CN117309969A - 一种Au NPs@NPC-ZnO复合材料、传感器及检测黄曲霉毒素B1的方法 - Google Patents
一种Au NPs@NPC-ZnO复合材料、传感器及检测黄曲霉毒素B1的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种Au NPs@NPC‑ZnO复合材料、传感器以及检测AFB1的方法，属于食品安全检测技术领域。该复合材料由NPC‑ZnO和Au NPs制备获得，并能够作为传感基底修饰，构建一种基于距离调控的电化学模式和光电模式相结合的双模式AFB1传感器，可用于0.02pg/mL～100ng/mL的AFB1的检测。并且，不同检测模式得到的结果可以相互验证，减少或消除因外部环境、仪器本身、参数变化而引起的误差，从而提高检测的可靠性。与此同时，本申请提供的以Au NPs@NPC‑ZnO复合材料修饰基底的双模式传感器还表现出很好的选择性和重现性具有广阔的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，尤其涉及一种Au NPs@NPC-ZnO复合材料、基于Au NPs@NPC-ZnO复合材料的电化学/光电化学双模式传感器以及利用该传感器检测黄曲霉毒素B1的方法。
背景技术
黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的真菌毒素，由香豆素环和呋喃环组成。在所有类型的黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1(AFB1)因其毒性最高而被国际癌症研究组织列为I类致癌物，广泛存在于谷物、花生和干果中。许多国家和组织对食品中AFB1的限量都有严格的规定，例如，中国和美国食品药品监督管理局规定花生及其制品中AFB1的最高限量应小于20μg/kg。因此，为了确保食品、药品和公共卫生安全，迫切需要建立一种快速、准确、灵敏的AFB1检测方法。
目前AFB1传统检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、液相色谱法(LC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)。虽然这些方法具有定量检测的优势，但它们存在检测成本高、操作复杂和检测时间长等缺点，严重限制了现场快速检测的需求。为了应对这些挑战，生物传感器凭借灵敏度高、操作简单、分析速度快等优点引起了分析工作者的广泛关注。然而，当前发展的AFB1传感器都是基于单一信号的靶触发变化，由于操作人员和环境的差异，单信号传感器很容易产生假性信号。多模式检测被认为是一种更有效的方法，独立的信号转导机制和输出方式不仅可以拓宽动态检测范围，而且使分析结果具有自验证性，提高了灵敏度和可靠性。
现有技术中也提供了一些用于检测AFB1的传感器，例如，中国专利CN115616056A提供了一种用于检测AFB1的光电化学适配体传感器，其采用Er-MOF@AuNPs作为光电材料，并采用合成的新型离子液体作为配体，制备传感器。朱冠宇等(朱冠宇，朱成喜，李玉叶等.基于二茂铁标记适配体的电化学传感器检测玉米中黄曲霉毒素B1[J].江都理工学院学报，2022(6)：38-46.)提出了一种基于二茂铁标记适配体的电化学传感器，以金为工作电极，利用DNA杂交将Fc-Apt组装于电极表面，得到AFB1适配体传感器。然而，包括上述方案在内的现有技术所提供的用于检测AFB1的传感器，其检测的灵敏度仍有待提高。
发明内容
为了解决上述问题，提高AFB1检测的精度和准确性，本申请旨在提供一种新型光电活性材料，用于作为传感基底修饰，基于目标物触发的距离调控策略，进而设计成一种电化学/光电化学双模式传感器。
一方面，本申请提供了一种Au NPs@NPC-ZnO复合材料，所述复合材料为由粒径为2～5nm的纳米金Au NPs均匀分散在氮掺杂多孔碳-氧化锌NPC-ZnO表面的结构；
所述复合材料由NPC-ZnO和Au NPs以(30～50)mg：(1.4～1.6)×10-3mmol的反应比例制备获得，且获得的所述复合材料的粒径为100～200nm。
在一种实施方式中，所述复合材料由NPC-ZnO和Au NPs以40mg：1.5×10-3mmol的反应比例制备获得，且获得的所述复合材料的平均粒径约为160nm。
可以理解的是，本申请中NPC-ZnO采用固体粉末，Au NPs的来源不作限定，例如可以采用金的酸或盐溶液作为原料制备。
其中，本申请提供的Au NPs@NPC-ZnO复合材料与其他的传感基底相比具有以下优势：(1)NPC作为敏化结构，可以缩小ZnO的带隙，增强光吸附能力，加速光生电子空穴对的分离。(2)Au NPs的LSPR效应可以将热电子注入NPC-ZnO的导带，导致光电信号增强。(3)由于PCZIF-8和Au NPs的优异导电性，它们的协同效应可以加速电极和传感基底之间的电子传递速率，提高电化学信号。因此，本申请提供的新型光电活性材料Au NPs@NPC-ZnO作为传感基底可以显著提高双模式传感器的灵敏度。
在一种实施方式中，所述复合材料的制备方法包括：将NPC-ZnO溶于溶剂中，加入金源混合，再加入还原剂，反应10～60min，离心获得固体产物。
优选的，所述溶剂为水，更优选为超纯水。
在一种实施方式中，所述金源为氯金酸；和/或，所述还原剂为硼氢化钠。
优选的，所述金源为摩尔浓度为10mM的氯金酸溶液。
优选的，所述还原剂为摩尔浓度为0.1M的硼氢化钠溶液。
在一种实施方式中，所述NPC-ZnO由ZIF-8粉末于氮气氛围下，温度500℃～800℃煅烧120～240min获得。
另一方面，本申请还提供了Au NPs@NPC-ZnO复合材料在制备用于检测黄曲霉毒素B1的传感器中的应用。
在一种实施方式中，所述传感器包括基于电化学和光电化学双信号模式的传感器。
另一方面，本申请还提供了一种用于检测黄曲霉毒素B1的电化学/光电化学双模式传感器，所述传感器包括：
基材，以及附着在所述基材上的电极层，所述电极层包括工作电极层；
所述工作电极层的表面依次涂覆有所述的Au NPs@NPC-ZnO复合材料、ssDNA-MB以及Apt-Fc。
在一种实施方式中，所述ssDNA-MB的核苷酸序列为：5’-MB-TCT CTG TTG TGC TCCCAT GCG AAT TGA AGA GAC AAC ACG ATG GG-(CH2)6-SH-3’；和/或，
所述Apt-Fc的核苷酸序列为：5’-Fc-GCA CGT GTT GTC TCT CTG TGT CTC GTG C-3’。
优选的，所述工作电极层以碳层为基底，Au NPs@NPC-ZnO复合材料、ssDNA-MB以及Apt-Fc依次涂覆在碳层表面。
优选的，所述电极层还包括对电极和参比电极。更优选的，对电极采用碳，参比电极采用Ag/AgCl。
另一方面，本申请还提供了一种定量检测黄曲霉毒素B1的方法，所述方法包括利用所述的传感器进行检测的步骤，具体包括：
将待测样本滴加在工作电极层的表面，室温下反应40～60min，通过差分脉冲伏安法和时间-电流曲线分别进行电化学和光电化学信号检测，绘制电化学信号/光电流强度与黄曲霉毒素B1浓度的拟合曲线，实现对黄曲霉毒素B1的定量检测。
在一种实施方式中，所述传感器在电化学模式下的检测范围为0.1pg/mL～100ng/mL，在光电模式下的检测范围为0.02pg/mL～100ng/mL。
本申请提供的电化学/光电化学双模式传感器，其检测AFB1的机理如图1所示，具体如下：
当AFB1不存在时，Apt-Fc通过DNA杂交与ssDNA-MB结合形成双链结构，使得MB分子远离电极界面Fc靠近电极表面，产生一个强的Fc的氧化电流和弱的MB的氧化电流。在光电模式下，由于Fc分子对光电信号的抑制作用，产生一个弱的光电流响应。当AFB1存在时，基于目标物与适配体的特异性结合，Fc分子在电极界面脱离，ssDNA恢复其茎环结构，使得MB分子靠近电极表面，此时MB的氧化电流增强，Fc的氧化电流降低。对于光电检测而言，由于MB具有优异的电子转移能力，导致阳极光电流显著增强。因此，双模式传感器能够根据两种电活性分子氧化电流的比值变化/光电流信号变化与AFB1浓度的关系，实现对AFB1的电化学/光电化学同时检测，进而为分析结果提供自我验证，提高了检测的可靠性，避免了虚假结果。
而本申请制备获得的Au NPs@NPC-ZnO复合材料，能够显示出良好的电化学活性和光电化学性能，可以作为电化学/光电活性的传感基底，有利于提高检测灵敏度。当待测物AFB1存在时，AFB1调控两种电活性分子(亚甲基蓝(MB)和二茂铁(Fc))与传感界面之间的距离，引起电化学/光电化学信号的同时改变。基于距离调控的传感策略，通过对比电化学/光电信号的变化与目标物浓度之间的关系，实现AFB1的定量检测。
进一步，本申请将Au NPs@NPC-ZnO复合材料制成双模式传感器，一方面相对于单模式分析方法，双模式传感器具有独立的信号转换和输出模式，检测结果可以相互验证，有效地提高了精度和可靠性，避免了假性信号的误报。另一方面，本申请构建的用于检测AFB1的Au NPs@NPC-ZnO双模式传感器，在电化学模式下的检测范围为0.1pg/mL～100ng/mL，光电模式下的检测范围为0.02pg/mL～100ng/mL，表现出了较低的检测限，在食品安全检测中具有良好的应用前景。
本申请的有益效果至少包括：
(1)本申请以ZIF-8作为前驱体，通过高温碳化和浸渍还原制备了Au NPs@NPC-ZnO复合材料，用于修饰传感界面，提高电极表面电子转移速率和光电信号转化效率，增强电化学/光电信号响应。
(2)本申请中目标物与适配体的特异性识别引起传感界面两种电活性分子距离的变化，进而引起电化学/光电信号的显著变化。
(3)本申请基于丝网印刷工艺制备的纸基传感器具有成本低廉，操作简单，小型化的优点，满足了现场检测的需求。
(4)本申请成功构建一种基于距离调控的传感策略的双模式AFB1传感器，电化学模式下的检测范围可用于0.02pg/mL～100ng/mL的AFB1的检测，检测为9.3fg/mL，由于不同检测模式得到的结果可以相互验证，从而可以提高检测的可靠性，另外传感器表现出高的选择性和重现性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请提供的双模式传感器检测AFB1的原理示意图；
图2为实施例1中所制备的Au NPs@NPC-ZnO复合材料的透射电镜图像，其中A是氯金酸溶液(质量浓度为10mM)用量为100μL(即1×10-3mmol)时获得的复合材料的透射电镜图，B是氯金酸溶液(质量浓度为10mM)用量为150μL(即1.5×10-3mmol)时获得的复合材料的透射电镜图，C是氯金酸溶液(质量浓度为10mM)用量为200μL(即2×10-3mmol)时获得的复合材料的透射电镜图；
图3为不同氯金酸溶液用量对Au NPs@NPC-ZnO复合材料光电性能的影响，其中a是用量为100μL，b是用量为150μL，c是用量为200μL；
图4为不同材料的光电响应曲线，其中a是ZIF-8，b是NPC-ZnO，c是Au NPs@NPC-ZnO；
图5为不同材料的交流阻抗谱图，其中a是ZIF-8，b是NPC-ZnO，c是Au NPs@NPC-ZnO；
图6为本发明所设计的纸基电极；
图7为不同浓度AFB1所对应传感器的差分脉冲伏安曲线；
图8为不同浓度AFB1的对数值与Fc和MB氧化电流比值的线性拟合曲线；
图9为不同浓度AFB1所对应传感器的时间-电流曲线；
图10为不同浓度AFB1的对数值与光电流的线性拟合曲线；
图11为本申请提供的双模式传感器的选择性测试结果；
图12为本申请提供的双模式传感器的重现性测试结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
本实施例提供了一种Au NPs@NPC-ZnO复合材料，其制备方法包括如下步骤：
(1)ZIF-8的制备
将0.8g 2-甲基咪唑和1.2g硝酸锌分别溶于20mL的甲醇溶液中，磁力搅拌15min，记为A和B溶液；
将A和B两种溶液混合，在室温条件下搅拌24h；通过离心收集固体产物，并用甲醇洗涤三次；将白色产物置于60℃真空干燥箱中干燥12h，获得ZIF-8粉末。
(2)NPC-ZnO的制备
将制备的80mg ZIF-8置于瓷舟中，在N2气氛下，以5℃/min的升温速率，在600℃下煅烧180min；冷却至室温并收集黑色固体粉末，制得NPC-ZnO。
(3)Au NPs@NPC-ZnO的制备
取三份40mg NPC-ZnO分别置于三个反应容器中，加入20mL的超纯水，然后分别加入摩尔浓度10mM的氯金酸溶液100μL(即1×10-3mmol)、150μL(即1.5×10-3mmol)和200μL(即2×10-3mmol)，搅拌10min；再分别加入20μL、摩尔浓度为0.1M新鲜制备的硼氢化钠溶液进行还原，继续反应30min；用超纯水和无水乙醇洗涤3次，通过离心收集固体产物，最后将获得的Au NPs@NPC-ZnO分散在磷酸盐缓冲溶液中(pH＝7.0)，4℃下保存备用，即获得三个不同纳米金负载量的Au NPs@NPC-ZnO复合材料，其中，制得的复合材料粒径均约为160nm，纳米金的粒径约为2nm。
将上述方法制备获得的三个不同纳米金负载量的复合材料分别用透射电镜进行观察，所得结果如图2所示。
由图2可知，当氯金酸溶液用量为100μL(即1×10-3mmol)时，NPC-ZnO表面的Au NPs数量较少(如图2中A所示)；当氯金酸溶液用量为200μL(即2×10-3mmol)时，Au NPs发生严重的团聚现象；而当氯金酸溶液用量在为150μL(即1.5×10-3mmol)时，粒径为2nm左右的AuNPs均匀分散在NPC-ZnO的表面，并且没有发生明显的团聚现象。
进一步，通过时间-电流曲线探究不同氯金酸溶液的用量对制得的Au NPs@NPC-ZnO复合材料光电性能的影响，所得结果如图3所示。
由图3可知，当氯金酸溶液用量为150μL(即1.5×10-3mmol)时，光电信号强度明显高于氯金酸溶液用量为100μL(即1×10-3mmol)和氯金酸溶液用量为200μL(即2×10- 3mmol)，由此可说明Au NPs负载量过低或者团聚现象会严重影响复合材料的光电性能。
以氯金酸溶液用量为150μL(即1.5×10-3mmol)时制得的Au NPs@NPC-ZnO复合材料为优选例，通过时间-电流曲线和交流阻抗谱图对其进行性能测试，并与NPC-ZnO和ZIF-8材料作对比，所得结果如图4和图5所示。
由图4可知，ZIF-8对光电信号几乎没有相应，而相较于NPC-ZnO，实施例制得的AuNPs@NPC-ZnO复合材料显示出了显著更好的光电信号响应，这是由于NPC作为敏化结构，可以缩小ZnO的带隙，增强光吸附能力，加速光生电子空穴对的分离。另外，Au NPs的LSPR效应可以将热电子注入NPC-ZnO的导带，导致光电信号增强。
由图5可知，相对于ZIF-8和NPC-ZnO，Au NPs@NPC-ZnO复合材料具有更小的阻抗值，如此可说明碳化过程和Au NPs的掺杂导致了电荷转移能力的增强，进而可以加快电极界面的电子转移，有利于提高Au NPs@NPC-ZnO在座位基底修饰材料时的检测灵敏度。
实施例2
本实施例提供了含有实施例1中由NPC-ZnO和Au NPs以40mg：1.5×10-3mmol的反应比例制备获得的Au NPs@NPC-ZnO复合材料的电化学/光电化学双模式传感器，该传感器的制备方法如下：
步骤a、制备纸基电极：
(a-1)在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计纸基电极图案，利用蜡印机将其批量打印在色谱纸上，圆形亲水区域直径为12mm，如图6中左图所示；
(a-2)将纸基电极图案置200℃的烘箱中加热180s，使蜡融化形成疏水屏障；
(a-3)利用丝网印刷方法在圆形亲水区域制备碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极，其中碳工作电极的直径为6mm，所制得的纸基电极如图6中右图所示。
步骤b、制备双模式传感器
(b-1)将6μL、2.00mg/mL的Au NPs@NPC-ZnO的超纯水溶液滴涂步骤a制得的纸基电极于步骤a制得的纸基电极的工作电极层表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
(b-2)继续将6μL、1.0μg/mL的ssDNA-MB溶液滴加在Au NPs@NPC-ZnO修饰的工作电极层表面；
(b-3)继续将3μL的6-巯基己醇(MCH)溶液滴加到工作电极层表面，用以封闭电极表面的非特异性活性位点；
(b-4)继续将6μL、1.0μg/mL的Apt-Fc溶液滴加到工作电极层表面，通过DNA杂交与ssDNA-MB结合；
(b-5)干燥，获得用于检测AFB1的电化学/光电化学双模式传感器。
对上述方法制得的电化学/光电化学双模式传感器对AFB1的检测效果进行检验，方法如下：
将6μL、0.02pg/mL～100ng/mL的不同浓度的AFB1溶液滴加在电极表面，室温下反应40min。随后，分别在电化学检测模式和光电检测模式下进行检测，结果如图7～图10所示。
在电化学检测模式下，通过差分脉冲伏安法进行检测，响应曲线如图7所示，绘制Fc和MB氧化电流比值与AFB1浓度的对数值的拟合曲线如图8所示。由图7和图8可知，本申请提供的传感器，其电化学检测模式下的检测范围为0.1pg/mL～100ng/mL，其线性方程为IFc/IMB＝-0.89lgcAFB1+2.82(R2＝0.993)，检测限为36.7fg/mL。
在光电检测模式下，通过时间-电流曲线进行光电化学信号检测，响应曲线如图9所示，绘制光电流强度与AFB1浓度的对数值的拟合曲线如图10所示。由图9和图10可知，本申请提供的传感器，其光电检测模式下的检测范围为0.02pg/mL～100ng/mL，其线性方程为I＝0.28lgcAFB1+1.79(R2＝0.996)，检测限为9.3fg/mL。
采用实际样品中可能存在的干扰真菌毒素，比如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A(OTA)和T-2毒素用于测试双模式传感器的选择性，所得结果如图11所示。
由图11中的结果可知，干扰真菌毒素样品的信号响应与空白样品一致。当样品中存在目标物AFB1时，传感器显示出明显的信号变化，结果表明该传感器具有良好的选择性。
另外，对双模式传感器的重现性进行了测试，所得结果如图12所示。
由图12的结果可知，电化学信号和光电化学信号响应的相对标准偏差分别为2.7％和2.3％，说明双模式传感器具有好的重现性。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (10)
1.一种Au NPs@NPC-ZnO复合材料，其特征在于，所述复合材料为由粒径为2～5nm的纳米金Au NPs均匀分散在氮掺杂多孔碳-氧化锌NPC-ZnO表面的结构；
所述复合材料由NPC-ZnO和Au NPs以(30～50)mg：(1.4～1.6)×10-3mmol的反应比例制备获得，且获得的所述复合材料的粒径为100～200nm。
2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料的制备方法包括：将NPC-ZnO溶于溶剂中，加入金源混合，再加入还原剂，反应10～60min，离心获得固体产物。
3.根据权利要求2所述的复合材料，其特征在于，所述NPC-ZnO由ZIF-8粉末于氮气氛围下，温度500℃～800℃煅烧120～240min获得。
4.根据权利要求2所述的复合材料，其特征在于，所述金源为氯金酸；和/或，所述还原剂为硼氢化钠。
5.如权利要求1-4任一所述的Au NPs@NPC-ZnO复合材料在制备用于检测黄曲霉毒素B1的传感器中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述传感器包括基于电化学和光电化学双信号模式的传感器。
7.一种用于检测黄曲霉毒素B1的电化学/光电化学双模式传感器，其特征在于，所述传感器包括：
基材以及附着在所述基材上的电极层，所述电极层包括工作电极层；
所述工作电极层的表面依次涂覆有如权利要求1-4任一所述的Au NPs@NPC-ZnO复合材料、ssDNA-MB以及Apt-Fc。
8.根据权利要求7所述的传感器，其特征在于，所述ssDNA-MB的核苷酸序列为：5’-MB-TCT CTG TTG TGC TCC CAT GCG AAT TGA AGA GAC AAC ACG ATG GG-(CH2)6-SH-3’；和/或，
所述Apt-Fc的核苷酸序列为：5’-Fc-GCA CGT GTT GTC TCT CTG TGT CTC GTG C-3’。
9.一种定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述方法包括利用如权利要求7或8所述的传感器进行检测的步骤，具体包括：
将待测样本滴加在工作电极层的表面，室温下反应40～60min，通过差分脉冲伏安法和时间-电流曲线分别进行电化学和光电化学信号检测，绘制电化学信号/光电流强度与黄曲霉毒素B1浓度的拟合曲线，实现对黄曲霉毒素B1的定量检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述传感器在电化学模式下的检测范围为0.1pg/mL～100ng/mL，在光电模式下的检测范围为0.02pg/mL～100ng/mL。
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