CN117327157A - 一种多肽偶联药物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种多肽偶联药物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多肽偶联药物及其制备方法和应用。该多肽偶联药物，包括：肿瘤靶向多肽，细胞毒性药物和连接子；其中，所述肿瘤靶向多肽的氨基酸序列为：Cyclo(Phe‑X‑Arg‑Gly‑Asp)，X表示氨基酸残基为Lys、Orn、Dab或Dap。本发明提供的肿瘤靶向多肽具有靶向性，环状结构的RGD携带药物靶向肿瘤细胞表面，以本发明靶向多肽作为小分子抗肿瘤药的载体制备多肽偶联药物，能够定向地把抗肿瘤药物递送至肿瘤细胞膜表面，并完成小分子药物的释放，进行肿瘤的特异性靶向治疗。

Description

一种多肽偶联药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体的说，尤其涉及一种基于羟氟吴茱萸碱的多肽偶联药物及其制备方法和应用。
背景技术
2022年2月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据。2020年全球新发癌症病例1929万例，癌症死亡病例996万例，其中全球乳腺癌新发病例一年高达226万例，成为全球第一大癌，而肺癌一年死亡180万例，高居全球癌症死亡人群首位。
传统的癌症治疗方法包括手术、放疗以及化疗等，其中化疗是目前治疗癌症的主要手段之一。但在治疗过程中，患者存在脱发，呕吐，骨髓抑制等不良反应，严重损害患者的生命健康。
目前，治疗癌症的小分子化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时，也会杀死大量人体健康细胞，导致患者免疫力急速下降，毒副作用大。
与小分子药物相比，目前正在兴起的抗体偶联药物在治疗癌症方面表现出较强的靶向性。但相比于传统的小分子药物，抗体偶联药物因其较大的分子量以及类似蛋白质的理化性质，限制了其在各类实体瘤疾病中的应用。
与抗体药物相比，多肽药物分子量相对较小，在生产制造的过程中成本低廉，并且获得的产品纯度比抗体高很多，使用过程中的毒副作用较小，同时，生产成本要明显低于抗体药物。多肽组织渗透性强，与抗癌药物联合可应用于肿瘤的靶向治疗，具有更好的药物靶向递送途径和疗效。目前，多肽偶联药物已成为肿瘤靶向治疗的新研究热点。
肿瘤靶向肽是指能够特异性的结合到肿瘤细胞和肿瘤血管的多肽，通常是由5～31个氨基酸组成的分子量较小的活性肽。与抗体相比，其具有以下优点：免疫原性低、易通过生理屏障、组织渗透性强、易化学合成、成本低。
3-氟-10-羟基吴茱萸碱是一种活性较高的癌症化疗药物。但因为没有实现靶向治疗，其本身对正常细胞的损伤较大，因此，用药量受到了很大限制，患者的耐药性以及治疗效果并不理想。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提供了一种多肽偶联药物及其制备方法和应用。本发明提供的肿瘤靶向多肽具有靶向性，环状结构的RGD携带药物靶向肿瘤细胞表面，以本发明靶向多肽作为小分子抗肿瘤药的载体制备多肽偶联药物，能够定向地把抗肿瘤药物递送至肿瘤细胞膜表面，并完成小分子药物的释放，进行肿瘤的特异性靶向治疗。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：
本发明第一方面提供了一种肿瘤靶向多肽，其氨基酸序列为：
Cyclo(Phe-X-Arg-Gly-Asp)，所述Asp侧链羧基与Phe主链氨基形成酰胺环；其中，X表示氨基酸残基为Lys、Orn、Dab或Dap。
本发明第二方面提供了上述肿瘤靶向多肽在制备多肽偶联药物中的应用。
本发明第三方面提供了一种多肽偶联药物，所述多肽偶联药物包括肿瘤靶向多肽，细胞毒性药物和连接子，所述连接子将所述肿瘤靶向多肽与所述细胞毒性药物相连接。
进一步地，所述细胞毒性药物为肿瘤化疗药物。
进一步地，所述肿瘤化疗药物为3-氟-10-羟基吴茱萸碱。
进一步地，所述连接子为戊二酸、亚硫基二乙酸或3，3-二硫代二丙酸。
进一步地，所述多肽偶联药物具有如式(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的结构：
其中，n为1，2，3或4；
其中，n为1，2，3或4；
其中，n为1，2，3或4。
本发明第四方面提供了上述多肽偶联药物的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用Fmoc固相多肽合成技术，将Fmoc-Asp(Oall)-OH偶联到Wang树脂上，然后依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-X(ivDde)-OH(X＝Lys、Orn、Dab、Dap)、Fmoc-D-Phe-OH，偶联完成后，脱除Asp残基侧链的OAll保护基团，加入缩合剂，完成环化反应；
(2)步骤(1)环化反应完成后，进行步骤2，具体为：
脱除X侧链的ivDde保护基团，得到Cyclo(D-Phe-X-Arg-Gly-Asp)，Asp侧链羧基与D-Phe主链氨基形成酰胺环，得肽树脂；其中，X为Dap、Dab、Orn或Lys；
(3)使用连接子将步骤(2)得到的肽树脂与细胞毒性药物相连接，得到多肽偶联药物树脂，用TFA裂解多肽偶联药物树脂，经过纯化，即得所述多肽偶联药物。
进一步地，所述细胞毒性药物为3-氟-10-羟基吴茱萸碱时，步骤(3)中所述多肽偶联药物树脂的制备具体为：在步骤(2)所得肽树脂上加入缩合试剂和3-氟-10-羟基吴茱萸碱，偶联反应，得到所述多肽偶联药物树脂。
进一步地，所述缩合试剂为DIC、HOBT。
本发明第五方面提供了上述多肽偶联药物在制备癌症靶向治疗药物中的应用。
本发明第六方面提供一种癌症靶向治疗的药物组合物，包括所述多肽偶联药物。
进一步地，所述癌症包括肝癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、喉脑癌、结肠直肠癌、食道癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、各种淋巴瘤或黑色素瘤。
进一步地，所述癌症为肺癌或乳腺癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明提供的肿瘤靶向多肽具有靶向性，环状结构的RGD携带药物靶向肿瘤细胞表面，以本发明靶向多肽作为小分子抗肿瘤药的载体制备多肽偶联药物，能够定向地把抗肿瘤药物递送至肿瘤细胞膜表面，并完成小分子药物的释放，进行肿瘤的特异性靶向治疗。
本发明的多肽偶联药物，通过Asp侧链羧基与D-Phe主链氨基连接，多肽序列进行相应的环化，形成稳定构象的多肽序列，可以避免多肽在体内的提前降解。
本发明的多肽偶联药物，在一个药物分子中，引入了细胞毒性药物3-氟-10-羟基吴茱萸碱，增加了肿瘤药物的治疗效果。
附图说明
图1为Cyclo(D-Phe-X-Arg-Gly-Asp，其中X为Dap)纯品的MS分析谱图(MW：561)；
图2为Cyclo(D-Phe-X-Arg-Gly-Asp，其中X为Dab)纯品的MS分析谱图(MW：575)；
图3为Cyclo(D-Phe-X-Arg-Gly-Asp，其中X为Orn)纯品的MS分析谱图(MW：589)；
图4为Cyclo(D-Phe-X-Arg-Gly-Asp，其中X为Lys)纯品的MS分析谱图(MW：603)；
图5为多肽偶联药物A纯品的MS分析谱图(MW：1012)；
图6为多肽偶联药物B纯品的MS分析谱图(MW：1026)；
图7为多肽偶联药物C纯品的MS分析谱图(MW：1040)；
图8为多肽偶联药物D纯品的MS分析谱图(MW：1054)；
图9为多肽偶联药物E纯品的MS分析谱图(MW：1072)；
图10为多肽偶联药物F纯品的MS分析谱图(MW：1086)；
图11为多肽偶联药物G纯品的MS分析谱图(MW：1100)；
图12为多肽偶联药物H纯品的MS分析谱图(MW：1114)；
图13为多肽偶联药物I纯品的MS分析谱图(MW：994)；
图14为多肽偶联药物J纯品的MS分析谱图(MW：1008)；
图15为多肽偶联药物K纯品的MS分析谱图(MW：1022)；
图16为多肽偶联药物L纯品的MS分析谱图(MW：1036)；
图17为多肽偶联药物与6-氨基己酸香豆素纯品的MS分析谱图(MW：1524)；
图18为划痕实验检测多肽偶联药物对肿瘤迁移的影响；
图19为Transwell实验检测多肽偶联药物对肿瘤迁移的影响；
图20为流式细胞术检测肿瘤细胞对带荧光标记的多肽偶联药物的摄取；
图21为激光共聚焦显微镜检测带荧光标记的多肽偶联药物与肿瘤细胞特异性结合能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例所用试剂均可通过市售途径获得。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：多肽序列的合成(X为Dap)
采用Fmoc固相多肽合成技术进行多肽序列的合成。称取载样量为0.37mmol/g的Wang树酯1g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀30min；称取Fmoc-Asp(Oall)-OH0.438g(1.11mmol)，HOBT 0.149g(1.11mmol)，DMAP 0.135g(1.11mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入160μl DIC(1mmol)，活化5min，加入反应柱，反应1.5小时后，加入14mL醋酸酐和12mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，得到Fmoc-Asp(Oall)-OH Wang树脂，然后根据Fmoc固相多肽合成的常规方法，按照序列依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Dap(ivDde)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，脱除Fmoc-D-Phe-OH上的Fmoc保护基团。
偶联完成后，用Pd(PPh3)4/苯硅烷的DCM溶液，脱除Asp残基侧链羧基上的OAll保护基团。然后加入HATU/HOAt/DIEA(4mmol/4.8mmol/6.0mmol)，在DMF中反应4小时，在固相上完成相应的环化反应。
上述环化完成的肽树脂，用DCM清洗3次，再用DMF清洗树脂3次。加入2％水合肼的DMF溶液反应45min，得到Cyclo(D-Phe-Dap-Arg-Gly-Asp)(Asp侧链羧基与D-Phe主链氨基形成酰胺环)的肽树脂，备用。该纯品的MS分析谱图如图1所示。
实施例2：多肽序列的合成(X为Dab)
采用Fmoc固相多肽合成技术进行多肽序列的合成。称取载样量为0.37mmol/g的Wang树酯1g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀30min；称取Fmoc-Asp(Oall)-OH0.438g(1.11mmol)，HOBT 0.149g(1.11mmol)，DMAP 0.135g(1.11mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入160μl DIC(1mmol)，活化5min，加入反应柱，反应1.5小时后，加入14mL醋酸酐和12mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，得到Fmoc-Asp(Oall)-OH Wang树脂，然后根据Fmoc固相多肽合成的常规方法，按照序列依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Dab(ivDde)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，脱除Fmoc-D-Phe-OH上的Fmoc保护基团。
偶联完成后，用Pd(PPh3)4/苯硅烷的DCM溶液，脱除Asp残基侧链羧基上的OAll保护基团。然后加入HATU/HOAt/DIEA(4mmol/4.8mmol/6.0mmol)，在DMF中反应4小时，在固相上完成相应的环化反应。
上述环化完成的肽树脂，用DCM清洗3次，再用DMF清洗树脂3次。加入2％水合肼的DMF溶液反应45min，得到Cyclo(D-Phe-Dab-Arg-Gly-Asp)(Asp侧链羧基与D-Phe主链氨基形成酰胺环)的肽树脂，备用。该纯品的MS分析谱图如图2所示。
实施例3：多肽序列的合成(X为Orn)
采用Fmoc固相多肽合成技术进行多肽序列的合成。称取载样量为0.37mmol/g的Wang树酯1g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀30min；称取Fmoc-Asp(Oall)-OH0.438g(1.11mmol)，HOBT 0.149g(1.11mmol)，DMAP 0.135g(1.11mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入160μl DIC(1mmol)，活化5min，加入反应柱，反应1.5小时后，加入14mL醋酸酐和12mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，得到Fmoc-Asp(Oall)-OH Wang树脂，然后根据Fmoc固相多肽合成的常规方法，按照序列依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Orn(ivDde)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，脱除Fmoc-D-Phe-OH上的Fmoc保护基团。
偶联完成后，用Pd(PPh3)4/苯硅烷的DCM溶液，脱除Asp残基侧链羧基上的OAll保护基团。然后加入HATU/HOAt/DIEA(4mmol/4.8mmol/6.0mmol)，在DMF中反应4小时，在固相上完成相应的环化反应。
上述环化完成的肽树脂，用DCM清洗3次，再用DMF清洗树脂3次。加入2％水合肼的DMF溶液反应45min，得到Cyclo(D-Phe-Orn-Arg-Gly-Asp)(Asp侧链羧基与D-Phe主链氨基形成酰胺环)的肽树脂，备用。该纯品的MS分析谱图如图3所示。
实施例4：多肽序列的合成(X为Lys)
采用Fmoc固相多肽合成技术进行多肽序列的合成。称取载样量为0.37mmol/g的Wang树酯1g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀30min；称取Fmoc-Asp(Oall)-OH0.438g(1.11mmol)，HOBT 0.149g(1.11mmol)，DMAP 0.135g(1.11mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入160μl DIC(1mmol)，活化5min，加入反应柱，反应1.5小时后，加入14mL醋酸酐和12mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，得到Fmoc-Asp(Oall)-OH Wang树脂，然后根据Fmoc固相多肽合成的常规方法，按照序列依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(ivDde)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，脱除Fmoc-D-Phe-OH上的Fmoc保护基团。
偶联完成后，用Pd(PPh3)4/苯硅烷的DCM溶液，脱除Asp残基侧链羧基上的OAll保护基团。然后加入HATU/HOAt/DIEA(4mmol/4.8mmol/6.0mmol)，在DMF中反应4小时，在固相上完成相应的环化反应。
上述环化完成的肽树脂，用DCM清洗3次，再用DMF清洗树脂3次。加入2％水合肼的DMF溶液反应45min，得到Cyclo(D-Phe-Lys-Arg-Gly-Asp)(Asp侧链羧基与D-Phe主链氨基形成酰胺环)的肽树脂，备用。该纯品的MS分析谱图如图4所示。
实施例5：3-氟-10-羟基吴茱萸碱通过硫醚键与多肽偶联
在四氢呋喃溶剂中，加入0.38g(2.9mmol)1，4-氧硫杂环己烷-2，6-二酮和144μl(2.9mmol)三乙胺与1g(2.9mmol)3-氟-10-羟基吴茱萸碱在N2保护下常温反应，5小时后，得到1，4-氧硫杂环己烷-2，6-二酮和3-氟-10-羟基吴茱萸碱偶联的化合物1，结构如下：
称取实施例1得到的肽树脂1g(0.37mmol)，加入带有夹套的固相反应柱，DMF溶胀树脂30分钟之后，加入1.11mmol的HOBt(3eq)，1.11mmol的DIC(3eq)和1.11mmol上述得到的化合物1(3eq)，加入DMF作为反应溶剂，室温下反应4h，得到3-氟-10-羟基吴茱萸碱与多肽偶联的肽树脂1.2g。
将上述1.2g肽树脂加入到50ml离心管中，预先配制裂解液10ml(TFA：H2O：TIPS＝95％:2.5％:2.5％),将裂解液加入50ml离心管中，室温反应4h，虑掉树脂，滤液加入到40ml无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤白色固体，真空干燥，得到白色固体偶联药物A的粗品0.38g。多肽偶联药物A，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物A的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物A纯品的MS分析谱图如图5。
采用与实施例5上述相同的制备方法，区别仅在于所使用的肽树脂为实施例2所得，偶联后得到0.38g多肽偶联药物B，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物B的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物B纯品的MS分析谱图如图6。
采用与实施例5上述相同的制备方法，区别仅在于所使用的肽树脂为实施例3所得，
偶联后得到0.38g多肽偶联药物C，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物C的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物C纯品的MS分析谱图如图7。
采用与实施例5上述相同的制备方法，区别仅在于所使用的肽树脂为实施例4所得，偶联后得到0.38g多肽偶联药物D，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物D的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物D纯品的MS分析谱图如图8。
实施例6：3-氟-10-羟基吴茱萸碱通过二硫键与多肽偶联
在四氢呋喃溶剂中，加入0.61g(2.9mmol)3，3二硫代二丙酸和144μl(2.9mmol)三乙胺与1g(2.9mmol)3-氟-10-羟基吴茱萸碱在N2保护下常温反应，5小时后，得到3，3二硫代二丙酸和3-氟-10-羟基吴茱萸碱偶联的化合物2，结构如下：
称取实施例1得到的肽树脂1g(0.37mmol)，加入带有夹套的固相反应柱，DMF溶胀树
脂30分钟之后，加入1.11mmol的HOBt(3eq)，1.11mmol的DIC(3eq)和1.11mmol上述得到的化合物1(3eq)，加入DMF作为反应溶剂，室温下反应4h，得到3-氟-10-羟基吴茱萸碱与多肽偶联的肽树脂1.2g。
将上述1.2g肽树脂加入到50ml离心管中，预先配制裂解液10ml(TFA：H2O：TIPS＝95％:2.5％:2.5％),将裂解液加入50ml离心管中，室温反应4h，虑掉树脂，滤液加入到40ml无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤白色固体，真空干燥，得到白色固体偶联药物E的粗品0.38g。多肽偶联药物E，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物E的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物E纯品的MS分析谱图如图9。
采用与实施例6上述相同的制备方法，区别仅在于所使用的肽树脂为实施例2所得，偶联后得到0.38g多肽偶联药物F，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物F的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物F纯品的MS分析谱图如图10。
采用与实施例6上述相同的制备方法，区别仅在于所使用的肽树脂为实施例3所得，偶联后得到0.38g多肽偶联药物G，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物G的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物G纯品的MS分析谱图如图11。
采用与实施例6上述相同的制备方法，区别仅在于所使用的肽树脂为实施例4所得，偶联后得到0.38g多肽偶联药物H，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物H的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物H纯品的MS分析谱图如图12。
实施例7：3-氟-10-羟基吴茱萸碱通过烷烃链与多肽偶联
在四氢呋喃溶剂中，加入0.38g(3.33mmol)戊二酸酐和462.8μl(3.33mmol)三乙胺与1.12g(3.33mmol)3-氟-10-羟基吴茱萸碱在N2保护下常温反应，5小时后，得到戊二酸酐和3-氟-10-羟基吴茱萸碱偶联的化合物3，结构如下：
称取实施例1得到的肽树脂1g(0.37mmol)，加入带有夹套的固相反应柱，DMF溶胀树脂30分钟之后，加入1.11mmol的HOBt(3eq)，1.11mmol的DIC(3eq)和1.11mmol上述得到的化合物1(3eq)，加入DMF作为反应溶剂，室温下反应4h，得到3-氟-10-羟基吴茱萸碱与多肽偶联的肽树脂1.2g。
将上述1.2g肽树脂加入到50ml离心管中，预先配制裂解液10ml(TFA：H2O：TIPS＝95％:2.5％:2.5％),将裂解液加入50ml离心管中，室温反应4h，虑掉树脂，滤液加入到40ml无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤白色固体，真空干燥，得到白色固体偶联药物I的粗品0.38g。多肽偶联药物I，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物I的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物I纯品的MS分析谱图如图13。
采用与实施例7上述相同的制备方法，区别仅在于所使用的肽树脂为实施例2所得，偶联后得到0.38g多肽偶联药物J，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物J的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物J纯品的MS分析谱图如图14。
采用与实施例7上述相同的制备方法，区别仅在于所使用的肽树脂为实施例3所得，偶联后得到0.38g多肽偶联药物K，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物K的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物K纯品的MS分析谱图如图15。
采用与实施例7上述相同的制备方法，区别仅在于所使用的肽树脂为实施例4所得，偶联后得到0.38g多肽偶联药物L，结构如下：
合成得到的多肽偶联药物L的粗品0.38g，采用HPLC纯化得到相应的纯品。
多肽偶联药物L纯品的MS分析谱图如图16。
表1化合物1，2和3的1HNMR，13CNMR和MS数据
/>
实施例8：多肽偶联药物与6-氨基己酸香豆素
在N，N-二甲基甲酰胺溶剂中，加入0.1g(0.38mmol)7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羧酸、0.117g(0.456mmol)N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、0.05g(0.038mmol)4-二甲氨基吡啶和0.996g(0.76mmol)6-氨基己酸常温反应，5小时后，得到7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羧酸与6-氨基己酸偶联的化合物4，结构如下：
/>
称取实施例3得到的肽树脂1g(0.37mmol)，加入带有夹套的固相反应柱，DMF溶胀树脂30分钟之后，加入1.11mmol的HOBt(3eq)，1.11mmol的DIC(3eq)和1.11mmol的Fmoc-Lys(ivDde)-OH(3eq)常温反应4h，用DCM清洗3次，再用DMF清洗树脂3次，然后加入20％哌啶鼓泡反应10min，再用DCM清洗3次，用DMF清洗树脂3次，然后加入1.11mmol的HOBt(3eq)，1.11mmol的DIC(3eq)和1.11mmol上述得到的化合物1(3eq)，加入DMF作为反应溶剂，室温下反应4h，用DCM清洗3次，再用DMF清洗树脂3次。加入2％水合肼的DMF溶液反应45min，然后加入1.11mmol的HOBt(3eq)，1.11mmol的DIC(3eq)和1.11mmol上述得到的化合物4(3eq)得到6-氨基己酸香豆素与多肽偶联药物C偶联的肽树脂1.2g。
将上述1.2g肽树脂加入到50ml离心管中，预先配制裂解液10ml(TFA：H2O：TIPS＝95％:2.5％:2.5％),将裂解液加入50ml离心管中，室温反应4h，虑掉树脂，滤液加入到40ml无水乙醚中，析出黄色固体，离心，无水乙醚洗涤黄色固体，真空干燥，得到黄色固体偶联药物M的粗品0.38g。多肽偶联药物与6-氨基己酸M，结构如下：
实施例9：CCK8实验检测多肽偶联药物的体外抗肿瘤活性
(1)将处于对数生长期的肿瘤细胞U87(αvβ3整合素高表达)，A549(αvβ3整合素低表达)，Hela细胞(αvβ3整合素低表达)，MCF-7(αvβ3整合素不表达)用胰酶消化。用培养基(DMEM+10％ FBS+1％双抗)将细胞稀释成单细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL。
(2)每孔100μL接种于96孔板中，置37℃、5％ CO2培养箱内培养24h。
(3)分别加入不同浓度的化合物，每个浓度平行三个复孔，并设置单纯细胞的实验对照组，置37℃、5％ CO2培养箱内培养72h。
(4)每孔加入10μL CCK8溶液，37℃下避光孵育1-4h，用Biotek-Synergy酶标仪测450nm OD值。计算半数抑制浓度IC50。
实验结果如下表2，多肽偶联药物C在αvβ3整合素高表达的U87细胞中表现出较强的靶向性，细胞毒性明显增强。
表2化合物的细胞毒性(IC50,μM)
实施例10：划痕实验检测多肽偶联药物对肿瘤迁移的影响
(1)将处于对数生长期的U87细胞用胰酶消化。用培养基(DMEM+10％ FBS+1％双抗)将细胞稀释成单细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL。
(2)每孔1mL接种于24孔板中，置37℃、5％ CO2培养箱内培养至细胞融合率100％。
(3)用200μL的枪头对细胞进行划痕处理，PBS洗涤后加入多肽偶联药物C，使其终浓度为25nM，并设置单纯细胞以及加入F-OH-EVO的实验对照组，置37℃、5％ CO2培养箱内培养16h。
(4)在显微镜下分别于0h，16h选取视野进行拍照。
实验结果如图18所示，多肽偶联药物C在U87细胞中表现出较强的肿瘤迁移抑制的效果。多肽偶联药物C的迁移抑制率达到29.03％，与F-OH-EVO对照药相比，提高了10.95％。
实施例11：Transwell实验检测多肽偶联药物对肿瘤迁移的影响
(1)将处于对数生长期的U87细胞用胰酶消化。用培养基(DMEM+10％ FBS+1％双抗)将细胞稀释成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/mL。
(2)每孔200μL接种于Transwell小室中，加入多肽偶联药物C，使其终浓度为25nM，并设置单纯细胞以及加入F-OH-EVO的实验对照组，下室加入500μL含2％ FBS的培养基，置37℃、5％ CO2培养箱内培养48h。
(3)用4％多聚甲醛固定Transwell小室中的细胞，之后用结晶紫对细胞进行染色，最后用棉签将小室上表面的染料擦掉。
(4)在显微镜下选取视野进行拍照。
实验结果如图19所示，多肽偶联药物C在U87细胞中表现出较强的肿瘤迁移抑制的效果。多肽偶联药物C的迁移抑制率达到47.18％，与F-OH-EVO对照药相比，提高了25.46％。该结果与上述实施例10的结果是一致的。
实施例12：流式细胞术检测肿瘤细胞对带荧光标记的多肽偶联药物的摄取
(1)将处于对数生长期的U87细胞用胰酶消化。用培养基(DMEM+10％ FBS+1％双抗)将细胞稀释成单细胞悬液，调整细胞密度为1.0×105个/mL。
(2)每孔2mL接种于6孔板中，置37℃、5％CO2培养箱内培养24h。
(3)加入不同浓度的带荧光标记的多肽偶联药物C，使其终浓度分别为5nM、10nM、20nM，并设置单纯细胞的实验对照组，置37℃、5％ CO2培养箱内培养2h。
(4)用流式细胞仪检测细胞对带荧光标记的多肽偶联药物C的摄取能力。
实验结果如图20所示，U87细胞对带荧光标记的多肽偶联药物C摄取能力随浓度的增加而增加。在20nM的浓度下，44.83％的多肽偶联药物C进入细胞，因此多肽偶联药物C能够与αvβ3整合素相结合，具有更好的靶向性。
实施例13：激光共聚焦显微镜检测带荧光标记的多肽偶联药物与肿瘤细胞特异性结合能力
(1)将处于对数生长期的U87细胞(αvβ3整合素高表达)、MCF-7细胞(αvβ3整合素不表达)用胰酶消化。用培养基(DMEM+10％ FBS+1％双抗)将细胞稀释成单细胞悬液，调整细胞密度为1.0×105个/mL。
(2)每孔1.5mL接种于共聚焦小皿中，置37℃、5％CO2培养箱内培养24h。
(3)加入带荧光标记的多肽偶联药物C，使其终浓度为20nM，并设置单纯细胞的实验对照组，置37℃、5％ CO2培养箱内培养2h。
(4)用激光共聚焦显微镜检测药物与细胞特异性结合能力。
实验结果如图21所示，带荧光标记的多肽偶联药物C对αvβ3整合素高表达的U87细胞具有较强的靶向性，而对αvβ3整合素不表达的MCF-7细胞几乎没有靶向性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (13)

1.一种肿瘤靶向多肽，其氨基酸序列为：
Cyclo(Phe-X-Arg-Gly-Asp)，所述Asp侧链羧基与Phe主链氨基形成酰胺环；其中，X表示氨基酸残基为Lys、Orn、Dab或Dap。
2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向多肽在制备多肽偶联药物中的应用。
3.一种多肽偶联药物，所述多肽偶联药物包括如权利要求1所述的肿瘤靶向多肽，细胞毒性药物和连接子，所述连接子将所述肿瘤靶向多肽与所述细胞毒性药物相连接。
4.根据权利要求3所述的一种多肽偶联药物，其特征在于：所述细胞毒性药物为肿瘤化疗药物。
5.根据权利要求3所述的一种多肽偶联药物，其特征在于：所述肿瘤化疗药物为3-氟-10-羟基吴茱萸碱。
6.根据权利要求3所述的一种多肽偶联药物，其特征在于：所述连接子为戊二酸、亚硫基二乙酸或3，3-二硫代二丙酸。
7.根据权利要求3所述的一种多肽偶联药物，其特征在于：所述多肽偶联药物具有如式(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的结构：
其中，n为1，2，3或4；
其中，n为1，2，3或4；
其中，n为1，2，3或4。
8.根据权利要求3-7任一项所述的多肽偶联药物的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用Fmoc固相多肽合成技术，将Fmoc-Asp(Oall)-OH偶联到Wang树脂上，然后依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-X(ivDde)-OH(X＝Lys、Orn、Dab、Dap)、Fmoc-D-Phe-OH，偶联完成后，脱除Asp残基侧链的OAll保护基团，加入缩合剂，完成环化反应；
(2)步骤(1)环化反应完成后，进行步骤2，具体为：
脱除X侧链的ivDde保护基团，得到Cyclo(D-Phe-X-Arg-Gly-Asp)，Asp侧链羧基与D-Phe主链氨基形成酰胺环，得肽树脂；其中，X为Dap、Dab、Orn或Lys；
(3)使用连接子将步骤(2)得到的肽树脂与细胞毒性药物相连接，得到多肽偶联药物树脂，用TFA裂解多肽偶联药物树脂，经过纯化，即得所述多肽偶联药物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述细胞毒性药物为3-氟-10-羟基吴茱萸碱时，步骤(3)中所述多肽偶联药物树脂的制备具体为：在步骤(2)所得肽树脂上加入缩合试剂和3-氟-10-羟基吴茱萸碱，偶联反应，得到所述多肽偶联药物树脂。
10.根据权利要求3-7任一项所述的多肽偶联药物在制备癌症靶向治疗药物中的应用。
11.一种癌症靶向治疗的药物组合物，包括如权利要求3-7任一项所述的多肽偶联药物。
12.根据权利要求11所述的一种癌症靶向治疗的药物组合物，其特征在于：所述癌症包括肝癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、喉脑癌、结肠直肠癌、食道癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、各种淋巴瘤或黑色素瘤。
13.根据权利要求12所述的一种癌症靶向治疗的药物组合物，其特征在于：所述癌症为肺癌或乳腺癌。
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