CN117305307A - Sam传感器分子、表达载体及检测细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶活性的试剂盒 - Google Patents

Sam传感器分子、表达载体及检测细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶活性的试剂盒 Download PDF

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CN117305307A CN202310243091.0A CN202310243091A CN117305307A CN 117305307 A CN117305307 A CN 117305307A CN 202310243091 A CN202310243091 A CN 202310243091A CN 117305307 A CN117305307 A CN 117305307A
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Abstract

本发明提供一种SAM传感器分子、表达载体及检测细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶活性的试剂盒。该传感器分子的序列如Seq ID No.1所示；其中，该序列沿5’端到3’端方向第1位到第20位、第66位至第78位碱基为发光模块序列、第22位至第64位碱基为感应模块序列、第21位和第65位碱基为换能器模块序列。本发明提供的该SAM传感器分子的表达载体及试剂盒利用Pepper荧光RNA适配体可动态检测体内SAM的含量，从而评估细胞内甲硫氨酸腺苷转移酶的活性，测量结果快速、灵敏。

Description

SAM传感器分子、表达载体及检测细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶 活性的试剂盒
技术领域
本发明属于生物样品检测技术领域，具体涉及一种SAM传感器分子、载体及用于检测甲硫氨酸腺苷转移酶活性的试剂盒。
背景技术
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)是广泛存在于动物、植物和微生物体内的重要代谢中间物质，也是人体内一种重要的生理活性物质，参与了40多种生化反应。在生物体代谢网络中，来自于ATP的腺苷部分攻击甲硫氨酸的硫原子，生成高能量、活泼的有机锍化合物S-腺苷甲硫氨酸。具有生物活性的S-腺苷甲硫氨酸，在体内主要起着转甲基、转硫、转氨丙基的作用。目前已发现，至少35种不同的转甲基反应需要SAM作为甲基的供体。诸如肾上腺素、胆碱、肌酸等许多含氮物质的生物合成都需要SAM提供甲基。许多DNA、RNA、蛋白质的甲基化修饰也要SAM的参与。
甲硫氨酸腺苷转移酶(Methionine adenosyltransferase，MATase)是合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)的重要酶，能够催化甲硫氨酸和ATP形成S-腺苷甲硫氨酸。在哺乳动物细胞中，MATase家族主要有MAT1A、MAT2A和MAT2B三种表达形式，前两者能够编码催化亚基的形成。MAT1A主要分布于肝脏，以维持肝细胞和胆管上皮细胞的分化；MAT2A则分布在肝的非实质细胞中以及其他非肝组织。MAT1A与MAT2A在序列上具有85％同源性。研究表明，MATase的丰度和活性能够影响细胞整体甲基化水平，从而诱导疾病发生，例如部分实体瘤或淋巴瘤患者能够响应MAT2A抑制剂，调节肿瘤细胞整体甲基化水平，改善患者预后。
在现有的报道中，一般依赖于液相色谱-质谱联用等技术测量细胞内的SAM水平，进而通过SAM水平变化评估MATase活性或基因表达量。而这类方法仅能够检测批量、固定的样品中的SAM水平，而不能实时观察到单细胞中SAM的动态变化
因此，研发出一种新的快速、灵敏、高效的检测MATase活性的检测技术成为亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种SAM传感器分子，该SAM传感器分子通过构建荧光RNA适配体，可动态检测体内SAM的含量，从而评估细胞内甲硫氨酸腺苷转移酶的活性。
本发明的另一目的在于提供一种载体，该载体可用于表达上述SAM传感器分子。
本发明的第三个目的在于提供一种用于检测甲硫氨酸腺苷转移酶活性的试剂盒，该试剂盒以Pepper为基础的荧光RNA传感器荧光亮度高，稳定性强，具有优异的信噪比。
为了实现上述目的，本发明提供一种SAM传感器分子，该传感器分子的序列如SeqID No.1所示：5’-CGCCCAAUCGUGGCGUGUCGACGAAAGGAUGG CGGAAACGCCAGAUGCCUUGUAACCGAAAGGGUACUGGCGCCGGUG-3’；其中，该序列沿5’端到3’端方向第1到第20、第66到第78位碱基为发光模块序列、第22到第64位碱基为感应模块序列、第21与第65位碱基为换能器模块序列。
本发明还提供一种DNA分子，转录上述的SAM传感器分子。
本发明还提供一种表达载体，包含上述的DNA分子。
本发明还提供上述表达载体的制备方法：包含如下步骤：
1)以如Seq ID No.2所示序列：CTAATACGACTCACTATAGGGAGTGCGGCCGCCCAATCGTGGCGTGTCGACG为正向引物F，如Seq ID No.3所示序列：GCCGACCGCGGCCACCGGCGCCAGTACCCTTTCGGTTACAAGGCATCT GGCGTTTCCGCCATCCTTTCGTCGACACGCCACGATT为反向引物R进行PC R反应，得到PCR产物；
2)将PCR产物进行双酶切，插入到带有U6启动子和Tornado表达系统序列的载体中。
优选地，所述带有U6启动子和Tornado序列的载体为pAV-U6+27-Tornado-Broccoli。
本发明还提供一种检测细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶活性的试剂盒，包含上述的表达载体。
本发明还提供一种甲硫氨酸腺苷转移酶活性的检测方法，包括如下步骤：
(1)准备待检测的细胞，在37℃，5％CO2条件下在12孔培养板中用培养基培养待检测的细胞至汇合度为60～80％；
(2)将上述的表达载体与脂质体转染试剂按1μg：2μl混合于50μl无血清培养基中制成混合液，室温孵育10分钟；随后将混合液加入到带有待检测的细胞的12孔培养板中，继续培养待检测的细胞24h；
(3)将共聚焦成像皿用浓度为100μg/ml的多聚赖氨酸溶液预处理12小时，随后将待检测的细胞转移至共聚焦成像皿中，培养1天至完全贴壁；
(4)准备成像：向无酚红的培养基加入HBC，配制成含HBC终浓度为10μM的无酚红的培养基，备用；
(5)将12孔培养板中细胞培养基吸出，并替换为含有HBC的无酚红培养基，孵育1小时；
(6)使用共聚焦显微镜或其它荧光显微镜对细胞进行成像，用FITC通道记录细胞荧光强度，每10分钟采集一次图像；
(7)使用图像处理软件分析细胞荧光强度。
与现有SAM或MATase活性检测技术相比，本发明的优势在于：
1.本发明能够直接测定产物SAM的含量，不受甲硫氨酸腺苷转移酶相同变构酶的影响；
2.本发明操作简便，不需裂解细胞，提纯蛋白等操作；
3.本发明响应速度快，滞后小，能准确反应甲硫氨酸腺苷转移酶的活性动态变化；
4.本发明的检测方式更为直观，能够通过荧光定量的形式对甲硫氨酸腺苷转移酶的活性进行定量研究，简单快速。
5.本发明能够检测单个活细胞中的SAM含量，检测保留了活细胞的动态信息，为代谢研究提供了更精准的工具。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种SAM传感器分子、表达该传感器分子的DNA载体以及用于检测甲硫氨酸腺苷转移酶活性的试剂盒。该SAM传感器分子利用Pepper荧光RNA适配体可动态检测体内SAM的含量，从而评估细胞内甲硫氨酸腺苷转移酶的活性，测量结果快速、灵敏。
附图说明
图1为本发明提供的SAM传感器分子的二级结构示意图。
图2为本发明提供的SAM传感器分子的作用原理示意图。
图3为本发明提供的SAM传感器对SAM的体外线性响应曲线。
图4为本发明提供的SAM传感器的选择性测试比较图。
图5为本发明提供的SAM与甲硫氨酸的化学结构示意图。
图6为本发明所提供的传感器实时监测培养基中甲硫氨酸浓度对HEK293T细胞内SAM动态的荧光照片。
图7为本发明所提供的SAM传感器实时监测HEK293T细胞内甲硫氨酸浓度变化的荧光强度-时间曲线图。
图8为本发明所提供的转染对照质粒的HEK293T细胞随着培养基中甲硫氨酸浓度变化的荧光强度-时间曲线图。
图9为本发明所提供的传感器在HEK293T细胞中实时监测环亮氨酸对甲硫氨酸腺苷转移酶活性的荧光照片。
图10为本发明所提供的SAM传感器在HEK293T细胞中实时监测环亮氨酸对甲硫氨酸腺苷转移酶活性的细胞荧光强度-时间曲线图。
图11为转染Pepper的对照质粒的HEK293T细胞中实时监测环亮氨酸对甲硫氨酸腺苷转移酶活性的细胞荧光强度-时间曲线图。
图12为本发明所提供的传感器在Hela细胞中实时监测SAHA对甲硫氨酸腺苷转移酶表达量影响的荧光照片。
图13为本发明所提供的SAM传感器在Hela细胞中实时监测SAHA对甲硫氨酸腺苷转移酶表达量影响的细胞荧光强度-时间曲线图。
图14为转染Pepper的对照质粒的Hela细胞随着SAHA处理的细胞荧光强度-时间曲线图。
图15为SAHA对甲硫氨酸腺苷转移酶影响的qPCR检测结果。
具体实施方式
下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明提供一种SAM传感器分子，该SAM传感器分子的序列如Seq IDNo.1所示：5’-CGCCCAAUCGUGGCGUGUCGACGAAAGGAUGGCGGAAACG CCAGAUGCCUUGUAACCGAAAGGGUACUGGCGCCGGUG-3’。该SAM传感器分子的二级结构如图1所示。从图1可以看出，该SAM传感器分子可分为三个部分：发光模块、感应模块、换能器模块。
其中，发光模块为荧光RNA适配体Pepper的核心序列。Pepper为一种能够结合荧光染料HBC(4-(1-氰基-2-(4-((2-羟乙基)(甲基)氨基)苯基)乙烯基)苄腈)的荧光RNA适配体。Pepper能够特异性地结合HBC分子，结合后可产生强烈的荧光。Pepper的序列如Seq IDNo.4所示：5’-CCAAUCGUGGCGUGUCGGCCUG CUUCGGCAGGCACUGGCGCCG-3’，其中下划线序列为颈环结构，下划线两侧为Pepper的核心序列。在Pepper中颈环结构部分只要能够维持颈结构即可保证Pe pper发光，因此，在保证颈环结构的情况下本发明对于Pepper的颈环结构进行改造，用于衔接感应模块和换能器模块。该SAM传感器分子两端Pepper核心序列外的各三个互补碱基(CGC和GUG)形成的颈结构用于稳定Pepper结构的折叠。也可以为其他可形成颈结构的各三个互补碱基。
感应模块为SAM核糖开关，是一种天然的RNA适配体，它能够特异性结合SAM并在结合后稳定折叠。
换能器(Transducer)模块为一对A-U碱基对，用于将感应模块与发光模块连接在一起，从而将感应模块与靶标SAM的结合信号转换为发光模块Pepper的折叠产生的荧光信号的作用。本发明中选择的换能器长度较短、亲和力较弱，便于SAM核糖开关在结合SAM前后的结构变化响应Pepper折叠，若换能器长度加长，形成的双链过于稳定，则会导致SAM核糖开关在结合SAM前后的结构变化无法影响Pepper折叠，造成失去响应性。
本发明所提供的表达SAM传感器分子的作用原理如图2所示，从图2可以看出：当感应模块没有结合SAM的时候，换能器模块的双链无法稳定发光模块的Pepper核心序列的构象，使发光模块无法正确折叠形成结合HBC的口袋，不产生荧光；感应模块结合到SAM后，感应模块与SAM形成稳定的RNA结构，使得换能器模块稳定形成双链，从而诱导发光模块的Pepper核心序列正确折叠，结合HBC而发光。
本发明所提供的SAM传感器分子，以荧光RNA适配体“Pepper”的核心序列为发光模块，以SAM的适配体作为感应模块，发光模块与感应模块由一段短双链RNA序列连接，称为“换能器”模块。通过调节换能器模块的序列，改变感应模块的热力学稳定性，能够使感应模块在没有结合SAM时处于未折叠的状态，Pepper无法发光；而在结合SAM后，SAM诱导其适配体模块折叠，从而稳定SAM传感器分子的结构，导致Pepper核心序列发出强烈的荧光，荧光亮度高，稳定性强，具有优异的信噪比。
材料：
1.引物委托北京擎科生物科技有限公司合成。
2.PCR mix(2×Taq Master Mix(Dye Plus))：购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，产品编号：P112-01。
3.T7体外转录试剂盒(T7 High Yield RNA Transcription Kit)购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，产品编号：TR101-01。
4.琼脂糖与凝胶回收试剂盒购买自爱思进生物技术有限公司，产品编号：AP-GX-250。
5.水饱和酚氯仿购买自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio)，产品编号：P1025；3M乙酸钠购买自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio)，产品编号：A1070。
6.pAV-U6+27-Tornado-Broccoli载体购买自Addgene，产品编号：#124360。
7.限制性内切酶Not I，购买自NEB，产品编号：#R0189V；限制性内切酶Sac II，购买自NEB，产品编号：#R0157V；T4 DNA连接酶购买自南京诺唯赞，产品编号：C301-01。
8.无酚红培养基购买自Biological Industries，产品编号：01-053-1A。
9.HEK293T细胞购买自ATCC，产品编号：CRL-3216。
10.阳离子脂质体转染试剂购买自Thermo Fisher，产品编号：L3000001。
11.Pepper核心序列所结合的HBC(4-(1-氰基-2-(4-((2-羟乙基)(甲基)氨基)苯基)乙烯基)苄腈)购买自Selleck，产品编号：E0078。
设备：
1.荧光成像显微镜使用Olympus SpinSR10显微镜。
2.荧光光谱仪使用HORIBA FluoroMax+荧光分光光度计。
3.PCR仪使用ABI Veriti96。
4.荧光定量PCR仪使用Agilent Technologies Stratagene MX3000P。
实施例1体外制备SAM传感器分子并检测SAM传感器的敏感性和选择性
1.体外合成SAM传感器
设计正向引物F，序列如Seq ID No.2所示：CTAATACGACTCACTATAG GGAGTGCGGCCGCCCAATCGTGGCGTGTCGACG；
反向引物R，序列如Seq ID No.3所示：GCCGACCGCGGCCACCGGCGC CAGTACCCTTTCGGTTACAAGGCATCTGGCGTTTCCGCCATCCTTTCGTCG ACACGCCACGATT。
配制PCR反应体系如表1所示。
表1PCR反应体系
PCR反应程序如表2所示。
表2 PCR反应程序
PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，并使用凝胶回收试剂盒回收DNA。以提取出的DNA为模板，通过T7体外转录试剂盒转录RNA。用水饱和酚氯仿抽提纯化转录得到的RNA，加入无菌、无RNA酶的纯净水溶解至浓度约为10μM，所转录得到的RNA即为SAM传感器，备用。
2.检测SAM传感器与SAM体外结合的荧光参数。
在试管中配制含不同浓度SAM的荧光结合体系，如表3所示。
表3 荧光结合体系
在37℃孵育1小时后，用FluoroMax+(HORIBA Scientific)测量荧光，结果如图3所示。从图3可以看出，SAM传感器的荧光强度与SAM呈正相关，说明该传感器的荧光强度能够定量SAM浓度。
3.检测SAM传感器的选择性
为了检测SAM传感器的选择性，将SAM传感器分别与SAM以及SAH(S-腺苷-L-高半胱氨酸)、甲硫氨酸、腺苷等类似SAM的物质配制反应体系，如表4所示。
表4
成分 终浓度
SAM传感器 1μM
HBC 10μM
HEPES缓冲液 40mM HEPES，100mM KCl，1mM MgCl2
SAM或SAH或甲硫氨酸或腺苷 1mM
在37℃孵育1小时后，用FluoroMax+(HORIBA Scientific)测量荧光。
从图4可以看出，SAM传感器能够高选择性地区分SAM与其类似物SAH、甲硫氨酸和腺苷，说明本发明制备的SAM传感器具有选择性。
实施例2检测甲硫氨酸浓度影响细胞内SAM动态变化
如图5所示为甲硫氨酸(Methionine)合成SAM的示意图，甲硫氨酸作为SAM合成的重要原料，细胞培养基中缺乏甲硫氨酸时，SAM逐渐消耗而无法补充；在培养基中重新加入甲硫氨酸后，细胞能够合成SAM，SAM浓度恢复正常水平。
选用的表达载体为带有U6启动子和Tornado表达系统序列的pAV-U6+27-Tornado-Broccoli，其中U6启动子启动mRNA的转录，Tornado表达系统序列促进表达的RNA环化，从而促进SAM分子二级结构的形成。也可以采用其他带有U6启动子和Tornado表达系统序列的表达载体。
1.质粒构建：
将实施例1中制备的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，并使用凝胶回收试剂盒回收DNA。
将回收的DNA进行Not I和Sac II双酶切，酶切体系如表5所示。
表5 酶切体系
DNA 1μg
Not I 1μL
Sac II 1μL
Buffer 2μL
水 补充至20μL
然后进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶回收试剂盒回收酶切后的DNA片段。
将pAV-U6+27-Tornado-Broccoli质粒同样进行Not I和Sac II双酶切，并使用琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收试剂盒回收线性化的质粒。
使用T4 DNA连接酶连接线性化的质粒和酶切后的DNA片段，得到连接产物。
将连接产物转化至Top 10大肠杆菌中，涂板挑取单克隆抽提质粒，并测序验证序列，得到正确序列的pAV-U6+27-Tornado-Pepper-SAM sensor质粒，该质粒用于在细胞内转录SAM传感器。
制备对照质粒pAV-U6+27-Tornado-Pepper：
设计并合成正向引物F对，序列如Seq ID No.5所示：AGTGCGGCCGCCCAATCGTGGCGTGTCGGCCTGCTTCGGCAGGCACT；
反向并合成引物R对，序列如Seq ID No.6所示：CGACCGCGGCCACCGGCGCCAGTGCCTGCCGAAGCAGGCC。
采用实施例1中所列表1的PCR反应体系和表2的PCR反应程序进行PC R反应，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，并使用凝胶回收试剂盒回收DNA。将回收的DNA进行Not I和Sac II双酶切，酶切采用表5体系进行。然后进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶回收试剂盒回收酶切后的DNA片段。将pAV-U6+27-Tornado-Broccoli质粒同样进行Not I和Sac II双酶切，并使用琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收试剂盒回收线性化的质粒。使用T4 DNA连接酶连接线性化的质粒和酶切后的DNA片段，得到连接产物。将连接产物转化至Top 10大肠杆菌中，涂板挑取单克隆抽提质粒，并测序验证序列，得到正确序列的pAV-U6+27-Tornado-Pepper质粒(对照质粒)，pAV-U6+27-Tornado-Pepper质粒用于表达Pepper。
2.活细胞内甲硫氨酸腺苷转移酶活性检测
(1)将HEK293T细胞在培养板中培养至汇合度为60～80％。
(2)使用Lipofectin 3000(Thermofisher)将质粒pAV-U6+27-Tornado-Pe pper-SAM sensor转染到细胞中，继续培养24h，作为实验组；采用相同方法将pAV-U6+27-Tornado-Pepper转染到细胞中，继续培养24h，作为对照组。
(3)将实验组和对照组细胞消化后，分别转移至对应的共聚焦成像皿中，继续培养1天至完全贴壁。
(4)准备成像：按每孔2mL的容量吸取无酚红的DMEM培养基，向其中加入HBC使HBC终浓度为10μM，备用。
(5)将细胞培养基吸出，并替换为含有HBC的无酚红培养基，孵育1小时。
(6)使用Olympus SpinSR10共聚焦显微镜对细胞进行成像，用FITC通道记录细胞荧光强度，如图6中0小时所示。
(7)将细胞培养基替换为含有HBC、缺乏甲硫氨酸的不完全培养基后，每10分钟采集一次图像，如图6中1-4小时所示，可以看出荧光逐渐减弱。
(8)在4小时后细胞培养基中加入甲硫氨酸使终浓度为100μM，继续拍摄，每10分钟采集一次图像，如图6中4.5-8小时所示，可以看出荧光又由弱转强。
(9)用Fiji图像处理软件分析细胞荧光强度，并根据结果绘制荧光强度-时间曲线，结果如图7和图8所示。
从图6可以看出，在实验组(标记为SAM sensor)中表达SAM传感器的HEK293T细胞中表现出强烈的荧光，表明SAM传感器可以在活的人类细胞中对内源性SAM进行成像。甲硫氨酸为细胞中SAM生物合成的底物，用不含甲硫氨酸的培养基替换完全培养基后，SAM缺乏合成原料，细胞荧光显著下降。为了进一步验证荧光的下降是由缺乏甲硫氨酸时SAM的消耗引起的，我们随后在培养基中加入甲硫氨酸(100μM)，细胞的荧光在3小时内恢复。而在对照组(标记为Pepper)中，Pepper不会响应SAM的水平变化，因此荧光强度没有变化。
图7和图8为根据多个细胞成像绘制的荧光强度-时间曲线图。从图7可以看出，转录出的SAM传感器能够在单个细胞层面分析HEK293T细胞的SAM合成速率差异，因此能够用于精准分析MATase在不同细胞中的活性差异，对于精准调控MATase活性有着重要的意义。而图8则说明单纯转录出的Pepper无法检测甲硫氨酸浓度对SAM的影响。
实施例3检测活细胞内的甲硫氨酸腺苷转移酶活性
为了进行细胞内MATase活性检测，分别用表达SAM传感器的质粒pAV-U6+27-Tornado-Pepper-SAM sensor(实验组)和表达Pepper的质粒pAV-U6+27-Tornado-Pepper(对照组)转染HEK293T细胞。采用实施例2的方法进行转染和成像准备。
在将细胞培养基替换为含有HBC的无酚红DMEM培养基并孵育1小时后，用共聚焦显微镜进行成像。
随后，在培养基内加入环亮氨酸至终浓度为30mM每隔10分钟采集一次图像，持续2小时；然后将细胞培养基更换为含有HBC而不含环亮氨酸的新鲜培养基，每隔10分钟对细胞进行成像，持续3小时，结果如图9所示。
从图9可以看出，培养基中加入环亮氨酸抑制甲硫氨酸腺苷转移酶活性后，实验组细胞荧光随着SAM消耗而逐渐下降；而洗去环亮氨酸后，甲硫氨酸腺苷转移酶活性恢复，细胞荧光随着SAM合成而逐渐增强。而对照组的Pepper荧光不受SAM浓度的影响，因此不会发生变化。
由于环亮氨酸是MATase的特异性抑制剂，培养基中加入环亮氨酸后，MA Tase活性被抑制，细胞无法利用MATase合成SAM，细胞中的SAM水平就会下降。洗去环亮氨酸，换成新鲜培养基后，MATase活性恢复，细胞中的SAM恢复到原来水平。
绘制的荧光强度-时间曲线如图10和图11所示。
从图10可以看出，SAM传感器能够监测甲硫氨酸腺苷转移酶的活性，而从图11可以看出，对照组的Pepper则无法响应甲硫氨酸腺苷转移酶的活性变化。
实施例4SAM传感器监测Hela癌细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶基因的表达水平
将Hela细胞在培养板中培养至汇合度为60～80％，并进行转染。实验组细胞转染pAV-U6+27-Tornado-Pepper-SAM sensor质粒；对照组细胞转染pAV-U6+27-Tornado-Pepper质粒。转染过程和成像准备与实施例2，3相同。
在将细胞培养基替换为含有10μM HBC的无酚红DMEM培养基并孵育1小时后，用共聚焦显微镜进行成像。
随后，在培养基内加入亚酰苯胺羟肟酸(SAHA)至终浓度为100μM每隔30分钟采集一次图像，持续8小时，结果如图12所示。
从图12可以看出，Hela细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶mRNA初始表达量较低，在加入SAHA后的8小时内，细胞荧光明显增加；说明加入亚酰苯胺羟肟酸(SAHA)则能够诱导Hela细胞中的甲硫氨酸腺苷转移酶mRNA过表达，从而使SAM合成增加。
用Fiji图像处理软件提取多个细胞荧光强度，绘制荧光强度-时间曲线，如图13、图14所示。成像结束后，提取细胞RNA，qPCR验证MATase的表达量变化，对照组(control)和SAHA处理组(SAHA)如图15所示。从图13至图15可以看出，在SAHA处理后甲硫氨酸腺苷转移酶mRNA的表达升高。
因此，从图12至图15可以看出，SAM传感器可以检测细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶基因表达量。
本发明提供了一种SAM传感器分子，以及基于该SAM传感器分子的甲硫氨酸腺苷转移酶活性检验试剂盒。该SAM传感器分子以及试剂盒从RNA的角度出发，为检测甲硫氨酸腺苷转移酶的活性提供了一种新的方法与概念，区别于以往各种试剂盒的检测。而且也兼具以往测定甲硫氨酸腺苷转移酶活性方法的优点，简单，灵敏，准确，特异性强，能够准确测定SAM的含量从而探测甲硫氨酸腺苷转移酶的总活性，不受各种甲硫氨酸腺苷转移酶变构型的影响，有助于帮助了解体内甲基化的情况，为各种情况下的甲基化机制的深入探究提供了方法，对于人类健康的研究具有重大意义。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种SAM传感器分子，其特征在于，该传感器分子的序列如Seq ID No.1所示；其中，该序列沿5’端到3’端方向第1位到第20位、第66位至第78位碱基为发光模块序列、第22位至第64位碱基为感应模块序列、第21位和第65位碱基为换能器模块序列。
2.一种DNA分子，其特征在于，转录如权利要求1所述的SAM传感器分子。
3.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的DNA分子。
4.如权利要求3所述表达载体的制备方法：其特征在于，包含如下步骤：
1)以如Seq ID No.2所示序列为正向引物F，如Seq ID No.3所示序列为反向引物R进行PCR反应，得到PCR产物；
2)将PCR产物进行双酶切，插入到带有U6启动子和Tornado表达系统序列的载体中。
5.如权利要求4所述表达载体的制备方法：其特征在于，所述带有U6启动子和Tornado序列的载体为pAV-U6+27-Tornado-Broccoli。
6.一种检测细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶活性的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求3所述的表达载体。
7.一种甲硫氨酸腺苷转移酶活性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)准备待检测的细胞，在37℃，5％CO2条件下在12孔培养板中用培养基培养待检测的细胞至汇合度为60～80％；
2)将如权利要求3所述的表达载体与脂质体转染试剂按1μg：2μl混合于50μl无血清培养基中制成混合液，室温孵育10分钟；随后将混合液加入到带有待检测的细胞的12孔培养板中，继续培养待检测的细胞24h；
3)将共聚焦成像皿用浓度为100μg/ml的多聚赖氨酸溶液预处理12小时，随后将待检测的细胞转移至共聚焦成像皿中，培养1天至完全贴壁；
4)准备成像：向无酚红的培养基加入HBC，配制成含HBC终浓度为10μM的无酚红的培养基，备用；
5)将12孔培养板中细胞培养基吸出，并替换为含有HBC的无酚红培养基，孵育1小时；
6)对细胞进行荧光成像，记录细胞荧光强度，每10分钟采集一次图像；
7)使用图像处理软件分析细胞荧光强度。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述培养基为DMEM培养基。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤6)所述荧光成像采用共聚焦显微镜或荧光显微镜实现。
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