CN113607704A - 一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，包括以下步骤：步骤1，微流控芯片内的固态试剂预置；步骤2，微流控芯片组装；步骤3，进样；步骤4，免疫反应；步骤5，吹除多余液体；步骤6，光学检测。本发明免除使用清洗液清洗步骤，使操作步骤更加简化，进一步缩短了检测时间，提高了检测效率。相应外部配套液路装置及芯片相应清洗流道相关的设计结构也得到简化，且有效避免了清洗液对免疫反应后复合物的影响，提高了检测结果的稳定性和准确性。该检测方法采用上下磁力交互吸附的混匀反应方式，不仅提高了免疫复合物的特异性结合效率，利于与其他组分相分离，还免除了复合物的清洗步骤，使外部配套检测设备结构大大简化、降低了生产成本。

Description

一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法

技术领域

本发明涉及微流控检测领域，尤其涉及一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法。

背景技术

超顺磁性聚合物微球作为一类新型的固相化载体试剂，其表面的特定化学基团可以与特异性生物分子结合，所得的免疫磁珠可以与相应的靶物质特异性结合，形成新的复合物，通过磁场时，这种复合物可被滞留，并与其它组分相分离。免疫磁珠在磁场中具有超顺磁性和纳米粒子的特性。其超顺磁性使固液分离操作更加简便，省去离心过滤等繁杂的传统操作；而且纳米尺寸的免疫磁珠颗粒小，比表面积大，偶联容量大，悬浮稳定性好，有利于特异性反应的顺利进行，在生物医学如细胞分离，免疫反应以及DNA提取等分析领域中得到了广泛的应用。

常规磁珠技术有着成熟的设计和方法，在生物样品检测有广泛的应用，很多设计已经商品化。但是常规免疫磁珠技术也还存在着如下不足，有待改进：

1)常规磁珠技术中使用常规器皿盛装样品溶液，使用移液器等进行清洗等操作，易引入外源污染物。

2)常规磁珠技术是需要人为操控实验步骤，如取样，清洗等，易引入人为操作失误因素导致实验失败。

3)常规磁珠技术实验平台比较庞大，需要较大的仪器设备，难于集成并微型化，难以实现便携性。

微流控芯片技术是以微管道网络为结构特征，采用微加工技术在几平方厘米大小的芯片上刻蚀出微管道网络和其它功能单元，从而制备出包含进样、反应、分离、检测于一体的快速、高效、低耗的微型分析装置。微流控芯片在检测平台中具有试剂消耗少，反应时间短，自动化程度高的特点。在目前的研究中，芯片的微型化却给前期样品分离和配套集成带来不少困难，同时在样品固定，洗脱等方面也存在不少问题。

磁珠技术结合微流控技术实现一种微分离芯片系统，利用磁珠高效分离的特性以及微流路控制液流进行生物反应，这样制作的微磁部件和微流路器件可用来构建高集成度的免疫检测微系统。同常规磁珠技术相比，有以下优点：

1)器件微小且没有人为操作，试剂消耗量很少。

2)通过设计不同微流路实现在同一芯片中不同试剂的混合反应，减少繁琐的生物实验操作，缩短检测所需时间。

3)微流控芯片可与电路接合实现自动化控制。

4)微流控芯片以及配套检测设备体积小巧，易于便携。

但在现有磁珠技术结合微流控芯片的检测技术中，检测系统虽然在上述优势方向上已做出了较大改进，但还存在如下不足：在免疫反应后的清洗液清洗步骤，使操作依然繁琐，检测时间也相应较长；清洗步骤的实施也使得芯片结构的设计也相对较复杂；并且清洗液的残留也会造成检测结果的不准确。另外，在免疫反应中一般采用超声混合，需相应配备超声发生器，使外部配套检测设备也较为复杂，而且传统超声混匀方式易损伤反应腔底面外壁，影响后续荧光信号的采集。

发明内容

为此，本发明提供了一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，在免疫反应过程中，采用上下磁力交互吸附的混匀反应方式，并且在免疫反应之后免除了清洗液清洗步骤。本发明不仅精简了操作步骤，还使芯片及外部配套检测设备的结构也大大简化，使该检测方法缩短了检测时间、降低了生产成本、检测结果也更加准确和稳定。

为实现上述目的，本发明主要采用以下技术方案：

一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，包括如下步骤：

步骤1，微流控芯片内的固态试剂预置：将所述固态试剂预置于所述微流控芯片的定量-反应腔内，所述固态试剂用于与样本进行特异性结合形成免疫反应复合物；

步骤2，微流控芯片组装：将所述微流控芯片键合为一体；

步骤3，微流控芯片进样：加入待测样本，使所述待测样本进入，将其送至所述定量-反应腔内；

步骤4，微流控芯片内的混匀及免疫反应：在所述微流控芯片的定量-反应腔上部和下部进行上下磁力交互吸附，使所述定量-反应腔内的所述待测样本和所述固态试剂充分混匀，进行免疫反应；

步骤5，吹除定量-反应腔内多余液体：免疫反应结束后，利用磁力吸附的方式固定所述定量-反应腔内的经所述免疫反应形成的免疫反应复合物，并经所述气路装置将多余液体吹除；

步骤6，微流控芯片光学检测：利用光学检测部件读取所述微流控芯片的定量-反应腔中的荧光强度，计算并给出结果。

优选的，步骤1中，所述固态试剂包括免疫磁珠和荧光微球标记抗体。

优选的，步骤1中，所述固态试剂包括免疫磁珠和荧光基团标记抗体。

优选的，步骤2中，所述微流控芯片包括上层芯片，中层芯片以及下层芯片，其通过芯片键合作用将所述固态试剂封装于所述微流控芯片内部。

优选的，步骤4中，所述上下磁力交互吸附通过对电磁铁进行交互通电来实现。

优选的，步骤4中，所述上下磁力交互吸附通过调整磁体与所述微流控芯片的距离来实现。

优选的，所述微流控芯片的定量-反应腔内部进行疏水处理。

优选的，步骤6中，所述检测结果经仪器屏幕进行显示。

优选的，步骤6中，所述检测结果能进行打印或进行数据传输。

优选的，所述微流控芯片包括进样腔、定量-反应腔及废液腔。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：1)该检测方法免除了清洗步骤，精简了操作步骤，缩短了检测时间；2)有效避免清洗液的残留对光路检测的影响，增加了检测结果的准确性和稳定性；3)微流控芯片的结构可不包括必要的清洗液微流道等与清洗步骤相关的结构，使芯片结构更加简化；4)该检测方法采用上下磁力交互吸附的混匀反应方式，不仅提高了免疫反应复合物的特异性结合效率，而且不会损伤定量-反应腔底面外壁，进而不会影响后续荧光信号的采集，还使外部配套检测设备结构大大简化、降低了生产成本。

附图说明

图1为本发明实施例中第一种微流控芯片中层芯片的正面结构示意图；

图2为本发明实施例中第一种微流控芯片中层芯片的背面结构示意图；

图3为本发明实施例中第一种微流控芯片下层芯片的正面结构示意图；

图4为本发明实施例中第二种微流控芯片中层芯片的正面结构示意图；

图5为本发明实施例中第二种微流控芯片中层芯片的背面结构示意图；

图6为本发明实施例中第二种微流控芯片下层芯片的正面结构示意图；

图7为本发明实施例中第二种微流控芯片的分解结构示意图；

图8为本发明实施例中第二种微流控芯片检测时的结构示意图。

附图标号说明：

2.中层芯片；2-1.进样部位；2-1-1.透气孔；2-5.清洗液接口；2-6.显色液接口；2-8.贯通的中层通孔；2-9.中层凹槽；2-10.反应池盖板；3.下层芯片；3-1.全血过滤池；3-2.定量-反应池；3-3.废液池；3-4.清洗液输送支路；3-5.显色液输送支路；6.阀门装置；9-a.第一防回流装置；9-b.第二防回流装置；

上层芯片1′；中层芯片2′；下层芯片3′；进样部位2-1′；透气孔2-1-1′；贯通的中层通孔2-8′；中层凹槽2-9′；反应池盖板2-10′；全血过滤池3-1′；定量-反应池3-2′；废液池3-3′；第一防回流装置9-a′；100.电磁铁；200.第二种微流控芯片。

具体实施方式

下面将结合示意图对本发明的具体实施方式进行更详细的描述。根据下列描述，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。

本发明提供了一种基于磁珠混匀的微流控芯片的检测方法，借助芯片载体和芯片接触装置等配套设备进行检测，在芯片载体上放置微流控芯片，继而经芯片接触装置对芯片实现检测，其中芯片接触装置含有气路装置，带有导电橡胶探头的阀门压点、可调控强磁体。

在一实施方案中，本发明检测中所用的微流控芯片，可以采用现有技术中的芯片结构，即申请人申请的专利号为201710531301.0的中国发明专利中的芯片结构，本实施例中称该芯片结构为第一种微流控芯片。如图1、图2及图3所示，该微流控芯片上设有光路扫描窗口、进样腔、定量-反应腔及废液腔，微流控芯片为三片式结构，由上到下依次层叠上层芯片、中层芯片2及下层芯片3且两两之间均通过定位柱、定位孔配合连接的方式实现相互间的层叠。上层芯片包括进样部位通孔、光路扫描窗口、清洗液接口通孔、显色液接口通孔及上层通气孔。中层芯片2包括与上层进样部位通孔相对应的进样部位2-1、反应池盖板2-10、中层盖板、清洗液接口2-5及显色液接口2-6，其中，进样部位2-1用于对接下层芯片的全血过滤池3-1，其具有环形凹槽和环形凸缘，气源接口置于环形凹槽中，在环形凸缘的端面和紧靠其内壁的锥形过渡面上设有透气孔2-1-1，当进样孔部分2-1通气不畅时，气体可借助透气孔2-1-1继续推动样本前进，进样部位2-1结合上层芯片进样部位通孔和下层芯片3的全血过滤池3-1构成进样腔；反应池盖板2-10位于中层芯片2的背面，用于对接下层芯片3上的定量-反应池3-2以将池口封接以构成定量-反应腔；中层盖板与下层芯片3的废液池3-3对应设置以封接废液池池口构成废液腔，中层盖板包括贯通的中层通孔2-8及中层凹槽2-9。下层芯片3设有全血过滤池3-1、定量-反应池3-2、废液池3-3、清洗液输送支路3-4及显色液输送支路3-5，全血过滤池3-1的出液口通过第一防回流装置9-a与定量-反应池3-2的进液口连通，所述清洗液输送支路3-4的出液口与显色液输送支路3-5的出液口汇聚后经第二防回流装置9-b与定量-反应池3-2的进液口连通，所述定量-反应池3-2与废液池3-3之间的微流控流道上安装有阀门装置6，该阀门装置6包括用于感测流体是否流经阀门装置安装位置的检测机构，该阀门装置6为常开状态，在检测机构所反馈的数值表明流体流经阀门装置6安装位置时能自动闭合，但处于截流状态的阀门装置6能定时打开，使流体在气流作用下流通。其中，全血过滤池3-1对应进样部位2-1设置，能与外接气路连通，池中铺设有全血滤样纸以实现样本过滤，可根据需要进行不同过滤设置，如过滤为血浆或血清；定量-反应池3-2等分成三个隔腔，其中处于中部的隔腔中置放有标记抗体，而处于两侧的隔腔则置放包被抗体(免疫磁珠)，与定量-反应池3-2相对应的反应池盖板2-10等分成两块盖板分体，每块盖板分体中均埋填有包被抗体(免疫磁珠)；废液池3-3具有两个连通的废液池分体，废液池分体a对应中层芯片2的贯通中层通孔2-8，废液池分体b对应中层芯片2的中层凹槽2-9，废液池3-3内置放有吸水纸，废液腔分体a的内壁与吸水纸之间能够形成气流通道，而废液腔分体b具有透气口。

第一种微流控芯片可在本发明的检测方法中使用，也即在不需要重新设计微流控芯片的情况下，可以充分利用现有的芯片也即现有资源进行检测，说明了该检测方法具备良好的适用性。因本发明的检测方法中免除了清洗液的清洗步骤，当结合本发明的检测方法使用第一种微流控芯片时，该芯片中清洗液输送支路及显色液输送支路、相应通孔和接口都不使用。

在另一实施方案中，检测中所用到的微流控芯片，还可使用一种新的微流控芯片，如图4、图5、图6及图7所示，该微流控芯片仅包含进样腔、定量-反应腔、废液腔及之间的相关流道，也即除了不需要与清洗液和显色液相关的接口、流道及相应的防回流装置外，该芯片的其他结构都与第一种微流控芯片结构基本类似，相对于现有技术的芯片，该芯片结构更加简化，也间接降低了设计和加工成本，本实施例中称该芯片结构为第二种微流控芯片200。在此实施例中，该芯片分为三层结构，由上至下层叠为上层芯片1′、中层芯片2′及下层芯片3′。上层芯片1′包括进样部位通孔及上层通气孔。中层芯片2′包括与上层进样部位通孔相对应的进样部位2-1′、透气孔2-1-1′、反应池盖板2-10′、贯通的中层通孔2-8′及中层凹槽2-9′。下层芯片3′设有全血过滤池3-1′、定量-反应池3-2′及废液池3-3′，全血过滤池3-1′的出液口通过第一防回流装置9-a′与定量-反应池3-2′的进液口连通。所述定量-反应池3-2′与所述反应池盖板2-10′形成定量-反应腔，所述废液池3-3′、贯通的中层通孔2-8′与上层芯片对应位置形成废液腔，定量-反应腔与废液腔之间的微流控流道上安装有导电橡胶阀门装置。

现将使用第二种微流控芯片200作为示例来具体说明实施该检测方法的过程，如图8所示，包括如下步骤：

步骤1：微流控芯片200内的固态试剂预置。

在芯片200进样前，需要将固态试剂预置于微流控芯片200的定量-反应腔内，固态试剂包括免疫磁珠和荧光微球标记抗体。在此实施例中是通过封闭液的涂覆和烘干来实现试剂的预置，本封闭液不参与反应，并且能放置荧光标记物以及免疫磁珠，在烘干过程中，其仍能保持生物活性，并避免与微控芯片发生非特异结合。在封闭液烘干后，将免疫磁珠添加至中层芯片2′上的反应池盖板2-10′中，然后，烘干，使免疫磁珠与中层芯片2′固定；将荧光微球标记抗体添加至下层芯片3′上定量-反应池3-2′中，然后，烘干，使荧光微球标记抗体与下层芯片3′固定。在其他实施例中，还可将免疫磁珠和荧光微球标记抗体制备为冻干珠，采用该方式将固态试剂放置于定量-反应腔内。

固态试剂还可采用免疫磁珠和荧光基团标记抗体，区别是取消使用荧光微球，改用荧光基团与抗体连接，荧光微球体积较大，当与样本抗原反应时，因空间位阻较大影响与样本抗原的捕获反应，造成反应不充分，检测结果不准确，将荧光基团直接与抗体连接可扩大与样本抗原的反应效率，能更充分地反应进而提高检测结果的准确性。

步骤2：微流控芯片200组装。

将上层芯片1′、固定有免疫磁珠的中层芯片2′以及固定有荧光标记抗体的下层芯片3′，采用芯片超声键合的方式，依次进行组装合并。

步骤3：微流控芯片200进样。

定量全血样本移至微流控芯片200进样部位内，然后将加样后的微流控芯片200放入外部配套检测设备中。随后，外部配套检测设备中的外接气路装置与芯片进样腔接合，加压空气推动全血样本在全血过滤膜的过滤下，变成血浆/血清，进入全血过滤池3-1′，持续的气压推动血浆/血清沿微流道继续向前流动，经第一防回流装置9-a′、定量-反应腔后流入导电橡胶阀门装置，电容变化致使阀门装置关闭，也即关闭进入废液腔的微流道，同时关闭外接气路，停止加压。

步骤4；微流控芯片内200的混匀及免疫反应。

免疫磁珠、荧光标记抗体复溶，与定量-反应腔中的血浆/血清混匀反应一定时间，此实施例控制为5-10分钟，形成免疫反应复合物。

本发明的混匀方法，在外部配套检测设备中设有可调控强磁体，其位于该芯片200的定量-反应腔上部和下部，本实施例中可调控强磁体使用电磁铁100，通过固定频率的上下交互通电，使定量-反应腔内的反应液在上下磁力交互吸附作用下充分混匀并反应，该可调控强磁体可以是电磁铁100，还可用普通磁力材料来代替，例如普通磁铁，通过调节普通磁铁与芯片之间的距离来控制定量-反应腔内反应液的混匀反应，磁铁距离芯片越远磁力越小，反之磁力越大，其中可调控强磁体相对于芯片的设置位置还可根据需要进行调整。该混匀方法使样本与免疫磁珠、荧光标记抗体反应过程中在上下磁力作用下进行靶物质的特异性结合形成免疫反应复合物，反应效率高，相较于传统超声混匀方法不会损伤定量-反应腔外壁底面而造成划痕，进而不会影响后续荧光信号的采集，有利于提高检测结果的准确性。

步骤5：气路装置吹除多余液体。

免疫反应结束后，经电磁铁吸附定量-反应腔内的样本磁珠标记抗体形成的免疫反应复合物，阀门装置会定时打开也即处于流通状态，同时启动外接气路装置，持续的气压推动微流控芯片200中的多余液体流向废液腔，直至吹干微流道中的液体，此时阀门装置中电容探头感测的电容值恢复至初始值，外接气路装置关闭并撤除电磁铁吸附力。

本发明通过启动外接气路装置进行吹洗，可直接将样本磁珠标记抗体形成的免疫反应复合物从反应液中有效分离，不需要配合清洗液进行反复清洗和吹干，不仅简化了操作步骤节约了时间，还简化了外部配套检测设备和芯片的设计结构，省去了外接液路和芯片内相应的液体流道，降低了生产成本，同时也避免了清洗液残留对光路检测的影响，使检测结果的准确性和稳定性也得到了提高。

另外，为了更好的完成步骤5，微流控芯片200内定量-反应腔的腔室还可以在预置试剂之前也即步骤1之前进行疏水处理，使废液吹出得更简单、彻底。

步骤6：微流控芯片200光学检测。

启动外部配套检测设备光学检测部件，通过定量-反应腔底面外壁读取微流控芯片200上定量-反应腔中的荧光强度，计算并给出结果报告。其中，经过运算，检测结果还可在仪器屏幕上显示，同时对检测结果还可打印或进行数据传输。

第一种微流控芯片在本发明的检测方法中同样适用，当结合本发明的检测方法使用第一种微流控芯片时，该芯片中清洗液输送支路及显色液输送支路、相应通孔和接口都不使用。

根据本发明所公开的上述方法步骤，将其应用于实际临床检测中，通过具体检测样本得出相应检测结果。在临床急性心肌梗死病症检测中，心肌肌钙蛋白I(cTnI)是溶栓治疗血管是否再通的早期敏感指标，血清cTnI在心肌炎症和轻微损伤的判断上具有临床应用价值，其在CABG围手术期心肌损伤的判断方面也是一个灵敏的指标。因此，本发明就cTnI的检测为例，将抗原设置为9个浓度(ng/mL),每个浓度值设置3个平行，加入微流控芯片中，按照上述步骤进行反应10min，对反应后荧光信号值进行检测：

1)当固态试剂为免疫磁珠和荧光微球标记抗体时，其检测数据如下：

2)当固态试剂为免疫磁珠和荧光基团标记抗体时，其检测数据如下：

通过表格中数据可以看出，两种固态试剂的使用中随抗原浓度的增加，荧光信号值均呈现正相关，检测的CV值在15％以内，也即表明该实验稳定性较好，符合产品开发需要。

综上所述，本发明公开了一种基于磁珠混匀的微流控芯片的检测方法，不仅精简了操作步骤，还使芯片结构及外部配套检测设备的结构也大大简化。免除清洗步骤，使操作步骤更加简化，进一步缩短了检测时间，提高了检测效率。因不存在清洗步骤，相应外部配套液路装置及芯片相应清洗流道相关的设计结构都可简化，且有效避免了清洗液对免疫反应后复合物的影响，也提高了检测结果的稳定性和准确性。该检测方法采用上下磁力交互吸附的混匀反应方式，不仅提高了免疫反应复合物的特异性结合效率，利于与其他组分相分离，还免除了复合物的清洗步骤，使外部配套检测设备结构大大简化、降低了生产成本。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，微流控芯片内的固态试剂预置：将所述固态试剂预置于所述微流控芯片的定量-反应腔内，所述固态试剂用于与样本进行特异性结合形成免疫反应复合物；

步骤2，微流控芯片组装：将所述微流控芯片键合为一体；

步骤3，微流控芯片进样：加入待测样本，使所述待测样本进入，将其送至所述定量-反应腔内；

步骤4，微流控芯片内的混匀及免疫反应：在所述微流控芯片的定量-反应腔上部和下部进行上下磁力交互吸附，使所述定量-反应腔内的所述待测样本和所述固态试剂充分混匀，进行免疫反应；

步骤5，吹除定量-反应腔内多余液体：免疫反应结束后，利用磁力吸附的方式固定所述定量-反应腔内的经所述免疫反应形成的免疫反应复合物，并经所述气路装置将多余液体吹除；

步骤6，微流控芯片光学检测：利用光学检测部件读取所述微流控芯片的定量-反应腔中的荧光强度，计算并给出结果。

2.根据权利要求1所述的一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，其特征在于，步骤1中，所述固态试剂包括免疫磁珠和荧光微球标记抗体。

3.根据权利要求1所述的一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，其特征在于，步骤1中，所述固态试剂包括免疫磁珠和荧光基团标记抗体。

4.根据权利要求1所述的一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，其特征在于，步骤2中，所述微流控芯片包括上层芯片，中层芯片以及下层芯片，其通过芯片键合作用将所述固态试剂封装于所述微流控芯片内部。

5.根据权利要求1所述的一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，其特征在于，步骤4中，所述上下磁力交互吸附通过对电磁铁进行交互通电来实现。

6.根据权利要求1所述的一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，其特征在于，步骤4中，所述上下磁力交互吸附通过调整磁体与所述微流控芯片的距离来实现。

7.根据权利要求1所述的一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，其特征在于，所述微流控芯片的定量-反应腔内部进行疏水处理。

8.根据权利要求1所述的一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，其特征在于，步骤6中，所述检测结果经仪器屏幕进行显示。

9.根据权利要求1所述的一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，其特征在于，步骤6中，所述检测结果能进行打印或数据传输。

10.根据权利要求1所述的一种基于磁珠混匀的微流控芯片检测方法，其特征在于，所述微流控芯片包括进样腔、定量-反应腔及废液腔。

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