CN117357521A - 一类氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，本发明的氮杂吲哚化合物在低于10μM浓度下可有效地促进小鼠胚胎成纤维细胞3T3和人包皮成纤维细胞HFF‑1的迁移和运动，提高细胞的侵袭穿透能力，同时，该类化合物对于正常小鼠的伤口愈合给药浓度为30mg/kg，而对于糖尿病小鼠的伤口愈合给药浓度可低至3mg/kg，11d伤口基本愈合，表明本发明的氮杂吲哚化合物可显著提高糖尿病小鼠的伤口愈合能力，加快慢性伤口愈合时间，用于药物中可广泛适用于外伤、烧烫伤、溃疡、皮炎、慢性伤口、分娩、糖尿病患者伤口的愈合。

Description

一类氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用

技术领域

本发明属于制药技术领域，具体涉及一类氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用。

背景技术

皮肤伤口是一种常见的临床症状，伤口愈合问题始终与外科学的发展相伴随，愈合延迟或不愈以及愈合过程中引起许多的并发症都是持久困扰临床的难题。因此，促进伤口顺利愈合和提高创伤患者的生存储质量，一直是外科学研究的重点之一。临床上皮肤伤口修复障碍主要表现为愈合迟缓性皮肤伤口，尽管一些生长因子在促进伤口愈合方面表现出较强的效果，但由于多种生长因子参与伤口愈合的复杂相容性和致癌的可能性，其安全性问题一直是人们关注的焦点。

正常的伤口愈合是一个协调良好的过程，其特征包括四个不同的相互关联阶段：止血、炎症、增殖和重塑，由于各种细胞之间的协调、生长因子和细胞因子的局部释放会影响伤口修复的速度，破坏其一则会导致伤口愈合的延迟。众所周知的，糖尿病患者的伤口愈合速度慢，因此容易导致伤口慢性溃疡的形成。一些研究表明，周围神经病变和微血管疾病是糖尿病患者伤口愈合延迟的重要因素。目前，对于伤口愈合的药物包括异喹啉、黄酮类、生物碱以及一些中草药等，但是对于促进慢性伤口愈合，尤其是糖尿病患者的伤口愈合效果并不明显，Li W等人发表了关于一种植物类黄酮，橙皮苷，可加速链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠皮肤伤口愈合：tgf-β/smads和ang-1/tie-2信号通路的作用(Li W,Kandhare AD,Mukherjee AA,et al.Hesperidin,a plant flavonoid accelerated the cutaneouswound healing in streptozotocin-induced diabetic rats:Role of TGF-β/Smads andAng-1/Tie-2signaling pathways.[J].Excli Journal,2018,17:399-419.)，该研究虽然证实了黄酮类中的橙皮苷具有促进糖尿病大鼠伤口愈合的效果，但是该橙皮苷用量较大，橙皮苷用量为50mg/kg～10IU/kg且需要在16天大鼠的伤口才可基本愈合，其皮肤伤口愈合速度仍然较慢。

因此，综上所述，目前对于慢性伤口愈合药物仍然处于基础研究阶段，因此，亟需提供一种可以加速慢性创口愈合的药物。

发明内容

针对上述现有的技术问题，本发明提供了一类氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，对于慢性伤口包括糖尿病患者伤口愈合有显著的作用。

第一方面，本发明提供了一类氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，所述氮杂吲哚化合物的分子结构通式如式(I)所示：

式中A为碳原子或氮原子，R1为

进一步地，所述A原子选自1个氮原子和3个碳原子。

进一步地，所述R1取代基位于A原子是碳原子的位置上。

更进一步地，所述氮杂吲哚化合物的分子结构如下：

优选地，所述氮杂吲哚化合物为N-1H-吡咯并[2,3-C]吡啶-5-基苯甲酰胺(N-1H-pyrrolo[2,3-c]pyridin-5-ylbenzamide)，化学分子式为C₁₄H₁₁N₃O，CAS号：300586-90-7，该氮杂吲哚化合物的分子结构如式(II)所示(本发明中代号为TS-2790)；

进一步地，所述药物还包括其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物。

进一步地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

进一步地，所述药物的给药途径为口服、注射、涂抹、擦拭或洗涤。

进一步地，所述药物的剂型为混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、凝胶剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、气雾剂或滴剂。

进一步地，所述药物适应症包括外伤、烧烫伤、溃疡、皮炎、慢性伤口、分娩、糖尿病患者伤口。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的氮杂吲哚化合物对人HFF-1细胞和小鼠3T3细胞的毒性很小，在浓度为0～10μM内均可有效地促进小鼠胚胎成纤维细胞3T3和人包皮成纤维细胞HFF-1的迁移和运动，提高细胞的侵袭穿透能力，同时，该类化合物对于正常小鼠的伤口愈合给药浓度为30mg/kg，而对于糖尿病小鼠的伤口愈合给药浓度可低至3mg/kg，表明本发明的氮杂吲哚化合物可显著提高糖尿病小鼠的伤口愈合能力，加快慢性伤口愈合时间，用于药物中可广泛适用于外伤、烧烫伤、溃疡、皮炎、慢性伤口、分娩、糖尿病患者伤口的愈合。

附图说明

图1为氮杂吲哚化合物的结构通式。

图2为本发明氮杂吲哚化合物对人包皮成纤维细胞HFF-1的毒性实验结果。

图3为本发明氮杂吲哚化合物对小鼠胚胎成纤维细胞3T3的毒性实验结果。

图4为本发明氮杂吲哚化合物对人包皮成纤维细胞HFF-1迁移能力影响的实验结果。

图5为本发明氮杂吲哚化合物对人包皮成纤维细胞HFF-1迁移能力影响的统计数据

图6为本发明氮杂吲哚化合物对小鼠胚胎成纤维细胞3T3迁移能力影响的实验结果。

图7为本发明氮杂吲哚化合物对小鼠胚胎成纤维细胞3T3迁移能力影响的统计数据。

图8为本发明氮杂吲哚化合物对人包皮成纤维细胞HFF-1侵袭能力的实验结果。

图9为本发明氮杂吲哚化合物对人包皮成纤维细胞HFF-1侵袭能力影响的统计数据。

图10为本发明氮杂吲哚化合物对小鼠胚胎成纤维细胞3T3侵袭能力影响的实验结果。

图11为本发明氮杂吲哚化合物对小鼠胚胎成纤维细胞3T3侵袭能力影响的统计数据。

图12为本发明氮杂吲哚化合物对正常小鼠伤口的愈合效果的实物图。

图13为本发明氮杂吲哚化合物对正常小鼠伤口愈合影响的统计分析数据。

图14为本发明氮杂吲哚化合物对糖尿病小鼠伤口愈合效果的实物图。

图15为本发明氮杂吲哚化合物对糖尿病小鼠伤口愈合影响的统计分析数据。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例并非用于限制本发明的保护范围。

本发明的氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用中，选择化合物N-1H-吡咯并[2,3-C]吡啶-5-基苯甲酰胺(N-1H-pyrrolo[2,3-c]pyridin-5-ylbenzamide)进行相关促伤口愈合实验，其化学分子式为C₁₄H₁₁N₃O，CAS号：300586-90-7，该氮杂吲哚化合物的分子结构如式(II)所示(本发明的实施例中用TS-2790代替其化学名称书写)；

实施例1化合物TS-2790对3T3、HFF-1细胞生长的影响

(1)实验对象：小鼠胚胎成纤维细胞3T3、人包皮成纤维细胞HFF-1；

(2)实验药物：化合物TS-2790、化合物溶剂DMSO(二甲基亚砜)；

(3)实验方法：

第一天下午铺板：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入90uL，10000个细胞；

第二天早上加药：每孔加入10μL浓度梯度的药物,每个药物浓度设置3个复孔，置于5％CO₂，37℃培养箱孵育；

加药48h后收板：先倒置显微镜下肉眼观察，接着每孔加入20ul MTT溶液(5mg/mL，即0.5％ MTT(噻唑蓝))，孵育4h后终止反应，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；

OD值检测：在酶标仪波长490nm处检测各孔的吸光值，按公式(1)和(2)计算细胞相对存活率或药物抑制率，％；

药物抑制率＝1-相对存活率 (2)

其中本实验设不含细胞的培养基作为空白对照组，每孔加入和化合物相同稀释比的DMSO溶液作为阴性对照组，含化合物TS-2790的实验组。

按上述实验方法和计算方法得到结果见图2和图3，结果表明，TS-2790对人包皮成纤维细胞HFF-1和小鼠胚胎成纤维细胞3T3的毒性很小，IC₅₀分别为52.53μM和167.5μM。

实施例2化合物TS-2790的促细胞迁移实验

(1)实验对象：小鼠胚胎成纤维细胞3T3、人包皮成纤维细胞HFF-1；

(2)实验药物：化合物TS-2790、化合物溶剂DMSO(二甲基亚砜)；

(3)实验方法：

铺板前用marker笔细头在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔，一般划三道线，依次命名为a、b、c线，b线横穿正中央，其他两条等间距划在b线两侧，六孔板铺板，每孔加入2ml含10％FBS(胎牛血清)的完全培养基，2×10⁶个细胞，各设置2个复孔，培养约24h，细胞数量以过夜贴壁能铺满90％以上为宜，适当调整，第二天打开孔板盖子，吸掉旧培养基，直尺垂直b线架在孔板上，用200uL枪头紧贴直尺均匀上下移动制造细胞划痕线，同样，在该线两侧等间距再划两条平行线，从左至右分别命名为线1，线2和线3，用无菌1×PBS(稀释到1倍的磷酸盐缓冲溶液)冲洗细胞3次，去除划下的细胞后，加入含20％FBS(胎牛血清)的完全培养基，再加入化合物TS-2790(工作浓度分别为5μM、10μM)放入37℃，5％CO₂培养箱培养，按加药0h、24h(HFF-1为30h)取样拍照。

按上述实验方法进行细胞划痕实验，得到的结果见附图4至附图7，实验结果表明：与对照组Control(DMSO溶液)相比，经TS-2790处理的细胞的迁移速度明显加快，具有显著的统计学意义(P<0.0001)，说明TS-2790能有效促进细胞迁移和运动。

实施例3化合物TS-2790的细胞侵袭实验

(1)实验对象：小鼠胚胎成纤维细胞3T3、人包皮成纤维细胞HFF-1；

(2)实验药物：化合物TS-2790、化合物溶剂DMSO(二甲基亚砜)；

(3)实验方法：

制备细胞悬液：消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)洗1遍，无血清培养基重悬，调整细胞密度至合适浓度(小鼠胚胎成纤维细胞3T3和人包皮成纤维细胞HFF-1的种板密度都为4×10⁵个/mL)；

接种细胞：每种细胞各设置阴性对照组(加入和化合物TS-2790相同稀释比的DMSO)，给药组(即化合物TS-2790对HFF-1细胞的工作浓度为0.5μM、对3T3细胞的工作浓度为0.125μM和0.5μM)，每组各2个复孔，根据细胞密度取细胞悬液适量，加入适量体积10％BSA(牛血清白蛋白)使其最终百分比为0.1％，再加入化合物TS-2790，最后用DMEM(液体培养基，高糖型)补齐，使得每孔总体积为200μL，混匀后轻柔均匀地加入铺有胶的Transwell上室，立刻在24孔板下室一般加入800μL含20％ FBS(胎牛血清)的培养基，给药24h收板；

细胞染色：取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用棉签轻轻擦掉上室未迁移下去的细胞及胶，并放入干净的24孔板内，用1×PBS(稀释到1倍的磷酸盐缓冲溶液)洗1遍，甲醇固定30分钟，吸净甲醇，将小室放通风橱风干，0.1％结晶紫染色20min，吸掉回收结晶紫，用PBS洗1遍，吸净PBS，通风橱晾干；

结果统计：5×镜下观察，10×显微镜下随机五个视野观察细胞，拍照，记数并统计作图，具体结果见图8至图11。

实验结果表明：与对照组相比，TS-2790治疗处理过的细胞，侵袭迁移过Transwell的细胞数明显增多，具有显著的统计学意义(P<0.05或P<0.01)，说明TS-2790能促进细胞运动迁移和侵袭穿透能力。

实施例4化合物TS-2790促伤口愈合小鼠实验

本发明的促糖尿病小鼠伤口愈合实验包括糖尿病小鼠造模、糖尿病小鼠伤口构建、给药对糖尿病小鼠伤口的愈合情况，具体实验设计见表1；

一、正常小鼠伤口促愈合的具体实验步骤如下：

表1：实验设计

(1)小鼠订购：从实验动物中心订购13周龄，雄性，BALB/c鼠，于SPF饲养室饲养5天，同时做隔离观察；

(2)分组：将小鼠随机分为Control阴性对照组以及TS-2790给药组；

(3)麻醉：用5％水合氯醛腹腔注射麻醉(100uL/20g)，将完全麻醉的小鼠以俯卧位置于垫巾上，用脱毛膏去除背部毛发，用75％酒精消毒背部皮肤，用直径为15mm的环钻于背部中线最高处两侧分别打出2个直径约15mm的圆形皮肤全层伤口，用手术剪及镊子剃除皮下组织，暴露肌肉表面筋膜，对伤口进行止血、消毒，开放伤口，以直尺作为对照，拍照记录伤口形态大小；

(4)给药：对照组的每只小鼠注射相同体积(0.1mL)的含有10％ DMSO-40％ PEG400-5％吐温80-45％生理盐水；TS-2790(30mg/kg/d)，给药方式为腹腔注射；小鼠创伤当天为1d，分别于1d、3d、5d、7d、9d、11d对各组小鼠进行注射；

(5)控温板下复苏麻醉小鼠，运回洁净饲育室EVC笼架。

按上述方法对正常小鼠进行促伤口愈合实验的结果如附图12、附图13所示。

二、糖尿病小鼠造模及伤口促愈合的具体实验步骤如下：

表2实验设计

(1)小鼠订购：从实验动物中心订购3周龄，雄性，BALB/c鼠，于SPF饲养室饲养5天，同时做隔离观察；

(2)以造模组小鼠开始进食高脂饲料为实验第一天，每周记录体重，观察毛发、进食及排尿状况，第28天晚上撤去饲料，禁食不禁水过夜；

(3)配制链脲佐菌素(STZ)注射液：将20mg STZ粉末溶于4mL柠檬酸缓冲液中，配制成5mg/mL的注射液，所有操作在冰上进行，注意避光，STZ溶液现配现用；

(4)注射STZ：第二天测量小鼠体重和空腹血糖，造模组小鼠腹腔注射STZ溶液(40mg/kg/d)，每天一次，连续5天，注射第一日继续禁食，注射第二日开始恢复高脂喂养；继续观察小鼠进食、饮水、排尿情况；

(5)给药结束2周后，分别检测两组小鼠空腹血糖，造模组小鼠中，定义以连续3次以上稳定在11.1mmoL/L以上并出现“多饮、多尿、多食、消瘦”的小鼠为造模成功的糖尿病鼠，纳入后续实验，不符合模型标准的小鼠退出实验，统计造模成功率；实验期间注意造模小鼠的卫生护理，若出现多饮多尿表现，必须注意及时补充饮水，缩短更换垫料间隔；

(6)分组：将造模成功小鼠随机分为未给药的造模Control对照组以及TS-2790给药组；

(7)麻醉：用5％水合氯醛腹腔注射麻醉(100μL/20g)，将完全麻醉的小鼠以俯卧位置于垫巾上，用脱毛膏去除背部毛发，用75％酒精消毒背部皮肤，用直径为15mm的环钻于背部中线最高处两侧分别打出2个直径约15mm的圆形皮肤全层伤口，用手术剪及镊子剃除皮下组织，暴露肌肉表面筋膜，对伤口进行止血、消毒，开放伤口，以直尺作为对照，拍照记录伤口形态大小；

(8)给药：未给药的造模Control对照组的每只小鼠注射相同体积(0.1mL)的含有10％DMSO-40％ PEG 400-5％吐温80-45％生理盐水；TS-2790(3mg/kg/d)，给药方式为腹腔注射；小鼠创伤当天为1d，分别于1d、3d、5d、7d、9d、11d对各组小鼠进行注射；

(9)控温板下复苏麻醉小鼠，运回洁净饲育室EVC笼架。

按上述方法对糖尿病小鼠进行促伤口愈合实验的结果如附图14、附图15所示。

三、小鼠促伤口愈合实验结果

按上述方法分别对正常小鼠和糖尿病小鼠进行促伤口愈合实验，附图12至附图15的实验结果表明：无论是正常小鼠的伤口愈合还是糖尿病小鼠的伤口愈合，经TS-2790给药的小鼠，其伤口愈合速度较未给药的对照组更快，实验结果具有明显的统计学意义(P<0.01)。

需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一类氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，其特征在于，所述氮杂吲哚化合物的分子结构如式(I)所示：

式中A为碳原子或氮原子，R1为

2.根据权利要求1所述的氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，其特征在于，所述A原子选自1个氮原子和3个碳原子。

3.根据权利要求1所述的氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，其特征在于，所述R1取代基位于A原子是碳原子的位置上。

4.根据权利要求1所述的氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，其特征在于，所述氮杂吲哚化合物的分子结构如下：

5.根据权利要求1～4任一项所述的氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，其特征在于，所述药物还包括其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物。

6.根据权利要求5所述的氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

7.根据权利要求6所述的氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为口服、注射、涂抹、擦拭或洗涤。

8.根据权利要求6所述的氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型为混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、凝胶剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、气雾剂或滴剂。

9.根据权利要求1所述的氮杂吲哚化合物在制备促伤口愈合药物中的应用，其特征在于，所述药物适应症包括外伤、烧烫伤、溃疡、皮炎、慢性伤口、分娩、糖尿病患者伤口。