CN117327786A - 一种多基因甲基化检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种多基因甲基化检测方法及其应用，具体涉及在上游引物添加反向标签序列以及在下游引物增加可检测标记。

Description

一种多基因甲基化检测方法及其应用
技术领域
本申请涉及生物医学领域，具体的涉及一种多基因甲基化检测方法及其应用。
背景技术
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，近年来的研究发现，基因的异常甲基化与细胞癌变有关。在哺乳动物中，DNA甲基化对于正常发育必不可少，而且与很多生物学现象有密切联系，包括基因组印迹，X染色体失活，转座因子招募，衰老和致癌作用。
DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)作为甲基供体，通过共价键结合的方式获得一个甲基基团的化学修饰过程。这种DNA甲基化修饰可以发生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位及鸟嘌呤的N-7位等位点。一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，其产物称为5-甲基胞嘧啶(5-mC)，是植物、动物等真核生物DNA甲基化的主要形式，也是目前发现的哺乳动物DNA甲基化的唯一形式。DNA甲基化作为一种相对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制。目前，传统的甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR、亚硫酸盐测序法和甲基荧光法。然而这些方法存在操作复杂、假阳性高，成本高等缺点。
本领域急需一种操作简单，重复性高；可应用于多种样本类型的多位点DNA甲基化检测法。
发明内容
本申请提供了一种多基因甲基化检测方法及其应用。针对上述问题，本申请旨在提供一种基于靶向捕获的多基因甲基化检测方法，本申请对多位点DNA甲基化检测，能够节省检测时间，同时能够得到灵敏稳定的检测结果。本申请提供的DNA甲基化检测方法，具有通量高、敏感性强、检测线性范围宽、反应快速等优点。
本申请提供了一种目标核酸的扩增和/或检测方法，所述方法包含以下步骤：(a)提供引物对，所述引物对包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含反向标签序列和靶向目标核酸的序列，所述第二引物包含靶向目标核酸的序列；(b)提供标记，所述标记连接在所述第二引物和/或dNTP；(c)提供探针，所述探针能够捕获所述反向标签序列；(d)在适合于扩增和/或检测所述目标核酸的条件下，使所述引物对、所述标记、所述探针以及包含所述目标核酸的样品接触。
本申请提供了一种引物对，所述引物对包含如本申请所述的第一引物和/或如本申请所述的第二引物。
本申请提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含一种或更多种如本申请所述的第一引物和/或如本申请所述的第二引物，以及任选地包含一种或更多种如本申请所述的探针。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是本申请所述示例性的DNA甲基化检测方法的流程示意图，其中荧光标记可以任选地替换为本领域其它检测标记。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“标签序列”通常是指特异性标记目标核酸的扩增产物的序列。例如，标签序列能够与探针的抗标签序列互补。标签序列和抗标签序列之间的特异性杂交，允许通过捕获，扩增的靶核酸序列。在某些实施方案中，标签序列的长度为6至60、8至50、10至40或20至30个核苷酸。
在本申请中，术语“标签序列”通常是指特异性标记目标核酸的扩增产物的序列。例如，标签序列能够与探针的抗标签序列互补。标签序列和抗标签序列之间的特异性杂交，允许通过捕获，扩增的靶核酸序列。在某些实施方案中，标签序列的长度为6至60、8至50、10至40或20至30个核苷酸。在本申请中，术语“反向标签序列”通常是指用于与捕获磁珠上的抗标签序列专一性互补配对的序列。例如所述捕获磁珠上的抗标签序列可以与反向标签序列杂交。反向标签序列，又可以称为倒置标签序列，例如相比于正向标签序列，反向标签序列能够使得探针捕获下游PCR引物扩增的序列。
在本申请中，术语“膀胱癌”通常是指膀胱组织相关的癌症和/或肿瘤。例如，膀胱癌可以包含膀胱尿路上皮癌、膀胱鳞状细胞癌、膀胱腺癌，例如还可以包含膀胱透明细胞癌、膀胱小细胞癌、膀胱类癌。
在本申请中，术语“甲状腺癌”通常是指甲状腺组织相关的癌症和/或肿瘤。例如，甲状腺癌可以包含乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌四种病理类型。
在本申请中，术语“前列腺癌”通常是指前列腺组织相关的癌症和/或肿瘤。例如，前列腺癌可以包括腺癌(腺泡腺癌)、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌。
在本申请中，术语“ITIH5”通常是指基因Inter-Alpha-Trypsin Inhibitor HeavyChain 5，其可以包括在GenBank中的登录号为80760的基因。
在本申请中，术语“ECRG4”通常是指基因Esophageal Cancer Related Gene4Protein，其可以包括在GenBank中的登录号为84417的基因。
在本申请中，术语“DAPK1”通常是指基因Death Associated Protein Kinase 1，其可以包括在GenBank中的登录号为1612的基因。
在本申请中，术语“RASSF1”通常是指基因Ras Association Domain FamilyMember 1，其可以包括在GenBank中的登录号为11186的基因。
在本申请中，术语“NORE1”通常是指基因Novel Ras Effector 1，其可以包括在GenBank中的登录号为83593的基因。
在本申请中，术语“TSHR”通常是指基因Thyroid Stimulating HormoneReceptor，其可以包括在GenBank中的登录号为7253的基因。
在本申请中，术语“MDR1”通常是指基因Multidrug Resistance Protein 1，其可以包括在GenBank中的登录号为5243的基因。
在本申请中，术语“APC”通常是指基因Adenomatous Polyposis Coli Protein，其可以包括在GenBank中的登录号为324的基因。
在本申请中，术语“甲基化”通常是指DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)的过程。DNA甲基化类型可分为:维持甲基化(maintenance DNA methylation)和重新甲基化(de novomethylation)。维持甲基化是指在甲基转移酶的作用下，DNA的半保留复制过程中，会在子链的相应的位置进行甲基化修饰的过程。重新甲基化是指在甲基转移酶的作用下，原来没有甲基化的DNA双链上，进行甲基化的过程，之后由维持甲基化酶来维持稳定的DNA甲基化状态。所述甲基化还可以包括形成N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。各种肿瘤中都普遍存在甲基化的异常改变，且异常的DNA甲基化状态是肿瘤的重要特征之一。
在本申请中，术语“第一引物”或“上游引物”通常是指作正义链(sense primer)。DNA 分子是双链，其中5’-3’的链称作正链，3’-5’方向的链称作负链。所述上游引物合成的链可以和所述正链的序列相同。所述上游引物合成的链可以和所述负链的序列互补。
在本申请中，术语“第二引物”或“下游引物”通常是指反义链(antisenseprimer)，所述下游引物合成的链可以和所述负链的序列相同。所述下游引物合成的链可以和所述正链的序列互补。
在本申请中，术语“肿瘤特异性基因”通常是指肿瘤相关(TAA)以及肿瘤特异性抗原(TSA)。例如，所述肿瘤特异性基因可以包括针对实体瘤和/或非实体瘤的特异性基因。本领域技术人员可以从数据库获得大量潜在的所述肿瘤特异性基因，例如TCGA数据库(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)。所述肿瘤特异性基因可以包括疾病或效果的指示物的分子种类。
在本申请中，术语“下游特异性序列”通常是指所述下游引物中可以特异性扩增目的基因的甲基化位点的核苷酸序列。例如，所述下游特异性序列可以与目的基因的甲基化位点附近(即该甲基化位点的上游5’以及下游3’处的核苷酸)的DNA序列的3’-5’的链的序列具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或更多的)同源性。
在本申请中，术语“上游特异性序列”通常是指所述上游引物中可以特异性扩增目的基因的甲基化位点的核苷酸序列。例如，所述上游特异性序列可以与目的基因的甲基化位点附近(即该甲基化位点的上游5’以及下游3’处的核苷酸)的DNA序列的5’-3’的链的序列相具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或更多的)同源性。
在本申请中，术语“探针”通常是指通过设计或选择，含有允许其在所限定的严格性下特异性地杂交到目标核酸序列的特异性核苷酸序列的合成的或以生物方式产生的核酸(DNA或RNA)。用作检测探针的寡核苷酸序列可以标记有可检测的基团。各种标记基团可以是本领域已知的，例如放射性的、荧光性的、化学发光的或电化学发光的化合物。在本申请中，探针可例如在5’端进行了氨基修饰，从而可以与载体(例如磁珠)进行偶连。已知可用于标记核酸的许多报告分子。直接报告分子包括荧光团、发色团和放射性团。
在本申请中，术语“标记”通常是指能够被检测的记号。在本申请中，术语“荧光标记”通常是指固有荧光的化合物、化学基团或组合物。所述荧光标记可以包括荧光团，所述荧光团可含有改变荧光团的溶解度、光谱特性或物理特性的取代基。本领域技术人员能够通过标记目的选择合适的荧光标记，例如，所述荧光标记可以包括FAM(羧基荧光素)、CY3、HEX(六氯-6-甲基荧光素)和/或TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)。
在本申请中，术语“PCR”通常是指一种方法，可以在不克隆或纯化的情况下，增加基因组DNA混合物中靶序列片段的浓度。扩增靶序列的过程可以包括将两个大量过量的寡聚核苷酸引物引入到包含想要的靶序列的DNA混合物中，随后在DNA聚合酶存在的情况下进行精确顺序的热循环。两个引物可以互补于双链靶序列中相应的链。为了实现扩增，对混合物进行变性，然后引物退火至它们在靶分子内的互补序列。退火后，可以用聚合酶延伸引物，以便形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以多次重复(即变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有很多“循环”)，以获得高浓度的想要的靶序列的扩增片段。想要的靶序列的扩增片段的长度可以是由引物相对于彼此的位置来确定的，因此，这个长度是可控参数。凭借该流程的重复性，该方法可以被称为“聚合酶链反应”(简称为PCR)。
在本申请中，术语“液相芯片系统”通常是指多功能悬浮点阵仪。所述液相芯片系统可以为Multi-Analyte Suspension Array、MASA、flexible Multi-Analyte Profiling或xMAP。所述液相芯片系统可以进行蛋白质、核酸等生物大分子的检测。所述液相芯片系统的原理为悬浮在液相体系中的至少一种探针可以在结合目标分子后，在激光激活下产生不同的信号。所述液相芯片系统可以仅需少量样本进行检测，并且可以同时进行定性、定量检测。
在本申请中，术语“引物对”通常是指一对能够有效扩增模板DNA的核苷酸序列。例如，所述引物对可以包括所述上游引物和所述下游引物。
发明详述
一方面，本申请提供了一种目标核酸的扩增和/或检测方法，可以包含(a)提供引物对，所述引物对包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含反向标签序列和靶向目标核酸的序列，所述第二引物包含靶向目标核酸的序列；(b)提供标记，所述标记连接在所述第二引物；(c)提供探针，所述探针能够捕获所述反向标签序列；(d)在适合于扩增和/或检测所述目标核酸的条件下，使所述引物对、所述标记、所述探针以及包含所述目标核酸的样品接触。
例如，所述方法还包含以下步骤：(d-1)在适合于扩增所述目标核酸的条件下，使所述引物对、所述标记以及包含所述目标核酸的样品接触，获得扩增产物；(d-2)在适合于检测所述目标核酸的条件下，使所述探针以及所述扩增产物接触，获得杂交产物；(d-3)确定所述杂交产物中所述标记的存在和/或含量。
例如，所述扩增包含通过PCR进行扩增。其他核酸扩增程序包括基于转录的扩增系统(TAS),包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR。
例如，通过所述杂交产物中所述标记的存在和/或含量，确定所述目标核酸的存在和/或含量。
例如，所述目标核酸包含具有甲基化修饰的目标核酸。
例如，所述方法检测所述具有甲基化修饰的目标核酸在所述样本中的存在和/或含量。
在本申请中，所述方法可以针对样本对一种以上的目的基因同时进行(例如多重)甲基化检测。在本申请中，所述方法可以用于预测、诊断和/或评估样本的一种以上目的基因的甲基化水平。例如，可以用于预测、诊断和/或评估样本的健康状况(例如是否患有肿瘤、患有肿瘤种类和/或所患肿瘤的阶段)。
例如，所述目标核酸来源于肿瘤特异性基因。所述肿瘤可以包括实体瘤和/或非实体瘤。例如，所述肿瘤包含实体瘤。例如，所述肿瘤包含膀胱癌、甲状腺癌、和/或前列腺癌。
例如，所述目标核酸来源于选自以下组的基因：APC、ITIH5、ECRG4、DAPK1、RASSF1A、NORE1A、TSHR、和MDR1。例如，所述目标核酸来源于膀胱癌、甲状腺癌、和/或前列腺癌的特异性基因。例如，所述膀胱癌、甲状腺癌、和/或前列腺癌的特异性基因选自以下组：APC、ITIH5、ECRG4、DAPK1、RASSF1A、NORE1A、TSHR、和MDR1。例如，所述目标核酸来源于选自以下组的膀胱癌特异性基因：ITIH5、和ECRG4。例如，所述目标核酸来源于选自以下组的甲状腺癌特异性基因：RASSF1A、NORE1A、DAPK1、和TSHR。例如，所述目标核酸来源于选自以下组的前列腺癌特异性基因：MDR1、RASSF1A、和APC。
例如，所述第一引物的所述反向标签序列选自SEQ ID NO：1、4、7、14和17中任一项的序列。例如，所述第一引物的所述靶向目标核酸的序列选自SEQ ID NO：2、5、10、12、15、18、20、22、和24中任一项的序列。例如，所述第二引物的所述靶向目标核酸的序列选自SEQID NO：3、6、11、13、16、19、21、23、和25中任一项的序列。
例如，所述第一引物的所述反向标签序列能够使得所述探针捕获扩增的目标核酸。例如，所述第一引物的所述反向标签序列能够使得所述探针捕获所述第二引物扩增的目标核酸。反向标签序列，又可以称为倒置标签序列，例如相比于正向标签序列，反向标签序列可以使得探针捕获下游PCR引物扩增的序列。例如，下游PCR引物扩增得到的扩增产物上可以含有反向标签序列，所述反向标签序列可以与微球上的抗标签序列结合，从而进行检测。
本申请的方法对于特定的瘤种有着显著的检测优势。例如，本申请的方法对于源于膀胱癌、甲状腺癌、和/或前列腺癌特异性基因的目标核酸有更特异的检测优势。如，本申请的方法对于源于膀胱癌特异性基因的目标核酸有更特异的检测优势。如，本申请的方法对于源于甲状腺癌特异性基因的目标核酸有更特异的检测优势。如，本申请的方法对于源于前列腺癌特异性基因的目标核酸有更特异的检测优势。
例如，靶向ITIH5的第一引物可以包含SEQ ID NO：1和2所示的序列，第二引物可以包含SEQ ID NO：3所示的序列。
例如，靶向ECRG4的第一引物可以包含SEQ ID NO：4和5所示的序列，第二引物可以包含SEQ ID NO：6所示的序列。
例如，靶向β-ACTIN的第一引物可以包含SEQ ID NO：7和8所示的序列，第二引物可以包含SEQ ID NO：9所示的序列。
例如，靶向DAPK1的第一引物可以包含SEQ ID NO：4和10所示的序列，第二引物可以包含SEQ ID NO：11所示的序列。
例如，靶向RASSF1A的第一引物可以包含SEQ ID NO：1和12所示的序列，第二引物可以包含SEQ ID NO：13所示的序列。
例如，靶向NORE1A的第一引物可以包含SEQ ID NO：14和15所示的序列，第二引物可以包含SEQ ID NO：16所示的序列。
例如，靶向TSHR的第一引物可以包含SEQ ID NO：17和18所示的序列，第二引物可以包含SEQ ID NO：19所示的序列。
例如，靶向MDR1的第一引物可以包含SEQ ID NO：1和20所示的序列，第二引物可以包含SEQ ID NO：21所示的序列。
例如，靶向RASSF1A的第一引物可以包含SEQ ID NO：4和22所示的序列，第二引物可以包含SEQ ID NO：23所示的序列。
例如，靶向APC的第一引物可以包含SEQ ID NO：17和24所示的序列，第二引物可以包含SEQ ID NO：25所示的序列。
例如，其中所述第一引物和/或第二引物的浓度为约1μM-约3μM。例如，其浓度可以为约1.2μM-约3μM、约1.4μM-约3μM、约1.6μM-约3μM、约1.8μM-约3μM、约2.0μM-约3μM、约1μM-约2.8μM、约1μM-约2.5μM、约1.5μM-约3μM、约1.5μM-约2.5μM或约1.5μM-约2μM。
例如，所述扩增包括以下的反应步骤：预变性95℃2-5min，热循环95℃15-20s，52℃-60℃20-30s，72℃5-30s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min。
例如，所述探针与载体连接。例如，所述探针的5’端与载体连接。例如，所述载体包括芯片、磁珠和/或微球。例如，所述探针与所述扩增产物杂交包括以下的反应步骤：95℃，1-5min；40-60℃，30-60min。在本申请中，所述探针可以与所述PCR扩增产物杂交获得杂交产物。例如，所述探针可以与所述PCR扩增产物中的至少部分序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的互补性而形成杂交产物。例如，所述探针可以与所述目的基因的甲基化位点相关序列中的至少部分序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的互补性而形成杂交产物。在本申请中，所述载体可以包括固相载体和/或液相载体。在本申请中，所述固相载体可以包括芯片。在本申请中，所述液相载体可以包括磁珠和/或微球。所述磁珠和/或微球可以具有硅基材质。所述磁珠和/或微球可以具有羧基或氨基修饰。所述磁珠和/或微球可以选自德国Miltenyi，美国Dynabeads，德国MagSERION beads，法国Ademtech的产品。所述磁珠和/或微球的粒径可以为约1-5μm。
在本申请中，所述探针的浓度可以为约1μM-约3μM。例如，其浓度可以为约1.2μM-约3μM、约1.4μM-约3μM、约1.6μM-约3μM、约1.8μM-约3μM、约2.0μM-约3μM、约1μM-约2.8μM、约1μM-约2.5μM、约1.5μM-约3μM、约1.5μM-约2.5μM或约1.5μM-约2μM。
例如，所述标记能够直接或间接使所述扩增产物产生信号。例如，所述标记与所述第二引物的5’端直接或间接连接。在本申请中，可以使用生物素-链酶亲和素(或亲和素)系统来使得所述PCR扩增产物产生荧光信号。例如，所述磁珠和/或微球可以包被链酶亲和素，该磁珠和/或微球可与所述PCR扩增产物结合而产生荧光信号。在某些情况下，也可以使用其他不同的亲和结合伙伴来替代所述生物素-链酶亲和素(或亲和素)系统，例如，可以使用抗原/半抗原和抗体，或者酶和对应的底物。
例如，所述标记包括生物素标记和/或荧光标记。例如荧光团、发色团、放射性基团、酶标记、抗体、化学/电致发光标记、亲和标记等。例如，所述标记可以不与所述dNTP直接或间接连接。例如，所述dNTP包含dCTP。
例如，所述方法还包含提供亲和素，所述亲和素与荧光标记直接或间接连接。
例如，所述亲和素与所述生物素接触包括以下的反应条件：25-37℃，10-30min。例如，可以使用链霉亲和素标记的荧光染料(SAPE)对所述带有磁珠和/或微球-生物素标记的杂交产物进行荧光标记。在本申请中，所述荧光标记的反应条件可以为在约25-约37℃条件下反应约10-约30min。
例如，所述方法包含通过检测所述信号确定所述杂交产物中所述标记的存在和/或含量。例如，所述方法包含使用液相芯片平台检测所述信号。
例如，所述方法还包含针对内参核酸进行扩增和/或扩增，包含通过所述扩增和/或检测目标核酸的方法扩增和/或检测所述内参核酸。
例如，所述内参引物来源于β-ACTIN。例如，所述靶向所述内参核酸的所述第一引物的所述反向标签序列选自SEQ ID NO：7的序列。例如，所述靶向所述内参核酸的所述第一引物的所述靶向内参核酸的序列选自SEQ ID NO：8的序列。例如，所述靶向所述内参核酸的所述第二引物的所述靶向内参核酸的序列选自SEQ ID NO：9的序列。
例如，所述方法还包含使包含所述目标核酸的样品经碱基转化处理，所述碱基转化处理使得包含甲基化的碱基与不包含甲基化的碱基在所述碱基转化处理后分别转化为不同的碱基。例如，所述方法还包含使包含所述目标核酸的样品经碱基转化处理，所述碱基转化处理使得包含甲基化的胞嘧啶能够与鸟嘌呤结合，且所述碱基转化处理使得包含甲基化的胞嘧啶不能够与鸟嘌呤结合。例如，所述方法还包含使包含所述目标核酸的样品经重亚硫酸盐处理。在本申请中，所述样本中的DNA可以经重亚硫酸盐处理和/或经酶学法转化。在本申请中，所述样本中的DNA可以经重亚硫酸盐处理或酶学法转化。所述方法可以将所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，这些尿嘧啶会在随后的PCR扩增中变成胸腺嘧啶。而甲基化胞嘧啶在这个过程中保持不变。所述重亚硫酸盐处理或酶学法转化可以使用试剂盒实现。
例如，其中所述样本的来源包含细胞、组织、器官和/或样本。例如，其中所述样本的来源包含微生物、植物、非人动物和/或人。例如，其中所述样本包含基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA、游离DNA、和/或合成DNA。例如，其中所述样本来源于血液样本、血浆样本、粪便样本和/或尿液样本。例如，其中所述样本来源于FFPE样本和/或组织样本。例如，其中所述样本来源于肿瘤患者、肿瘤组织和/或肿瘤细胞。
在本申请中，所述细胞、组织、器官和/或受试者的样本可以来源于肿瘤患者，和/或，所述细胞、组织可以包括肿瘤细胞和/或肿瘤组织。例如，所述细胞、组织、器官和/或受试者的样本可以来源于肿瘤患者，和/或，所述细胞、组织包括肿瘤细胞和/或肿瘤组织。例如，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或非实体瘤。本申请的方法可以适用于不同的适应症患者和/或不同的从患者处获得的样本来源。
一方面，本申请提供了一种引物对，所述引物对包含如本申请所述的第一引物和/或如本申请所述的第二引物。
一方面，本申请提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含一种或更多种如本申请所述的第一引物和/或如本申请所述的第二引物，以及任选地包含一种或更多种如本申请所述的探针。例如，不同种类的引物和探针针对不同种类的目标核酸。例如，针对不同种类的目标核酸可以提供产生不同信号的标记。
在本申请中，所述的试剂盒可以包含本申请所述的探针。本申请所述的试剂盒可以用于通过一轮PCR实现对一个以上的目的基因进行甲基化检测。本申请所述的试剂盒可以用于预测、诊断和/或评估样本的一种以上目的基因的甲基化水平。例如，可以用于预测、诊断和/或评估样本的健康状况(例如是否患有肿瘤、患有肿瘤种类和/或所患肿瘤的阶段)。例如，可以用于预测、诊断和/或评估样本患有膀胱癌、甲状腺癌、和/或前列腺癌的情况。
例如，本申请的方法对于特定的瘤种的预测、诊断和/或评估有着显著的检测优势。如，本申请的方法对于潜在为膀胱癌来源的样本的目标核酸有更特异的检测优势。如，本申请的方法对于潜在为甲状腺癌来源的样本的目标核酸有更特异的检测优势。如，本申请的方法对于潜在为前列腺癌来源的样本的目标核酸有更特异的检测优势。例如，样本的位点阳性检测率为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％以上。例如，样本的位点阳性检测率通过检测患者的M个待测位点，其中N个待测位点通过本申请的方法检测为阳性，则样本的位点阳性检测率为N/M。
在本申请中，所述探针、所述上游引物和/或所述下游引物可以分装在不同的独立包装中。
在本申请中，所述试剂盒还可以包含为PCR扩增所需的任何试剂。例如，可以包括Taq Master mix。
在本申请中，所述试剂盒还可以包含为样本收集和/或处理所需的任何试剂。例如，可以包括包含重亚硫酸盐的溶液。
本申请提供了一种DNA甲基化检测方法，包括：
1)针对目的基因甲基化位点设计合成甲基化特异性PCR引物，上游引物5'端添加反向标签序列(用于与捕获磁珠上的反标签序列的专一性互补配对)，下游引物5'端进行荧光修饰；2)使用甲基化特异性PCR引物对经重亚硫酸盐处理的DNA样本进行PCR扩增，得到带有荧光标记的甲基化特异性产物；3)使用带有互补标签序列的磁珠对步骤2)产物片段进行杂交；检测步骤3)产物荧光信号并进行数据分析。
优选地，步骤1)中，采用CY3进行荧光修饰。更优选地，步骤1)中，上游引物的浓度采用0.125μM，0.25μM，0.0625μM或0.05μM，CY3荧光修饰的下游引物浓度采用0.5μM，1μM，0.25μM或2.5μM。
优选地，步骤2)中，PCR扩增反应条件：预变性95℃10-20min，热循环95℃15-30s，52-60℃30s，72℃15-40s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min。
优选地，步骤3)中，所述磁珠采用羟基表面修饰的磁珠。优选地，步骤3)中，杂交反应条件：96℃，1-5min；40-60℃，30-60min。
优选地，步骤4)中，采用液相芯片系统检测步骤3)产物荧光信号并进行数据分析。
与现有技术相比本申请的方法至少具包含以下优点：1.操作简单，结果判读清晰，节省成本，降低损失。2.减少PCR扩增产物的移取动作，降低了PCR产物的污染风险。3.通用性好，检测成本低。4.所需样本量少，适用于微量DNA样本。5.本检测方法可用于多种样本类型，如人类血液样本、血浆样本、FFPE样本、组织样本、粪便样本、尿液样本以及植物微生物。6.本申请所述的方法可应用于各领域多位点DNA甲基化检测，包括但不限于癌症筛查、疾病诊断、科学研究等。
实施方案
1.一种目标核酸的扩增和/或检测方法，所述方法包含以下步骤：(a)提供引物对，所述引物对包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含反向标签序列和靶向目标核酸的序列，所述第二引物包含靶向目标核酸的序列；(b)提供标记，所述标记连接在所述第二引物；(c)提供探针，所述探针能够捕获所述反向标签序列；(d)在适合于扩增和/或检测所述目标核酸的条件下，使所述引物对、所述标记、所述探针以及包含所述目标核酸的样品接触。
2.如实施方式1-2中任一项所述的方法，所述方法还包含以下步骤：(d-1)在适合于扩增所述目标核酸的条件下，使所述引物对、所述标记以及包含所述目标核酸的样品接触，获得扩增产物；(d-2)在适合于检测所述目标核酸的条件下，使所述探针以及所述扩增产物接触，获得杂交产物；(d-3)确定所述杂交产物中所述标记的存在和/或含量。
3.如实施方式1-3中任一项所述的方法，所述扩增包含通过PCR进行扩增。
4.如实施方式2-3中任一项所述的方法，通过所述杂交产物中所述标记的存在和/或含量，确定所述目标核酸的存在和/或含量。
5.如实施方式1-4中任一项所述的方法，所述目标核酸包含具有甲基化修饰的目标核酸。
6.如实施方式1-5中任一项所述的方法，所述方法检测所述具有甲基化修饰的目标核酸在所述样本中的存在和/或含量。
7.如实施方式1-6中任一项所述的方法，所述目标核酸来源于肿瘤特异性基因。
8.如实施方式7所述的方法，所述肿瘤包含实体瘤。
9.如实施方式7-8中任一项所述的方法，所述肿瘤包含膀胱癌、甲状腺癌、和/或前列腺癌。
10.如实施方式1-9中任一项所述的方法，所述目标核酸来源于选自以下组的基因：APC、ITIH5、ECRG4、DAPK1、RASSF1A、NORE1A、TSHR、和MDR1。
11.如实施方式1-10中任一项所述的方法，所述目标核酸来源于膀胱癌、甲状腺癌、和/或前列腺癌的特异性基因。
12.如实施方式11所述的方法，所述膀胱癌、甲状腺癌、和/或前列腺癌的特异性基因选自以下组：APC、ITIH5、ECRG4、DAPK1、RASSF1A、NORE1A、TSHR、和MDR1。
13.如实施方式1-12中任一项所述的方法，所述目标核酸来源于选自以下组的膀胱癌特异性基因：ITIH5、和ECRG4。
14.如实施方式1-13中任一项所述的方法，所述目标核酸来源于选自以下组的甲状腺癌特异性基因：RASSF1A、NORE1A、DAPK1、和TSHR。
15.如实施方式1-14中任一项所述的方法，所述目标核酸来源于选自以下组的前列腺癌特异性基因：MDR1、RASSF1A、和APC。
16.如实施方式1-15中任一项所述的方法，所述第一引物的所述反向标签序列选自SEQ ID NO：1、4、7、14和17中任一项的序列。
17.如实施方式1-16中任一项所述的方法，所述第一引物的所述反向标签序列能够使得所述探针捕获扩增的目标核酸。
18.如实施方式1-17中任一项所述的方法，所述第一引物的所述反向标签序列能够使得所述探针捕获所述第二引物扩增的目标核酸。
19.如实施方式1-18中任一项所述的方法，所述第一引物的所述靶向目标核酸的序列选自SEQ ID NO：2、5、10、12、15、18、20、22、和24中任一项的序列。
20.如实施方式1-19中任一项所述的方法，所述第二引物的所述靶向目标核酸的序列选自SEQ ID NO：3、6、11、13、16、19、21、23、和25中任一项的序列。
21.如实施方式1-20中任一项所述的方法，其中所述第一引物和/或第二引物的浓度为约1μM-约3μM。
22.如实施方式1-21中任一项所述的方法，所述扩增包括以下的反应步骤：预变性95℃2-5min，热循环95℃15-20s，52℃-60℃20-30s，72℃5-30s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min。
23.如实施方式1-22中任一项所述的方法，所述探针与载体连接。
24.如实施方式1-23中任一项所述的方法，所述探针的5’端与载体连接。
25.如实施方式1-24中任一项所述的方法，所述载体包括芯片、磁珠和/或微球。
26.如实施方式1-25中任一项所述的方法，所述探针与所述扩增产物杂交包括以下的反应步骤：95℃，1-5min；40-60℃，30-60min。
27.如实施方式1-26中任一项所述的方法，所述标记能够直接或间接使所述扩增产物产生信号。
28.如实施方式1-27中任一项所述的方法，所述标记与所述第二引物的5’端直接或间接连接。
29.如实施方式1-28中任一项所述的方法，所述标记不与所述dNTP直接或间接连接。
30.如实施方式1-29中任一项所述的方法，所述dNTP包含dCTP。
31.如实施方式1-30中任一项所述的方法，所述标记包括生物素和/或荧光素。
32.如实施方式1-31中任一项所述的方法，所述方法还包含提供亲和素，所述亲和素与荧光素直接或间接连接。
33.如实施方式1-32中任一项所述的方法，所述亲和素与所述生物素接触包括以下的反应条件：25-37℃，10-30min。
34.如实施方式1-33中任一项所述的方法，所述方法包含通过检测所述信号确定所述杂交产物中所述标记的存在和/或含量。
35.如实施方式1-34中任一项所述的方法，所述方法包含使用液相芯片平台检测所述信号。
36.如实施方式1-35中任一项所述的方法，所述方法还包含针对内参核酸进行扩增和/或扩增，包含通过所述扩增和/或检测目标核酸的方法扩增和/或检测所述内参核酸。
37.如实施方式36所述的方法，所述内参引物来源于β-ACTIN。
38.如实施方式36-37中任一项所述的方法，所述靶向所述内参核酸的所述第一引物的所述反向标签序列选自SEQ ID NO：7的序列。
39.如实施方式36-38中任一项所述的方法，所述靶向所述内参核酸的所述第一引物的所述靶向内参核酸的序列选自SEQ ID NO：8的序列。
40.如实施方式36-39中任一项所述的方法，所述靶向所述内参核酸的所述第二引物的所述靶向内参核酸的序列选自SEQ ID NO：9的序列。
41.如实施方式1-40中任一项所述的方法，所述方法还包含使包含所述目标核酸的样品经碱基转化处理，所述碱基转化处理使得包含甲基化的碱基与不包含甲基化的碱基在所述碱基转化处理后分别转化为不同的碱基。
42.如实施方式1-41中任一项所述的方法，所述方法还包含使包含所述目标核酸的样品经碱基转化处理，所述碱基转化处理使得包含甲基化的胞嘧啶能够与鸟嘌呤结合，且所述碱基转化处理使得包含甲基化的胞嘧啶不能够与鸟嘌呤结合。
43.如实施方式1-42中任一项所述的方法，所述方法还包含使包含所述目标核酸的样品经重亚硫酸盐处理。
44.如实施方式1-43中任一项所述的方法，其中所述样本的来源包含细胞、组织、器官和/或样本。
45.如实施方式1-44中任一项所述的方法，其中所述样本的来源包含微生物、植物、非人动物和/或人。
46.如实施方式1-45中任一项所述的方法，其中所述样本包含基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA、游离DNA、和/或合成DNA。
47.如实施方式1-46中任一项所述的方法，其中所述样本来源于血液样本、血浆样本、粪便样本和/或尿液样本。
48.如实施方式1-47中任一项所述的方法，其中所述样本来源于FFPE样本和/或组织样本。
49.如实施方式1-48中任一项所述的方法，其中所述样本来源于肿瘤患者、肿瘤组织和/或肿瘤细胞。
50.一种引物对，所述引物对包含如实施方式1-49中任一项所述的第一引物和/或如实施方式1-49中任一项所述的第二引物。
51.一种试剂盒，所述试剂盒包含一种或更多种如实施方式1-49中任一项所述的第一引物和/或如实施方式1-49中任一项所述的第二引物，以及任选地包含一种或更多种如实施方式1-49中任一项所述的探针。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1
本申请示例性方法(下游引物为5’端添加生物素标记)用于检测膀胱癌
本实施例采用的引物由金斯瑞生物科技公司合成，含有M-ITIH5,M-ECRG4,M-β-ACTIN甲基化位点目的区域和NC(不含甲基化位点目的区域)质粒由金唯智生物科技有限公司合成；MagPlex-TAG Microspheres购自Luminex公司；2×Taq Master mix(所需的Taq酶、dNTP混合物，MgCl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自Takara公司(Takara，RR001B)；SAPE原液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Life Technologies，S-866)；TMAC(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(SigmaT3411)；Sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma L7414)；Tris-HCl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8230)；Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8200)；EDTA(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx1340GR500)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx1115GR500)；NaCl(氯化钠)购自天大化学试剂。
pH8.0的TE溶液：物质组成是10mM Tris-HCl、1mM EDTA。
引物探针设计及合成
PCR引物针对甲基化位点设计，引物的纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，引物序列长度为16-30bp，TM值为50-70℃，上游引物5’端添加反向标签序列，下游引物为5’端添加生物素标记
上游引物：ITIH5-M-F 5'-AATAAGAGAATTGATATGAAGATG(SEQ ID NO：1)CAACACAAATAACCCCTACTA(SEQ ID NO：2)-3'
下游引物：ITIH5-M-R 5'Biotin–TTTTCGGTTTTAGTTTTATTAGAGTCG(SEQ ID NO：3)-3'
其中Biotin表示生物素修饰。
引物干粉分别加入TE pH8.0溶解，使引物的浓度为2.5μM。
标准品和阴性参照品合成
M-ITIH5,M-ECRG4,M-β-ACTIN甲基化位点目的区域标准品和NC阴性对照标准品干粉分别加无酶水溶解后，稀释至1015拷贝/ml，10倍梯度稀释标准品，均取1010拷贝/ml作为标准品模板，使用M-ITIH5,M-ECRG4,M-β-ACTIN对照标准品分别检测ITIH5引物的特异性。
特异性分析
1)M-ITIH5,M-ECRG4,M-β-ACTIN甲基化位点目的区域标准品，NC阴性标准品，按照上述要求稀释作为待测模板，按照下述步骤进行检测：
2)本实施例PCR扩增体系如下表所示：
成分 体积
PCR引物(2.5μM) 0.8μl
2×Taq Master mix 5μl
待测模板 2μl
ddH2O 至10μl
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于Bio-rad T100上进行PCR反应，反应程序如下：
3)杂交:96孔板(AXYGEN,PCR-96-LP-FLT-C)每个反应孔中分别加入25μl 2×Tm杂交液(0.4M NaCl，0.2M Tris,0.16％Triton X-100,pH 8.0)、16μl去离子水，6μl步骤2)PCR产物及3μl磁珠混合物(Luminex,MagPlex-TAG Microspheres)，封膜后震荡混匀20s。按照如下条件设置PCR仪并进行反应：95℃，90s,37℃，15min。
4)显色：制备SAPE混合液，包括SAPE原液(Life Technologies,S-866)1.875μl；1×Tm杂交液(0.2M NaCl，0.1M Tris,0.08％Triton X-100,pH 8.0)125μl。将步骤3)的杂交产物从PCR仪取下后立即置于磁力板(V&P Scientific,VP771LD-4CS)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入配置好的SAPE混合液25μl，封膜后震荡混匀20s。按如下条件设置PCR仪并进行反应：37℃，15min。反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
5)液相芯片平台检测：步骤4)得到的产物使用Luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照Luminex200操作说明书操作。
6)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
检测结果如表1所示，M-ITIH5,M-ECRG4,M-β-ACTIN为甲基化位点的目的区域标准品，NC为阴性标准品。
Location Sample B35_ITIH5
1(1，A1) M-ECRG 21
2(1，B1) M-β-ACTIN 24
3(1，C1) M-ITIH5 572
4(1，D1) NC 40
如上表所示，本检测方法ITIH5引物能够特异性的区分M-ITIH5标准品，说明该方法特异性较好。
多重检测分析
本实施例采用的引物和探针由金斯瑞生物科技公司合成；阴性标准品为经重亚硫酸盐转化人类非甲基化DNA，购自Zymo research生物公司(ZYMO RESEARCH，D5014)；MagPlex-TAG Microspheres购自Luminex公司；尿液DNA提取试剂盒购自Zymo research生物公司尿液DNA提取试剂盒(ZYMO RESEARCH,D3061)；2×Taq Mastermix(所需的Taq酶、dNTP混合物；MgCl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自Takara公司(Takara，RR001B)；SAPE原液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Life Technologies，S-866)，TMAC(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(SigmaT3411)；Sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma L7414)；Tris-HCl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷，购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8230)；Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8200)；EDTA(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx1340GR500)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx1115GR500)；NaCl(氯化钠)购自天大化学试剂。
按照实施例说明的方法，引物设计及合成，序列如下
上游引物：ECRG4-M-F 5′-GAAGATATTGAAAGAATTTGATGT(SEQ ID NO：4)GAGAGAGGATTTCGGTGGTATTCG(SEQ ID NO：5)-3′
下游引物：ECRG4-M-R 5′Biotin-GAATTATCCCTACGTCGCTACCGA(SEQ ID NO：6)-3′
上游引物：β-ACTIN-M-F 5′-AATTGAGAAAGAGATAAATGATAG(SEQ ID NO：7)TTTAATGTTACGTACGATTTTTC(SEQ ID NO：8)-3′
下游引物：β-ACTIN-M-R 5′Biotin-GTAGGATGGTATGGGGGA(SEQ ID NO：9)-3′
其中Biotin表示生物素修饰
引物干粉分别加入TE PH8.0溶解，配成PCR引物混合液，使每对引物的度为2.5uM
尿液样本的提取：Zymo research生物公司尿液DNA提取试剂盒(D3061)，按照说明书方法，对5个膀胱癌尿液样本和5个健康尿液样本进行DNA提取。
使用经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化DNA和人类非甲基化DNA(ZYMO RESEARCH，D5014)作为阳性和阴性标准品，经重亚硫酸盐转化后的人类组织DNA样本作为待测样本。
多重检测
1)本实施例PCR扩增体系如下表所示：
成分 体积
PCR引物混合液(2.5μM) 0.8μl
2×Taq酶mix 5μl
转化后DNA模板 2μl
ddH2O 至10μl
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于Bio-rad T100上进行PCR反应，反应程序如下：
2)杂交:96孔板(AXYGEN,PCR-96-LP-FLT-C)每个反应孔中分别加入25μl 2×Tm杂交液(0.4M NaCl，0.2M Tris,0.16％Triton X-100,pH 8.0)、16μl去离子水，6μl步骤1)PCR产物及3μl磁珠混合物(Luminex,MagPlex-TAG Microspheres)，封膜后震荡混匀20s。按照如下条件设置PCR仪并进行反应：95℃，90s,37℃，15min。
3)显色：制备SAPE混合液，包括SAPE原液(Life Technologies,S-866)5.25μl；1×Tm杂交液(0.2M NaCl，0.1M Tris,0.08％Triton X-100,pH 8.0)350μl。将步骤2)杂交产物从PCR仪取下后立即置于磁力板(V&P Scientific,VP771LD-4CS)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入配置好的SAPE混合液25μl，封膜后震荡混匀20s。按如下条件设置PCR仪并进行反应：37℃，15min。反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
4)液相芯片平台检测：步骤3)得到的产物使用Luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照Luminex200操作说明书操作。
5)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
Location Sample B35_ITIH5 B55_ECRG4 B72_β-ACTIN
1(1，A1) C1 685 421.5 605
2(1，B1) C2 715 47.5 453
3(1，C1) C3 83 615.5 625
4(1，D1) C4 978.5 322 349
5(1，E1) C5 29 682 558
6(1，F1) H1 22 84.5 438
7(1，F1) H2 46 48.5 602.5
8(1，G1) H3 36.5 86 420
9(1，A2) H4 55 42 566
10(1，B2) H5 63.5 20.5 510.5
11(1，C2) PC 512 663.5 707
12(1，D2) NC 43 56.5 31.5
13(1，E2) H 45 36.5 59
如上表所示，阳性对照几个位点的检测结果均大于其对应NC值的3倍，证明该方法可以同时进行多个位点的检测；5个患者样本均有不少于1个位点为阳性，而对照均为阴性，证明该方法能够较好地将膀胱癌样本区分出来。
实施例2
本申请示例性方法(下游引物为5’端添加荧光标记)用于检测膀胱癌
本实施例采用的引物由金斯瑞生物科技公司合成，含有M-ITIH5，M-ECRG4，M-β-ACTIN甲基化位点目的区域和NC(不含甲基化位点目的区域)质粒由金唯智生物科技有限公司合成；MagPlex-TAG Microspheres购自Luminex公司；2×Taq Master mix(所需的Taq酶、dNTP混合物，MgCl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自Takara公司(Takara，RR001B)；TMAC(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma T3411)；Sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma L7414)；Tris-HCl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8230)；Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8200)；EDTA(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx 1340GR500)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx 1115GR500)；NaCl(氯化钠)购自天大化学试剂。
pH8.0的TE溶液：物质组成是10mM Tris-HCl、1mM EDTA。
引物探针设计及合成
PCR引物针对甲基化位点设计，引物的纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，引物序列长度为16-30bp，TM值为50-70℃，上游引物5’端添加反向标签序列，下游引物5'端进行荧光修饰。
上游引物：ITIH5-M-F 5'-AATAAGAGAATTGATATGAAGATG(SEQ ID NO：1)CAACACAAATAACCCCTACTA(SEQ ID NO：2)-3'
下游引物：ITIH5-M-R 5'CY3–TTTTCGGTTTTAGTTTTATTAGAGTCG(SEQ ID NO：3)-3'
其中CY3表示荧光修饰。
引物干粉分别加入TE pH8.0溶解，使引物的浓度为2.5μM。
标准品和阴性参照品合成
M-ITIH5,M-ECRG4,M-β-ACTIN甲基化位点目的区域标准品和NC阴性对照标准品干粉分别加无酶水溶解后，稀释至1015拷贝/ml，10倍梯度稀释标准品，均取1010拷贝/ml作为标准品模板，使用M-ITIH5,M-ECRG4,M-β-ACTIN对照标准品分别检测ITIH5引物的特异性。
特异性分析
1)M-ITIH5,M-ECRG4,M-β-ACTIN甲基化位点目的区域标准品，NC阴性标准品，按照上述要求稀释作为待测模板，按照下述步骤进行检测：
2)本实施例PCR扩增体系如下表所示：
成分 体积
PCR引物(2.5μM) 0.8μl
2×Taq Master mix 5μl
待测模板 2μl
ddH2O 至10μl
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于Bio-rad T100上进行PCR反应，反应程序如下：
3)杂交：96孔板(AXYGEN，PCR-96-LP-FLT-C)每个反应孔中分别加入25μl 2×Tm杂交液(0.4M NaCl，0.2M Tris,0.16％Triton X-100,pH 8.0)、16μl去离子水，6μl步骤2)PCR产物及3μl磁珠混合物(Luminex，MagPlex-TAG Microspheres)，封膜后震荡混匀20s。按照如下条件设置PCR仪并进行反应：95℃，90s，37℃，15min。
4)洗涤：将步骤3)杂交产物从PCR仪取下后立即置于磁力板(V&P Scientific，VP771LD-4CS)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
5)液相芯片平台检测：步骤4)得到的产物使用Luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照Luminex200操作说明书操作。
6)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
检测结果如下表所示，M-ITIH5，M-ECRG4，M-β-ACTIN为甲基化位点的目的区域标准品，NC为阴性标准品。
Location Sample B35_ITIH5
1(1，A1) M-ECRG 39
2(1，B1) M-β-ACTIN 42
3(1，C1) M-ITIH5 662
4(1，D1) NC 51
可见，本检测方法ITIH5引物能够特异性的区分M-ITIH5标准品，说明该方法特异性较好。
多重检测分析
本实施例采用的引物和探针由金斯瑞生物科技公司合成；阴性标准品为经重亚硫酸盐转化人类非甲基化DNA，购自Zymo research生物公司(ZYMO RESEARCH，D5014)；MagPlex-TAG Microspheres购自Luminex公司；尿液DNA提取试剂盒购自Zymo research生物公司尿液DNA提取试剂盒(ZYMO RESEARCH,D3061)；2×Taq Master mix(所需的Taq酶、dNTP混合物；MgCl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自Takara公司(Takara，RR001B)；TMAC(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma T3411)；Sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma L7414)；Tris-HCl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷，购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8230)；Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8200)；EDTA(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx 1340GR500)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx 1115GR500)；NaCl(氯化钠)购自天大化学试剂。
按照实施例说明的方法，引物设计及合成，序列如下
上游引物：ECRG4-M-F 5'-GAAGATATTGAAAGAATTTGATGT(SEQ ID NO：4)GAGAGAGGATTTCGGTGGTATTCG(SEQ ID NO：5)-3'
下游引物:ECRG4-M-R 5'CY3-GAATTATCCCTACGTCGCTACCGA(SEQ ID NO：6)-3'
上游引物：β-ACTIN-M-F 5'-AATTGAGAAAGAGATAAATGATAG(SEQ ID NO：7)TTTAATGTTACGTACGATTTTTC(SEQ ID NO：8)-3'
下游引物:β-ACTIN-M-R 5'CY3-GTAGGATGGTATGGGGGA(SEQ ID NO：9)-3'
其中CY3表示荧光修饰
引物干粉分别加入TE PH8.0溶解，配成PCR引物混合液，使每对引物的度为2.5uM
尿液样本的提取：Zymo research生物公司尿液DNA提取试剂盒(D3061)，按照说明书方法，对5个膀胱癌尿液样本和5个健康尿液样本进行DNA提取。
使用经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化DNA和人类非甲基化DNA(ZYMO RESEARCH，D5014)作为阳性和阴性标准品，经重亚硫酸盐转化后的人类尿液DNA样本作为待测样本。
多重检测
1)本实施例PCR扩增体系如下表所示：
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于Bio-rad T100上进行PCR反应，反应程序如下：
2)杂交：96孔板(AXYGEN，PCR-96-LP-FLT-C)每个反应孔中分别加入25μl 2×Tm杂交液(0.4M NaCl，0.2M Tris,0.16％Triton X-100,pH 8.0)、16μl去离子水，6μl步骤1)PCR产物及3μl磁珠混合物(Luminex，MagPlex-TAG Microspheres)，封膜后震荡混匀20s。按照如下条件设置PCR仪并进行反应：95℃，90s，37℃，15min。
3)洗涤：将步骤2)杂交产物从PCR仪取下后立即置于磁力板(V&P Scientific，VP771LD-4CS)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
4)液相芯片平台检测：步骤3)得到的产物使用Luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照Luminex200操作说明书操作。
5)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
Location Sample B35_ITIH5 B55_ECRG4 B72_β-ACTIN
1(1，A1) C1 574 482 744.5
2(1，B1) C2 761 60 686.5
3(1，C1) C3 75 655 608
4(1，D1) C4 985 784.5 457
5(1，E1) C5 46 580.5 628
6(1，F1) H1 57 55 569
7(1，F1) H2 56 47 454
8(1，G1) H3 60.5 102 397
9(1，A2) H4 60 55 543
10(1，B2) H5 54.5 55 403
11(1，C2) PC 550 669 841
12(1，D2) NC 53 57 42
13(1，E2) H 56 41 17.5
如上表所示，阳性对照几个位点的检测结果均大于其对应NC值的3倍，证明该方法可以同时进行多个位点的检测；5个患者样本均有不少于1个位点为阳性，而对照均为阴性，证明该方法能够较好地将膀胱癌样本区分出来。
实施例3
本申请示例性方法(下游引物为5’端添加荧光标记)用于检测甲状腺癌
本实施例采用的引物由金斯瑞生物科技公司合成，含有M-RASSF1A,M-NORE1A,M-DAPK1,M-TSHR,M-β-ACTIN甲基化位点目的区域和NC(不含甲基化位点目的区域)质粒由金唯智生物科技有限公司合成；MagPlex-TAG Microspheres购自Luminex公司；2×TaqMaster mix(所需的Taq酶、dNTP混合物，MgCl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自Takara公司(Takara，RR001B)；TMAC(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma T3411)；Sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma L7414)；Tris-HCl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8230)；Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8200)；EDTA(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx 1340GR500)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx 1115GR500)；NaCl(氯化钠)购自天大化学试剂。
pH8.0的TE溶液：物质组成是10mM Tris-HCl、1mM EDTA。
引物探针设计及合成
PCR引物针对甲基化位点设计，引物的纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，引物序列长度为16-30bp，TM值为55-70℃，上游引物5’端添加反向标签序列，下游引物5'端进行荧光修饰
上游引物：DAPK1-M-F 5'-GAAGATATTGAAAGAATTTGATGT(SEQ ID NO：4)GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC(SEQ ID NO：10)-3'
下游引物：DAPK1-M-R 5'CY3–CCCTCCCAAACGCCGA(SEQ ID NO：11)-3'
其中CY3表示荧光修饰。
引物干粉分别加入TE pH8.0溶解，使引物的浓度为2.5μM。
标准品和阴性参照品合成
M-RASSF1A,M-NORE1A,M-DAPK1,M-TSHR,M-β-ACTIN甲基化位点目的区域标准品和NC阴性对照标准品干粉分别加无酶水溶解后，稀释至1015拷贝/ml，10倍梯度稀释标准品，均取1010拷贝/ml作为标准品模板，使用M-RASSF1A,M-NORE1A,M-DAPK1,M-TSHR,M-β-ACTIN对照标准品分别检测DAPK1引物的特异性。
特异性分析
1)M-RASSF1A,M-NORE1A,M-DAPK1,M-TSHR,M-β-ACTIN甲基化位点目的区域标准品，NC阴性标准品，按照上述要求稀释作为待测模板，按照下述步骤进行检测：
2)本实施例PCR扩增体系如下表所示：
成分 体积
PCR引物(2.5μM) 0.8μl
2×Taq Master mix 5μl
待测模板 2μl
ddH2O 至10μl
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于Bio-rad T100上进行PCR反应，反应程序如下：
3)杂交:96孔板(AXYGEN,PCR-96-LP-FLT-C)每个反应孔中分别加入25μl 2×Tm杂交液(0.4M NaCl，0.2M Tris,0.16％Triton X-100,pH 8.0)、16μl去离子水，6μl步骤2)PCR产物及3μl磁珠混合物(Luminex,MagPlex-TAG Microspheres)，封膜后震荡混匀20s。按照如下条件设置PCR仪并进行反应：95℃，90s,37℃，15min。
4)洗涤：将步骤3)杂交产物从PCR仪取下后立即置于磁力板(V&P Scientific,VP771LD-4CS)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
5)液相芯片平台检测：步骤4)得到的产物使用Luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照Luminex200操作说明书操作。
6)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
检测结果如下表所示，M-RASSF1A,M-NORE1A,M-DAPK1,M-TSHR,M-β-ACTIN为甲基化位点的目的区域标准品，NC为阴性标准品。
Location Sample B55_DAPK1
1(1，A1) M-RASSF1A 29
2(1，B1) M-NORE1A 28
3(1，C1) M-TSHR 37
4(1，D1) M-DAPK1 799
5(1，E1) M-β-ACTIN 58
6(1，F1) NC 23
可见，本检测方法DAPK1引物能够特异性的区分M-DAPK1标准品，说明该方法特异性较好。
多重检测分析
本实施例采用的引物和探针由金斯瑞生物科技公司合成；阴性标准品为经重亚硫酸盐转化人类非甲基化DNA，购自Zymo research生物公司(ZYMO RESEARCH，D5014)；MagPlex-TAG Microspheres购自Luminex公司；组织提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,DP304)；2×Taq Mastermix(所需的Taq酶、dNTP混合物；MgCl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自Takara公司(Takara，RR001B)；TMAC(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(SigmaT3411)；Sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma L7414)；Tris-HCl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷，购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8230)；Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8200)；EDTA(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx 1340GR500)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx1115GR500)；NaCl(氯化钠)购自天大化学试剂。
按照实施例说明的方法，引物设计及合成，序列如下
上游引物：RASSF1A-M-F 5′-AATAAGAGAATTGATATGAAGATG(SEQ ID NO：1)GTGTTAACGCGTTGCGTATC(SEQ ID NO：12)-3′
下游引物：RASSF1A-M-R 5′CY3-ACCCCGCGAACTAAAAACGA(SEQ ID NO：13)-3′
上游引物：NORE1A-M-F 5′-TGTATATGTTAATGAGATGTTGTA(SEQ ID NO：14)TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG(SEQ ID NO：15)-3′
下游引物：NORE1A-M-R 5′CY3-CAAACCCCACAAAACTTAAAAACAA(SEQ ID NO：16)-3′
上游引物：TSHR-M-F 5'-GTAAGAGTATTGAAATTAGTAAGA(SEQ ID NO：17)TGTAGAGTTGAGAATGAGGCGATTTC(SEQ ID NO：18)-3'
下游引物:TSHR-M-R 5'CY3-CCAACTACAACAAATCCGCCG(SEQ ID NO：19)-3'
上游引物：β-ACTIN-M-F 5'-AATTGAGAAAGAGATAAATGATAG(SEQ ID NO：7)TTTAATGTTACGTACGATTTTTC(SEQ ID NO：8)-3'
下游引物:β-ACTIN-M-R 5'CY3-GTAGGATGGTATGGGGGA(SEQ ID NO：9)-3'
其中CY3表示荧光修饰
引物干粉分别加入TE PH8.0溶解，配成PCR引物混合液，使每对引物的度为2.5uM
组织样本DNA的提取：组织DNA提取参照组织DNA提取试剂盒(TIANGEN,DP304)，按照说明书方法，对5个甲状腺癌组织样本和5个非甲状腺癌组织样本进行DNA提取。
使用经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化DNA和人类非甲基化DNA(ZYMO RESEARCH，D5014)作为阳性和阴性标准品，经重亚硫酸盐转化后的人类组织DNA样本作为待测样本。
多重检测
1)本实施例PCR扩增体系如下表所示：
成分 体积
PCR引物混合液(2.5μM) 0.8μl
2×Taq酶mix 5μl
转化后DNA模板 2μl
ddH2O 至10μl
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于Bio-rad T100上进行PCR反应，反应程序如下：
2)杂交:96孔板(AXYGEN,PCR-96-LP-FLT-C)每个反应孔中分别加入25μl 2×Tm杂交液(0.4M NaCl，0.2M Tris,0.16％Triton X-100,pH 8.0)、16μl去离子水，6μl步骤1)PCR产物及3μl磁珠混合物(Luminex,MagPlex-TAG Microspheres)，封膜后震荡混匀20s。按照如下条件设置PCR仪并进行反应：95℃，90s,37℃，15min。
3)洗涤：将步骤2)杂交产物从PCR仪取下后立即置于磁力板(V&P Scientific,VP771LD-4CS)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液75μl，震荡混匀20s
4)液相芯片平台检测：步骤3)得到的产物使用Luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照Luminex200操作说明书操作。
5)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
Location Sample B35_RASSF1 B37_NORE1 B55_DAPK1 B66_TSHR B72_β-ACTIN
1(1，A1) C1 351 397 365.5 436 530
2(1，B1) C2 407.5 223 53 68 578
3(1，C1) C3 427 346.5 41 96 390
4(1，D1) C4 17 375 378 732 522
5(1，E1) C5 515 232 23 57 609
6(1，F1) H1 32 41 40 32 403
7(1，F1) H2 26 33.5 71 57 552
8(1，G1) H3 32 39 27.5 41.5 361
9(1，A2) H4 56 42 41 29 395
10(1，B2) H5 15 36.5 33.5 56 377
11(1，C2) PC 508 392.5 355 547.5 436
12(1，D2) NC 27 22 19 53 24
13(1，E2) H 32 17.5 23 41 27
上表数据显示，阳性对照几个位点的检测结果均大于其对应NC值的3倍，证明该方法可以同时进行多个位点的检测；5个患者样本均有不少于2个位点为阳性，而对照均为阴性，证明该方法能够较好地将甲状腺癌样本区分出来。
实施例4
本申请示例性方法(下游引物为5’端添加荧光标记)用于检测前列腺癌
本实施例采用的引物由金斯瑞生物科技公司合成，含有M-MDR1，M-RASSF1A，M-APC，M-β-ACTIN甲基化位点目的区域和NC(不含甲基化位点目的区域)质粒由金唯智生物科技有限公司合成；MagPlex-TAG Microspheres购自Luminex公司；2×Taq Master mix(所需的Taq酶、dNTP混合物，MgCl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自Takara公司(Takara，RR001B)；TMAC(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(SigmaT3411)；Sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(SigmaL7414)；Tris-HCl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8230)；Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8200)；EDTA(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx 1340GR500)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx 1115GR500)；NaCl(氯化钠)购自天大化学试剂。
pH8.0的TE溶液：物质组成是10mM Tris-HCl、1mM EDTA。
引物探针设计及合成
PCR引物针对甲基化位点设计，引物的纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，引物序列长度为18-30bp，TM值为55-70℃，上游引物5’端添加反向标签序列，下游引物5'端进行荧光修饰。
上游引物：MDR1-M-F 5'-AATAAGAGAATTGATATGAAGATG(SEQ ID NO：1)GGCGGGTAAAGTTTAGAACGCG(SEQ ID NO：20)-3'
下游引物：MDR1-M-R 5'CY3–AAACGCCCGCCGTTAATACCC(SEQ ID NO：21)-3'
其中CY3表示荧光修饰。
引物干粉分别加入TE pH8.0溶解，使引物的浓度为2.5μM。
标准品和阴性参照品合成
M-MDR1,M-RASSF1A,M-APC,M-β-ACTIN甲基化位点目的区域标准品和NC阴性对照标准品干粉分别加无酶水溶解后，稀释至1015拷贝/ml，10倍梯度稀释标准品，均取1010拷贝/ml作为标准品模板，使用M-MDR1,M-RASSF1A,M-APC,M-β-ACTIN对照标准品分别检测MDR1引物的特异性。
特异性分析
1)M-MDR1,M-RASSF1A,M-APC,M-β-ACTIN甲基化位点目的区域标准品，NC阴性标准品，按照上述要求稀释作为待测模板，按照下述步骤进行检测：
2)本实施例PCR扩增体系如下表所示：
成分 体积
PCR引物(2.5μM) 0.8μl
2×Taq Master mix 5μl
待测模板 2μl
ddH2O 至10μl
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于Bio-rad T100上进行PCR反应，反应程序如下：
3)杂交：96孔板(AXYGEN，PCR-96-LP-FLT-C)每个反应孔中分别加入25μl 2×Tm杂交液(0.4M NaCl，0.2M Tris,0.16％Triton X-100,pH 8.0)、16μl去离子水，6μl步骤2)PCR产物及3μl磁珠混合物(Luminex，MagPlex-TAG Microspheres)，封膜后震荡混匀20s。按照如下条件设置PCR仪并进行反应：95℃，90s，37℃，15min。
4)洗涤：将步骤3)杂交产物从PCR仪取下后立即置于磁力板(V&P Scientific，VP771LD-4CS)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
5)液相芯片平台检测：步骤4)得到的产物使用MAGPIX液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照MAGPIX操作说明书操作。
6)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
检测结果如下表所示，M-MDR1，M-RASSF1A,M-APC，M-β-ACTIN为甲基化位点的目的区域标准品，NC为阴性标准品。
Location Sample B35_MDR1
1(1，A1) M-MDR1 576
2(1，B1) M-RASSF1A 62.5
3(1，C1) M-APC 32
4(1，D1) M-β-ACTIN 29
5(1，E1) NC 32
可见，本检测方法MDR1引物能够特异性的区分M-MDR1标准品，说明该方法特异性较好。
多重检测分析
本实施例采用的引物和探针由金斯瑞生物科技公司合成；阴性标准品为经重亚硫酸盐转化人类非甲基化DNA，购自Zymo research生物公司(ZYMO RESEARCH，D5014)；MagPlex-TAG Microspheres购自Luminex公司；组织提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,DP304)；2×Taq Mastermix(所需的Taq酶、dNTP混合物；MgCl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自Takara公司(Takara，RR001B)；SAPE原液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Life Technologies，S-866)，TMAC(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma T3411)；Sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma L7414)；Tris-HCl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷，购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8230)；Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio T8200)；EDTA(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx 1340GR500)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(BioFroxx 1115GR500)；NaCl(氯化钠)购自天大化学试剂。
按照实施例说明的方法，引物设计及合成，序列如下
上游引物：RASSF1A-M-F 5'-GAAGATATTGAAAGAATTTGATGT(SEQ ID NO：4)GCGTTGAAGTCGGGGTTC(SEQ ID NO：22)-3'
下游引物:RASSF1A-M-R 5'CY3-CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG(SEQ ID NO：23)-3'
上游引物：APC-M-F 5'-GTAAGAGTATTGAAATTAGTAAGA(SEQ ID NO：17)TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT(SEQ ID NO：24)-3'
下游引物:APC-M-R 5'CY3-GAACCAAAACGCTCCCCA(SEQ ID NO：25)-3'
上游引物：β-ACTIN-M-F 5'-AATTGAGAAAGAGATAAATGATAG(SEQ ID NO：7)TTTAATGTTACGTACGATTTTTC(SEQ ID NO：8)-3'
下游引物:β-ACTIN-M-R 5'CY3-GTAGGATGGTATGGGGGA(SEQ ID NO：9)-3'
其中CY3表示荧光修饰。
引物干粉分别加入TE PH8.0溶解，配成PCR引物混合液，使每对引物的度为2.5uM
组织样本DNA的提取：组织DNA提取参照组织DNA提取试剂盒(TIANGEN,DP304)，按照说明书方法，对5个前列腺癌组织样本和5个非前列腺癌组织样本进行DNA提取。
使用经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化DNA和人类非甲基化DNA(ZYMO RESEARCH，D5014)作为阳性和阴性标准品，经重亚硫酸盐转化后的人类组织DNA样本作为待测样本。
多重检测
1)本实施例PCR扩增体系如下表所示：
成分 体积
PCR引物混合液(2.5μM) 0.8μl
2×Taq酶mix 5μl
转化后DNA模板 2μl
ddH2O 至10μl
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于Bio-rad T100上进行PCR反应，反应程序如下：
/>
2)杂交:96孔板(AXYGEN,PCR-96-LP-FLT-C)每个反应孔中分别加入25μl 2×Tm杂交液(0.4M NaCl，0.2M Tris,0.16％Triton X-100,pH 8.0)、16μl去离子水，6μl步骤1)PCR产物及3μl磁珠混合物(Luminex,MagPlex-TAG Microspheres)，封膜后震荡混匀20s。按照如下条件设置PCR仪并进行反应：95℃，90s,37℃，15min。
3)洗涤：将步骤2)杂交产物从PCR仪取下后立即置于磁力板(V&P Scientific,VP771LD-4CS)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
4)液相芯片平台检测：步骤3)得到的产物使用MAGPIX液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照MAGPIX操作说明书操作。
5)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
Location Sample B39_MDR1 B55_RASSF1A B66_APC B72_β-ACTIN
1(1，A1) C1 356 484 660 451
2(1，B1) C2 197 58 463 624
3(1，C1) C3 52 705.5 437 516
4(1，D1) C4 321 47 36 406
5(1，E1) C5 279 701 59 498
6(1，F1) H1 80 90 37 522
7(1，F1) H2 62 63 48 609
8(1，G1) H3 48 56 52 619
9(1，A2) H4 57 32 86 573
10(1，B2) H5 33 22 106.5 725
11(1，C2) PC 712 593.5 706 692
12(1，D2) NC 59 46.5 41.5 53
13(1，E2) H 22 76.5 38 27.5
上表结果显示，阳性对照几个位点的检测结果均大于其对应NC值的3倍，证明该方法可以同时进行多个位点的检测；5个患者样本均有不少于1个位点为阳性，而对照均为阴性，证明该方法能够较好地将前列腺癌样本区分出来。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
序列表
<110> 昂凯生命科技（苏州）有限公司
<120> 一种多基因甲基化检测方法及其应用
<130> 0262-PA-006
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> transTag 1
<400> 1
aataagagaa ttgatatgaa gatg 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ITIH5 F 1
<400> 2
caacacaaat aacccctact a 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ITIH5 R 1
<400> 3
ttttcggttt tagttttatt agagtcg 27
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> transTag 2
<400> 4
gaagatattg aaagaatttg atgt 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ECRG4 F 1
<400> 5
gagagaggat ttcggtggta ttcg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ECRG4 R 1
<400> 6
gaattatccc tacgtcgcta ccga 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> transTag 3
<400> 7
aattgagaaa gagataaatg atag 24
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> beta ACTIN F 1
<400> 8
tttaatgtta cgtacgattt ttc 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> beta ACTIN R 1
<400> 9
gtaggatggt atggggga 18
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> DAPK1 F
<400> 10
ggatagtcgg atcgagttaa cgtc 24
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> DAPK1 R
<400> 11
ccctcccaaa cgccga 16
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RASSF1A F 1
<400> 12
gtgttaacgc gttgcgtatc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RASSF1A R 1
<400> 13
accccgcgaa ctaaaaacga 20
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> transTag 9
<400> 14
tgtatatgtt aatgagatgt tgta 24
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NORE1A F
<400> 15
tttggttgga gtgtgttaat gtg 23
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NORE1A R
<400> 16
caaaccccac aaaacttaaa aacaa 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> transTag 10
<400> 17
gtaagagtat tgaaattagt aaga 24
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TSHR F
<400> 18
tgtagagttg agaatgaggc gatttc 26
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TSHR R
<400> 19
ccaactacaa caaatccgcc g 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MDR1 F
<400> 20
ggcgggtaaa gtttagaacg cg 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MDR1 R
<400> 21
aaacgcccgc cgttaatacc c 21
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RASSF1A F
<400> 22
gcgttgaagt cggggttc 18
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RASSF1A R
<400> 23
cccgtacttc gctaacttta aacg 24
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> APC F
<400> 24
ttatatgtcg gttacgtgcg tttatat 27
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> APC R
<400> 25
gaaccaaaac gctcccca 18

Claims (10)

1.一种目标核酸的扩增和/或检测方法，所述方法包含以下步骤：(a)提供引物对，所述引物对包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含反向标签序列和靶向目标核酸的序列，所述第二引物包含靶向目标核酸的序列；(b)提供标记，所述标记连接在所述第二引物；(c)提供探针，所述探针能够捕获所述反向标签序列；(d)在适合于扩增和/或检测所述目标核酸的条件下，使所述引物对、所述标记、所述探针以及包含所述目标核酸的样品接触。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包含以下步骤：(d-1)在适合于扩增所述目标核酸的条件下，使所述引物对、所述标记以及包含所述目标核酸的样品接触，获得扩增产物；(d-2)在适合于检测所述目标核酸的条件下，使所述探针以及所述扩增产物接触，获得杂交产物；(d-3)确定所述杂交产物中所述标记的存在和/或含量。
3.如权利要求1所述的方法，所述目标核酸包含具有甲基化修饰的目标核酸。
4.如权利要求1所述的方法，所述目标核酸来源于膀胱癌、甲状腺癌、和/或前列腺癌的肿瘤特异性基因。
5.如权利要求1所述的方法，所述目标核酸来源于选自以下组的基因：APC、ITIH5、ECRG4、DAPK1、RASSF1A、NORE1A、TSHR、和MDR1。
6.如权利要求1所述的方法，所述第一引物的所述反向标签序列能够使得所述探针捕获第二引物扩增的目标核酸。
7.如权利要求1所述的方法，所述方法还包含针对内参核酸进行扩增和/或扩增，包含通过所述扩增和/或检测目标核酸的方法扩增和/或检测所述内参核酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，所述标记能够直接或间接使所述扩增产物产生信号，通过检测所述信号确定所述杂交产物中所述标记的存在和/或含量。
9.一种引物对，所述引物对包含如权利要求1-7中任一项所述的第一引物和/或如权利要求1-7中任一项所述的第二引物。
10.一种试剂盒，所述试剂盒包含一种或更多种如权利要求1-7中任一项所述的第一引物和/或如权利要求1-7中任一项所述的第二引物，以及任选地包含一种或更多种如权利要求1-7中任一项所述的探针。
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