CN117358327A - 易读取的肿瘤细胞检测装置、微流控芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了易读取的肿瘤细胞检测装置、微流控芯片及其制备方法，其中微流控芯片包括进样单元、检测单元、动力提供单元以及废液回收单元。所述动力提供单元包括若干与所述检测单元连接的毛细管提供液体流动的动力。本申请所提供的易读取的肿瘤细胞检测装置包括箱体，箱体上设有结果读取窗；箱体内设有至少一个检测单元，所述检测单元用于放置微流控芯片。读取窗上用于放置智能手机取色分析。本申请无需外部泵和控制设备来控制液体流动，检测结果读取方便，便携性好，对设备、经验等要求较低，有利于推广。
Description
技术领域
本申请涉及肿瘤细胞检测技术领域，特别涉及易读取的肿瘤细胞检测装置、微流控芯片及其制备方法。
背景技术
目前的肿瘤诊断方法大多依赖于昂贵的大型设备，同时繁琐的操作方法以及需要专业的技术人员进行检测等原因限制了其在快速护理点(POC)诊断中的实际适用性，尤其是在资源匮乏的地区。近年来，微流控芯片技术的飞速发展极大地推动了 CTC 检测技术的进步。但是，目前微流控芯片操作过程繁琐、装置复杂且需要额外的外部泵、连接器和控制设施配合来完成检测，此外，目前微流控芯片检测结果的读取通常还需要一定的专业知识，不利于在市场上大规模推广。
侧流免疫测定法(LFIA)技术是一种结合了色谱分析和免疫反应原理的固相免疫层析技术，具有操作简便、检测快速、携带方便等特点，已广泛应用于临床诊断、药物检测、环境污染等领域。之前的研究表明，在资源有限的国家和地区，LFIA装置可以从广泛的样本中检测到病原体。然而，LFIA分析装置的检测目标通常是DNA、RNA或蛋白质，不适合用于肿瘤细胞的检测。因此，有必要开发一种具备快速、简单、相对经济且可以广泛使用的循环细胞检测设备，来满足临床上对及时诊断和治疗监测以改善患者生存质量的要求。
结直肠癌作为一种常见的胃肠道恶性疾病，在早期没有症状往往很难被检测，目前临床上仅能检出晚期继发性肿瘤，在肿瘤早期阶段确诊对肿瘤确诊并进行治疗干预是降低死亡率和提高生活质量的最有效方法。
循环肿瘤细胞（CTCs）是从实体瘤原发病灶、复发灶或转移灶脱落，通过血液或淋巴系统进入血液循环的肿瘤细胞，是肿瘤转移发展的主要原因，对患者进行CTC检测可以动态监测患者肿瘤发生和进展，有助于实现早诊断早治疗的目的。
发明内容
本申请提供了易读取的肿瘤细胞检测装置、微流控芯片及其制备方法，所提供的易读取的肿瘤细胞检测装置及微流控芯片的优点是无需外部泵和控制设备来控制液体流动，检测结果读取方便，便携性好，对设备、经验等要求较低，有利于推广。
一方面，本申请提供一种微流控芯片，包括：
进样单元，所述进样单元具有入口，所述进样单元内用于加入待检测的样品或信号放大基质；
检测单元，所述检测单元与所述进样单元连接；
动力提供单元，所述动力提供单元包括若干与所述检测单元连接的毛细管；
以及废液回收单元，所述废液回收单元与所述动力提供单元连接，所述废液回收单元具有出口。
进一步的，所述检测单元包括第一腔室和第二腔室，所述第一腔室和第二腔室之间设有连接通道连通，所述第一腔室的一端与所述进样单元连接，所述第一腔室和第二腔室均与动力提供单元连接。
进一步的，所述动力提供单元包括第一毛细管组和第二毛细管组，第一毛细管组和第二毛细管组分别与检测单元中的第一腔室和第二腔室连接。
进一步的，所述废液回收单元包括第一回收腔室和第二回收腔室，所述第一回收腔室和第二回收腔室上均具有出口，所述第一回收腔室和第二回收腔室分别与所述动力提供单元中的第一毛细管组和第二毛细管组连接。
进一步的，所述第一腔室和第二腔室内设有若干三角形微柱，所述第一腔室内的三角形微柱上修饰可与待测目标肿瘤细胞特异结合的抗体，所述第二腔室内的三角形微柱上修饰强阳离子聚电解质，待检测样本中利用修饰了特异性识别抗体的CoPt3探针标记肿瘤细胞。
进一步的，所述第二毛细管组用于提供动力，使得放入进样单元中的待检测样品能够依次经过第一腔室和第二腔室流至第二毛细管组；
所述第一毛细管组用于提供动力，使得放入进样单元中的信号放大基质能够从进样单元中经第一腔室流至第一毛细管组。
另一方面，本申请提供一种肿瘤细胞检测方法，利用如上述方案中所述的微流控芯片进行检测，包括如下步骤：
样品预处理：将外周循环血/粪便样本、CoPt3探针和缓冲液一起加入离心管，孵育30分钟后用磁铁分离CoPt3探针和CoPt3探针-循环肿瘤细胞复合物，然后用缓冲液洗涤两到三次，最后加入缓冲液200ul；
进样检测：保持第二回收腔室出口通畅，使第二毛细管组处于打开状态，用封口膜堵住第一回收腔室出口，使第一毛细管组关闭；将预处理好的样品滴加到进样单元入口，样品在毛细管作用力下自动流过检测单元，并依次流过第一腔室和第二腔室；第一腔室作为检测线，第二腔室作为对照线，此过程中检测线三角形微柱上的抗体与样品中循环肿瘤细胞表面蛋白结合，实现了循环肿瘤细胞的识别与捕获，对照线上的强阳离子聚电解质与CoPt3探针发生物理吸附；
信号放大：当样品流出对照线后，关闭第二毛细管组，打开第一毛细管组，将信号放大基质滴加到进样口；
检测：待信号放大基质充满检测单元的检测线和对照线，等待五分钟，根据检测线的颜色深浅程度进行直观的可视化定性检测分析，对照线的颜色用于判断该次检测是否有效，或利用图像采集设备获取颜色信息进行分析。
另一方面，本申请提供一种微流控芯片的制备方法，用于制备如上述方案所述的微流控芯片，包括如下步骤：
绘制微流控芯片的通道并打印在两张黑色胶片上，其中一张胶片上包括进样通道和上层的免泵毛细管通道，另外一张胶片上包括第一腔室和第二腔室以及下层的免泵毛细管通道；
利用黑色胶片、光刻胶SU-8以及紫外曝光机通过软光刻技术在半径为10cm的硅片上制备主模；
用聚二甲基硅氧烷PDMS预聚物与固化剂以10:1的质量比混合，将PDMS混合物倒在主模上，然后在80°C下固化120分钟形成PDMS基片；
将制备的PDMS基片从主模上揭下并在进样入口和两个免泵毛细管泵出口处打孔，对捕获微柱表面进行聚乙二醇修饰以增加芯片内部通道的亲水性，用异丙醇洗涤微柱3次以去除通道内部残留的聚乙二醇，4℃冷却1小时；
将制备好的PDMS基片放入等离子清洗机处理1分钟后按照接口进行对齐贴合经等离子处理后进行键合得到微流控芯片；
利用将抗体和强阳离子聚电解质分别注入对检测线和对照线腔室，置于冰箱中孵育12小时后用磷酸缓冲液清洗烘干备用进行处理。
另一方面，本申请提供一种易读取的肿瘤细胞检测装置，包括箱体，箱体上设有结果读取窗；箱体内设有至少一个检测单元，所述检测单元用于放置如上述方案中所述的微流控芯片，所述微流控芯片放入箱体内后，检测模块位于读取窗正对的位置。
进一步的，所述箱体上设有遮光板，所述读取窗上用于目视观察或放置图像采集设备。
综上所述，本申请的有益效果有：
1．本申请提供的微流控芯片，无需外接泵和控制设备控制液体流动，无需大型仪器配合，结构更加简单，降低检测成本，对设备以及人员操作等要求降低，有利于推广，且检测结果容易读取；
2．本申请对肿瘤的检测流程简单，易于掌握，有利于对肿瘤细胞的快速筛查，以确定是否需要进一步的准确病理检查，极大地提高了POC诊断效率；
3．本申请提供的易读取的肿瘤细胞检测装置，整体体积紧凑，便于携带，可以简化操作流程、节约时间、降低成本。
附图说明
图1是本申请肿瘤细胞检测的原理示意图；
图2是本申请微流控芯片的示意图；
图3是本申请微流控芯片中检测单元的示意图；
图4是本申请微流控芯片中动力提供单元的示意图；
图5是本申请易读取的肿瘤细胞检测装置的示意图一，其中，微流控芯片位于箱体内；
图6是本申请易读取的肿瘤细胞检测装置的示意图二，其中，微流控芯片被拉出箱体外。
图中，1-放置单元；2-遮光板；3-读取窗；4-进样单元；5-检测单元；6-动力提供单元；7-废液回收单元；8-样品毛细管泵出口；9-信号毛细管泵出口；10-连接通道；11-进样入口。
实施方式
下面结合附图详细说明本申请的具体实施方式。
在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“ 设置”应做广义理解，例如，可以是固定相连、设置，也可以是可拆卸连接、设置，或一体地连接、设置。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例：本申请实施例提供一种微流控芯片，参考1-5，微流控芯片三层聚二甲基硅氧烷PDMS键合而成，包括进样单元4、检测单元5、动力提供单元6以及废液回收单元7。
所述进样单元具有入口，所述进样单元内用于加入待检测的样品或信号放大基质。
所述检测单元与所述进样单元连接；所述检测单元包括第一腔室和第二腔室，所述第一腔室和第二腔室之间设有连接通道10连通，所述第一腔室的一端与所述进样单元连接，所述第一腔室和第二腔室均与动力提供单元连接。其中，第一腔室用作检测线，第二腔室用作对照线。
所述动力提供单元包括若干与所述检测单元连接的毛细管，毛细管包括第一毛细管组和第二毛细管组，第一毛细管组和第二毛细管组分别形成第一毛细管泵和第二毛细管泵。第一毛细管组和第二毛细管组分别与检测单元中的第一腔室和第二腔室连接。
所述废液回收单元与所述动力提供单元连接，所述废液回收单元具有出口。废液回收单元包括第一回收腔室和第二回收腔室，所述第一回收腔室和第二回收腔室上均具有出口，所述第一回收腔室和第二回收腔室分别与所述动力提供单元中的第一毛细管组和第二毛细管组连接。
所述第一腔室和第二腔室内设有若干三角形微柱，所述第一腔室内的三角形微柱上修饰可与待测目标肿瘤细胞特异结合的抗体，所述第二腔室内的三角形微柱上修饰强阳离子聚电解质，，待检测样本中利用修饰了特异性识别抗体的CoPt3探针标记肿瘤细胞。
所述第二毛细管组用于提供动力，使得放入进样单元中的待检测样品能够依次经过第一腔室和第二腔室流至第二毛细管组，第二毛细管泵为样品样品毛细管泵；样品毛细管泵出口8与对照线连接。所述第一毛细管组用于提供动力，使得放入进样单元中的信号放大基质能够从进样单元中经第一腔室流至第一毛细管组，第一毛细管泵为信号毛细管泵，信号毛细管泵出口9与检测线连接，且连接点位于进样单元连接点相对一侧。
足够纤细的毛细管通道中溶液在表面张力作用下能自发的从进样口流动到出样口进而提供液体流动的动力。
本申请另一实施例提供一种肿瘤细胞检测方法，利用如上述方案中所述的微流控芯片进行检测，参考图1，包括如下步骤：
样品预处理：将外周循环血/粪便样本、CoPt3探针和缓冲液一起加入离心管，孵育30分钟后用磁铁分离CoPt3探针和CoPt3探针-循环肿瘤细胞复合物，然后用缓冲液洗涤两到三次，最后加入缓冲液200ul；利用CoPt3探针标记透明质酸抗体，待测样本中细胞与透明质酸结合形成CoPt3-细胞复合物。
进样检测：保持第二回收腔室出口通畅，使第二毛细管组处于打开状态，用封口膜堵住第一回收腔室出口，使第一毛细管组关闭；将预处理好的样品滴加到进样单元入口，样品在毛细管作用力下自动流过检测单元，并依次流过第一腔室和第二腔室；第一腔室作为检测线，第二腔室作为对照线，此过程中检测线三角形微柱上的抗体与样品中循环肿瘤细胞表面蛋白结合，实现了循环肿瘤细胞的识别与捕获，对照线上的强阳离子聚电解质与CoPt3探针发生物理吸附；在检测线三角微柱上修饰了抗体，利用抗体与细胞表面蛋白的相互作用实现肿瘤细胞的识别，在对照线三角微柱上修饰了强阳离子聚电解质，利用带负电的CoPt3探针与之发生物理吸附作用实现CoPt3探针的捕获。
信号放大：当样品流出对照线后，关闭第二毛细管组，打开第一毛细管组，将信号放大基质滴加到进样口（信号放大基质为H2O2和多巴胺）；信号放大原理：通过CoPt3的过氧化物酶活性，催化多巴胺生成聚多巴胺实现信号放大功能，聚多巴胺(PDA)具有良好的细胞粘附性能和生物相容性，并且其黑色可以提供强烈的视觉信号，可以提高检测结果可靠性。阴性样本在检测过程中由于缺少目标肿瘤细胞，检测线内无法捕获到细胞，CoPt3探针全部在对照线被捕获，只有对照线出现棕色至黑色信号。阳性样本在检测过程中目标肿瘤细胞与CoPt3探针形成CoPt3-细胞复合物并被检测线微柱捕获，多余的CoPt3探针被对照线微柱捕获，所以检测线和对照线均出现信号，因此，当对照线不出现信号时，无论检测线是否出现信号，该次测试均为无效。
检测：待信号放大基质充满检测单元的检测线和对照线（信号放大基质从检测单元底部进样入口11流入检测线和对照线腔室，待两个腔室充满溶液后从位于腔室顶部的通道流出至信号毛细管泵出口9），等待五分钟，根据检测线的颜色深浅程度进行直观的可视化定性检测分析，对照线的颜色用于判断该次检测是否有效，或利用图像采集设备获取颜色信息进行分析。
本申请另一实施例提供一种微流控芯片的制备方法，用于制备如上述方案所述的微流控芯片，包括如下步骤：
利用AutoCAD软件绘制微流控芯片的通道并打印在两张黑色胶片上，其中一张胶片上包括进样通道和上层的免泵毛细管通道，另外一张胶片上包括第一腔室和第二腔室以及下层的免泵毛细管通道；
利用黑色胶片、光刻胶SU-8以及紫外曝光机通过软光刻技术在半径为10cm的硅片上制备主模；
用聚二甲基硅氧烷PDMS预聚物与固化剂以10:1的质量比混合，将PDMS混合物倒在主模上，然后在80°C下固化120分钟形成PDMS基片；
将制备的PDMS基片从主模上揭下并在进样入口和两个免泵毛细管泵出口处打孔，对捕获微柱表面进行聚乙二醇修饰以增加芯片内部通道的亲水性，用异丙醇洗涤微柱3次以去除通道内部残留的聚乙二醇，4℃冷却1小时；
将制备好的PDMS基片放入等离子清洗机处理1分钟后按照接口进行对齐贴合经等离子处理后进行键合得到微流控芯片；
利用将抗体和强阳离子聚电解质分别注入对检测线和对照线腔室，置于冰箱中孵育12小时后用磷酸缓冲液清洗烘干备用进行处理。。
本申请另一实施例提供一种易读取的肿瘤细胞检测装置，参考图5-6，包括箱体，箱体上设有结果读取窗3；箱体内设有三个检测单元1，所述检测单元用于放置如上述方案中所述的微流控芯片，微流控芯片为抽拉设置，所述微流控芯片放入箱体内后，检测模块位于读取窗正对的位置。
箱体为暗箱，所述箱体上设有遮光板2，遮光板保持检测过程中暗箱内亮度始终一致以减少误差。所述读取窗上用于目视观察或放置图像采集设备。图像采集设备为智能手机，通过智能手机取色软件对检测线颜色进行分析以得到更准确的数据。
以上所述的仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (10)
1.一种微流控芯片，其特征在于，包括：
进样单元，所述进样单元具有入口，所述进样单元内用于加入待检测的样品或信号放大基质；
检测单元，所述检测单元与所述进样单元连接；
动力提供单元，所述动力提供单元包括若干与所述检测单元连接的毛细管；
以及废液回收单元，所述废液回收单元与所述动力提供单元连接，所述废液回收单元具有出口。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述检测单元包括第一腔室和第二腔室，所述第一腔室和第二腔室之间设有连接通道连通，所述第一腔室的一端与所述进样单元连接，所述第一腔室和第二腔室均与动力提供单元连接。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述动力提供单元包括第一毛细管组和第二毛细管组，第一毛细管组和第二毛细管组分别与检测单元中的第一腔室和第二腔室连接。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述废液回收单元包括第一回收腔室和第二回收腔室，所述第一回收腔室和第二回收腔室上均具有出口，所述第一回收腔室和第二回收腔室分别与所述动力提供单元中的第一毛细管组和第二毛细管组连接。
5.根据权利要求2、3或4所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一腔室和第二腔室内设有若干三角形微柱，所述第一腔室内的三角形微柱上修饰可与待测目标肿瘤细胞特异结合的抗体，所述第二腔室内的三角形微柱上修饰强阳离子聚电解质，待检测样本中利用修饰了特异性识别抗体的CoPt3探针标记肿瘤细胞。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述第二毛细管组用于提供动力，使得放入进样单元中的待检测样品能够依次经过第一腔室和第二腔室流至第二毛细管组；
所述第一毛细管组用于提供动力，使得放入进样单元中的信号放大基质能够从进样单元中经第一腔室流至第一毛细管组。
7.一种肿瘤细胞检测方法，其特征在于，利用如权利要求5或6所述的微流控芯片进行检测，包括如下步骤：
样品预处理：将外周循环血/粪便样本、CoPt3探针和缓冲液一起加入离心管，孵育30分钟后用磁铁分离CoPt3探针和CoPt3探针-循环肿瘤细胞复合物，然后用缓冲液洗涤两到三次，最后加入缓冲液200ul；
进样检测：保持第二回收腔室出口通畅，使第二毛细管组处于打开状态，用封口膜堵住第一回收腔室出口，使第一毛细管组关闭；将预处理好的样品滴加到进样单元入口，样品在毛细管作用力下自动流过检测单元，并依次流过第一腔室和第二腔室；第一腔室作为检测线，第二腔室作为对照线，此过程中检测线三角形微柱上的抗体与样品中循环肿瘤细胞表面蛋白结合，实现了循环肿瘤细胞的识别与捕获，对照线上的强阳离子聚电解质与CoPt3探针发生物理吸附；
信号放大：当样品流出对照线后，关闭第二毛细管组，打开第一毛细管组，将信号放大基质滴加到进样口；
检测：待信号放大基质充满检测单元的检测线和对照线，等待五分钟，根据检测线的颜色深浅程度进行直观的可视化定性检测分析，对照线的颜色用于判断该次检测是否有效，或利用图像采集设备获取颜色信息进行分析。
8.一种微流控芯片的制备方法，其特征在于，用于制备如权利要求3-6任意一项所述的微流控芯片，包括如下步骤：
绘制微流控芯片的通道并打印在两张黑色胶片上，其中一张胶片上包括进样通道和上层的免泵毛细管通道，另外一张胶片上包括第一腔室和第二腔室以及下层的免泵毛细管通道；
利用黑色胶片、光刻胶SU-8以及紫外曝光机通过软光刻技术在半径为10cm的硅片上制备主模；
用聚二甲基硅氧烷PDMS预聚物与固化剂以10:1的质量比混合，将PDMS混合物倒在主模上，然后在80°C下固化120分钟形成PDMS基片；
将制备的PDMS基片从主模上揭下并在进样入口和两个免泵毛细管泵出口处打孔，对捕获微柱表面进行聚乙二醇修饰以增加芯片内部通道的亲水性，用异丙醇洗涤微柱3次以去除通道内部残留的聚乙二醇，4℃冷却1小时；
将制备好的PDMS基片放入等离子清洗机处理1分钟后按照接口进行对齐贴合经等离子处理后进行键合得到微流控芯片；
利用将抗体和强阳离子聚电解质分别注入对检测线和对照线腔室，置于冰箱中孵育12小时后用磷酸缓冲液清洗烘干备用进行处理。
9.一种易读取的肿瘤细胞检测装置，其特征在于，包括箱体，箱体上设有结果读取窗；箱体内设有至少一个检测单元，所述检测单元用于放置如权利要求1-7任意一项所述的微流控芯片，所述微流控芯片放入箱体内后，检测模块位于读取窗正对的位置。
10.根据权利要求9所述的易读取的肿瘤细胞检测装置，其特征在于，所述箱体上设有遮光板，所述读取窗上用于目视观察或放置图像采集设备。
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| CN202311305477.6A CN117358327A (zh) | 2023-10-10 | 2023-10-10 | 易读取的肿瘤细胞检测装置、微流控芯片及其制备方法 |
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2023
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