CN117327019A - 一种局部作用的雄激素受体拮抗剂的应用 - Google Patents

一种局部作用的雄激素受体拮抗剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种局部作用的雄激素受体拮抗剂的应用，所述应用为如式I所示的4‑(3‑(4‑氰基‑3‑(三氟甲基)苯基)‑5,5‑二甲基‑4‑氧代‑2‑硫代咪唑烷‑1‑基)‑2‑氟苯甲酸叔丁酯，或其药物组合物在制备用于预防或治疗与雄激素异常有关疾病的药物中的应用。4‑(3‑(4‑氰基‑3‑(三氟甲基)苯基)‑5,5‑二甲基‑4‑氧代‑2‑硫代咪唑烷‑1‑基)‑2‑氟苯甲酸叔丁酯的皮肤稳定性较好，代谢慢，发挥抗雄激素脱发作用，但在血浆内稳定性极差，可定向、快速代谢为非活性代谢产物恩杂鲁胺酸，避免全身性分布导致的全身雄激素拮抗副作用。

Description

一种局部作用的雄激素受体拮抗剂的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种局部作用的雄激素受体拮抗剂4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟苯甲酸叔丁酯，或其药物组合物在制备用于治疗雄激素受体相关疾病或病症药物中的应用。
背景技术
雄激素性脱发(AGA)，又被称为脂溢性脱发、早秃，分为男性型脱发和女性型脱发，是临床上最常见的非瘢痕脱发。AGA主要发生在青春期后期，以毛囊间进行萎缩为特征。该病在男性患者中主要表现为发际线后移或头顶毛发减少和变细；女性患者则主要表现为头顶部毛发减少与变细，少数患者表现为弥漫性头发变稀而发际线未受影响。2010年流行病调查显示，AGA在我国男性患病率为21.3％，女性为6.0％，其中有家族史的男性占29.7％，女性占19.2％。中国男性脱发发病率不断提高，并出现低龄化趋势，中青年成了“脱发大军”的主力。60％的男性在25岁前开始脱发，在30岁前开始脱发的比例近84％。Qi J，Ho CH等人报道，50％的男性与女性正遭受不同程度AGA的影响。雄激素性脱发常发于17～20岁的男青年，30岁左右为发病高峰，以后随年龄的增加，虽然发病率减少，但症状加重，最后变为全秃。虽然AGA对患者的身体健康不产生影响，但其影响着患者的心理健康和生活质量，严重者可导致患者抑郁、焦虑、人际关系紧张和敏感等。
雄激素性脱发是一种雄激素依赖的多基因遗传性疾病，自1942年HamiltonNorwood首次提出AGA的发生与雄激素有关，此后国内外学者对AGA的研究主要集中在头皮部的雄激素及其代谢酶。然而至今本病的确切病因及发病机制尚未明确。有学者发现，该病的发病率还与种族、民族、年龄、性别、生活环境、生活习惯、精神心理因素及病菌感染(糠秕孢子菌、痤疮棒状杆菌等)等因素有关。近年来，AGA发病率不断提高，并表现出低龄化。因此急切需要进行治疗。
男性的雄激素主要由睾丸合成，包括睾酮、二氢睾酮(DHT)、雄烯二酮(DHEA)及脱氢异雄酮(ASD)等。女性的雄激素则主要来源于肾上腺皮质。睾酮和雄烯二酮可被5α-还原酶还原成DHT，而DHT对雄激素受体(AR)的亲和力是睾酮的5+倍。人体有两种5α-还原酶同工酶：5α-还原酶I和5α-还原酶II。其中，5α-还原酶I主要分布于皮脂腺与肝脏；5α-还原酶II主要分布在头皮毛囊、附睾、输精管、精囊、前列腺及胎儿生殖器皮肤。研究表明，头皮毛囊是雄激素的靶器官之一。取男性AGA患者头发活检标本，可见头顶部脱发区5α-还原酶活性明显高于枕部非脱发区。另外也有研究表明头顶部脱发区毛囊AR高表达，从而加速了该区域的脱发。DHT具有强AR亲和力，其与AR结合后进入细胞核内，抑制毛囊的腺苷酸环化酶，减少环苷酸及相关蛋白的合成，使毛发提前进入休止期。并抑制毛囊的生长，使毛囊缩小，刺激皮脂腺的增生与油脂分泌，进一步使毛囊体积减小并逐渐消失进而促进毛发的脱落。
目前AGA患者众多，但针对AGA的药物仍很少，目前仅非那雄胺与米诺地尔被批准上市，用于治疗AGA，其他多数药物为超适应症应用。现有AGA疗法有效，但也带来诸多副作用，如非那雄胺的男性性功能障碍、米诺地尔的丙二醇过敏和直立性低血压等。这些副作用限制了对应药物在临床上的使用。因此，临床上仍亟需局部有效、避免系统性分布、副作用低、使用方便的AGA药物。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟苯甲酸叔丁酯(式I)或其药学上可接受的盐的组合物的应用。
本发明更进一步要解决的技术问题是提供了一种预防哺乳动物由雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症、降低哺乳动物由雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症进展、治疗哺乳动物由雄激素或雄激素受体介导的疾病或病症的方法。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了如式I所示的4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟苯甲酸叔丁酯，或其药物组合物在制备用于预防或治疗与雄激素异常有关疾病的药物中的应用；
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(i)4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟苯甲酸叔丁酯，和(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，所述预防或治疗与雄激素异常有关疾病为预防雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症、降低雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症进展、或治疗雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症。
在一些实施方案中，所述雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症选自前列腺癌、痤疮或脱发；在一些实施方案中，所述雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症为痤疮；在一些实施方案中，所述雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症为脱发；在一些实施方案中，所述雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症为雄激素性脱发。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种预防哺乳动物由雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症、降低哺乳动物由雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症进展、治疗哺乳动物由雄激素或雄激素受体介导的疾病或病症的方法，包括对需要该治疗的哺乳动物给予治疗有效量的式(I)化合物或其药物组合物。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人类。
除非另有说明，本申请中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
术语“治疗”意为将本申请所述化合物或制剂进行给药以改善或消除疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括：
i.抑制疾病或疾病状态，即遏制其发展；
ii.缓解疾病或疾病状态，即使该疾病或疾病状态消退。
术语“预防”意为将本申请所述化合物或制剂进行给药以预防疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括：预防疾病或疾病状态在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病状态，但尚未被诊断为已患有该疾病状态时。
术语“治疗有效量”意指(i)治疗或预防特定疾病、病况或障碍，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状发作的本申请化合物的用量。构成“治疗有效量”的本申请化合物的量取决于该化合物、疾病状态及其严重性、给药方式以及待被治疗的哺乳动物的年龄而改变，但可例行性地由本领域技术人员根据其自身的知识及本公开内容而确定。
术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药物组合物”是指一种或多种本申请的化合物或其盐与药学上可接受的辅料组成的混合物。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本申请的化合物。
术语“药学上可接受的辅料”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些辅料。合适的辅料是本领域技术人员熟知的，例如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等。
词语“包括(comprise)”或“包含(comprise)”及其英文变体例如comprises或comprising应理解为开放的、非排他性的意义，即“包括但不限于”。
术语“药学上可接受的辅料”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些辅料。合适的辅料是本领域技术人员熟知的，例如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等。
本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(3H)，碘-125(125I)或C-14(14C)。又例如，可用重氢取代氢形成氘代药物，比如d3-甲基表示甲基上的三个氢原子全部被氘原子取代，氘与碳构成的键比普通氢与碳构成的键更坚固，相比于未氘化药物，氘代药物有降低毒副作用、增加药物稳定性、增强疗效、延长药物生物半衰期等优势。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。
本申请还包括与本文中记载的那些相同的，但一个或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数的原子置换的同位素标记的本申请化合物。可结合到本申请化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、123I、125I和36Cl等。
某些同位素标记的本申请化合物(例如用3H及14C标记的那些)可用于化合物和/或底物组织分布分析中。氚化(即3H)和碳-14(即14C)同位素对于由于它们易于制备和可检测性是尤其优选的。正电子发射同位素，诸如15O、13N、11C和18F可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以测定底物占有率。通常可以通过与公开于下文的方案和/或实施例中的那些类似的下列程序，通过同位素标记试剂取代未经同位素标记的试剂来制备同位素标记的本申请化合物。
此外，用较重同位素(诸如氘(即2H))取代可以提供某些由更高的代谢稳定性产生的治疗优点(例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求)，并且因此在某些情形下可能是优选的，其中氘取代可以是部分或完全的，部分氘取代是指至少一个氢被至少一个氘取代，所有这样的形式的化合物包含于本申请的范围内。
本申请的药物组合物可通过将本申请的化合物与适宜的药学上可接受的辅料组合而制备，例如可配制成固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等。
给予本申请化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、局部、吸入、肠胃外、舌下、阴道内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。
本申请的药物组合物可以采用本领域众所周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等。
本申请化合物的治疗剂量可根据例如以下而定：治疗的具体用途、给予化合物的方式、患者的健康和状态，以及签处方医师的判断。本申请化合物在药用组合物中的比例或浓度可不固定，取决于多种因素，它们包括剂量、化学特性(例如疏水性)和给药途径。例如可通过含约0.1～10％w/v该化合物的生理缓冲水溶液提供本申请化合物，用于肠胃外给药。某些典型剂量范围为约1μg/kg～约1g/kg体重/日。在某些实施方案中，剂量范围为约0.01mg/kg～约100mg/kg体重/日。剂量很可能取决于此类变量，如疾病或病症的种类和发展程度、具体患者的一般健康状态、所选择的化合物的相对生物学效力、赋形剂制剂及其给药途径。可通过由体外或动物模型试验系统导出的剂量-反应曲线外推，得到有效剂量。
本申请的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本申请的实施例。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
本发明所提供的4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟苯甲酸叔丁酯为局部作用的雄激素拮抗剂。同时，该化合物的皮肤稳定性较好，代谢慢，发挥抗雄激素脱发作用，并且其在血浆内稳定性极差，可定向、快速代谢为非活性代谢产物恩杂鲁胺酸(CAS:1242137-15-0)，从而避免全身性分布导致的全身雄激素拮抗副作用。另外，本发明所提供的化合物经皮给药在小鼠脱发模型上也表现出促毛发生长作用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为C57BL/6小鼠毛发生长评分。
具体实施方式
为清楚起见，进一步用实施例来阐述本发明，但是实施例并非限制本申请的范围。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下，针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。本申请所使用的所有试剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟苯甲酸叔丁酯(化合物1)的制备
步骤1：化合物1-1的合成
250mL三颈瓶中加入150mL N,N-二甲基甲酰胺和15mL水，依次加入2-氟-4-溴苯甲酸10g、2-甲基丙氨酸7.25g、碳酸钾15.8g、碘化亚铜1.7g、2-乙酰基环己酮1.2g和三乙胺0.8g。110℃加热搅拌反应6h，加入500mL水稀释，用柠檬酸调pH至3-4。用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤3次。有机相经无水硫酸钠干燥后浓缩，所得固体粗品中加入50mL二氯甲烷，室温搅拌1h后过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤。收集并干燥滤饼，得9.3g化合物1-1。
步骤2：化合物1-2的合成
250mL三颈瓶中加入100mL甲醇和13g上述步骤1制备的化合物1-1，搅拌溶解后冰浴降温。在冰浴条件下缓慢滴加氯化亚砜25.6g，滴加完毕后加热回流反应。待反应完毕后，关闭加热，待冷至室温后加入50mL甲苯，减压浓缩。所得残渣用300mL乙酸乙酯复溶，用饱和食盐水洗涤1次，接着用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3次。有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，得11.3g化合物1-2。
步骤3：化合物1-3的合成
50mL三颈瓶中依次加入5mL二甲亚砜、10mL醋酸异丙酯、5g上述步骤2制备的化合物1-2和8.9g 4-异硫氰基-2-(三氟甲基)苯甲腈，90℃加热搅拌反应20h。关闭加热，自然冷至室温，反应液中加入50mL水稀释，用乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，用饱和食盐水洗涤3次，有机相经无水硫酸钠干燥后浓缩。所得油状物加入35mL甲醇并室温搅拌2h。过滤，收集滤饼并干燥，的5.8g化合物1-3。
步骤4：化合物1-4的合成
将3.8g上述步骤3制备的化合物1-3溶于15mL四氢呋喃中，加入溶有0.68g氢氧化钠的水溶液15mL，室温搅拌反应过夜。反应完毕后，加入50mL水稀释，用1M稀盐酸调pH至3-4后，用乙酸乙酯萃取3次。合并有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩有机相得3.0g化合物1-4。
步骤5：化合物1的合成
25mL圆底烧瓶中加入0.3g上述步骤4制备的化合物1-4、5mL叔丁醇、0.29g二叔丁基二碳酸酯和0.14g三乙胺，30℃搅拌反应6h。减压浓缩，所得油状物用30mL乙酸乙酯复溶，用饱和食盐水洗涤3次。有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，所得粗品经柱层析纯化得0.16g白色固体。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.07(t,J＝8.1Hz,1H),8.04–7.95(m,2H),7.85(dd,J＝8.3,1.8Hz,1H),7.22–7.11(m,2H),1.64–1.63(m,15H).
MS(ESI,[M+H]+)m/z:508.4.
实施例2：4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯(化合物2)的制备
25mL圆底烧瓶中依次加入0.2g实施例1步骤4所得化合物1-4、5mL N,N-二甲基甲酰胺、0.25g 2-碘丁烷和0.15g碳酸钾，60℃加热反应过夜。反应完毕后，撤去加热，冷却至室温，加入25mL水稀释反应液。有乙酸乙酯萃取(15mL×3)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤(15mL×3)。有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，所得粗品经柱层析纯化得0.34g白色固体。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.13(t,J＝8.0Hz,1H),8.02(d,J＝8.3Hz,1H),7.97(d,J＝2.0Hz,1H),7.85(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.25–7.11(m,2H),5.25–5.11(m,1H),1.85–1.67(m,2H),1.64(s,6H),1.39(d,J＝6.3Hz,3H),1.02(t,J＝7.5Hz,3H).
MS(ESI,[M+H]+)m/z:508.4.
应用实验例1：化合物对雄激素受体的拮抗活性
1)所有测试化合物溶于DMSO中配置成15mM溶液，并且3倍连续稀释10次，配置成15mM、5mM、1.6667mM、0.5576mM、0.1852mM、0.0617mM、0.0206mM、0.0069mM、0.0023mM和0.0008mM溶液。
2)按照ATCC的建议(https://www.atcc.org/)培养HEK293T细胞(ATCC，CRL-3216)。细胞在指数生长期时进行检测。
3)从培养皿中去除培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，向培养皿中加入胰蛋白酶溶液，使细胞分离。用完全培养基清洗细胞一次。
4)使用磷酸盐缓冲液将细胞洗涤两次，以去除酚红，并将其重新悬浮在培养基中至适当浓度。
5)将6*106HEK293T细胞播种到100毫米的培养皿中(只有存活率大于90％的细胞才用于分析)，并在37℃、5％CO2条件下培养16h。
6)将质粒(pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro]，Promega，E1360；pBIND-AR Vector，康龙化成；LTX&Plus Reagent，Invitrogen，15338-100)转染到HEK293T细胞中，并在37℃和5％CO2条件下培养5-6h。
7)使用非接触式纳升级声波移液系统(Labcyte，Echo550)将50nl化合物稀释液转移到384孔分析板中。
8)将HEK293T细胞以15000个细胞/孔和1nM DHT(MCE，HY-A0120)终浓度接种到384孔的分析板中(25μl)。
9)细胞在37℃、5％CO2条件下培养18-20小时。
10)将25μl荧光素酶分析试剂(britelite plus，PerkinElmer，6066769)加入384孔分析板的每个孔中。
11)使用酶标仪(Envision 2105，PerkinElmer)记录发光值，并计算IC50。
表1化合物对雄激素受体的拮抗活性
实施例 IC50(μM)
1 0.88
2 0.78
恩杂鲁胺 0.78
恩杂鲁胺酸 >30
结果说明，4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟苯甲酸叔丁酯具有雄激素受体拮抗活性。
应用实验例2：化学稳定性
温孵液配置：10mL 0.02M pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)加入9.8mL DMSO中，冰浴降温后震荡涡旋30s，配置成温孵液。
待测化合物用DMSO配制成10mM的储存液。用DMSO将待测化合物稀释至2mM。取15μL2mM的待测化合物溶液，加至1485μL温孵液中，涡旋30s后室温静置。于0h、2h、4h、6h、8h，取样300μL，14400rpm离心3min后，吸取200μL上清液，HPLC检测，计算浓度，并按照公式T1/2＝-0.693/k计算半衰期。
表2化学稳定性
实施例 半衰期
1 NAa
2 NA
恩杂鲁胺 NA
a 8h仍未观察到明显降解，无法拟合计算半衰期
结果显示，本发明化合物在pH7.4条件下稳定性较好。
应用实验例3：大鼠血浆稳定性
待测化合物用DMSO配制成10mM的储存液。用DMSO将待测化合物稀释至2mM工作液。取10μL 2mM工作液，加至990μL大鼠血浆中，涡旋5s，配置成初始浓度为20μM的反应体系，37℃温孵，并分别在0min、10min、20min、30min、1h、2h、4h和6h取80μL血浆样品。血浆样品中加入240μL甲醇，涡旋3min后14400rpm离心3min，吸取200μL上清液，HPLC检测，计算浓度，并按照公式T1/2＝-0.693/k计算半衰期，结果如表3所示。
表3大鼠血浆半衰期及降解产物
实施例 半衰期 降解产物
1 <5min 恩杂鲁胺酸
2 <5min 恩杂鲁胺酸
恩杂鲁胺 NAa 无
a 6h仍未观察到明显降解，无法拟合计算半衰期
结果显示，4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟苯甲酸叔丁酯在血浆中极不稳定，血浆半衰期小于5min，代谢产物为恩杂鲁胺酸，因此，本发明化合物进入血液后迅速失活，不能在全身分布，从而无法引起全身的雄激素拮抗作用，故而不会造成性欲降低、精子生成减少、ED等副作用，可有效解决现有药物如非那雄胺等药物系统性分布，导致全身性的雄激素抑制引起性欲降低、精子生成减少、ED等副作用的问题。
应用实验例4：小鼠10％皮肤匀浆液稳定性
1)待测化合物用DMSO配制成10mM的储存液，取20μL待测化合物储备液，加至80μLDMSO中，涡旋10s，配置成2mM工作液；
2)C57BL/6雄性小鼠(许可证号SCXK(豫)2020-0005)经脱毛膏对背部进行脱毛；
3)在麻醉状态下剥取背部皮肤，剔除血管、皮下组织和脂肪，并用预冷的生理盐水漂洗干净；
4)取2.3g皮肤，加至23mL预冷生理盐水中，在冰浴条件下充分匀浆(每匀浆15s，暂停10s)，5000rpm离心5min，吸取上清液，即皮肤组织匀浆液，置于冰上待用；
5)取皮肤组织匀浆液990μL，加入10μL 2mM待测化合物工作液，涡旋5s，并置于37℃水浴锅中，温孵，于0min、5min、10min、15min、30min、1h和2h分别取样80μL，加入240μL甲醇；
6)涡旋震荡3min后，13000rpm离心5min；
7)吸取上清液200μL，用HPLC进样分析，计算浓度，并按照公式T1/2＝-0.693/k计算半衰期，结果如表4所示。
表4小鼠10％皮肤匀浆液稳定性及降解产物
实施例 半衰期 降解产物
1 11.6h 恩杂鲁胺酸
2 57.75min 恩杂鲁胺酸
恩杂鲁胺 NAa 无
a 2h仍未观察到明显降解，无法拟合计算半衰期
4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟苯甲酸叔丁酯在皮肤匀浆液中半衰期长，稳定性好。被缓慢降解为非活性代谢产物恩杂鲁胺酸。
应用实验例5：C57BL/6小鼠毛发生长模型
购买6至7周龄的雄性C57BL/6小鼠，并在标准条件下饲养于群笼中一周。通过在轻度麻醉下用电动剃须刀给下背部剃毛，后用脱毛膏脱去背部毛发，裸露皮肤约2cm×2cm，次日，挑选背部皮肤无破损，且皮肤颜色呈粉红色的小鼠进行随机分组，分为：空白对照组、模型组、治疗组(实施例1组)和阳性对照组(米诺地尔组)，每组6只。
空白对照组：每日皮下注射DMSO:甘油＝1:1的混合溶剂，并且每日两次再脱毛部位涂抹丙酮20μL；
模型组：每日皮下注射二氢睾酮溶液(6mg/mL，溶剂为DMSO:甘油＝1:1的混合溶剂)，剂量为30mg/kg，并且每日两次再脱毛部位涂抹丙酮20μL；
实施例1组：每日皮下注射二氢睾酮溶液(6mg/mL，溶剂为DMSO:甘油＝1:1的混合溶剂)，剂量为30mg/kg，并且每日两次于再脱毛部位涂抹5％(g/mL)实施例1的丙酮溶液20μL。
阳性对照组(米诺地尔组)：每日皮下注射二氢睾酮溶液(6mg/mL，溶剂为DMSO:甘油＝1:1的混合溶剂)，剂量为30mg/kg，并且每日两次于再脱毛部位涂抹5％(g/mL)米诺地尔的丙酮溶液20μL。
每两天记录毛发生长评分。
用于小鼠毛发生长的评分系统为：
a)0：没有毛发生长，粉色肤色；
b)1：剃毛区域的肤色从粉色变为灰色，没有可见的毛发生长，表明毛生长期启动；
c)2：剃毛区域的肤色为黑色，有微小的毛发；
d)3：剃毛区域长出短的黑色毛发；
e)4：剃毛区域的毛发几乎接近周边区域。
毛发评分如表5和图1所示。结果显示：经20天的治疗，实施例1具有的促进毛发生长的作用。
表5毛发评分
组别 0天 8天 10天 12天 14天 16天 18天 20天
空白组 0 0.17 0.67 1.50 2.33 3.83 3.83 4.00
模型组 0 0 0 0 0 0.17 0.17 0.33
实施例1组 0 0 0 0.50 0.83 1.67 2.33 2.83
阳性对照组 0 0 0 0.33 0.50 1.50 2.17 2.50
本发明提供了一种局部作用的雄激素受体拮抗剂的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (7)

1.如式I所示的4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟苯甲酸叔丁酯，或其药物组合物在制备用于预防或治疗与雄激素异常有关疾病的药物中的应用；
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物组合物包含(i)4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟苯甲酸叔丁酯，和(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述预防或治疗与雄激素异常有关疾病为预防雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症、降低雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症进展、或治疗雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症选自前列腺癌、痤疮或脱发。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症为痤疮。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症为脱发。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述雄激素或雄激素受体活性介导的疾病或病症为雄激素性脱发。
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