CN115216405A - 一种多层级联的神经网络微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多层级联的神经网络微流控芯片及其制备方法，涉及传感器制造技术。该芯片系统由用于电生理检测与调控的微电极阵列芯片和用于分区培养神经元网络的微流控芯片构成，微电极阵列芯片包括微电极、对电极等部件；微流控芯片包括多个细胞培养槽、多组连接培养槽的微沟道以及突触控制室等部件。本发明芯片集成化，具备分区域培养不同神经元网络的功能和同时空检测与调控神经元网络的能力，不同区域的神经元网络在相连的微通道中形成定向互连，可简单模拟大脑神经网络之间的连接关系；通过突触控制室可以实现对突触进行精确调控；底部的微电极可以用于检测神经元网络受到刺激调控后电活动的变化。

Description

一种多层级联的神经网络微流控芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物传感器的微加工领域以及生物细胞培养与检测领域，是一种多层级联的神经网络微流控芯片及其制备方法。
背景技术
大脑是地球上最为复杂的结构体，大脑除了可感知外部世界，控制机体的反射活动外，还具有语言、学习、记忆和思维等高级功能。然而，人类对大脑功能的认知还十分有限。因此，深入了解大脑的复杂结构，对人类了解大脑并进而开发大脑具有十分重要的意义。
神经电生理学研究是评价大脑功能的重要途径之一。而微加工技术制备的微电极阵列为神经电生理信息的记录和调控提供了一种高信噪比、高通量的手段，是研究神经科学、神经网络发育、神经信息编码、传导、响应和存储的机制研究、神经性疾病的治疗研究以及高通量药物筛选和神经药理学研究等众多领域中的重要研究工具。因此，将微电极阵列用于体外神经元网络电生理信息的检测已经成为理解大脑一些简单功能和潜在神经机制的重要手段。
然而，现在对大脑功能的基本原理的理解仍是神经生理学研究中的一大重要挑战，由于高度的连通性，因此在大脑水平上进行这项研究会带来很高的复杂性。相反，单个或几个神经元的水平不能提供足够的功能连接。从这个意义上讲，体外对神经元网络的研究成为了解大脑高级功能最基本原理的途径之一。
基于微加工技术制备的微流控芯片可以精细化的制作出微小的流体结构，使得体外定制设计神经网络的连接成为可能。这为体外构建大脑的连接关系提供了方法。近年来，将微流控芯片与微电极阵列组合的神经芯片，因其具备检测与调控定制网络的神经电生理信息的能力，在研究脑神经机理上取得了重要成果。
发明内容
本发明的目的是提供一种多层级联的神经网络微流控芯片及其制备方法。该芯片通过微流控的方法在微电极阵列上培养五个相对独立神经元网络，不同神经元网络之间通过微沟道产生突触连接，从而实现不同神经元网络之间的信息传递，并且通过突触控制室可以对微沟道中两个不同神经元网络之间形成的突触进行化学和物理上的调控。微流控芯片下的微电极阵列可以实现对这些神经元网络电生理动力学的评价，从而了解神经元网络之间的神经信息的传递及功能的实现。这些发明使得该芯片能够在实现大脑不同脑区的体外简单模拟，对了解神经元网络信息传递，进而认识大脑的高级功能的基本原理有重要意义。
为实现这一目的，本发明采用如下技术方案：
一种多层级联的神经网络微流控芯片，包括两层子芯片：第一层子芯片和第二层子芯片，其中第一层子芯片为第一层微电极阵列芯片，第二层子芯片为第二层微流控芯片；第一层微电极阵列芯片包括：绝缘基底、多个微电极、对电极、连接导线、接触位点及绝缘层；所述绝缘基底(1)是整个神经网络微流控芯片的载体；微电极(2)分四组，微电极位于微沟道(8)的两侧；每组微电极(2)周围都设有对电极(3)；对电极(3)和微电极(2)均通过连接导线(4)延伸并连接到绝缘基底外围的接触位点(5)；所有连接导线(4)表面均覆盖有绝缘层(6)；
第二层微流控芯片包括：五个细胞培养槽、四组用于连接不同细胞培养槽的微沟道以及一组用于调控突触的突触控制室；突触控制室(9)能够用于对微沟道(8)中的生长的突触进行化学或物理学上的调控造模；在键合工艺下完成所述芯片的微电极阵列芯片与微流控芯片的封装。
所述两层子芯片为第一层微电极阵列芯片和第二层微流控芯片。
所述绝缘基底是整个神经网络微流控芯片的载体；微电极分四组，微电极位于微沟道的两侧；每组微电极周围都设有对电极；对电极和微电极均通过连接导线延伸并连接到绝缘基底外围的接触位点；所有连接导线表面均覆盖有绝缘层。
所述微流控芯片中的五个细胞培养槽用于培养神经细胞，并通过微沟道进行连接。而突触控制室可用于对微沟道中的生长的突触进行化学或物理学上的调控造模。
所述的一种多层级联的神经网络微流控芯片，所述微电极阵列芯片，绝缘基底的材料选用石英玻璃；微电极的材料是具备生物相容性的导电薄膜，可以为金、铂、氮化钛、铟锡氧化物和纳米线其中之一；绝缘层所使用材料为具备生物相容性的绝缘材料，为二氧化硅、氮化硅和SU8之一。
所述的一种多层级联的神经网络微流控芯片，所述微电极直径为5μm-30μm，微电极间距为50-500μm。
所述的一种多层级联的神经网络微流控芯片，所述微流体芯片的五个细胞培养槽(7)相互独立，仅通过宽度约5-15μm，高度约5-15μm的微沟道(8)相连接，因此可以将培养在不同细胞培养槽(7)的神经元网络可以看作仅通过轴突与树突相连接的独立神经元网络，可将其简单模拟成大脑中的独立网络。
所述的一种多层级联的神经网络微流控芯片，所述的第二层微流控芯片的材质是具有生物相容性的聚甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
所述的一种多层级联的神经网络微流控芯片，所述的第二层微流控芯片的细胞培养槽(7)为圆孔，直径为4-8mm；微沟道(8)分四组，每组10-30条沟道，长度400-900μm，用于连接细胞培养槽。
所述的一种多层级联的神经网络微流控芯片，所述的第二层微流控芯片的突触控制室(9)有大小不同的两个圆形调控室，直径为1-4mm，两者通过一条宽为20-50μm的沟道相连接。
所述的一种多层级联的神经网络微流控芯片，第一层微电极阵列芯片与第二层微流控芯片通过加热键合或者等离子键合的方式在对准仪器上将两个芯片进行贴合。
本发明还提供一种制备如上任一项所述的神经网络微流控芯片的方法，包括制备第一层微电极阵列芯片和制备第二层微流控芯片；
制备第一层微电极阵列芯片，包括如下步骤：
(1)清洗玻璃基底，获得表面清洁的绝缘基底(1)；
(2)在经过清洗过的绝缘基底(1)上旋涂一层光刻胶，厚度为1-2μm，光刻显影后形成微电极(2)、对电极(3)、连接导线(4)和接触位点(5)的图案；
(3)在光刻胶图案化的表面通过溅射沉积一层铂导层；可选地可预先溅射钛种子层，用于增加导电层基底的粘附性；
(4)采用剥离工艺在有机溶剂中去除多余的导电层，留下所需的微电极(2)、对电极(3)、连接导线(4)和接触位点(5)；
(5)通过等离子体增强的化学气相沉积的方法在基底上沉积氧化硅或氮化硅绝缘层(6)；
(6)通过光刻和等离子束刻蚀的方法，暴露出微电极(2)、对电极(3)和接触位点(5)，保留所有连接导线(4)表面覆盖的绝缘层；
制备第二层微流控芯片，包括如下步骤：
(1)在经过清洗过的硅片上旋涂光刻胶，图形化出用于后续光刻的对准标记，接着通过溅射铂在硅片上生成对准标记；
(2)采用光刻胶通过光刻的工艺在硅片上光刻出微沟道(8)；
(3)在硅片上光刻出细胞培养槽(7)与突触控制室(9)；
(4)光刻完毕后，在热板上加热完成坚模工艺，获得制作好的模具；
(5)将PDMS预聚物和催化剂混合倒入装模具的培养皿中，在真空干燥器中去除气泡后，加热固化；
(6)将微流控器件从模具中分离，并用打孔器在微流控器件中制作出细胞培养槽(7)与突触控制室(9)。
进一步地，所述方法还包括如下步骤：将第一层微电极阵列芯片与第二层微流控芯片在氧离子清洁机中进行表面活化；活化后在对准仪器中间第一层微电极阵列芯片与第二层微流控芯片对齐获得最终的神经网络微流控芯片。
所述的一种多层级联的神经网络微流控芯片的试验方法，具体步骤如下：
(a)选择怀孕15-18天的ICR(Institute of Cancer Research)小鼠通过颈椎脱位安乐死，用75％酒精消毒孕鼠的腹部皮肤，然后用手术到去除子宫并放入预冷的HBSS缓冲液中。剥离胎鼠，剪下头部放入预冷的HBSS缓冲液。小心分离海马脑区，去除脑膜并切碎。
(b)剥离胎鼠的海马脑区置于DMEM缓冲液中解离15分钟。使用移液枪头轻轻吹打组织使其分散。收集缓冲液的上清液，在离心机中离心5分钟。用Neurobasal Plus Medium重悬细胞并使用血细胞计数器对重悬的细胞进行计数。
(c)将神经细胞分别接种在所述芯片的不同细胞培养槽(7)上，神经细胞在体外培养2-3周，让相邻细胞培养槽(7)的轴树突在微沟道中形成突触连接以后进行电生理的检测。
本发明提供的一种多层级联的神经网络微流控芯片及其制备方法，结合了微电极阵列和微流控的技术，能够在体外构建按照个人想法连接的神经元网络群，并且每个神经元网络内部相对独立，通过微电极阵列可以检测不同神经元网络之间的神经信息的流向。芯片还具备对突触区域精确控制与检测的功能，通过对突触控制区加入化学或物理刺激可以体外模拟突触损伤类连接的神经元网络。因此，本发明为大脑提供一个简化模型，对了解神经元网络信息传递，进而认识大脑的高级功能的基本原理有重要价值。
附图说明
为了使本发明的目的、特点和优势更加清楚，下面结合图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为本发明一种多层级联的神经网络微流控芯片的结构示意图；
图2为本发明一种多层级联的神经网络微流控芯片的第一层芯片微电极阵列芯片结构示意图；
图3为本发明一种多层级联的神经网络微流控芯片的第一层芯片微电极阵列芯片局部放大图；
图4为本发明一种多层级联的神经网络微流控芯片的第二层芯片微流控芯片结构示意图；
图5为本发明一种集成微流控、微电极阵列的类脑功能第二层芯片微流控芯片平面示意图；
图6为本发明一种多层级联的神经网络微流控芯片的局部发大图；
图7为本发明多层级联的神经网络微流控芯片的第一层微电极阵列芯片的制备方法工艺流程图；
图7a为清洗石英玻璃片；
图7b为石英玻璃片表面涂覆AZ1500型光刻胶；
图7c为光刻AZ1500型光刻胶暴露出导电层图形；
图7d为溅射Ti/Pt导电层；
图7e为采用lift-off工艺形成导电层图形留下所需电极、引线及触点示意图；
图7f为PECVD沉积氧化硅和氮化硅；
图7g为刻蚀绝缘层获得微电极阵列芯片；
附图标号说明：
a为微电极阵列芯片，b为微流控芯片。
1为绝缘基底，2为微电极，3为对电极、4为连接导线、5为接触位点、6为绝缘层，7为细胞培养槽、8为微沟道，9为突触控制室。
具体实施方式
以下结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步描述。以下实施例不构成对本发明的限定。
如图1、2和4为所示，本发明提供的一种多层级联的神经网络微流控芯片。整个芯片系统包括两层子芯片：第一层子芯片和第二层子芯片；其中第一层子芯片为第一层微电极阵列芯片，第二层子芯片为第二层微流控芯片。
第一层微电极阵列芯片a包括：绝缘基底1、多个微电极2、对电极3、连接导线4、接触位点5及绝缘层6。
第二层微流控芯片b包括：五个细胞培养槽7、四组用于连接不同细胞培养槽的微沟道8以及一组用于调控突触的突触控制室9。
绝缘基底1为玻璃基底。微电极2、对电极3、连接导线4、接触位点5、绝缘层6、细胞培养槽7、微沟道8以及突触控制室9设置在绝缘基底1上。微沟道8为微流控芯片沟道。突触控制室9为微流控芯片的突触控制室。
如图2、3所示，石英玻璃绝缘基底1是整个芯片系统的载体，厚度约为1.5mm，长度约为5cm，宽度约为5cm。微电极2分四组。微电极2在石英玻璃绝缘基底1的中央区域并分布于每组微沟道8的附近(图6)，微电极2通过连接导线4连接到基底外围的接触位点5，微电极的直径约为20μm。微沟道8两侧的每组微电极2附近都设有对电极3。对电极3通过连接导线4延伸并连接到绝缘基底外围的接触位点5。所有连接导线4表面均覆盖有绝缘层6。
如图4、5所示，所述第二层微流控芯片的细胞培养槽7为圆孔，细胞培养槽7是由于培养神经元网络的主体，其直径为4mm。五个细胞培养槽7用于培养神经细胞。微沟道8宽度约5-15μm，高度约5-15μm。
微沟道8用于连接不同的细胞培养槽7进而实现不同神经元网络之间产生定向连接。微沟道8分四组，每组10-30条沟道，长度400-900μm，用于连接细胞培养槽。所述微流体芯片的五个细胞培养槽7相互独立，仅通过微沟道8相连接，因此可以将培养在不同细胞培养槽7的神经元网络可以看作仅通过轴突与树突相连接的独立神经元网络，可将其简单模拟成大脑中的独立网络。
例如，相邻的细胞培养槽7之间有20条微沟道，微沟道长、宽和高分别为600μm、10μm和5μm。突触控制室9由孔径为2μm和1.5μm一大一小两个圆孔与一条宽度为50μm的沟道组成，一大一小两个圆孔通过所述的一条宽度为50μm的沟道相连接。如图5所示，突触控制室9的沟道位于中央的细胞培养槽7和与中央细胞培养槽相连接的一个外围的细胞培养槽的微沟道8之间，突触控制室9的沟道距离中央和其中一个外围的细胞培养槽分别为200μm和400μm。突触控制室9能够用于对微沟道8中的生长的突触进行化学或物理学上的调控造模。如图6所示，微电极阵列芯片a与微流控芯片b在对准键合后，微电极阵列芯片a上的微电极2分四组，每组31个分布在微流控芯片b的微沟道8附近。具体分布状况如下：距离微沟道8两端100μm的沟道内各分布8个微电极2，每个微电极2中心之间的间距为50μm，共16个；微沟道8两侧分布15个电极。
所述微电极阵列芯片，微电极2的材料是具备生物相容性的导电薄膜，可以为金、铂、氮化钛、铟锡氧化物和纳米线其中之一。绝缘层6所使用材料为具备生物相容性的绝缘材料，为二氧化硅、氮化硅和SU8之一。
所述第二层微流控芯片的材质是具有生物相容性的聚甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
第一层微电极阵列芯片与第二层微流控芯片通过加热键合或者等离子键合的方式在对准仪器上将两个芯片进行贴合。
神经网络微流控芯片制备可以分为两个部分：第一层微电极阵列芯片的制备和第二层微流控芯片的制备。
本发明的第一层微电极阵列芯片a部分具体制备过程如图7，详细描述如下：
1.在进行工艺前，现有食人鱼液体清洗尺寸为5*5cm2玻璃绝缘基底1，获得表面清洁的绝缘基底1(图7a)。
2.在石英玻璃片表面旋涂一层正性光刻胶AZ1500，厚度1.5μm，光刻显影后形成掩模板上所有微电极2、对电极3、连接导线4及接触位点5的图案(图7b-c)。
3.在光刻胶图案表面溅射一层厚度30nm的Cr金属种子层，以增加Au导电薄膜层与硅片基底的粘附性，接着溅射250nm的Au薄膜层(图7d)。
4.采用剥离工艺去除多余的Cr/Au薄膜层，留下所需微电极2、对电极3、连接导线4及接触位点5(图7e)。
5.通过等离子体增强的化学气相沉积的方法在制备好Au薄膜层的基底表面沉积氧化硅或氮化硅绝缘层。氧化硅绝缘层的厚度为300nm。氮化硅绝缘层厚度为500nm。最后，通过光刻和SF6等离子刻蚀方法，暴露出微电极2、对电极3、以及接触位点5，保留所有连接导线4表面的绝缘层(图7f-g)。
本发明的第二层微流控芯片b部分具体制备过程的详细描述如下：
1.在经过食人鱼液体清洗过的4寸硅片上旋涂厚度为1-2μm AZ1500光刻胶图，通过后续的光刻显影工艺图案化出对准标记的图形，接着把铂溅射到硅片上形成后续工艺的对准标记；
2.采用SU8 5型光刻胶通过光刻的工艺在硅片上光刻出10μm左右的微沟道8；
3.采用SU8 2100型光刻出100μm左右的细胞培养槽7和突触控制室9；
4.光刻完毕后，在175摄氏度的热板上加热2h完成坚模工艺，获得制作好的模具；
5.将PDMS预聚物和催化剂(道康宁184；道康宁184硅橡胶是由液体组分组成的双组分套件产品，包括基本组分与固化剂；所述PDMS预聚物指的是基本组分，所述催化剂指的是固化剂)按重量比10:1混合倒入装模具的培养皿(康宁corning直径150mm)中，在真空干燥器中去除气泡后放入80摄氏度烘箱中进行固化。
6.用道具将微流控器件从模具中分离，并用打孔器在微流控器件中制作出细胞培养槽7与突触控制室9，得到PDMS微流控芯片。
完成上述工艺后，我们将所述微电极阵列芯片a与PDMS微流控芯片b在氧离子清洁机中进行表面活化1分钟。活化后在对准仪器中间所述微电极阵列芯片a与PDMS微流控芯片b对齐获得最终的神经网络微流控芯片。
一种多层级联的神经网络微流控芯片的使用步骤如下：
1.在使用芯片之前，将去离子水加到细胞培养槽7中，接着在相连细胞培养槽7中通过气泵抽取空气，使得去离子水充入微沟道8中；
2.去除芯片中的去离子水，并加入多聚赖氨酸溶液到细胞培养槽7中，等待溶液充满微沟道8后，等待多聚赖氨酸给表面改性30min后，去除溶液。
3.将原代神经元细胞溶液分辨加入到不同的细胞培养槽7，培养3-7以后，不同细胞培养槽神经模块的轴突和树突会在微沟道8中形成功能连接。
实施例1：
从怀孕15-18天的ICR大鼠的胚胎中获取分离的原代皮层兴奋性神经元和γ-氨基丁酸(GABA)抑制性神经元，将原代皮层兴奋性神经元培养在本发明芯片周边的四个细胞培养槽7中，将GABA抑制性神经元培养在本发明芯片中心的细胞培养槽7中。神经元在CO2培养箱培养2-3周后，体外的神经元网络开始成熟。
神经元网络成熟后，可以使用美国blackrock公司的128通道电生理检测仪对神经元进行电生理学检测。神经元网络检测实验可以分为以下几个步骤：
1.在未加入任何调控的稳定状态下，记录各个细胞培养槽的神经元网络的电生理动力学特性；
2.在芯片周边的一个细胞培养槽中加入对神经元有兴奋性刺激的谷氨酸(Glu)，在加入后持续记录该细胞培养槽、中心细胞培养槽与加入Glu细胞培养槽相对的培养槽的神经元网络的电生理特性。着重关注兴奋性信号在不同神经元网络之间的传递情况，与中心抑制性神经元网络如何处理兴奋性信号并将其传递到下一级神经元网络；
3.使用双通道点设立电刺激仪在芯片周边的一个细胞培养槽的微电极上施加频率为1Hz或50Hz，幅度为300mV的双极型电刺激。通过记录电刺激后的神经元网络的电生理动力学评价神经元的可塑性，并通过分析微沟道两端的微电极检测到的神经元放电特征来计算本发明两相邻神经元网络的信息的传递时间与效率。
本实施例可以在体外模拟大脑不同神经元网络之间的神经信息的传递。
实施例2：
从怀孕15-18天的ICR大鼠的胚胎中获取原代海马神经元，将原代海马神经元培养在本发明芯片细胞培养槽7中。神经元在体外培养2-3周后，体外的神经元网络开始成熟。
神经元网络成熟后，可以对其进行电生理学检测。神经元网络检测实验可以分为以下几个步骤：
1.在未加入任何调控的稳定状态下，记录各个细胞培养槽的神经元网络的电生理动力学特性；
2.在突触控制室9中加入神经抑制物质(如GABA等)，通过突触控制室的微沟道流到两个细胞培养槽连接的微沟道中并抑制两个神经元网络的神经信息交互。
本实施例可以在评价体外模拟大脑神经元网络损伤前后的电生理动力学的变化，进而为神经损伤、退化性疾病的治疗提供基础。
以上实施例只是为了起到说明目的，并非对本发明的限制，在上述说明的基础上，可以对本发明做出许多改进和改变，所做改进和改变，以及选用其他功能材料的方法均应包括在本发明权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多层级联的神经网络微流控芯片，其特征在于，所述神经网络微流控芯片包括两层子芯片：第一层子芯片和第二层子芯片，其中第一层子芯片为第一层微电极阵列芯片，第二层子芯片为第二层微流控芯片；
第一层微电极阵列芯片包括：绝缘基底(1)、多个微电极(2)、对电极(3)、连接导线(4)、接触位点(5)及绝缘层(6)；所述绝缘基底(1)是整个神经网络微流控芯片的载体；微电极(2)分四组，微电极位于微沟道(8)的两侧；每组微电极(2)周围都设有对电极(3)；对电极(3)和微电极(2)均通过连接导线(4)延伸并连接到绝缘基底外围的接触位点(5)；所有连接导线(4)表面均覆盖有绝缘层(6)；
第二层微流控芯片包括：五个细胞培养槽(7)、四组用于连接不同细胞培养槽的微沟道(8)以及一组用于调控突触的突触控制室(9)；所述微流控芯片中的五个细胞培养槽(7)用于培养神经细胞；突触控制室(9)能够用于对微沟道(8)中的生长的突触进行化学或物理学上的调控造模；
在键合工艺下完成所述芯片的微电极阵列芯片与微流控芯片的封装。
2.根据权利要求1所述的神经网络微流控芯片，其特征在于：所述绝缘基底(1)的材料选用石英玻璃；
微电极(2)的材料是具备生物相容性的导电薄膜，优选地所述微电极(2)的材料是为金、铂、氮化钛、铟锡氧化物和纳米线其中之一；
绝缘层(6)所使用材料为具备生物相容性的绝缘材料，优选地绝缘层(6)所使用材料为二氧化硅、氮化硅和SU8之一。
3.根据权利要求1所述的神经网络微流控芯片，其特征在于：所述微电极直径为5μm-30μm，微电极间距为50-500μm。
4.根据权利要求1或3所述的神经网络微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的五个细胞培养槽(7)相互独立，仅通过宽度5-15μm，高度5-15μm的微沟道(8)相连接，因此可以将培养在不同细胞培养槽(7)的神经元网络可以看作仅通过轴突与树突相连接的独立神经元网络，可将其模拟成大脑中的独立网络。
5.根据权利要求1或3所述的神经网络微流控芯片，其特征在于：所述第二层微流控芯片的材质是具有生物相容性的聚甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
6.根据权利要求1所述的神经网络微流控芯片，其特征在于：所述第二层微流控芯片的细胞培养槽(7)为圆孔，直径为4-8mm；微沟道(8)分四组，每组10-30条沟道，长度400-900μm，用于连接细胞培养槽。
7.根据权利要求1所述的神经网络微流控芯片，其特征在于：所述第二层微流控芯片的突触控制室(9)有大小不同的两个圆形调控室，直径为1-4mm，两者通过一条宽为20-50μm的沟道相连接。
8.根据权利要求1所述的神经网络微流控芯片，其特征在于：第一层微电极阵列芯片与第二层微流控芯片通过加热键合或者等离子键合的方式在对准仪器上将两个芯片进行贴合。
9.制备如权利要求1-8任一项所述的神经网络微流控芯片的方法，其特征在于，包括制备第一层微电极阵列芯片和制备第二层微流控芯片；
制备第一层微电极阵列芯片，包括如下步骤：
(1)清洗玻璃基底，获得表面清洁的绝缘基底(1)；
(2)在经过清洗过的绝缘基底(1)上旋涂一层光刻胶，厚度为1-2μm，光刻显影后形成微电极(2)、对电极(3)、连接导线(4)和接触位点(5)的图案；
(3)在光刻胶图案化的表面通过溅射沉积一层铂或金导层；可选地可预先溅射钛种子层，用于增加导电层与基底的粘附性；
(4)采用剥离工艺在有机溶剂中去除多余的导电层，留下所需的微电极(2)、对电极(3)、连接导线(4)和接触位点(5)；
(5)通过等离子体增强的化学气相沉积的方法在基底上沉积氧化硅或氮化硅绝缘层(6)；
(6)通过光刻和等离子束刻蚀的方法，暴露出微电极(2)、对电极(3)和接触位点(5)，保留所有连接导线(4)表面覆盖的绝缘层；
制备第二层微流控芯片，包括如下步骤：
(1)在经过清洗过的硅片上旋涂光刻胶，图形化出用于后续光刻的对准标记，接着通过溅射铂在硅片上生成对准标记；
(2)采用光刻胶通过光刻的工艺在硅片上光刻出微沟道(8)；
(3)在硅片上光刻出细胞培养槽(7)与突触控制室(9)；
(4)光刻完毕后，在热板上加热完成坚模工艺，获得制作好的模具；
(5)将PDMS预聚物和催化剂混合倒入装模具的培养皿中，在真空干燥器中去除气泡后，加热固化；
(6)将微流控器件从模具中分离，并用打孔器在微流控器件中制作出细胞培养槽(7)与突触控制室(9)。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：完成上述工艺后，将第一层微电极阵列芯片与第二层微流控芯片在氧离子清洁机中进行表面活化；活化后在对准仪器中间第一层微电极阵列芯片与第二层微流控芯片对齐获得最终的神经网络微流控芯片。
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