USA)来分析视频。
微计算机断层摄影。行为测试后，处死小鼠，立即解剖后肢，固定在4％多聚甲醛中。使用μCT成像系统(Brüker SkyScan 1173；Brüker microCT,Kontich,Belgium)的3D重建对软骨下骨的结构特性进行评价。在盐水中用以下设置扫描样品：60kV，167mA光束强度，0.5mm铝过滤器，0.7°旋转步长，平均4帧，1090ms积分时间，1024×1024像素矩阵，以及10μm各向同性体素尺寸。扫描后，通过消除尺寸小于4像素的不连续对象，从图像中去除噪声。从胫骨髁完全融合的第一个切片开始，对向近端延伸的50个切片进行形态测量分析。使用轮廓绘制工具在关键切片上手动从皮质壳分割软骨下骨，自动将轮廓变形，以便在所有切片上分割小梁骨。重建形态测量学并加以分析。将一组8位切片中的灰度值95设置为阈值，在比较两组中的灰度图像和二值化图像后应用于样本。阈值处理后，对BV/TV(％)、Tb.Th(mm)、Tb.Sp(mm)和Tb.N(mm-1)进行量化。
体内染料摄取测定。在抗体处理后4天，经由尾静脉共同注射伊文思蓝染料(Mw：900Da)(200mg/kg)和FITC-葡聚糖(Mw:10,000Da)(200mg/kg)。施用染料一小时后，麻醉小鼠，用冷PBS和4％多聚甲醛进行心脏灌注。将两个后肢分离，准备冰冻切片。用DAPI将切片染色，然后使用Keyence显微镜(BZ-X710，Keyence,Osaka,Japan)对切片拍照。通过NIHImage J软件对染料摄取强度进行定量。
统计分析。使用GraphPad Prism5统计软件(GraphPad)进行统计分析。数据表示为平均值±SEM。使用T检验和带有Tukey检验的双向方差分析进行统计分析。星号表示与对照相比的显著差异程度(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
结果抑制Cx43半通道改善了OA的组织病理学变化。为了研究Cx43半通道在OA进展中的功能，通过内侧半月板失稳(DMM)手术在雄性C57BL/6小鼠中诱导创伤后OA模型。在术后30分钟和4周，通过腹膜内注射施用抗Cx43半通道阻断抗体(M1抗体)或盐水两次(图1A)。利用番红O/固绿组织学染色来可视化关节软骨损伤的严重程度，这是由两名盲法观察者使用国际骨关节炎研究学会(OARSI)评分系统(Glasson SS等人，Osteoarthritis andcartilage.2010；第18卷增刊3：S17-23)确定的(图1B至图1D)。在DMM诱导OA后8周，小鼠表现出以蛋白聚糖丢失和软骨侵蚀为特征的OA病理变化(图1B)，内侧胫骨平台(MTP)和内侧股骨髁(MFC)的平均OARSI分数分别为1.95±0.11和1.72±0.18。与盐水处理组相比，M1抗体处理显示出对软骨退化严重程度的明显保护，以及内侧胫骨平台和内侧股骨髁两者的OARSI分数显著降低(图1C)。接受盐水或M1抗体处理的假手术小鼠在关节软骨中没有表现出病理改变(图1C)。通过关节的三级切片还量化了MTP和MFC的总OARSI分数，进一步验证在M1抗体处理后关节软骨的结构完整性得到显著改善(图1D)。此外，通过滑膜炎评分量化滑膜增生(Krenn V等人，Pathology,research and practice.2002；198(5):317-25；以及Huesa C等人，Annals of the rheumatic diseases.2016；75(11):1989-97)。结果显示，与盐水处理组相比，M1抗体处理组的滑膜炎程度显著降低(图2A和图2B)。
抑制Cx43半通道降低了OA诱导的基质蛋白水平和蛋白酶水平。胶原X(Col X)是肥大软骨细胞最重要的标记物之一，而基质金属蛋白酶13(MMP13)是裂解II型胶原(关节软骨中的主要形式)最有效的酶。测试了Col X和MMP13的减少是否可能是M1抗体对软骨的保护作用的基础。使用免疫组织化学，在DMM后8周，Col X阳性细胞的百分比从溶媒处理小鼠中的52％降至M1抗体处理小鼠中的38％(图3)。类似地，进行对MMP13的免疫组织化学染色，以分析表达。结果显示，盐水处理DMM小鼠中的MMP13阳性软骨细胞分布在股骨髁和胫骨髁的关节软骨的三个区域中。相比之下，M1抗体处理小鼠中的MMP13阳性软骨细胞主要位于中间区域和深层区域(图4A)。在DMM后8周，关节软骨中MMP-13阳性细胞的百分比从盐水处理小鼠中的36％降至M1抗体处理小鼠中的27％(图4B)。小鼠或兔IgG用作同型对照(图3A和图4A，下图)，显示无反应性。
抑制Cx43半通道减轻了OA的软骨下骨硬化。由于OA还具有软骨下骨重塑异常的特征，所以为了研究抑制Cx43半通道对软骨下骨微结构的影响，进行了显微CT分析。手术后8周的DMM小鼠3D渲染和重建扫描显示，与假手术小鼠相比，膝关节发生了变化，包括内侧软骨下板的厚度变化，以及软骨下骨的明显硬化(图5A)。与之一致的是，显微CT分析揭示，相比于假手术，DMM后小鼠胫骨软骨下骨的相对骨体积分数(骨体积/总体积，BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨矿物质密度(BMD)增加(图5B、图5C和图5E)。与盐水处理DMM小鼠相比，施用抗Cx43抗体在胫骨软骨下骨处显示出明显降低的BV/TV、Tb.Th和BMD(图5B、图5C和图5E)，以及升高的骨小梁分离度(Tb.Sp)(图5D)，表明阻断Cx43半通道减轻了OA的软骨下骨硬化。
抑制Cx43半通道减轻了OA相关的疼痛症状。OA进展伴随继发性临床症状，最突出的是疼痛(Felson DT.Arthritis research&therapy.2009；11(1):203)。通过在两个时间点施加到进行过假手术或DMM手术的后爪跖面的冯·弗雷细丝的撤回阈值来测量机械性异常性疼痛。在DMM后4周，与用盐水处理的小鼠相比，抑制Cx43半通道显示出对机械刺激的反应阈值略有增加的趋势(图6B)。在DMM后8周，用M1抗体处理的小鼠显示出的缩爪阈值是在盐水处理DMM小鼠中观察到的缩爪阈值的121.4％(图6C)，这暗示它们经历的疼痛比盐水处理组轻得多。此外，通过对小鼠进行旷场试验来监测活动度，以量化假手术或DMM手术后用盐水/M1抗体处理后的运动。在DMM后4周，与盐水组相比，Cx43抗体处理小鼠有移动距离增加和静止时间缩短的趋势(图7B和图7E)。在DMM后8周，与假手术小鼠相比，盐水处理DMM小鼠表现出行进距离减小和静止时间增加，而M1抗体处理抑制了这些疼痛反应(图7C和图7F)。在8周时，在盐水处理的假手术小鼠与M1抗体处理的假手术小鼠之间，在通过冯·弗雷细丝试验(图6A)测得的缩爪阈值、通过旷场试验测得的行进距离和静止时间(图7A和图7D)方面没有观察到差异。
M1抗体与滑膜结合并抑制OA中的半通道开放。由于软骨的致密性和抗体的大尺寸，人们普遍认为抗体无法穿透软骨基质。为了确定膝关节区域中的抗体结合模式，在DMM手术后30分钟腹膜内(i.p.)注射具有人IgG表位的M1抗体(25mg/kg)或盐水。如图表(图8A)所示，在注射后1周或2周，对小鼠实施安乐死和灌注，之后将后肢分离。制备冷冻组织切片，用缀合Alexa Fluor 594的抗人IgG二抗进行免疫标记。在施用抗体后1周和2周均能够检测到信号，抗体结合位点主要位于滑膜区中(图8B)。关节滑膜包含巨噬细胞样A型细胞和成纤维细胞样B型细胞，前者负责吞噬滑液，后者产生透明质酸和粘蛋白，分别用于滋养下方的关节软骨和对其提供机械保护(Donahue HJ等人，Nature reviews Rheumatology.2017；14(1):42-51)。然后用巨噬细胞标记物CD68对切片进行免疫标记，M1抗体与CD68在滑膜区中共定位(图9)。此外，还观察到M1抗体和滑膜成纤维细胞标记物骨膜蛋白的共定位(图10)。
为了确定体内的Cx43半通道活性，进行了伊文思蓝染料摄取测定。在DMM手术后30分钟，用盐水或Cx43抗体(M1抗体)(25mg/kg)处理小鼠。在处理后两周通过尾静脉注射伊文思蓝染料(200mg/kg)，并对滑膜区中伊文思蓝染料摄取强度进行定量。结果显示，DMM使半通道开放增加了2倍，这可以通过施用M1抗体来阻断(图11A和图11B)。用M1抗体对由盐水处理小鼠制备的冷冻切片进行免疫标记，进一步验证了M1抗体在阻断表达Cx43的滑膜细胞内由骨关节炎诱导的半通道开放中的作用(图11C)。
单次施用抗Cx43半通道抗体(M1抗体)改善了OA的严重程度。研究了施用M1抗体一次是否能够显示出减缓OA进展的效果。在术后30分钟，通过腹膜内注射仅施用抗Cx43半通道抗体(M1抗体)或盐水一次，执行行为测试，之后，在DMM后8周处死小鼠进行组织学检查(图12A)。番红O/固绿染色结果表明，与盐水对照相比，M1抗体处理后蛋白聚糖丢失和软骨侵蚀较少(图12B)。通过OARSI分数对软骨退化进行定量，结果显示，在用M1抗体处理的DMM小鼠中，内侧胫骨平台和内侧股骨髁两者中的软骨退化均显著减轻(图12C)。此外，MMP13分数被确定为积分光密度(IOD)与关节软骨面积之比，其从盐水处理小鼠中的0.17±0.016降至M1抗体处理小鼠中的0.10±0.009(图13)。在DMM后8周，与用盐水处理的小鼠相比，抑制Cx43半通道显示出对机械刺激的缩爪阈值略有增加的趋势(图14A)。与之一致的是，用M1抗体处理的DMM小鼠与盐水对照相比，行进距离明显增加，静止时间明显缩短(图14B)。
结论。结果表明，施用抗Cx43半通道抗体(M1抗体)减轻了DMM诱导的OA模型中的关节软骨退化、滑膜炎程度，并减少了其中的MMP13/ColX表达。对软骨下骨硬化的显微CT分析显示，在抑制Cx43半通道后，BV/TV、Tb.Th减小，而Tb.Sp增大。此外，在抗体处理DMM小鼠中，冯·弗雷细丝试验和旷场试验表现出OA相关疼痛症状减轻，以及活动性改善。体内染料摄取和免疫荧光测定验证了抗Cx43半通道抗体在阻断表达Cx43的滑膜细胞内由OA诱导的半通道开放中的作用。综上所述，这些结果表明靶向Cx43半通道是一种可以用于减轻OA进展期间关节的分解代谢和炎性环境的治疗策略(图15)。
实施例2-抗Cx43半通道抗体(M1抗体)减轻骨关节炎滑膜炎并阻断Cx43半通道开放和炎性基因表达
染料摄取测定。将细胞与0.1mM溴化乙锭(EtBr，MW 394Da)和1mg/ml FITC-葡聚糖(MW 10kDa)的混合物一起孵育5分钟。EtBr用作示踪剂来检测半通道活性，FITC-葡聚糖太大而不能通过半通道，但被死亡细胞吸收，因而用作阴性对照。然后用PBS漂洗细胞5次，之后用2％多聚甲醛固定10分钟。在20X荧光显微镜(Keyence,BZ-X710,Osaka,Japan)下捕获荧光场的至少6张显微照片。对于每个图像，使用ImageJ软件(NIH，Bethesda,USA)测量并量化来自至少30个随机细胞的EtBr荧光的平均强度。将实验重复3次，收集的数据以任意单位的像素平均值表示。
RNA分离和实时PCR。根据制造商的说明，使用TRI试剂(Molecular ResearchCenter,Cincinnati,USA)从RAW264.7细胞和SW982细胞中分离总RNA。在通过Nanodrop2000进行RNA定量后，使用高容量RNA到cDNA试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)从1μg总RNA合成cDNA。使用ABI 7900PCR装置(Thermo Fisher Scientific)和SYBRGreen(Biorad,Hercules,USA)以两步方案(94℃持续15秒；60℃持续60秒)进行实时PCR。qPCR数据分析采用ΔΔCT方法。GAPDH用作管家基因对照。实验以三个平行样进行。
结果延迟抗Cx43半通道抗体(M1抗体)处理减轻了OA滑膜炎。测试了延迟施用抗Cx43半通道抗体(M1抗体)是否也能显示出缓解OA进展的效果。不是在手术后立即用抗体处理，而是从DMM手术后10天开始，通过腹膜内注射施用抗Cx43半通道抗体(M1抗体)或盐水，之后分别在手术后25天和40天第二次注射和第三次注射。DMM手术后8周处死小鼠进行组织学检查(图16A)。通过滑膜炎评分量化滑膜增生。结果显示，与盐水处理组相比，抗Cx43半通道抗体(M1抗体)处理组的滑膜炎程度显著降低(图16B和图16C)。
抗Cx43半通道抗体(M1抗体)阻断RAW264.7细胞和SW982细胞中的Cx43半通道开放和炎性基因表达。由于抗Cx43半通道抗体(M1抗体)在体内主要结合至滑膜区，包括滑膜巨噬细胞和成纤维细胞，因此在体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞和人滑膜成纤维细胞SW982细胞，以研究Cx43半通道在炎症状态下的作用。Cx43半通道的活性用EtBr染料摄取测定来确定。分别用脂多糖(LPS)或白介素1β(IL1β)来处理RAW264.7细胞或SW982细胞。如图17所示，LPS和IL1β诱导Cx43半通道开放显著增加，这种增加可以被Cx43E2阻断抗体(2μg/ml)或生胃酮(CBX)消除。接下来，在用LPS处理RAW264.7细胞后，测定在使用或不使用Cx43E2抗体的情况下，MMP3/13、环氧合酶2(COX2)、具有血小板反应蛋白1型基序4的ADAM金属肽酶(Adamts4)和IL6基因的表达(图18)。这些炎性基因表现出由LPS诱导的显著上调，而这些变化在用Cx43E2抗体预处理的细胞中明显降低。此外，在用IL1β处理过的SW982细胞中评价MMP3/13、COX2、Adamts4/5和一氧化氮合酶2(NOS2)基因表达(图19)。Cx43E2阻断抗体显著降低了IL1β处理后这些炎性基因的表达。上述结果证明，Cx43半通道在调节巨噬细胞和滑膜成纤维细胞中的炎性基因表达方面发挥重要作用。
鉴于本公开，本文公开和要求保护的所有方法都可以在没有过度实验的情况下进行和执行。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文描述的方法以及方法的步骤或步骤次序进行变化。更具体地说，显而易见的是，某些化学和生理相关的药剂可以取代本文所描述的药剂，同时将获得相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有这些相似取代和修改被认为处在如由随附权利要求书限定的本发明的精神、范围以及理念内。
序列表
<110> 德克萨斯大学系统董事会(Board of Regents of the University of TexasSystem)
<120> 用于治疗骨关节炎、类风湿性关节炎以及关节和肌腱病症的组合物和方法
<130> 21105.0082P1
<150> US 63/136/753
<151> 2021-01-13
<160> 66
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 384
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 1
gaggttcagc tggagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata tgtactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggggga attaatccta gcaatggtgg tactaacttc 180
aatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagagagggt 300
aacccctact atactatgaa ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagcc 360
aaaacgacac ccccatctgt ctat 384
<210> 2
<211> 128
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Glu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Asn Pro Tyr Tyr Thr Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
<210> 3
<211> 324
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 3
gatattgtga tgacacagac tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300
tcggaggggg gaccaagctg gaaa 324
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys
100 105
<210> 5
<211> 384
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 5
gaggttcagc tggagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata tgtactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggggga attaatccta gcaatggtgg tactaacttc 180
aatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagagagggt 300
aacccctact atactatgaa ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagcc 360
aaaacgacac ccccatctgt ctat 384
<210> 6
<211> 128
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 6
Glu Val Gln Leu Glu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Asn Pro Tyr Tyr Thr Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
<210> 7
<211> 375
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 7
gatattgtga tgacccagac tccatcctcc ctgagtgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagac ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctacggggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaaccgattt cactcttacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga tcatagttat 300
ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaac gggctgatgc tgcaccaact 360
gtatccgcat gcacc 375
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
115 120
<210> 9
<211> 405
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 9
ctggagcagc ctggggctga actggtgagg cctggggctt cagtaatgct gtcctgcaag 60
gcttctggct acatcttcac cacctactgg atgcactggc tgaagcagag gcctggacaa 120
ggccttgact ggattggaga gattagtcct agcaacggtc gttctaatta caataagaag 180
ttcaagagca aggccacact gactgtagac aaatcctcca gcacagccta catgcaactc 240
agcagcctga catctgagga ctctgcggtc tattactgtg cacgattcga cgagggggac 300
ttctggggcc aaggcaccac tctcatagtc tcctcagcca aaacaacagc cccatcggtc 360
tatccactgg cccctgtgtg tggagataca actggctcct cggtg 405
<210> 10
<211> 135
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 10
Leu Glu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Met
1 5 10 15
Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Thr Tyr Trp Met His
20 25 30
Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile Gly Glu Ile
35 40 45
Ser Pro Ser Asn Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Lys Lys Phe Lys Ser Lys
50 55 60
Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu
65 70 75 80
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe
85 90 95
Asp Glu Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Ile Val Ser Ser
100 105 110
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
115 120 125
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
130 135
<210> 11
<211> 324
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 11
gatattgtga tgacacagac tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300
tcggaggggg gaccaagctg gaaa 324
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys
100 105
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Phe Leu Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Lys Arg Asp Pro Cys Pro His Gln Val Asp
1 5 10
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
Leu Ser Ala Val Tyr Thr Cys Lys Arg
1 5
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
ggctacacct tcaccagcta ctat 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
attaatccta gcaatggtgg tact 24
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
acaagagagg gtaaccccta ctatactatg aactac 36
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Thr Arg Glu Gly Asn Pro Tyr Tyr Thr Met Asn Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
ggctacatct tcaccaccta ctgg 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
attagtccta gcaacggtcg ttct 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
gcacgattcg acgaggggga cttc 24
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Gly Tyr Ile Phe Thr Thr Tyr Trp
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Ile Ser Pro Ser Asn Gly Arg Ser
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
Ala Arg Phe Asp Glu Gly Asp Phe
1 5
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 28
cagagtctgt taaacagtgg aaatcaaaag acctac 36
<210> 29
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
ggggcatcc 9
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
cagaatgatc atagttatcc attcacg 27
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
Gly Ala Ser
1
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
aaaagtgtca gtacatctgg ctatagttat 30
<210> 35
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
cttgtatcc 9
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
cagcacatta gggagcttac acg 23
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 38
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
Leu Val Ser
1
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr
1 5
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
aaaagtgtca gtacatctgg ctatagttat 30
<210> 41
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 41
cttgtatcc 9
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
cagcacatta gggagcttac acgt 24
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
Leu Val Ser
1
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg
1 5
<210> 46
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
gagcctctta gaaagcgatg gaaagacata t 31
<210> 47
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 47
ctggtgtct 9
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 48
tggcaaggta cacattttcc gtggacg 27
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 49
Gln Ser Leu Leu Glu Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 50
Leu Val Ser
1
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 51
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 52
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 52
gaggtccaac tccagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata tgtactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggggga attaatccta gcaatggtgg tactaacttc 180
aatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagagagggt 300
aacccctact atactatgaa ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 53
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 53
gaggtccaac tccagcaacc tggggctgaa ctggtgaggc ctggggcttc agtaatgctg 60
tcctgcaagg cttctggcta catcttcacc acctactgga tgcactggct gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgactg gattggagag attagtccta gcaacggtcg ttctaattac 180
aataagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc acgattcgac 300
gagggggact tctggggcca aggcaccact ctcatagtct cctca 345
<210> 54
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 54
gacattgtga tgacgcagtc tccatcctcc ctgagtgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagac ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctacggggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaaccgattt cactcttacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga tcatagttat 300
ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339
<210> 55
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 55
gacattgtgt tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300
tcggaggggg gaccaagctg gaaatcaaac 330
<210> 56
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 56
gatattgtga tgacccagtc tcccgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300
tcggaggggg ggaccaagct ggaaatcaaa 330
<210> 57
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 57
gacgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gaaagcgatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 58
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 58
Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Asn Pro Tyr Tyr Thr Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Met Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Ser Pro Ser Asn Gly Arg Ser Asn Tyr Asn Lys Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Asp Glu Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Ile
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 61
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 61
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Ser Asn
100 105 110
<210> 62
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 62
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 63
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 63
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Gly Tyr Ile Phe Ile Thr Thr Trp
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 66
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys

Claims (48)

1.一种治疗或预防受试者的骨关节炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
2.一种治疗或预防受试者的类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
3.一种治疗或预防受试者的肌腱病症或肌腱损伤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
4.一种治疗或预防受试者的骨关节炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
5.一种治疗或预防受试者的类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
6.一种治疗或预防受试者的肌腱病症或肌腱损伤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
7.一种治疗或预防受试者的骨关节炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
8.一种治疗或预防受试者的类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
9.一种治疗或预防受试者的肌腱病症或肌腱损伤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
10.一种降低MMP13或胶原X水平的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
11.一种减轻受试者的软骨退化的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
12.一种减轻受试者的滑膜炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
13.一种降低MMP13或胶原X水平的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
14.一种减轻受试者的软骨退化的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
15.一种减轻受试者的滑膜炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
16.一种降低MMP13或胶原X水平的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
17.一种减轻受试者的软骨退化的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
18.一种减轻受试者的滑膜炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
19.一种治疗或预防受试者的软骨下骨硬化的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
20.一种治疗或预防受试者的软骨下骨硬化的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
21.一种治疗或预防受试者的软骨下骨硬化的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
22.一种减轻或改善受试者的骨关节炎的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
23.一种减轻或改善受试者的骨关节炎的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
24.一种减轻或改善受试者的骨关节炎的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗连接蛋白43抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：可变重链，所述可变重链包含与SEQ ID NO:58中示出的序列具有至少90％同一性的序列；和可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ ID NO:60中示出的序列具有至少90％同一性的序列。
25.如权利要求1、2、3、7、8、9、10、11、12、16、17、18、19、21或22中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:19的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；
b)包含SEQ ID NO:20的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或
c)包含SEQ ID NO:21的序列的互补决定区(CDR3)或其变体。
26.如权利要求4、5、6、7、8、9、13、14、15、16、17、18、20、21或23中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:31的序列的互补决定区1(CDR1)或其变体；
b)包含SEQ ID NO:32的序列的互补决定区2(CDR2)或其变体；和/或
c)包含SEQ ID NO:33的序列的互补决定区3(CDR3)或其变体。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中与亲本CDR相比，所述重链免疫球蛋白可变区的CDR1、CDR2或CDR3或者所述轻链免疫球蛋白可变区的CDR1、CDR2或CDR3中的任一者包含至少一个氨基酸取代。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述至少一个氨基酸取代是半胱氨酸残基变为另一种氨基酸，或甘氨酸变为另一种氨基酸。
29.如权利要求1、2、3、7、8、9、10、11、12、16、17、18、19、21、22或24中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：
(a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列具有至少60％同一性的序列；
(b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或
(c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列具有至少60％同一性的序列。
30.如权利要求4、5、6、7、8、9、13、14、15、16、17、18、20、21、23或24中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：
(a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列具有至少60％同一性的序列；
(b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列具有至少60％同一性的序列；和/或
(c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列具有至少60％同一性的序列。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的所述抗体或其片段处于编码所述抗体或其片段的表达载体中。
32.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述抗体以药学上可接受的组合物施用。
33.如权利要求1至30或32中任一项所述的方法，其中所述抗体被全身施用。
34.如权利要求1至30或32中任一项所述的方法，其中所述抗体在静脉内、皮内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部施用。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用至少第二治疗剂。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述第二治疗剂是非甾体抗炎药、葡糖胺补充剂、软骨素补充剂或关节置换手术。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段与Cx43半通道结合。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段还包含标签序列。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段抑制或阻断Cx43半通道的开放。
41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述其片段是Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。
42.如权利要求32所述的方法，其中所述药物组合物被冻干。
43.如权利要求7、8、9、16、17、18、21或24中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含：
(a)重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：
i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:19具有至少60％同一性的序列；
ii)第二互补决定区2，其包含与SEQ ID NO:20具有至少60％同一性的序列；和
iii)第三互补决定区3，其包含与SEQ ID NO:21具有至少60％同一性的序列；以及
(b)轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：
i)第一互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:31具有至少60％同一性的序列；
ii)第二互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:32具有至少60％同一性的序列；和
iii)第三互补决定区1，其包含与SEQ ID NO:33具有至少60％同一性的序列。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
45.如权利要求22至24中任一项所述的方法，其中骨关节炎的所述一种或多种症状是疼痛。
46.如权利要求1、2、3、7、8、9、10、11、12、16、17、18、19、21、22或24中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：
(a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:19中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；
(b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:20中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或
(c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:21中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。
47.如权利要求4、5、6、7、8、9、13、14、15、16、17、18、20、21、23或24中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：
(a)互补决定区1(CDR1)，其包含与SEQ ID NO:31中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；
(b)互补决定区2(CDR2)，其包含与SEQ ID NO:32中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列；和/或
(c)互补决定区3(CDR3)，其包含与SEQ ID NO:33中示出的序列相比具有单一氨基酸变化的序列。
48.如权利要求7、8、9、16、17、18、21或24中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含：
(a)重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包含：
i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:19相比具有单一氨基酸变化的序列；
ii)第二互补区2，其包含与SEQ ID NO:20相比具有单一氨基酸变化的序列；和
iii)第三互补区3，其包含与SEQ ID NO:21相比具有单一氨基酸变化的序列；以及
(b)轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包含：
i)第一互补区1，其包含与SEQ ID NO:31相比具有单一氨基酸变化的序列；
ii)第二互补区1，其包含与SEQ ID NO:32相比具有单一氨基酸变化的序列；和
iii)第三互补区1，其包含与SEQ ID NO:33相比具有单一氨基酸变化的序列。
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