CN117330758A

CN117330758A - Itga11及其标记的肿瘤相关成纤维细胞亚群在膀胱癌转移、预后、治疗中的应用

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Publication number: CN117330758A
Application number: CN202311158619.0A
Authority: CN
Inventors: 陈长昊; 林天歆; 郑汉豪; 安明杰; 罗宇明; 赵月; 林彦; 庞明睿; 陈健成; 刘戴胤
Original assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2023-09-08
Filing date: 2023-09-08
Publication date: 2024-01-02

Abstract

本发明公开了一种ITGA11及其标记的肿瘤相关成纤维细胞亚群在膀胱癌转移、预后、治疗中的应用，属于生物医药技术领域，本发明研究发现PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs高富集与膀胱癌的淋巴转移和患者的不良预后呈正相关，PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs可充当膀胱癌淋巴转移及患者预后预测的生物标志物，本发明利用ITGA11中和抗体抑制PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs可显著抑制膀胱癌的淋巴管新生与淋巴转移，ITGA11可以做为膀胱癌淋巴转移治疗的新靶标。

Description

ITGA11及其标记的肿瘤相关成纤维细胞亚群在膀胱癌转移、预后、治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及ITGA11及其标记的肿瘤相关成纤维细胞亚群在膀胱癌转移、预后、治疗中的应用。

背景技术

膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，其发病率具有逐年升高趋势。据最新的癌症数据统计，2020年全球膀胱癌新发病例57万，死亡病例21万，居高不下的发病率和死亡率给国民带来巨大的经济负担。根据肌层浸润与否，膀胱癌可分为肌层浸润性膀胱癌和非肌层浸润性膀胱癌，其中非肌层浸润性膀胱癌约占75%，肌层浸润性膀胱癌约占25%。大部分非肌层浸润性膀胱癌在经过经尿道肿瘤电切除术及膀胱灌注等治疗后仍会复发或进展为肌层浸润性膀胱癌。而肌层浸润性膀胱癌易发生转移，患者的预后更差。研究表明，淋巴转移是膀胱癌转移的最主要途径和首发方式，超过41%的肌层浸润性膀胱癌会发生淋巴转移。一旦发生淋巴转移，现有的治疗方式，包括手术切除、放化疗、免疫治疗和靶向治疗等在改善膀胱癌患者的预后中效果有限，患者的五年生存率由77.6%骤降至18.6%。近年来，部分基础研究揭示了膀胱癌淋巴转移的分子机制，但是这些研究却很难形成有效的药物靶点，在改善膀胱癌淋巴转移患者的治疗与预后上效果不明显。此外，目前临床上尚无有效的膀胱癌淋巴转移预测的生物标志物。因此，深入解析膀胱癌淋巴转移的分子机理，寻找膀胱癌淋巴转移有效的生物标志物和药物治疗新靶点是目前膀胱癌研究中亟待解决的难题。

肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts；CAFs）是指在包括肿瘤细胞在内的各种生物因素诱导下发生功能活化的成纤维细胞，它是膀胱癌肿瘤微环境中最主要的间质细胞之一，在细胞外基质重塑、脉管系统新生、肿瘤细胞干性等方面扮演重要角色，深刻影响肿瘤淋巴转移的发生。近期研究发现非选择性去除微环境中的所有CAFs群体并未给肿瘤患者带来明显受益，相反可能导致原发肿瘤进展，提示具有高度异质性的CAFs可能存在功能截然不同的亚群。随着单细胞测序技术的出现，多种具有不同功能的CAFs亚群得以鉴定并解析了其在肿瘤进展中的作用。例如，CD10⁺GPR77⁺CAFs亚群在乳腺癌组织高富集，通过维持NF-κB信号通路的激活上调IL-6的分泌，促进肿瘤细胞的干性调控乳腺癌进展。此外，ITGB1⁺CAFs亚群可通过促进微环境中胶原蛋白分泌而塑造转移前微环境，促进肺癌转移。然而，目前关于CAFs亚群在膀胱癌淋巴转移中的生物学作用及具体的分子机制尚不清楚。

整合素亚基ɑ11（Integrin ɑ11；ITGA11）是一类表达于多种细胞表面的粘附蛋白，它在细胞的生长和生物学活动的调控中发挥重要功能。一方面ITGA11可以介导细胞与细胞外基质以及细胞与细胞之间的粘附，从而促进细胞在微环境中的迁移和侵袭；另一方面，ITGA11除了介导细胞间物理黏附外，还能起信号转导的作用。ITGA11可以做为配体分子，与其靶细胞上的受体结合后向细胞内传递信号介导MAPK、PI3K/Akt、STAT等信号通路的激活，进而影响靶细胞的增殖、凋亡与干性等。近年来，ITGA11在肿瘤细胞和肿瘤微环境中的功能被逐步揭示，已有多篇研究证实ITGA11在肿瘤的发生发展中起着关键的促进作用，提示ITGA11有望成为肿瘤治疗的新靶点。因此，进一步探究ITGA11在膀胱癌淋巴转移中的生物学功能及分子机制，并基于ITGA11开发膀胱癌淋巴转移的早期诊断标志物和精准靶向治疗药物，对早期诊断膀胱癌淋巴转移、改善患者预后具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种ITGA11及其标记的肿瘤相关成纤维细胞亚群在膀胱癌预后、治疗中的应用， PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs高富集与膀胱癌的淋巴转移和患者的不良预后呈正相关， PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs可充当膀胱癌淋巴转移及患者预后预测的生物标志物。

本发明解决其技术问题采用以下技术方案：

ITGA11作为分子标志物在制备用于预测膀胱癌转移和/或预后产品中应用。

优选的，所述产品包括芯片、试剂盒、试剂。

优选的，所述ITGA11在膀胱癌组织中主要表达于PDGFRα所标记的CAFs上。

本发明还提供了PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群作为分子标志物在制备用于预测膀胱癌转移和/或预后产品中应用。

本发明还提供了检测膀胱癌组织标本中PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群表达水平的试剂在制备用于膀胱癌转移和/或预后的产品中的应用。

优选的，所述产品包括芯片、试剂盒。

优选的，所述PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群高表达的受试者预后相对较差，所述PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群低表达的受试者预后相对较好。

优选的，所述PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群在淋巴转移阳性的膀胱癌组织中的浸润量高于未发生淋巴转移的膀胱癌组织。

优选的，所述PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群高表达的受试者比PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群低表达的受试者具有更短的总生存率。

优选的，所述PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群高表达的受试者比PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群低表达的受试者具有更短的无病生存率。

本发明还提供了一种ITGA11中和抗体在制备治疗膀胱癌药物中的应用。

优选的，所述ITGA11中和抗体可显著抑制膀胱癌的淋巴管新生与淋巴转移，ITGA11可以做为膀胱癌淋巴转移治疗的新靶标。

本发明的有益效果：（1）本发明鉴定出ITGA11主要在CAFs中高表达，并证实PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs高富集与膀胱癌的淋巴转移和患者的不良预后呈正相关，进一步的体内外实验证实PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs对膀胱癌淋巴管新生和淋巴转移的促进作用，从而揭示了PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs在膀胱癌淋巴转移中的生物学做用。更重要的是我们利用ITGA11中和抗体阻断PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs后，在抑制膀胱癌淋巴管新生与淋巴转移方面取得显著效果，这些结果为将PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs作为膀胱癌淋巴转移早期诊断标记物和治疗新靶点提供理论基础和科学依据。（2）本发明探究了PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs与膀胱癌淋巴转移及患者预后的相关性，PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs可充当膀胱癌淋巴转移及患者预后预测的生物标志物；（3）本发明利用ITGA11中和抗体抑制PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs可显著抑制膀胱癌的淋巴管新生与淋巴转移，ITGA11可以做为膀胱癌淋巴转移治疗的新靶标。

附图说明

图1为膀胱癌组织切片荧光染色检测PDGFRα、ITGA11与LYVE-1在不同膀胱癌组织表达情况代表图。

图2为膀胱癌组织切片荧光染色检测PDGFRα、ITGA11在不同膀胱癌组织表达情况的结果统计分析PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs在不同膀胱癌组织浸润情况图，统计学方法：nonparametric Mann-Whitney U-test；**代表P<0.01。

图3为膀胱癌组织切片荧光染色检测PDGFRα、ITGA11和LYVE-1在不同膀胱癌组织表达情况的实验结果统计分析图，统计学方法：Spearman等级相关分析。

图4为膀胱癌组织中PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs富集程度和膀胱癌患者总生存率及无疾病生存率的统计分析图，统计学方法：Kaplan–Meier生存曲线分析，其中318例患者中PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs富集程度的中位数做为临界值，高于中位数的定义为PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs高富集，低于中位数的定义为PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs低富集。

图5为显微镜下拍摄的不同处理组别的淋巴管内皮细胞的成管及Transwell代表图。

图6为统计学分析在不同组别中淋巴管内皮细胞成管宽度的差异，三个点代表实验重复三次，统计学方法是one-way ANOVA followed by Dunnett’ s tests。**代表P<0.01。

图7为统计学分析在不同组别中淋巴管内皮细胞Transwell穿过去细胞数的差异图，三个点代表实验重复三次，统计学方法是one-way ANOVA followed by Dunnett’ stests；**代表P<0.01。

图8为不同组别裸鼠盆腔淋巴结切片的荧光染色代表图。GFP阳性为RT4膀胱癌细胞，表示淋巴结发生转移。

图9为统计学表格分析不同组别间发生腘窝淋巴结转移的裸鼠的数量图，并用卡方检验进行差异显著性分析，其中一个*代表统计学P<0.05。

图10为不同组别裸鼠膀胱肿瘤组织切片荧光染色检测PDGFRα、ITGA11与LYVE-1的表达情况代表图。

图11为统计学分析在不同组别中裸鼠膀胱肿瘤组织中LYVE-1标记的淋巴管数量柱状图，每个点代表一只裸鼠的情况，统计学方法是one-way ANOVA followed byDunnett’ s tests；**代表P<0.01。

图12为不同组别NCG小鼠中PDX肿瘤组织切片荧光染色检测PDGFRα、ITGA11与LYVE-1的表达情况代表图。

图13为统计学分析在不同组别NCG小鼠上PDX肿瘤组织中LYVE-1标记的淋巴管数量柱状图，每个点代表一只NCG小鼠的情况，统计学方法是2-tailed Student’s t test；**代表P<0.01。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，本发明各实施例及对比例所用组分原料除非特别说明，否则均为市售原料，且各平行实验中所使用的组分原料均为同种。

实施例1

膀胱癌中ITGA11主要在PDGFRα⁺CAFs表达，且PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs与膀胱癌患者的淋巴转移和不良预后相关

收集来自孙逸仙纪念医院的318个膀胱癌的石蜡切片，通过使用来自佰诺全景生物技术（北京）有限公司的多靶点免疫荧光染色试剂盒（货号：10203100100）对切片进行染色，使用的抗体是来自abcam公司的ITGA11（货号：ab198826）及LYVE-1（货号：ab219556）、Cell Signaling Technology公司的PDGFRα（货号：3174），具体的操作步骤按该试剂盒的说明书进行。随后将染色的切片利用The side scanner Pannoramic Confocal (3DHISTECH,Hungary)仪器进行扫描，并通过Imaris 9.0软件对切片进行识别与统计分析。结果发现（如图1所示），ITGA11在膀胱癌组织中主要表达于PDGFRα所标记的CAFs上。

收集膀胱癌切片对应的患者的临床信息，通过统计分析发现：PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs在淋巴转移阳性的膀胱癌组织中的浸润量显著高于未发生淋巴转移的膀胱癌组织（如图2所示）。

结合LYVE-1标记的淋巴管染色结果分析（如图3所示），发现PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs高富集的膀胱癌组织中LYVE-1标记的新生淋巴管的密度显著高于PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs低富集的膀胱癌组织。此外，通过结合患者的生存随访数据进行统计学分析（如图4所示），发现PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs在膀胱癌组织中的富集程度和膀胱癌患者的不良预后呈正相关，其中膀胱癌组织中PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs高富集的患者其总生存率（Overall Survival；OS）和无病生存率（Disease Free Survival；DFS）显著低于膀胱癌组织中PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs低富集的患者。

实施例2

体外实验证实PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs能促进淋巴管内皮细胞的迁移和成管能力

PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs的获取：首先收集膀胱癌术后新鲜的组织标本，并利用Miltenyi Biotec公司的组织解离试剂盒（货号：130-095-929）将新鲜的膀胱癌组织解离成单细胞悬液，具体步骤按试剂盒的说明书进行。随后利用来自苏州四正柏生物科技有限公司的ITGA11抗体（货号：AP10393a）和PDGFRα抗体（货号：FHP140a）、Biolegend公司的CD45抗体（货号：304006）和EpCAM抗体（货号：324203）、BDBiosciences公司的CD31抗体（货号：557508）和CD235a抗体（货号：559943）、eBioscience公司的FVD-eFluor780染料对单细胞悬液进行标记染色，并通过Becton Dickinson 公司的FACScan flow cytometer 仪器对标记后的单细胞悬液进行流式分选，从而获得PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs与非PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs细胞（PDGFRα⁺ITGA11⁺-d CAFs）。

具体的分选策略如下：利用FVD-eFluor780排除死细胞、利用CD45排除髓系细胞、利用EpCAM排除上皮细胞、利用CD31排除内皮细胞、利用CD235a排除红细胞，剩余的细胞则为CAFs，进而利用PDGFRα和ITGA11进行标记筛选出PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs与PDGFRα⁺ITGA11⁺-d CAFs细胞。人源永生化的淋巴管内皮细胞（human lymphatic endothelial cells；HLECs）则从吉妮欧生物科技有限公司购买获得，并转染GFP荧光质粒，从而使HLECs带GFP荧光。

将PBS、1×10⁵个PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs或者PDGFRα⁺ITGA11⁺-d CAFs分别与1×10⁵个HLECs混合后，加入到六孔板中，将细胞放置于培养箱中培养2天。将六孔板取出，弃去培养基，并用胰酶将贴壁细胞消化，离心5分钟后，弃去液体，使用新的培养基重悬细胞沉淀，并利用流式分选仪将GFP标记的HLECs分选出来。

对于成管实验，提前1天在24孔板中铺好基质胶，其实验流程如下：按基质胶：无血清培养基=1：2的比例配制并混匀基质胶，随后按每孔700ul加入稀释混匀好的基质胶至24孔板中，晃动并铺平，将铺有基质胶的24孔板放置于培养箱中，待基质胶凝固即可使用。用正常的含5%血清的完全培养基重悬分选后的HLECs沉淀，并计数。取5×10⁴个细胞/孔，轻柔加入到提前铺好基质胶的24孔板中，轻柔晃匀，铺平细胞。放置于细胞培养箱中培养，每隔2h观察细胞的成管情况，待细胞成管后在倒置显微镜下拍照，并用Image J软件测量成管长度，通过统计学分析（如图5、图6所示），对比组别之间成管情况的差异。结果发现：与PBS组及PDGFRα⁺ITGA11⁺-d CAFs组相比，PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs共培养后的HLECs的成管能力显著提高。

对于Transwell实验，用不含血清的培养基重悬流式分选后的HLECs沉淀，并计数。取5×10⁴个细胞并用无血清的培养基稀释至总体积300ul，然后将细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，下室则加入700ul含5%血清的培养基，将整个体系放置于培养箱中培养8h后，将小室取出，用4%的多聚甲醛固定细胞15min，然后用PBS轻柔洗三遍，然后再用结晶紫染液染细胞15min，用PBS洗去多余的结晶紫染液。用棉签轻柔拭去小室内面的细胞，然后在显微镜下观察拍照，取随机的视野用Image J进行计数，统计学分析不同组别间细胞迁移能力的差异。结果发现（如图7所示）：与PBS组及PDGFRα⁺ITGA11⁺-d CAFs组相比，PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs共培养后的HLECs的迁移能力显著提高。

实施例3

体内实验证实PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs可以显著促进膀胱癌的淋巴转移

构建裸鼠膀胱癌原位成瘤模型：RT4膀胱癌细胞系购买于中国科学院细胞库，并转染GFP荧光质粒，从而构建GFP标记的RT4膀胱癌细胞系；于广东药康生物科技有限公司购买4-5周龄的健康雌性裸鼠36只，用3%戊巴比妥钠进行麻醉，将静脉留置针 (24-gauge;Terumo Medical Products)插入麻醉后的裸鼠尿道中。将裸鼠随机分为3组，每组12只。通过留置针往裸鼠膀胱内灌注如下50 ul细胞悬液：PBS组为1.25 ×10⁵个RT4细胞，PDGFRα⁺ITGA11⁺-d CAFs组为1.25 ×10⁵个RT4细胞+3.75 ×10⁵个PDGFRα⁺ITGA11⁺-d CAFs，PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs组为1.25 ×10⁵个RT4细胞+3.75 ×10⁵个PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs。随后每周行一次活体成像观察裸鼠盆腔淋巴结的转移情况，直至裸鼠膀胱肿瘤直径大于2cm或裸鼠死亡。分离裸鼠膀胱肿瘤组织及盆腔淋巴结，并制成石蜡切片，通过上述的多靶点免疫荧光染色试剂盒进行石蜡切片染色，检测不同组别中裸鼠膀胱癌组织中淋巴管新生的程度及盆腔淋巴转移情况。结果发现（如图8~图11所示）：与PBS组及PDGFRα⁺ITGA11⁺-d CAFs组相比，PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs混合注射组的裸鼠盆腔淋巴结转移率显著增高，并且其膀胱癌组织中LYVE-1标记的新生淋巴管的密度也显著增多。

实施例4

使用ITGA11中和抗体显著抑制膀胱癌淋巴转移：于R&D Systems公司购买ITGA11中和抗体及相应的同型IgG抗体。于广东药康生物科技有限公司购买4-5周龄的健康雌性nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency/interleukin-2r-γ-null(NCG) 小鼠30只，并通过如下流程构建人源肿瘤异种移植模型：首先收集新鲜的膀胱癌组织标本，去除坏死及脂肪组织后将其分割成直径约5mm的小块肿瘤组织，备用。将NCG小鼠用3%戊巴比妥钠进行麻醉后，用剃毛器剃除其右侧腹股沟处毛发并用碘伏进行消毒。随后用眼科剪剪开约1cm的切口，并钝性分离皮肤与皮下组织，将原先备好的肿瘤组织块埋入NCG小鼠皮下中。用可吸收缝线缝合伤口并消毒处理，待肿瘤组织长至200mm³，即为F1代人源肿瘤异种移植鼠。将F1代NCG鼠上的肿瘤组织剥离下来后通过上述一致的方法将肿瘤移植至新的NCG鼠上，形成F2代人源肿瘤异种移植鼠。再将F2代NCG鼠上的肿瘤组织剥离下来后通过上述一致的方法将肿瘤移植至新的NCG鼠上，形成F3代人源肿瘤异种移植鼠。将24只F3代人源肿瘤异种移植鼠随机分成2组，每组12只，分别给予瘤内注射等量的ITGA11中和抗体及相应的同型IgG抗体，每三天1次，共注射36天。随后对小鼠实施安死术，并分离肿瘤组织制成石蜡切片。通过上述的多靶点免疫荧光染色试剂盒进行石蜡切片染色，检测不同组别中膀胱癌组织中淋巴管新生的程度。结果发现（如图12~13所示）：与同型IgG抗体注射组相比，注射ITGA11中和抗体组NCG小鼠PDX肿瘤组织中LYVE-1标记的新生淋巴管的密度显著减少。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims

1.ITGA11作为分子标志物在制备用于预测膀胱癌转移和/或预后产品中应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒、试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ITGA11在膀胱癌组织中主要表达于PDGFRα所标记的CAFs上。

4.PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群作为分子标志物在制备用于预测膀胱癌转移和/或预后产品中应用。

5.检测膀胱癌组织标本中PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群表达水平的试剂在制备用于膀胱癌转移和/或预后的产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群高表达的受试者预后相对较差，所述PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群低表达的受试者预后相对较好。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群在淋巴转移阳性的膀胱癌组织中的浸润量高于未发生淋巴转移的膀胱癌组织。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群高表达的受试者比PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群低表达的受试者具有更短的总生存率；和/或

所述PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群高表达的受试者比PDGFRα⁺ITGA11⁺CAFs亚群低表达的受试者具有更短的无病生存率。

10.ITGA11中和抗体在制备治疗膀胱癌药物中的应用。