CN117363481A - 一种用于实现单细胞电互连的微流控神经芯片、制备方法与检验方法 - Google Patents

一种用于实现单细胞电互连的微流控神经芯片、制备方法与检验方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于实现单细胞电互连的微流控神经芯片、制备方法与检验方法，用于实现单细胞电互连。所述芯片包括：柔性绝缘衬底、微电极阵列、集成了微流控通道的细胞培养腔室和神经网络。微电极阵列在柔性绝缘基底上制备，包括至少4组排布相同的电极区，每个区包括工作电极和参比电极。细胞培养腔室封装在微电极阵列上后，可以定制神经网络的连接。基于与神经网络之间的双向通讯(检测记录与刺激调控)，该微流控神经芯片能够实现非物理连接的神经元之间的电互连，并根据多区神经活动相对关系检验电互连的形成。总的来说，本发明提供了一种微流控神经芯片及其制备方法与检验方法，可用于神经元行为研究、神经网络建模和计算神经元学习等领域。

Description

一种用于实现单细胞电互连的微流控神经芯片、制备方法与 检验方法
技术领域
本公开涉及神经生物学、微纳制造技术和生物电子学等领域，特别是涉及一种用于实现单细胞电互连的微流控神经芯片、制备方法及检验方法。
背景技术
生物神经网络是一个非常复杂的系统，它由神经元和突触等基本单元组成。这些神经元通过突触连接成为网络，形成了大脑中非常复杂的神经电路。在研究生物神经网络的基础上能够发展新的人工神经网络系统，这对于神经科学、人工智能和生物医学等领域都具有很大的意义。生物神经网络产生的信号的主要形式是电生理信号和电化学信号，其中电生理信号常用于神经计算方面的研究之中，因为其可量化，即时性高。微电极阵列可以与生物神经网络之间进行电信号的双向通讯从而实现神经网络与外界环境之间的交互。然而，少有微电极阵列用于实现神经网络与神经网络之间的单细胞电互连，提高不同神经网络间的交互效率。
近年来，神经生物学为我们提供了关于神经元结构、功能和信号传导机制的基本知识，为实现电互连提供了理论基础。基于微纳制造技术使得我们能够精确地制作出高性能的微电极阵列与微流控通道，这为电互连提供了实验平台。但是目前仍缺乏用于实现离体神经网络单细胞电互连的微流控神经芯片与检验神经网络之间电互连形成的方法。为解决这一问题，本发明提供了微流控神经芯片及基于该设备实现多个生物神经网络之间通过微电极阵列实现基于电信号的相互连接并检验单细胞电互连形成的检验方法，从而实现对物理上不连接的神经网络实现超距控制，同时提高神经网络之间的信息交换速度，更有望实现对功能分化的模块化生物神经网络进行可控的组合。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于实现单细胞电互连的微流控神经芯片及其制备方法与检验方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种用于实现单细胞电互连的微流控神经芯片，由柔性绝缘衬底，微电极阵列，集成了微流控通道的细胞培养腔室和定制连接的神经网络组成：
可选地，柔性绝缘衬底包括刚性基板，金属牺牲层，柔性材料层，改性绝缘层。其刚性基板，金属牺牲层可通过腐蚀金属牺牲层去除。可作为微流控神经芯片的衬底，在其改性绝缘层上方进行后续多步加工。
可选地，微纳加工技术制作的微电极阵列在柔性绝缘衬底上加工制造。包括触点，引线和与神经细胞进行双向通讯的电极。触点为284个正方形的导电转接点和4个圆形的导电转接点。所有电极可分为相对几何排布关系相同的4组，每71个所述正方形触点和1个圆形触点为一组，围绕衬底中心按顺时针旋转分布在衬底边缘。电极共包括284个圆形微电极和4个等腰三角形的参比电极。所有电极可分为相对几何排布关系相同的4组，每71个所述工作电极和1个参比电极为一组，围绕衬底中心按顺时针旋转分布在衬底中心位置。所述电极和触点通过引线连接，正方形触点与圆形微电极相连，圆形触点与三角形参比电极相连。
可选地，集成了微流控通道的细胞培养腔室包括4个腔室，其中两个腔室通过微流控通道相连。
可选地，定制连接的神经网络包括4个子神经网络，其中两个子神经网络通过物理互连的微流控通道形成突触连接形成生物互连，另外两个子网络相互独立。
可选地，柔性绝缘衬底的柔性材料层包括PDMS，parylene等具有高度的柔性和透明度和可靠生物相容性的材料。
可选地，工作电极的直径分布在5-30μm，位点间距分布在20-200μm。
可选地，集成了微流控通道的细胞培养腔室半径为2-4cm，隔断不同腔室之间的墙壁厚度为100-350μm。
可选地，刚性基板、金属牺牲层、柔性材料层和改性绝缘层，以上4层按所述顺序依次加工在前一层上方，加工方式包括但不限于热氧化，增强化学气相沉积或等离子体化学气相沉积等。
根据本发明另一方面，提供一种微流控神经芯片的制备方法，包括：
(1)利用食人鱼溶液清洁刚性基板，如石英玻璃片或硅片；
(2)在刚性基板上溅射100nm的铝金属薄膜，作为牺牲层；
(3)通过多次旋涂PDMS或者沉积parylene，形成厚度为30-50μm的，表面厚度均匀的柔性材料层；
(4)通过电感耦合等离子体增强化学气相沉积在柔性材料层沉积200-500nm的二氧化硅对柔性材料层进行改性；
(5)在上述柔性绝缘衬底上利用微加工工艺经过多步光刻溅射金属层，沉积绝缘层制备微电极阵列；
(6)通过高精度3D打印实现PDMS模具的制备；
(7)在模具中灌注未凝固的消泡后的液态PDMS，静置30分钟后放入80℃烘箱；
(8)脱模后的PDMS细胞培养腔室通过激光切割在相邻两个腔室之间的墙壁上形成沟道，沟道宽度为10-200μm，数量为4-10；
(9)利用硅橡胶将上述集成了微流控通道的细胞培养腔室与制备了微电极阵列的柔性绝缘衬底进行封装；
(10)清洁消毒所述微流控微电极阵列并在4个腔室中皆接种神经细胞，生长至21天，在显微镜下确认每个腔室中的神经细胞均形成了神经网络，且微流控通道内存在神经细胞或突触，即物理接连的腔室内的两个神经网络形成了生物上的连接。
本发明的第三方面提供了一种微流控神经芯片实现单细胞电互连的检验方法，包括：
(1)将四个腔室内的神经网络分布命名为A区神经网络，A*区神经网络，B区神经网络，C区神经网络；其中A区神经网络和A*区神经网络通过微流控通道实现物理互连。在显微镜下观察确保A区神经网络和A*区神经网络通过突触形成了生物互连。A区神经网络和B区神经网络；A*区神经网络和C区神经网络分布在调控后形成单细胞电互连。B区神经网络和C区神经网络之前无连接。分别将A区神经网络与A*区神经网络、A区神经网络与B区神经网络、A*区神经网络与C区神经网络、B区神经网络和C区神经网络命名为连接网络AA*、连接网络AB、连接网络A*C、连接网络BC，并作为整体分析；
(2)分别分析4个双神经网络的同步性热图，互信息连接网络，网络爆发放电内的总传递时间；
(3)分别比较4个双神经网络的同步性热图的相似性，互信息连接网络的距离，网络爆发放电内的总传递时间的长短。如果连接网络AB或连接网络A*C与连接网络AA*的相似性显著高于连接网络BC与连接网络AA*的相似性；连接网络AB或连接网络A*C与连接网络AA*的距离显著低于连接网络BC与连接网络AA*的距离；连接网络AB或连接网络A*C的总传递时间显著短于连接网络BC，则确认连接网络AB或连接网络A*C形成了单细胞电互连。
总体来说，本发明提供了一种用于实现单细胞电互连的微流控神经芯片以及基于该设备检验单细胞电互连形成的检验方法。该微流控神经芯片通过实现单细胞电互连从而实现对物理上不连接的神经网络实现超距控制，同时提高神经网络之间的信息交换速度，更有望实现对功能分化的模块化生物神经网络进行可控的组合，形成大规模的具有逻辑结构的生物神经网络。
附图说明
通过以下参照附图对本公开实施例的描述，本公开的上述内容以及其他目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：
图1示意性示出了根据本公开实施例的微流控神经芯片的结构示意图。
图2示意性示出了根据本公开实施例的微流控神经芯片中生物神经网络层的分区和分区间连接关系的示意图，其中，生物神经网络被划分为A，A*，B，C四个子神经网络，A与A*通过突触实现了生物互连；A与B通过双向的模拟神经输入信号转化实现了电互连；A*与C通过单神经元互连对应关系实现了电互连；B与C完全不互连。
图3示意性示出了根据本公开实施例的柔性绝缘衬底的制备流程图。
图4示意性示出了根据本公开实施例的微电极阵列的制备流程图。
图5示意性示出了根据本公开实施例的微流控通道的制备流程图，包括3D打印模具、灌注固化、脱模。
图6示意性示出了根据本公开实施例的微流控神经芯片的工作原理流程图。
图7示意性示出了根据本公开实施例的检验单细胞电互连的三个检验参数的数据分析图。
图中：1、柔性绝缘衬底，2、微电极阵列，3、细胞培养腔室，4、生物神经网络，5、A区神经网络，6、A*区神经网络，7、B区神经网络，8、C区神经网络。
具体实施方式
下面将参照附图来描述本发明的实施例。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本发明实施例的全面理解。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。
在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本发明。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。
本发明提出了一种用于实现单细胞电互连微流控神经芯片的制备方法，并提供了单细胞电互连的检验方法。
实施例1
如图1和图2所示，本发明设计制作了一种基用于实现单细胞电互连微流控神经芯片，主要由柔性绝缘衬底1，微电极阵列2，集成了微流控通道的细胞培养腔室3和定制连接的生物神经网络4组成。微电极阵列2在柔性绝缘衬底1上层；细胞培养腔室3在微电极阵列2上层；生物神经网络4在微电极阵列2上层，微流控通道的细胞培养腔室3内。其中生物神经网络4被划分为四个分区，命名为A区神经网络5，A*区神经网络6，B区神经网络7，C区神经网络8。其中两个子神经网络(A区神经网络5和A*区神经网络6)通过物理互连的微流控通道形成突触连接形成生物互连，另外两个子网络相互独立(B区神经网络7和C区神经网络8)，用于提供具有可塑性的活体生物智能。该神经芯片可以实现物理不互连的神经网络实现单细胞电互连，并检验单细胞电互连的形成。
柔性绝缘衬底1包括刚性基板，金属牺牲层，柔性材料层，改性绝缘层。其中，柔性材料层选用厚度为30-50μm的PDMS，parylene等具有高度的柔性和透明度和可靠生物相容性的材料，制备流程如图3所示。该方法例如可以包括：
(1)利用食人鱼溶液清洁刚性基板，如石英玻璃片或硅片。得到清洁过的刚性基板A；
(2)在刚性基板上溅射100nm的铝金属薄膜，作为牺牲层。得到溅射了铝金属层的刚性基板B；
(3)通过多次旋涂PDMS或者沉积parylene，形成厚度为30-50μm的，表面厚度均匀的柔性材料层。得到旋涂了多层PDMS的柔性基板C；
(4)通过电感耦合等离子体增强化学气相沉积在柔性材料层沉积200-500nm的二氧化硅对柔性材料层进行改性。得到沉积了二氧化硅改性的柔性基板D。
微电极阵列2包括触点，引线和与神经细胞进行双向通讯的电极。触点为284个正方形的导电转接点和4个圆形的导电转接点。所有电极可分为相对几何排布关系相同的4组，每71个所述正方形触点和1个圆形触点为一组，围绕衬底中心按顺时针旋转分布在衬底边缘。电极共包括284个圆形微电极和4个等腰三角形的参比电极。所有电极可分为相对几何排布关系相同的4组，每71个所述工作电极和1个参比电极为一组，围绕衬底中心按顺时针旋转分布在衬底中心位置。所述电极和触点通过引线连接，正方形触点与圆形微电极相连，圆形触点与三角形参比电极相连。加工前需要根据实际尺寸在L-edit软件中设计光刻掩膜版，包括金属层和绝缘层，其中金属层包括电极，触点以及相连导线。制备流程如图4所示。该方法例如可以包括：
a)在柔性绝缘衬底上均匀旋涂光刻胶(例如选择正性光刻胶AZ1500)；
b)通过光刻对绝缘基底上的电极，引线以及触点进行曝光从而图案化；
c)通过合适浓度的氢氧化钠溶液(0.6wt％～1wt％)清除曝光的部分从而实现显影；
d)在旋涂了光刻胶的柔性基底上先溅射用于粘附的Cr种子层，再溅射Au薄膜层。具体厚度本公开不做限制，例如溅射30nm的Cr种子层及250nm的Au薄膜层。溅射后剥离未曝光的残留有光刻胶的部分；
e)制备绝缘层，采用等离子体化学气相沉积沉积二氧化硅，氮化硅或复合绝缘层，例如沉积300nm的二氧化硅或400nm的氮化硅；
f)在绝缘层上均匀旋涂光刻胶(例如选择正性光刻胶AZ1500)；
g)通过光刻对绝缘基底上的电极以及触点进行曝光从而图案化；
h)通过反应离子刻蚀去除电极和触点上方的绝缘层，暴露电极和触点。
最后对微电极阵列进行清洗，去除残留的光刻胶以及其它有机物，得到可进行下一步加工的微电极阵列。
集成了微流控通道的细胞培养腔室包括4个腔室，其中两个腔室通过微流控通道相连，用于控制神经网络的物理结构的定制。制备流程如图4所示。加工前需要根据实际尺寸在SolidWorks软件中设计腔室的高度和面积，形状排布等，然后利用3D打印制造模具，再通过灌注成型。制备流程如图5所示。该方法例如可以包括：
(1)通过高精度3D打印实现PDMS模具的制备；
(2)在模具中灌注未凝固的消泡后的液态PDMS，静置30分钟后放入80℃烘箱；
(3)脱模后的PDMS细胞培养腔室通过激光切割在相邻两个腔室之间的墙壁上形成沟道，沟道宽度为10-200μm，数量为4-10。
神经网络包括4个子神经网络，其中两个子神经网络通过物理互连的微流控通道形成突触连接形成生物互连，另外两个子网络相互独立，接种密度均不少于106个/cm3。神经芯片的制备包括利用硅橡胶将上述集成了微流控通道的细胞培养腔室与制备了微电极阵列的柔性绝缘衬底进行封装，然后需要清洁消毒所述器件并在4个腔室中皆接种神经细胞，生长至21天，在显微镜下确认每个腔室中的神经细胞均形成了神经网络，且微流控通道内存在神经细胞或突触，即物理接连的腔室内的两个神经网络形成了生物上的连接。
实施例2
以下以离体海马神经网络为例对本发明提出的用于实现单细胞电互连的微流控神经芯片进行性能测试，控制物理不互连的神经网络形成电互连并检验电互连的形成。具体步骤如下：
(1)基于离体海马神经网络的神经芯片的制备。海马神经网络是从怀孕15.5天的ICR胎鼠的大脑海马获得。步骤如下：怀孕15.5天的ICR孕鼠安乐死后，75％酒精浸泡消毒。消毒后的手术器械剪开腹部皮肤，取出胚胎。在体视显微镜下小心剥离脑组织，收集大脑皮层。收集的组织用0.1％胰酶，37℃消化10min。消化结束后轻轻吹打组织，使细胞脱落，收集细胞于新的离心管中，1000g离心5min。培养基重悬细胞，计数，按照1×106个/ml接种于微电极阵列中心区域(微电极阵列提前用PDL预包被，0.1mg/ml，室温包被10min，包被结束后双蒸水清洗3次，晾干)，接种30min后向微电极阵列中补充1ml neurobasal plus培养基继续培养。之后每三天进行一次半换液，培养到21天时，微电极阵列上形成了成熟的神经网络。将四个腔室内的神经网络分布命名为A区神经网络，A*区神经网络，B区神经网络，C区神经网络；其中A区神经网络和A*区神经网络通过微流控通道实现物理互连。在显微镜下观察确保A区神经网络和A*区神经网络通过突触形成了生物互连。此时，图1所示的神经芯片才确认为制备完成。
(2)神经芯片的检测记录与刺激调控。电生理检测仪器使用BlackrockMicrosystems公司的Cerebus信号采集系统。首先，由微电极感知电极附近的神经活动；紧接着，微电极阵列将检测到的神经信号经过自制的信号放大器传输到检测仪器中；最后，通过仪器将电生理检测仪器中的模拟信号转化为数字信号，显示在电脑上的采集软件中，并通过自制的python脚本实现动作电位发放时刻的导出，以便进行刺激调控信号的转换。电刺激仪器使用双通道神经电刺激仪(Multichannel)，其刺激序列通过自制的python脚本生成，包括两种生成策略，包括将记录到的神经放电信号直接转化为模拟神经输入的信号，以及通过生物互连的A区神经网络和A*区神经网络解码获得的单神经元互连对应关系将记录到的神经放电信号间接转化为模拟神经输入的信号。相应的信息流方向以及工作原理如图6所示，具体来说：
通过检测模块，A区神经网络，A*区神经网络，B区神经网络，C区神经网络等四个神经网络能够被同时检测。而刺激模块能够调控A区神经网络，B区神经网络，C区神经网络等三个神经网络。
对于A区神经网络和B区神经网络，对两个神经网络同时进行检测和调控。调控A区神经网络的刺激信号是将B区神经网络的记录信号转化为模拟神经输入信号获得，延迟为1s；调控B区神经网络的刺激信号是将A区神经网络的记录信号转化为模拟神经输入信号获得，延迟为1s。双向调控至A区神经网络和B区神经网络形成稳定的单细胞电互连。
对于A*区神经网络和C区神经网络，对两个神经网络同时进行检测。结合A区神经网络和A*区神经网络的记录信号获得单神经元互连对应关系，并通过单神经元互连对应关系将A*区神经网络的记录信号转化为模拟神经输入信号，并作为C区神经网络的刺激信号。单向调控至A*区神经网络和C区神经网络形成稳定的单细胞电互连。
(3)检验单细胞电互连的形成。在完成多区神经网络的检测和调控之后，需要对神经电生理信号进行分析以确定单细胞电互连的形成，具体步骤包括：
分别将A区神经网络和A*区神经网络；A区神经网络和B区神经网络；A*区神经网络和C区神经网络；B区神经网络和C区神经网络命名为连接网络AA*；连接网络AB；连接网络A*C；连接网络BC，并作为整体分析。
分别分析4个双神经网络的同步性热图，互信息连接网络，网络爆发放电内的总传递时间。
分别比较4个双神经网络的同步性热图的相似性，互信息连接网络的距离，网络爆发放电内的总传递时间的长短。如果连接网络AB或连接网络A*C与连接网络AA*的相似性显著高于连接网络BC与连接网络AA*的相似性；连接网络AB或连接网络A*C与连接网络AA*的距离显著低于连接网络BC与连接网络AA*的距离；连接网络AB或连接网络A*C的总传递时间显著短于连接网络BC，则确认连接网络AB或连接网络A*C形成了单细胞电互连。
本实施例中，如图7所示，分析了A区神经网络的同步性热图，互信息连接网络，网络爆发放电内的总传递时间。A区神经网络共有20个有效的神经元，同步性热图体现了20个神经元相互之间的同步性。根据神经元之间的互信息，观察到神经元之间形成了具有多个超节点的网络结构。该A区神经网络网络爆发放电内的总传递时间为0.14s。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于实现单细胞电互连的微流控神经芯片，其特征在于，由柔性绝缘衬底(1)，微纳加工技术制作的微电极阵列(2)，集成了微流控通道的细胞培养腔室(3)和定制连接的神经网络(4)组成；
所述柔性绝缘衬底(1)包括刚性基板、金属牺牲层、柔性材料层和改性绝缘层；优选地其刚性基板、金属牺牲层可通过腐蚀金属牺牲层去除；所述柔性绝缘衬底(1)可作为微流控神经芯片的衬底，在其改性绝缘层上方进行后续多步加工；
所述微纳加工技术制作的微电极阵列(2)在柔性绝缘衬底(1)上加工制造，优选地，所述微电极阵列(2)包括触点，引线和与神经细胞进行双向通讯的电极，触点为284个正方形的导电转接点和4个圆形的导电转接点；优选地所有电极可分为相对几何排布关系相同的4组，每71个所述正方形触点和1个圆形触点为一组，围绕衬底中心按顺时针旋转分布在衬底边缘；电极共包括284个圆形微电极和4个等腰三角形的参比电极；优选地所有电极可分为相对几何排布关系相同的4组，每71个所述工作电极和1个参比电极为一组，围绕衬底中心按顺时针旋转分布在衬底中心位置；所述电极和触点通过引线连接，正方形触点与圆形微电极相连，圆形触点与三角形参比电极相连；所述微电极阵列是微流控神经芯片的信号转换核心，实现信息输入和信号读出；
所述集成了微流控通道的细胞培养腔室(3)包括4个腔室，其中两个腔室通过微流控通道相连，用于控制神经网络的物理结构的定制，另外两个腔室分别与其它腔室物理隔离；
所述定制连接的神经网络(4)组成包括4个子神经网络，其中两个子神经网络通过物理互连的微流控通道形成突触连接形成生物互连，另外两个子网络相互独立，用于提供具有可塑性的活体生物智能。
2.根据权利要求1所述的微流控神经芯片，其特征在于，所述柔性绝缘衬底的柔性材料层为聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚对二甲苯(parylene)具有柔性、透明度和生物相容性的材料。
3.根据权利要求1所述的微流控神经芯片，其特征在于，所述工作电极的直径分布在5-35μm，位点间距分布在20-200μm。
4.根据权利要求1所述的微流控神经芯片，其特征在于，所述集成了微流控通道的细胞培养腔室半径为2-4cm，隔断不同腔室之间的墙壁厚度为100-350μm。
5.根据权利要求1所述的微流控神经芯片，其特征在于，所述定制连接的神经网络是基于细胞培养技术的，是海马神经网络、皮层神经网络等单脑区神经元构成的单神经网络，或者是由干细胞分化形成的单神经网络，或者是不同种类神经元构成的混合神经网络。
6.根据权利要求1所述的微流控神经芯片，其特征在于，所述芯片通过对神经信号双向的记录和调控，应用于实现单细胞电互连。
7.根据权利要求2所述的微流控神经芯片，其特征在于，所述的柔性绝缘衬底的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用食人鱼溶液清洁刚性基板，如所述基板为石英玻璃片或硅片；
(2)在刚性基板上溅射至少100nm的铝金属薄膜，作为牺牲层；
(3)通过多次旋涂PDMS或者沉积parylene，形成厚度为30-50μm的，表面厚度均匀的柔性材料层；
(4)通过电感耦合等离子体增强化学气相沉积在柔性材料层沉积200-500nm的二氧化硅对柔性材料层进行改性。
8.根据权利要求4所述的微流控神经芯片，其特征在于，所述的集成了微流控通道的细胞培养腔室的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过3D打印实现PDMS模具的制备；
(2)在模具中灌注未凝固的消泡后的液态PDMS，静置30分钟后放入80℃烘箱；
(3)脱模后的PDMS细胞培养腔室通过激光切割在相邻两个腔室之间的墙壁上形成沟道，沟道宽度为10-200μm，数量为4-10。
9.一种基于权利要求1-7任一项所述微流控神经芯片的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)制备柔性绝缘衬底；
(2)在上述柔性绝缘衬底上利用微加工工艺经过多步光刻溅射金属层，沉积绝缘层制备微电极阵列；
(3)制备集成了微流控通道的细胞培养腔室；
(4)利用硅橡胶将上述集成了微流控通道的细胞培养腔室与制备了微电极阵列的柔性绝缘衬底进行封装；
(5)清洁消毒所述微流控微电极阵列并在4个腔室中皆接种神经细胞，生长至21天，在显微镜下确认每个腔室中的神经细胞均形成了神经网络，且微流控通道内存在神经细胞或突触，即物理接连的腔室内的两个神经网络形成了生物上的连接。
10.一种基于权利要求1-8任一项所述微流控神经芯片实现单细胞电互连的检验方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将四个腔室内的神经网络分布命名为A区神经网络，A*区神经网络，B区神经网络，C区神经网络；其中A区神经网络和A*区神经网络通过微流控通道实现物理互连；在显微镜下观察确保A区神经网络和A*区神经网络通过突触形成了生物互连；A区神经网络和B区神经网络；A*区神经网络和C区神经网络分布在调控后形成单细胞电互连；B区神经网络和C区神经网络之前无连接；分别将A区神经网络与A*区神经网络、A区神经网络与B区神经网络、A*区神经网络与C区神经网络、B区神经网络与C区神经网络命名为连接网络AA*、连接网络AB、连接网络A*C、连接网络BC，并作为整体分析；
(2)分别分析4个双神经网络的同步性热图，互信息连接网络，网络爆发放电内的总传递时间；
(3)分别比较4个双神经网络的同步性热图的相似性，互信息连接网络的距离，网络爆发放电内的总传递时间的长短；如果连接网络AB或连接网络A*C与连接网络AA*的相似性显著高于连接网络BC与连接网络AA*的相似性，连接网络AB或连接网络A*C与连接网络AA*的距离低于连接网络BC与连接网络AA*的距离且利用配对t检验进行统计分析后具有统计显著性，连接网络AB或连接网络A*C的总传递时间短于连接网络BC且利用配对t检验进行统计分析后具有统计显著性，则确认连接网络AB或连接网络A*C形成了单细胞电互连。
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