CN117304332A - 融合有穿膜肽的耐热性纳米颗粒蛋白、纳米载体、免疫原性复合物和纳米颗粒疫苗及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了融合有穿膜肽的耐热性纳米颗粒蛋白、纳米载体、免疫原性复合物和纳米颗粒疫苗及应用，属于疫苗技术领域。本发明提供了融合有穿膜肽的耐热性纳米颗粒蛋白，由耐热性自组装蛋白的N端或C端通过连接肽连接穿膜肽得到；所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以耐热性自组装蛋白作为耐热性纳米颗粒蛋白的基础，可用于递送各种疫苗抗原，显著提高疫苗抗原的稳定性。并且，本发明通过在耐热纳米蛋白表面遗传融合添加穿膜肽，显著提升了耐热纳米蛋白内体逃逸和抗原递呈的能力，对于后续诱发更强的免疫反应至关重要。
Description
技术领域
本发明属于纳米疫苗技术领域，具体涉及融合有穿膜肽的耐热性纳米颗粒蛋白、纳米载体、免疫原性复合物和纳米颗粒疫苗及应用。
背景技术
在疫苗学中，纳米颗粒疫苗作为新兴的应用领域，纳米颗粒主要发挥三个主要作用：作为佐剂、载体或表达平台，由疫苗抗原如何与纳米颗粒相互作用决定。接种疫苗后，纳米颗粒用于通过这些作用的一种或多种来改善免疫反应。无论是无机的还是有机的纳米颗粒平台，均涉及抗原附着在颗粒表面，通过加强与细胞受体的识别和结合来促进免疫反应。
无机的纳米颗粒平台存在毒性和非生物降解性的问题。例如，胶束平台已被用于呈递SARS-CoV-2尖峰三聚体，但可能仅限于具有跨膜结构域的抗原。相比之下，基于蛋白质的平台具有高度的生物相容性，可以均匀地组装，并可以有效定制以适应任何抗原。静脉注射的蛋白质纳米颗粒已被证明可以自由地穿过循环管和淋巴管，并在甲状腺和脾脏中快速积聚，有利于建立体液免疫。此外，基于蛋白质的平台通过遗传融合或亲和标签复合物实现抗原附着，从而允许在平台上均匀地装饰抗原。第一个蛋白质平台利用从其感染成分中分离出的病毒衣壳蛋白，并利用其天然的寡聚性质形成稳定的纳米颗粒，称为病毒样颗粒(VLP)。VLP由自组装的病毒包膜或衣壳蛋白组成，已被广泛用作临床试验和商业批准疫苗的平台。然而，VLP对外界环境条件变化，例如高温、冻融和pH等耐受性差，造成其稳定性差。此外，纳米颗粒蛋白载体在抗原递送过程中容易被溶酶体摄取进而形成内体，导致无法有效发挥免疫作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供融合有穿膜肽的耐热性纳米颗粒蛋白、纳米载体、免疫原性复合物和纳米颗粒疫苗及应用，本发明的耐热性纳米颗粒蛋白稳定性强，且内体逃逸和抗原递呈能力强。
本发明提供了融合有穿膜肽的耐热性纳米颗粒蛋白，由耐热性自组装蛋100002
白的N端或C端通过连接肽连接穿膜肽得到；所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
优选的，所述耐热性自组装蛋白包括24聚体铁蛋白、60聚体AaLS、酰基转移酶组分E2蛋白、Sm蛋白的7聚体结构域或聚合鞭毛蛋白丝。
本发明提供了一种纳米载体，所述纳米载体包括第一纳米载体或第二纳米载体；
所述第一纳米载体由上述方案所述耐热性纳米颗粒蛋白连接第一共价键得到；所述第一共价键和穿膜肽分别连接在耐热性自组装蛋白的两端；
所述第二纳米载体由耐热性自组装蛋白的N端或C端连接第一共价键得到；
所述第一共价键的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述方案所述的耐热性纳米颗粒蛋白或者所述的纳米载体在制备纳米颗粒疫苗中的应用。
本发明还提供了一种免疫原性复合物，包括上述方案所述的纳米载体和抗原单元；
当所述纳米载体为第一纳米载体时，所述抗原单位为第一抗原单元；所述第一纳米载体包括上述方案所述纳米载体；所述第一抗原单元由抗原的N端或C端融合第二共价键得到；
当所述纳米载体为第二纳米载体时，所述抗原单元为第二抗原单元；所述第二抗原单元的两端分别融合有第二共价键和穿膜肽；
所述第二共价键和第一共价键通过酰胺键结合；所述第二共价键的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述抗原包括肿瘤模型抗原OVA；所述肿瘤模型抗原OVA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了上述方案所述免疫原性复合物的制备方法，包括以下步骤：
将纳米载体和抗原单元混合，自组装得到免疫原性复合物。
本发明还提供了上述方案所述的免疫原性复合物或者所述制备方法制备得到的免疫原性复合物在制备纳米颗粒疫苗中的应用。
本发明还提供了一种纳米颗粒疫苗，包含上述方案所述的免疫原性复合物或者所述制备方法制备得到的免疫原性复合物。
本发明还提供了成套试剂盒，包含上述方案所述的纳米颗粒疫苗以及用于接种所述纳米颗粒疫苗的容器。
本发明提供了融合有穿膜肽的耐热性纳米颗粒蛋白，由耐热性自组装蛋白的N端或C端通过连接肽连接穿膜肽得到；所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以耐热性自组装蛋白作为耐热性纳米颗粒蛋白的基础，可用于递送各种疫苗抗原，显著提高疫苗抗原的稳定性。并且，本发明通过在耐热纳米蛋白表面遗传融合添加穿膜肽，显著提升了耐热纳米蛋白内体逃逸和抗原递呈的能力，对于后续诱发更强的免疫反应至关重要。
附图说明
图1为AaLS纳米载体和OVA抗原构建示意图；
图2为AaLS纳米载体和OVA抗原构建示意图；
图3为AaLS和OVA-AaLS的透射电镜图，其中A为AaLS，B为OVA-AaLS；
图4为不同温度处理后AaLS和OVA-AaLS的可溶性比例变化；
图5为65℃处理一个月后的AaLS和OVA-AaLS的溶解度变化；
图6为5轮冻融处理后AaLS和OVA-AaLS的溶解度变化；
图7为冻干前后AaLS和OVA-AaLS的溶解度变化；
图8为不同类型疫苗处理后DCs的相对荧光强度，其中，1：阴性对照组；2：Cy5.5-OVA游离抗原组；3：Cy5.5-OVA-AaLS组；4：Cy5.5-OVA-AaLS-TAT组；
图9为小鼠体内荧光强度的时程估计；
图10为流式细胞术检测各组小鼠脾细胞中活化T细胞的百分比；
图11为各组小鼠脾细胞中IFN-γ的分泌水平；
图12为各组小鼠肿瘤免疫后的肿瘤体积动态监测曲线；
图13为免疫结束后小鼠的肿瘤图片。
具体实施方式
本发明提供了融合有穿膜肽的耐热性纳米颗粒蛋白，由耐热性自组装蛋白的N端或C端通过连接肽连接穿膜肽得到；所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：RKKRRQRRR。
在本发明中，所述耐热性纳米蛋白优选的通过融合表达得到；所述融合表达包括：将耐热性纳米颗粒蛋白的cDNA转入支架融合表达。
在本发明中，穿膜肽可显著提高疫苗抗原的内体逃逸实现有效的抗原递呈。
本发明的耐热性纳米颗粒蛋白用于疫苗抗原递呈时，可增强疫苗抗原的热稳定性和免疫原性。
在本发明中，所述耐热性自组装蛋白优选的包括24聚体铁蛋白、60聚体AaLS、酰基转移酶组分E2蛋白、Sm蛋白的7聚体结构域或聚合鞭毛蛋白丝。
在本发明中，所述24聚体铁蛋白分离自嗜热古生菌焦球菌。
在本发明中，所述60聚体AaLS来自于超嗜热菌的二氧四氢喋啶合酶。
在本发明中，所述酰基转移酶组分E2蛋白是来自于嗜热脂肪土芽孢杆菌的酰基转移酶组分。
在本发明中，所述Sm蛋白的7聚体结构域为来自于超嗜热古菌Sm蛋白的7聚体结构域。
本发明提供了一种纳米载体，所述纳米载体包括第一纳米载体或第二纳米载体；
所述第一纳米载体由上述方案所述耐热性纳米颗粒蛋白连接第一共价键得到；所述第一共价键和穿膜肽分别连接在耐热性自组装蛋白的两端；
所述第二纳米载体由耐热性自组装蛋白的N端或C端连接第一共价键得到；
所述第一共价键的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：MVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDS SGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQV TVDGEATEGDAHT。
在本发明中，所述第一共价键优选为共价键SpyCatcher。
在本发明中，所述第一纳米载体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
MRKKRRQRRRGGGGMQIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDCIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKEDIDAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLANLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTKHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLRGGGGMVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHTGGGGHHHHHH。
在本发明中，所述第二纳米载体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
MQIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDCIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKEDIDAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLANLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTKHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLRGGGGMVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHTGGGGHHHHHH。
本发明还提供了上述方案所述的耐热性纳米颗粒蛋白或者所述的纳米载体在制备纳米颗粒疫苗中的应用。
本发明还提供了一种免疫原性复合物，包括上述方案所述的纳米载体和抗原单元；
当所述纳米载体为第一纳米载体时，所述抗原单位为第一抗原单元；所述第一纳米载体包括上述方案所述纳米载体；所述第一抗原单元由抗原的N端或C端融合第二共价键得到；
当所述纳米载体为第二纳米载体时，所述抗原单元为第二抗原单元；所述第二抗原单元的两端分别融合有第二共价键和穿膜肽；
所述第二共价键和第一共价键通过酰胺键结合；所述第二共价键的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：RGVPHIVMVDAYKRYK。
在本发明中，所述第二共价键优选为共价键SpyTag。
在本发明中，所述第一抗原单元的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
MGSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVRFDKLPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDVYSFSLASRLYAEERYPILPEYLQCVKELYRGGLEPINFQTAADQARSSANGGGGRGVPHIVMVDAYKRYKGGGGHHHHHH。
在本发明中，所述第二抗原单元的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：
MRKKRRQRRRGGGGMGSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVRFDKLPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDVYSFSLASRLYAEERYPILPEYLQCVKELYRGGLEPINFQTAADQARSSANGGGGRGVPHIVMVDAYKRYKGGGGHHHHHH。
本发明还提供了上述方案所述的耐热性纳米颗粒蛋白或者所述的纳米载体在制备纳米颗粒疫苗中的应用。
本发明还提供了一种免疫原性复合物，包括上述方案所述纳米载体和抗原单元；所述抗原单元由抗原的N端或C端融合第二共价键得到；所述第二共价键和第一共价键通过酰胺键结合；
在本发明，所述抗原优选的包括肿瘤模型抗原OVA；所述肿瘤模型抗原OVA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
MGSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGA KDSTRTQINKVVRFDKLPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDV YSFSLASRLYAEERYPILPEYLQCVKELYRGGLEPINFQTAADQARSSAN。
本发明通过共价键SpyCatcher/SpyTag构建“即插即用”型纳米支架，即利用蛋白质结构域SpyCatcher(SC)与其肽伙伴SpyTag(ST)之间自发形成的酰胺键将抗原定向装载于自组装蛋白表面。
本发明还提供了上述方案所述免疫原性复合物的制备方法，包括以下步骤：
将纳米载体和抗原单元混合，自组装得到免疫原性复合物。
在本发明中，所述纳米载体和抗原单元的摩尔比优选为1:2。
在本发明中，所述混合的温度优选为4℃；所述混合的时间优选为9～16h，更优选为12h。
在本发明中，所述纳米载体和抗原单元优选的于PBS中性缓冲液中混合。
在本发明中，所述PBS中性缓冲液以1L计，优选的包括以下组分：8gNaCl、0.2gKCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4和余量的蒸馏水；所述PBS中性缓冲液的pH值优选为7.4。
本发明还提供了上述方案所述的免疫原性复合物或者所述制备方法制备得到的免疫原性复合物在制备纳米颗粒疫苗中的应用。
在本发明中，所述纳米颗粒疫苗优选的包括肿瘤纳米颗粒疫苗。
本发明的肿瘤纳米颗粒疫苗可显著提高肿瘤疫苗抗原的稳定性和抗原递呈能力。
本发明还提供了一种纳米颗粒疫苗，包含上述方案所述的免疫原性复合物或者所述制备方法制备得到的免疫原性复合物。
在本发明中，所述纳米颗粒疫苗优选的还包括药学上可接受的载体和/或佐剂。
本发明还提供了成套试剂盒，包含上述方案所述的纳米颗粒疫苗以及用于接种所述纳米颗粒疫苗的容器。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
以肿瘤模型抗原OVA为例，验证一种基于穿膜肽增强耐热蛋白载体细胞内递送的方法。
1.耐热纳米蛋白载体和疫苗构建
选择来自超嗜热菌的二氧四氢喋啶合酶的60聚体AaLS用于肿瘤纳米疫苗构建，选择肿瘤模型抗原OVA作为纳米疫苗抗原。
1.1耐热纳米蛋白载体和抗原修饰
穿膜肽的添加包括两种方式：
(1)AaLS的穿膜肽遗传修饰
AaLS的亚基氨基酸N端和C端均在颗粒表面暴露，便于后续的遗传修饰。将穿膜肽TAT(一级氨基酸序列：RKKRRQRRR)于N或C端融合表达。
通过共价键SpyCatcher/SpyTag构建“即插即用”型纳米蛋白载体，即利用蛋白质结构域SpyCatcher(SC)与其肽伙伴SpyTag(ST)之间自发形成的共价键将抗原定向装载于纳米蛋白表面。具体的构建方式是将SC和ST氨基酸序列分别融合在AaLS纳米蛋白和OVA抗原氨基酸序列的C或N端，C或N端同时引入组氨酸标签(HHHHHH，如SEQ ID NO.9所示)用于下游的蛋白纯化处理，见图1。
(2)OVA的穿膜肽遗传修饰
将TAT氨基酸序列融合在OVA抗原N或C端，ST和SC氨基酸序列分别融合于AaLS和OVA C或N端，C或N端引入组氨酸标签用于下游蛋白纯化处理，见图2。
1.2耐热纳米蛋白载体和疫苗表达与纯化
1.2.1AaLS载体和OVA抗原表达与纯化
将构建的AaLS载体和OVA抗原序列进行基因合成，cDNA序列亚克隆到pET21b表达质粒中，pET21b表达质粒转化到大肠杆菌BL21中进行扩大培养，加入0.5mM IPTG诱导剂诱导目的蛋白表达。进一步通过亲和层析(Ni-NTA)和尺寸排阻色谱法纯化目的蛋白，浓缩后采用SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色进行纯度鉴定。
1.2.2AaLS载体和OVA抗原偶联与纯化
纯化的AaLS载体和OVA抗原以摩尔比1:2于PBS中性缓冲液(称取8g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，灭菌即可)中在4℃偶联过夜，偶联产物(OVA-AaLS)采用SDS-PAGE进行纯度鉴定，测定蛋白浓度后，保存于-20℃用于后续分析。
1.2.3AaLS载体和OVA-AaLS的电镜表征参见图3。
电镜结果显示，AaLS和OVA-AaLS镜下显示均匀一致的球状形态，偶联OVA后的AaLS粒径增加。
1.2.4AaLS载体和OVA-AaLS的zeta电位分析
表1
Zeta电位分析测量显示，与表面未添加TAT的纳米颗粒相比，由于富含精氨酸的TAT肽的高阳离子电荷的加入，呈递TAT-纳米颗粒(即TAT-AaLS、TAT-OVA-AaLS)的表面电荷明显更小。考虑到细胞膜的负电荷，表面添加TAT的纳米粒子可能在结合和/或穿透细胞方面具有优势。
2.耐热纳米蛋白载体和疫苗稳定性评估
2.1AaLS和OVA-AaLS的热稳定测试
(1)纯化的AaLS和OVA-AaLS在PBS中性缓冲中于25℃、37℃、65℃、75℃和95℃孵育24h，离心去除任何聚集体，SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色测试蛋白的可溶性比例变化。结果参见图4。
(2)纯化的AaLS和OVA-AaLS在PBS中性缓冲中于65℃孵育1个月，每周定期检测蛋白溶解度变化。结果参见图5。
2.2AaLS和OVA-AaLS的冻融测试
纯化的AaLS和OVA-AaLS在PBS中性缓冲中于-80℃反复冻融5次，离心去除任何聚集体，测定纳米颗粒蛋白的溶解度变化。结果参见图6。
2.3AaLS和OVA-AaLS的冻干测试
纯化的AaLS和OVA-AaLS经冻干机冻干，并在中性缓冲液中重新溶解，测试纳米颗粒蛋白的可溶性比例。结果参见图7。
结果表明，AaLS和OVA-AaLS对高温、循环冻融和冻干具有超高的耐受性，经不同条件处理后，蛋白的溶解性未发生明显变化，表明AaLS赋予了抗原高的稳定性。
3.耐热性疫苗抗原递呈评估
3.1体外细胞实验
为了更直观地观察添加TAT后DCs对纳米疫苗的摄取情况。将荧光染料Cy5.5偶联在抗原OVA上，进一步构建纳米颗粒疫苗。DCs分为阴性对照组、Cy5.5-OVA游离抗原组、Cy5.5-OVA-AaLS组和Cy5.5-OVA-AaLS-TAT组。DCs分别采用等摩尔的Cy5.5-OVA、Cy5.5-OVA-AaLS和Cy5.5-OVA-AaLS-TAT处理6h，免疫荧光染色检测荧光标记DCs的荧光强度，阴性对照组不做处理。结果参见图8。
3.2体内动物实验
BALB/c小鼠分为3组：Cy5.5-OVA组、Cy5.5-OVA-AaLS和Cy5.5-OVA-AaLS-TAT组，每组6只。小鼠采用等摩尔的荧光标记的Cy5.5-OVA、Cy5.5-OVA-AaLS和Cy5.5-OVA-AaLS-TAT皮下注射，然后通过光学成像分析在预先确定的时间点监测24h内的体内生物分布。结果参见图9。
结果表明，与OVA相比，在体内外AaLS显著促进了疫苗抗原被细胞摄取；在添加TAT后，细胞对纳米疫苗的摄取进一步增强，可实现有效的内体逃逸，并在动物体内形成更广泛的分布以及滞留更长的时间，有助于进一步提高后期的抗原递呈和免疫反应效果。
4.耐热性疫苗免疫原性评估
BALB/c小鼠分为4组：阴性对照组、OVA组、OVA-AaLS和OVA-AaLS-TAT组，每组6只。采用等摩尔的OVA、OVA-AaLS和OVA-AaLS-TAT肌肉注射。
4.1细胞免疫
小鼠接种疫苗7d后，处死收集脾脏，通过流式细胞术评估活化T细胞的百分比，包括CD3+CD8+CD69+T和CD3+CD4+CD69+细胞，结果参见图10。；同时收集脾细胞，采用OVA抗原体外刺激，ELISpot检测IFN-γ的分泌水平，结果参见图11。
结果显示，与OVA游离抗原相比，纳米疫苗诱导了更高比例的活化T细胞，这些细胞经抗原刺激后分泌更高的IFN-γ，表明产生了更高比例的特异性T细胞；同时，纳米疫苗添加TAT后，活化T细胞的比例显著提高，并分泌更高水平的IFN-γ，表明添加TAT诱发了更强的免疫反应。
4.2肿瘤抑制实验
为了进一步验证新型纳米疫苗的抑癌功能，我们构建了小鼠肿瘤模型来检测疫苗免疫对肿瘤生长的抑制作用。BALB/c小鼠分为4组：阴性对照组、OVA组、OVA-AaLS和OVA-AaLS-TAT组。采用3剂OVA-AaLS或单体OVA免疫，随后皮下接种E.G7-OVA肿瘤细胞，并动态监测肿瘤生长情况。结果参见图12和图13。
结果显示，与OVA相比，在第二针接种后，OVA-AaLS纳米疫苗表现出明显的肿瘤生长抑制，而OVA-AaLS-TAT的肿瘤抑制率进一步增加，表明TAT的添加进一步抑制了肿瘤的生长，激发了更强的免疫效果。
综上，耐热纳米蛋白AaLS构建的抗原递送载体对极端的外界条件(包括高温、反复冻融和冻干等)具有超强的耐受性，并赋予抗原OVA超高的稳定性。与游离抗原OVA相比，耐热纳米疫苗诱发了更强的抗原递呈和免疫反应，激活了更高水平的活化T细胞、OVA特异性T细胞以及肿瘤抑制。而在纳米颗粒疫苗表面添加TAT后，疫苗的抗原递呈能力进一步提升，并诱发了更高水平的T细胞活化和肿瘤抑制，表明TAT修饰的耐热纳米蛋白载体在增强抗原稳定性、抗原递呈和激活下游免疫反应过程中具有潜在应用价值。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.融合有穿膜肽的耐热性纳米颗粒蛋白，其特征在于，由耐热性自组装蛋白的N端或C端通过连接肽连接穿膜肽得到；所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的耐热性纳米颗粒蛋白，其特征在于，所述耐热性自组装蛋白包括24聚体铁蛋白、60聚体AaLS、酰基转移酶组分E2蛋白、Sm蛋白的7聚体结构域或聚合鞭毛蛋白丝。
3.一种纳米载体，其特征在于，所述纳米载体包括第一纳米载体或第二纳米载体；
所述第一纳米载体由权利要求1或2所述耐热性纳米颗粒蛋白连接第一共价键得到；所述第一共价键和穿膜肽分别连接在耐热性自组装蛋白的两端；
所述第二纳米载体由耐热性自组装蛋白的N端或C端连接第一共价键得到；
所述第一共价键的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1或2所述的耐热性纳米颗粒蛋白或者权利要求3所述的纳米载体在制备纳米颗粒疫苗中的应用。
5.一种免疫原性复合物，包括权利要求3所述的纳米载体和抗原单元；
当所述纳米载体为第一纳米载体时，所述抗原单位为第一抗原单元；所述第一纳米载体包括权利要求3所述纳米载体；所述第一抗原单元由抗原的N端或C端融合第二共价键得到；
当所述纳米载体为第二纳米载体时，所述抗原单元为第二抗原单元；所述第二抗原单元的两端分别融合有第二共价键和穿膜肽；
所述第二共价键和第一共价键通过酰胺键结合；所述第二共价键的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
6.根据权利要求5所述的免疫原性复合物，其特征在于，所述抗原包括肿瘤模型抗原OVA；所述肿瘤模型抗原OVA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.权利要求5或6所述免疫原性复合物的制备方法，包括以下步骤：
将纳米载体和抗原单元混合，自组装得到免疫原性复合物。
8.权利要求5或6所述的免疫原性复合物或者权利要求7所述制备方法制备得到的免疫原性复合物在制备纳米颗粒疫苗中的应用。
9.一种纳米颗粒疫苗，包含权利要求5或6所述的免疫原性复合物或者权利要求7所述制备方法制备得到的免疫原性复合物。
10.成套试剂盒，其特征在于，包含权利要求9所述的纳米颗粒疫苗以及用于接种所述纳米颗粒疫苗的容器。
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|---|---|---|---|---|
| CN117599209A (zh) * | 2024-01-23 | 2024-02-27 | 中山大学 | 自组装纳米蛋白笼及其制备方法和应用 |
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2023
- 2023-01-12 CN CN202310065337.XA patent/CN117304332A/zh active Pending
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