CN117304255B - 脱氢膜海鞘素b、其衍生物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域，具体而言，涉及脱氢膜海鞘素B、其衍生物及制备方法。本发明采用膜海鞘素B为底物利用化学合成的方式制备脱氢膜海鞘素B。化学合成方式采用了两种策略，第一种为保护基策略，通过选择性保护环状骨架上的羟基，对侧链羟基实现化学氧化，再脱保护生成脱氢膜海鞘素B。第二种为选择性氧化策略，将膜海鞘素B通过一步选择性氧化反应直接生成脱氢膜海鞘素B。本发明进一步对膜海鞘素B进行化学衍生，合成了两种新型的膜海鞘素化合物，并对其生物活性进行了测试。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体而言，涉及脱氢膜海鞘素B、其衍生物及制备方法。
背景技术
脱氢膜海鞘素B(2，商品名：Aplidin)是源自海洋地中海海鞘(Aplidiumalbicans)的一种抗癌药物[1]。虽然在化学结构上，它与第一个在美国进入临床研究的海洋天然产物膜海鞘素B(1)的区别仅在于侧链末端的乳酸酰基被氧化成了丙酮酸酰基，但是在生物活性上，其抗癌活性却比膜海鞘素B高6～10倍，且毒性大大降低[2]。2018年，澳大利亚药品管理局(TGA)已批准脱氢膜海鞘素B，联合地塞米松用于复发性或难治性多发性骨髓瘤(MM)患者的治疗[3]。此外，2021年Science杂志报道了脱氢膜海鞘素B(2)有效抑制新冠病毒SARS-CoV-2的复制的活性(IC90为0.88nM)，该结果比对照药瑞德西韦高了27.5倍[4]。通过对其作用机制的研究发现，脱氢膜海鞘素B(2)通过抑制宿主翻译延长因子1A(eukaryotic translation elongation factor1A,eEF1A)干扰SARS-CoV-2利用宿主细胞器蛋白转录翻译系统的能力，进而降低了病毒的复制和感染的能力。这种作用于宿主靶点的机制，极有可能对变异病毒同样有效[4]。目前西班牙制药公司PharmaMar已经成功完成了脱氢膜海鞘素B(2)治疗新冠肺炎的I/II期合并临床实验，已经开始II/III期的合并临床实验[5]。目前全球包括美国国立癌症研究中心在内的多家医疗研究机构和医药公司也正在开展脱氢膜海鞘素B的临床研究，临床研究市场需求巨大。
膜海鞘素B(1)和脱氢膜海鞘素B(2)的化学结构。
脱氢膜海鞘素B具有优异的生物活性和极大的临床潜力，但是该化合物在自然界中含量极低。目前，该类化合物的获取途径主要有半合成和全合成两种方式。半合成方式是指先通过从原索动物Trididemnum solidum分离获得膜海鞘素A(9)，再进行化学衍生制备脱氢膜海鞘素B(2)[6]。
已报道的半合成方式制备脱氢膜海鞘素B
然而，膜海鞘素类化合物在原索动物中的含量极低，且天然提取不仅严重破坏海洋的生态系统，成本也十分高昂，目前已经弃用。
全合成的方式即通过化学合成制备脱氢膜海鞘素B[6]。但是化学全合成步骤繁琐，其中需要用到大量的缩合试剂如EDC,HATU,HABU,PyBroP等合成酰胺键和酯键。同时，为了保证缩合位点的准确，大量的氨基、羟基和羧基的保护和脱保护反应也是必不可少的。此外，最后的环化步骤收率较低，使得整体的合成收率低于4％[6]，整个过程耗时至少两个月。因此，全合成大量制备脱氢膜海鞘素B从经济角度考虑过于昂贵，在一定程度上制约了其作为药物开发的潜力并大大增加了使用成本。
微生物发酵生物合成是一种绿色高效、成本低廉的制备方法。然而，脱氢膜海鞘素B的产生菌尚未见报道，因此无法通过发酵直接获得。膜海鞘素B的产生菌运动替斯崔纳菌Tistrella mobilis和波扎诺替斯崔纳菌Tistrella bauzanensis已见文献报道[7,8]，但是它们的发酵产量普遍较低(<3.2mg/L)。
针对目前脱氢膜海鞘素B的供应问题，寻找绿色、高效、成本低廉的制备方法势在必行。
发明内容
本发明采用微生物发酵和半合成结合的方式，首先通过细菌发酵获得膜海鞘素B，再采用化学方法将膜海鞘素B转化为脱氢膜海鞘素B。这一制备策略不仅绿色高效，而且成本低廉。
特别地，本发明采用两种策略将膜海鞘素B转化为脱氢膜海鞘素B，即保护基策略和选择性氧化策略。保护基策略是通过选择性保护膜海鞘素B环状骨架上的羟基，对侧链羟基进行化学氧化生成羰基，再脱保护生成脱氢膜海鞘素B；此策略仅需要三步反应，且三步反应总收率高达56％，相比常规脱氢膜海鞘素B的化学全合成制备，具有步骤短，收率高，成本低的优势。选择性氧化策略是选择性地氧化膜海鞘素B的侧链羟基，一步生成脱氢膜海鞘素B，此策略规避了保护试剂的使用，原子经济，效率高，收率高(可达92％)，节省时间和人力成本，便于工业化生产。
作为反应起始物的膜海鞘素B可通过细菌发酵获得。本发明通过筛选合适的菌株，并对其发酵条件进行优化，提高了膜海鞘素B发酵产量。该制备方法相较于化学合成，绿色、经济、高效，适合工业化生产。
此外，本发明还提供了两种新的膜海鞘素B衍生物、其制备方法和用途，丰富了膜海鞘素类化合物的结构多样性，为寻找新型高效低毒的膜海鞘素类药物提供原料。
保护基策略制备脱氢膜海鞘素B
本申请提供了一种制备脱氢膜海鞘素B的方法，所述方法以膜海鞘素B为起始物，以如下路线进行：
所述方法包括以下步骤：
步骤1：选择性地保护膜海鞘素B上的iso-sta-OH，获得化合物5，所述化合物5上的R1为羟基保护基：
步骤2：对所述化合物5上的Lac-OH进行氧化生成羰基，获得化合物6；
步骤3：脱除化合物6上的羟基保护基R1，生成脱氢膜海鞘素B。
所述方法首先选择性地保护骨架上的iso-sta-OH，进而对侧链Lac-OH进行化学氧化生成羰基，最后脱保护生成脱氢膜海鞘素B。
本发明中，术语“化学氧化”指的是利用化学氧化剂对目标物进行氧化的方法，区别于生物催化氧化。
步骤1中使用的羟基保护基优选体积较小的保护基，包括但不仅限于TMS(三甲基硅基),THP(四氢吡喃基)，MOM(甲氧基甲基醚)等。因为酰胺基团的吸电子效应，Lac-OH的亲核能力相对较弱，所以体积较小的保护基如TMS，在低温条件下优先保护亲核能力更强的iso-sta-OH。
在一些实施方案中，所述步骤1在低于室温的温度下进行，例如在0～2℃进行。在一些实施方案中，所述步骤1进行2～5小时。步骤1中，如果温度升高或者反应时间大大延长，则羟基保护的选择性会降低。
在一些实施方案中，羟基保护基R1为TMS，所述步骤1包括：在有机溶剂(例如DMF)以及碱(例如有机碱，例如咪唑)的存在下，使TMSCl(三甲基氯硅烷)或TMSOTf(三氟甲磺酸三甲基硅酯)与膜海鞘素B上的iso-sta-OH形成硅醚；之后，对产物进行分离(例如通过萃取进行分离)以获得化合物5。在一些实施方案中，膜海鞘素B：TMSCl或TMSOTf：咪唑的摩尔比为1:1.2～1.3：1.2～1.3(例如1:1.22:1.22)。
在一些实施方案中，因为TMS保护基的不稳定性，保护后的产物在后处理后，应马上进行氧化而不需经过纯化。
步骤2中，采用化学氧化对化合物5上的Lac-OH进行氧化生成羰基。可选择合适的、用于将仲醇氧化成对应的酮的氧化反应来实现。在一些实施方案中，所述氧化反应为Ley-Griffith氧化，使用TPAP(四(正)丙基高钌酸铵(Tetrapropylammonium Perruthenate)，分子式为N(C3H7)4RuO4)和NMO(4-甲基吗啉-N-氧化物)作为氧化剂体系。所述反应可以在室温下进行。
在使用TPAP进行氧化的时候，优选地需要控制反应时间，以减少羟基保护基(例如TMS)脱保护带来的副产物和产率降低。在一些实施方案中，所述步骤2进行1-5小时。
在一些实施方案中，所述步骤2包括：在有机溶剂(例如DCM)的存在下，以TPAP和NMO为氧化剂进行氧化反应；之后，对产物进行分离(例如通过萃取进行分离)以获得化合物6。在一些实施方案中，化合物5：TPAP：NMO的摩尔比为1:0.09～0.11：1.4～1.6(例如1:0.1:1.5)。
步骤3进行脱保护反应，可以在酸性条件下进行(例如在乙酸存在的条件下进行)。在一些实施方案中，乙酸为化合物6的至少10倍当量。脱保护反应可以在室温下进行。在一些实施方案中，脱保护反应进行至少8小时(例如8-12小时)。在一些实施方案中，所述步骤3包括：在有机溶剂(例如甲醇)和乙酸的存在下，对化合物6进行脱保护；之后，对产物进行分离(例如通过萃取进行分离)和纯化(例如通过制备型HPLC进行纯化)。
选择性氧化策略制备脱氢膜海鞘素B
本申请提供了另外一种制备脱氢膜海鞘素B的方法，所述方法以膜海鞘素B为起始物，以如下路线进行：
所述方法包括以下步骤：通过氧化反应选择性地对膜海鞘素B上的Lac-OH进行氧化。在一些实施方案中，所述方法还包括：对产物进行分离(例如通过萃取进行分离)和纯化(例如通过制备型HPLC进行纯化)以获得纯净的脱氢膜海鞘素B。
所述方法选择性氧化膜海鞘素B的侧链Lac-OH，一步生成脱氢膜海鞘素B。因为异丁基的存在，骨架上iso-sta-OH的空间位阻较大，使得体积较大的氧化剂优先与空间位阻较小的侧链Lac-OH反应；而iso-sta-OH的亲核性较强，因此如果使用空间位阻小的氧化剂，则iso-sta-OH优先被氧化。
可用于所述方法的氧化反应包括但不限于Dess-Martin高碘烷氧化，IBX氧化，Ley-Griffith氧化，PCC氧化，PDC氧化，Pfitzner-Moffat氧化，Swern氧化，TEMPO/NaClO氧化，Parikh-Doering氧化，Mukaiyama氧化，Corey-Kim氧化，Oppenauer氧化，Albright-Goldman氧化反应等。
在一些实施方案中，所述氧化反应为TEMPO/NaClO氧化。其中TEMPO以催化量进行反应且可以回收，NaClO为氧化剂，并使用NaBr为助催化剂。在一些实施方案中，所述反应以甲苯，乙酸乙酯和水组成两相体系，不需要干燥溶剂进行反应，试剂成本低，且此类反应已有工业化应用先例，因此该方法制备脱氢膜海鞘素B具有很强的工业适用性。另外，该反应产物单一，未检测到过度氧化的副产物，因此产率超过90％。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：以TEMPO为催化剂，以NaClO为氧化剂，以NaBr为助催化剂，在包含甲苯、乙酸乙酯和水的两相体系中进行氧化反应。在一些实施方案中，所述氧化反应在低于室温的温度下进行，例如在0-2℃进行。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
步骤(1)：将膜海鞘素B溶于乙酸乙酯和甲苯的混合液中，冷却至0℃；
步骤(2)：将溴化钠溶于水中，滴加到步骤(1)获得的溶液中；
步骤(3)：将催化量的TEMPO加入到步骤(2)获得的溶液中；
步骤(4)：将NaClO和NaHCO3溶于水中，缓慢滴加到步骤(3)获得的溶液中；
步骤(5)：滴加完毕后，保温反应；
步骤(6)：对产物进行分离(例如通过萃取进行分离)和纯化(例如通过制备型HPLC进行纯化)。
在一些实施方案中，乙酸乙酯和甲苯为等体积混合。在一些实施方案中，膜海鞘素B：NaClO：NaBr的摩尔比为1:1～1.1：1～1.1(例如1:1.1:1.1)。在一些实施方案中，保温反应1～3小时。
在一些实施方案中，所述氧化反应为IBX氧化。IBX氧化以2-碘酰基苯甲酸(2-iodoxybenzoic acid；IBX)为氧化剂，反应条件温和，常温常压下即可反应。在一些实施方案中，所述反应以二甲基亚砜和四氢呋喃的混合液为反应溶剂。在一些实施方案中，所述氧化反应在室温进行。在一些实施方案中，反应时间为8-12小时。如果反应时间短，则有原料剩余，如果反应时间过长，则会有过度氧化产物(双氧化产物3)生成。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
步骤(1)：将膜海鞘素B溶于二甲基亚砜和四氢呋喃的混合液中；
步骤(2)：将2-碘酰苯甲酸(IBX)加入到上述溶液中；
步骤(3)：室温反应8-12小时；
步骤(4)：对产物进行分离(例如通过萃取进行分离)和纯化(例如通过制备型HPLC进行纯化)。
在一些实施方案中，二甲基亚砜和四氢呋喃为等体积混合。在一些实施方案中，膜海鞘素B：IBX的摩尔比为1:1.1～1:1.3(例如1:1.2)。
图1示例性地展示了上述两种制备脱氢膜海鞘素B的策略。
微生物发酵制备膜海鞘素B
本发明的制备脱氢膜海鞘素B的方法中，膜海鞘素B可以通过替斯崔纳菌(Tistrella)(例如运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis))在包含碳源、氮源和无机盐的培养基里，进行有氧发酵得到。
我国海洋微生物菌种保藏管理中心(Marine Culture Collection of China,MCCC)目前已公布多株新分离的Tistrella属菌株。在一些实施方案中，用于发酵的替斯崔纳菌选自以下菌株：
在一些实施方案中，所述替斯崔纳菌为Tistrella mobilis(MCCC1A11766)。发明人对上述17株替斯崔纳菌进行筛选，发现同等培养条件下，Tistrella mobilis(MCCC1A11766)具有较高的膜海鞘素B产量。对发酵条件进行优化，可将摇瓶发酵的产量提高到36mg/L，放大发酵的产量可提高到22mg/L。
可使用任何适宜的培养基进行有氧发酵，例如海洋微生物培养基，牛肉浸膏培养基，LB培养基或TSB培养基或其他已报道的培养基。
发明人在已报道的培养基的基础上进行改进，获得了一种新的可用于培养Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)的培养基。使用所述培养基进行有氧发酵可以获得较高产量的膜海鞘素B。
以重量百分比计，所述培养基包含N-乙酰葡萄胺0.38％～0.4％、明胶蛋白胨0.38％～0.4％、甘油0.38％～0.4％、酵母提取物0.57％～0.6％、蛋白胨1.9％～2.0％以及水。
任选地，所述培养基还含有氨基酸(例如缬氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸，例如酪氨酸)。在一些实施方案中，以重量百分比计，所述氨基酸的含量为0.49％～0.51％(例如0.5％)。
任选地，所述培养基还含有亚抑制浓度的抗生素(例如庆大霉素、氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、红霉素、克拉霉素、诺氟沙星、四环素、大观霉素，例如亚抑制浓度(0.9～1.1μg/mL(例如1.0μg/mL))的庆大霉素)。术语“亚抑制浓度”指的是抑制细菌生长所需要的最低浓度。
在一些实施方案中，所述膜海鞘素B是通过如下发酵方法得到的：将替斯崔纳菌(例如Tistrella mobilis(MCCC 1A11766))按照体积比0.9％-1.1％(例如1.0％)的接种量接种至发酵培养基，所述发酵培养基可以是上述任一种培养基，培养温度为25～34℃，发酵液的起始pH为6.0，培养1～7天。
发酵结束后，可以通过对发酵液进行离心、萃取、有机溶剂提取等方式分离获得膜海鞘素B。
膜海鞘素衍生物、其用途和制备方法
本申请还提供了膜海鞘素衍生物，选自具有以下结构的化合物：
本申请提供了上述任一种膜海鞘素衍生物用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗肿瘤。
本发明中，肿瘤是指细胞增殖性疾病状态，包括但不限于：结肠癌、白血病、淋巴瘤、膀胱癌、骨癌、脑瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤、乳腺癌、腺瘤/类癌、肾上腺皮质癌、胰岛细胞癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、结肠直肠癌、皮肤癌、食管癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、卡波氏肉瘤、肾癌、口腔癌、肺癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺阴茎癌、前列腺癌、尿道癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、肉瘤等，包括前述癌症的转移。
本申请还提供了一种药物组合物，其包含上述任一种膜海鞘素衍生物。
本发明的药物组合物可以含有治疗和/或预防疾病有效量的本发明的膜海鞘素衍生物；任选地，所述组合物还含有一种或多种药学上可接受的辅料，例如载体和/或赋形剂。所述载体和/或赋形剂包括但不限于:离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物或羊毛脂。
所述药物组合物可以制成药学上可接受的任一剂型。所述药物组合物还可以以任何合适的给药方式，例如口服、肠胃外、直肠或经肺给药等方式施用于需要这种治疗的个体。用于口服给药时，所述药物组合物可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。用于肠胃外给药时，所述药物组合物可制成注射剂，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，配制注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂。用于直肠给药时，所述药物组合物可制成栓剂等。用于经肺给药时，所述药物组合物可制成吸入剂或喷雾剂等。
本申请还提供了制备上述两种膜海鞘素衍生物的方法。
式3所示的膜海鞘素衍生物可以通过包括以下步骤的方法制得：在氧化剂存在的条件下对膜海鞘素B上的两个羟基同时进行氧化。在一些实施方案中，所述氧化剂为TPAP/NMO氧化剂体系。在一些实施方案中，所述步骤包括：在有机溶剂(例如DCM)的存在下，以TPAP和NMO为氧化剂体系进行氧化反应；之后，对产物进行分离(例如通过萃取进行分离)以获得化合物6。在一些实施方案中，膜海鞘素B：TPAP：NMO的摩尔比为15～17:2～4：48～50(例如16:3:49)。在一些实施方案中，所述氧化反应在室温下进行1～5小时。
式4所示的膜海鞘素衍生物的制备方法以膜海鞘素B为起始物，以如下路线进行：
所述方法包括以下步骤：
步骤1：选择性地保护膜海鞘素B上的Lac-OH，获得化合物7，所述化合物7上的R2为羟基保护基：
步骤2：对所述化合物7上的iso-sta-OH进行氧化生成羰基，获得化合物8；
步骤3：脱除化合物8上的羟基保护基R2，生成所述膜海鞘素衍生物4。
在一些实施方案中，使用TBS(叔丁基二甲基硅基)作为羟基保护基。
在一些实施方案中，所述步骤1在低于室温的温度下进行，例如在0-2℃进行。在一些实施方案中，所述步骤1进行2-5小时。
在一些实施方案中，羟基保护基R1为TBS，所述步骤1包括：在有机溶剂(例如DMF)以及碱(例如有机碱，例如咪唑)的存在下，使TBSCl(叔丁基二甲基氯硅烷)与膜海鞘素B上的Lac-OH形成硅醚；之后，对产物进行分离(例如通过萃取进行分离)以获得化合物7。在一些实施方案中，膜海鞘素B：TBSCl：咪唑的摩尔比为1:1.9～2.1：2.9～3.1(例如1:2:3)。
步骤2中，采用化学氧化对化合物7上的iso-sta-OH进行氧化生成羰基。可选择合适的、用于将仲醇氧化成对应的酮的氧化反应来实现。在一些实施方案中，使用Dess-Martin高碘烷氧化(DMP)，所述反应可以在室温下进行。
在一些实施方案中，所述步骤2进行2-5小时。
在一些实施方案中，所述步骤2包括：在有机溶剂(例如DCM)和碱(例如无机碱，例如碳酸氢钠)的存在下，使用DMP氧化剂进行氧化反应；之后，对产物进行分离(例如通过萃取进行分离)以获得化合物8。在一些实施方案中，化合物7：碱：DMP氧化剂的摩尔比为2:2.9～3.1:2.9～3.1(例如2:3:3)。
步骤3进行脱保护反应，可以在酸性条件下进行(例如在甲酸存在的条件下进行)。脱保护反应可以在室温下进行。在一些实施方案中，脱保护反应进行至少12小时(例如12-24小时)。在一些实施方案中，所述步骤3包括：在有机溶剂(例如四氢呋喃)、水和甲酸的存在下，对化合物8进行脱保护；之后，对产物进行分离(例如通过萃取进行分离)和纯化(例如通过制备型HPLC进行纯化)。
本申请中，术语“室温”指的是16～30℃，例如20～25℃。
有益效果
1、本发明采用野生菌发酵和半合成结合的方式制备脱氢膜海鞘素B。通过筛选合适的菌株，并对其发酵条件进行优化，提高发酵产量，进而分离得到膜海鞘素B。该制备方法相较于化学合成，绿色、经济、高效，适合工业化生产。
2、本发明将膜海鞘素B通过半合成的方式制备脱氢膜海鞘素B。本发明采用了两种策略化学制备脱氢膜海鞘素B。第一种为保护基策略，此策略仅需要三步反应，且三步反应总收率高达56％，相比常规脱氢膜海鞘素B的化学全合成制备，具有步骤短，收率高，成本低的优势。第二种为选择性氧化策略，此策略仅需要一步，规避了保护试剂的使用，原子经济，效率高，收率高(可达92％)，节省时间和人力成本，便于工业化生产。
3、本发明将膜海鞘素B进行化学转化制备了两种新型的膜海鞘素衍生物，丰富了膜海鞘素类化合物的结构多样性，为寻找新型高效低毒的膜海鞘素类药物提供原料。
附图说明
图1示例性地展示了本申请提供的两种制备脱氢膜海鞘素B的策略。
图2为膜海鞘素B的高分辨质谱和二级质谱分析。
图3为保护基策略制备脱氢膜海鞘素B的高分辨质谱和二级质谱分析。
图4为化合物5的高分辨质谱和二级质谱分析。
图5为化合物6的高分辨质谱和二级质谱分析。
图6为通过选择性氧化策略，利用TEMPO/NaClO氧化制备脱氢膜海鞘素B的高分辨质谱和二级质谱分析。
图7为通过选择性氧化策略，利用IBX氧化制备脱氢膜海鞘素B的高分辨质谱和二级质谱分析。
图8为膜海鞘素B衍生物(化合物3)的高分辨质谱和二级质谱分析。
图9为膜海鞘素B衍生物(化合物4)的高分辨质谱和二级质谱分析。
图10为化合物7的高分辨质谱和二级质谱分析。
图11为化合物8的高分辨质谱和二级质谱分析。
图12为膜海鞘素B(1)、脱氢膜海鞘素B(2)、膜海鞘素衍生物3和4的液相色谱-高分辨质谱，蒸发光散射检测器(ELSD)，紫外吸收联用检测含量和纯度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
筛选一种高产膜海鞘素B的运动替斯崔纳菌，并通过简单的发酵获得较高产量的膜海鞘素B。
1、膜海鞘素B含量测定的标准曲线绘制
采用色谱甲醇将100μg/mL的膜海鞘素B依次倍比稀释至50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL......，0.2μg/mL。膜海鞘素B的浓度测定使用6500+Triple Quad LC-MS/MS System的ExionLC UPLC unit(AB SCIEX LLC,CA,USA)组件和ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100×2.1mm,1.7μm)。膜海鞘素B的梯度洗脱采用流动相A(含0.1％甲酸的水)和流动相B(含0.1％甲酸的乙腈)。其中，流动相B在色谱柱的浓度增加梯度依次为从10％到95％运行10min、95％维持2min、10％维持3min，运行时长为15min；进样体积为1μL，流速为0.2mL/min。质谱数据采集经电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)、正离子模式检测和多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)扫描。离子喷雾电压和温度分别设定在5000V和500℃。雾化气Gas1、辅助气Gas2和气帘气Curtain gas的流速分别设置为50psi、50psi和35psi。碰撞气体collision gas的流速设置为中等。数据分析的软件版本为SCIEX Analystsoftware 3.2。检测膜海鞘素B的MS/MS仪器设置参数见表1。
表1化合物膜海鞘素B检测参数
备注：Q1＝Parent ion(母离子),Q3＝Product ion(子离子),DP＝DeclusteringPotential(去簇电压),EP＝Entrance Potential(入口电压),CE＝Collision Energy(碰撞气能量)，CXP＝Collision Cell Exit Potential(喷雾电压)。
2、评价不同发酵培养基和不同温度对Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)膜海鞘
素B产量的影响
选择7种不同的培养基，分别是海洋微生物培养基A1，2种牛肉浸膏培养基，2种文献已报道产膜海鞘素的培养基(分别命名为R1和R2)，LB培养基和TSB培养基。结果表明：Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)在培养基R2，25℃发酵7天，培养液可检测到较高含量的膜海鞘素B，产量为2.0mg/L。培养基R2的组成是4.0g半乳糖、4.0g明胶蛋白胨、4.0g甘油、6.0g酵母提取物、20.0g蛋白胨、1L水。
3、评价不同的氨基酸、抗生素、碳源对Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)膜海鞘
素B产量的影响
已有文献报道Tistrella mobilis可利用半乳糖、甘油、N-乙酰葡萄胺、D-甘露醇、L-阿拉伯糖、D-甘露醇作为碳源。因此本实验在培养基R2的基础条件下，研究半乳糖、甘油、N-乙酰葡萄胺、D-甘露醇等对Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)膜海鞘素B产量的影响。实验结果表明：改良的R2培养基(4.0g N-乙酰葡萄胺、4.0g明胶蛋白胨、4.0g甘油、6.0g酵母提取物、20.0g蛋白胨、1L水)产量最高(4.6mg/L)，比R2培养基(4.0g半乳糖、4.0g明胶蛋白胨、4.0g甘油、6.0g酵母提取物、20.0g蛋白胨、1L水)的3.8mg/L高出了21.8％。
在R2培养基中分别添加0.5％的缬氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸。结果表明：发酵培养基含0.5％酪氨酸时，Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)膜海鞘素B的产量最高(9.3mg/L),比R2培养基的发酵产量(7.3mg/L)高出了26.8％。
在R2培养基中分别添加亚抑制浓度的抗生素庆大霉素、氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、红霉素、克拉霉素、诺氟沙星、四环素、大观霉素。结果表明，添加亚抑制浓度的庆大霉素的产量最高(25.8mg/L)，比R2培养基的发酵产量(21.2mg/L)高出了21.3％。
4、高产膜海鞘素B菌株的筛选
17株替斯崔纳菌购买于海洋微生物菌种保藏管理中心(Marine CultureCollection of China,MCCC)，菌株的信息见表2。
表2 17株Tistrella的购买信息和产量信息
备注：菌株购买于海洋微生物菌种保藏管理中心(Marine Culture Collectionof China,MCCC)。
高产膜海鞘素B菌株的筛选步骤如下：
1)从-80℃冰箱取出保藏的菌种，冻存管在37℃水浴箱中快速解冻。
2)在超净工作台内分别从各菌株保藏管中取100μL菌液并均匀涂布于15mL的LB平板；使用封口膜将平板密封好后，细菌在25℃恒温培养箱中培养2天，以获得成熟的菌苔。
3)在长有成熟菌苔的平板内加入5.0mL 0.9％生理盐水，使用L型涂布器将菌苔刮下并打散均匀，获得菌悬液用分光光度计在600nm处测定吸光度(optical density,OD)。
4)各菌株种子液的制作：使用0.9％生理盐水将各菌株的细菌悬液稀释至OD600＝0.5，统一按照体积比1％的接种量接种至50mL种子液培养基，细菌的培养条件为25℃,220rpm,培养48h。种子液培养基的配制：1.0g半乳糖、1.0g明胶蛋白胨、1.0g甘油、1.5g酵母提取物、5.0g蛋白胨、1000mL水溶解，115℃高压蒸汽灭菌15min。在超净工作台将种子液转移至250mL锥形瓶(121℃高压蒸汽灭菌30min)中，每瓶50mL。
5)各菌株发酵液的制作：使用种子培液将各菌株的种子悬液稀释至OD600＝0.5，统一按照体积比1％的接种量接种至50mL发酵液培养基，细菌的培养条件为25℃,140rpm,培养7天。各菌株生物学实验重复3次。发酵液培养基的配制：12.0g半乳糖、12.0g明胶蛋白胨、12.0g甘油、18.0g酵母提取物、60.0g蛋白胨、3L水溶解，115℃高压蒸汽灭菌15min。在超净工作台将发酵液培养基转移至250mL锥形瓶中，每瓶50mL。
6)样品处理：从各菌株的发酵液取100μL菌液与900μL色谱甲醇混匀，37℃超声处理2h，再次混匀后14000rpm离心10min，上清液用0.22μm有机系的滤膜以获得样品。
7)样品分析参考膜海鞘素B含量的标准曲线绘制时的运行参数。
5、改变发酵液的pH、菌种接种量对Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)膜海鞘素B产量的影响
在保持高产膜海鞘素B菌株筛选的发酵流程其它条件不变的情况，研究发酵液pH从6.0-8.5对Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)膜海鞘素B产量的影响。研究结果表明:当发酵液的pH＝6.0时，Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)的发酵产量提高至32.5mg/L，比菌株的初始产量值提高了46.2％。进一步研究Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)种子液的接种量从0.5％，1％，2％至6％对Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)膜海鞘素B产量的影响。研究结果表明：当种子液的接种量为1％时，Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)的发酵产量提高至36.1mg/L，比菌株的初始产量提高了62.7％。
6、膜海鞘素B高产菌株Tistrella mobilis(MCCC 1A11766)产量的验证及其小量
制备
使用种子培养基将菌株的种子液稀释至OD600＝0.5，按照1％的接种量接种至含450mL的发酵液培养基(pH＝6.0)，总发酵体积为6升，细菌的培养条件为25℃,140rpm,培养7天。发酵结束后，发酵液在4℃离心机6000rpm离心15min。上清部分使用乙酸乙酯1：1连续萃取三次；600mL甲醇将菌体部分重悬，在25℃恒温摇床,220rpm振荡16h。细菌的粗提取物经旋转蒸发仪40℃旋干后的重量为8.8g。粗体取物加入600mL的乙腈复溶并旋转蒸发浓缩至25mL，后经0.22μm有机系滤膜过滤得样品。膜海鞘素B的纯化使用Waters AutoPurification HPLC/MS System(2545/2767)和XBridge Prep C18 OBD column(19×250mm,10μm)色谱柱。膜海鞘素B的梯度洗脱采用流动相A(水)和流动相B(甲醇)。其中，流动相B在色谱柱的浓度增加梯度依次为从20％到100％运行15min、100％维持3min、20％维持2min，运行时长为20min。上样体积和流速分别为800μL和20mL/min。制备回收的样品经旋转蒸发仪将有机相旋干，水相经冷冻干燥机冻干后得到133.0mg膜海鞘素B。
图2为膜海鞘素B的高分辨质谱和二级质谱分析。
实施例2
本实施例以TMS作为保护基，通过保护基策略制备脱氢膜海鞘素B，路线及步骤如下：
(1)膜海鞘素B(1)(10.0mg，0.009mmol)溶于DMF(0.2mL)中，冷却至0℃。
(2)分别加入咪唑(0.7mg，0.011mmol)，TMSCl(1.2mg，0.011mmol)，反应2小时。
(3)待反应完毕后，用水(2.0mL)进行稀释，然后用乙酸乙酯(2.0mL)进行萃取，有机相分别用水(1.0mL)，饱和氯化钠溶液(1.0mL)进行洗涤，无水硫酸钠进行干燥。
(4)除去溶剂得TMS保护的膜海鞘素B(5)，因TMS保护基不稳定，产物未经提纯直接用于下一步反应。
(5)化合物5(10.0mg,0.008mmol)溶于干燥二氯甲烷(0.2mL)中，加入TPAP(0.1eq.)和NMO(1.5eq.)，室温反应一小时。
(6)待反应完毕后，用二氯甲烷(5.0mL)进行稀释，有机相分别用水(3.0mL)，饱和氯化钠溶液(3.0mL)进行洗涤，无水硫酸钠进行干燥。
(7)除去溶剂得化合物6，直接用于下一步反应。
(8)化合物6溶于甲醇(0.2mL)中，加入AcOH(10eq.)，室温反应过夜。
(9)待反应完毕后，用乙酸乙酯(1.0mL)进行稀释，有机相分别用水(1.0mL)，饱和碳酸氢钠溶液(1.0mL)，饱和氯化钠溶液(1.0mL)进行洗涤，无水硫酸钠进行干燥。
(10)旋蒸除去溶剂，制备型HPLC进行纯化得脱氢膜海鞘素B(2)(三步反应总收率56％)。
脱氢膜海鞘素B(2)的核磁数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.85(d,1H,J＝9.2Hz),7.80(d,1H,J＝9.2Hz),7.60(d,1H,J＝5.8Hz),7.19(t,1H,J＝9.4Hz),7.08(d,2H,J＝8.6Hz),7.07(d,2H,J＝8.6Hz),7.05(d,1H,J＝6.6Hz),6.85(d,2H,J＝8.6Hz),6.84(d,2H,J＝8.6Hz),5.39(dd,1H,J＝3.8,11.3Hz),5.33-5.27(m,2H),5.21-5.15(m,3H),5.12-5.08(m,1H),4.83-4.77(m,2H),4.71(t,1H,J＝7.0Hz),4.66(dd,1H,J＝2.2,6.5Hz),4.64-4.60(m,2H),4.57(dd,1H,J＝2.0,5.6Hz),4.22(q,1H,J＝6.8,13.7Hz),4.18(q,1H,J＝6.8,13.7Hz),4.13-4.02(m,4H),4.02-3.97(m,1H),3.89-3.83(m,1H),3.82-3.76(m,7H),3.74-3.67(m,3H),3.62-3.56(m,4H),3.35(dd,2H,J＝4.1,14.3Hz),3.24(dd,2H,J＝7.2,16.7Hz),3.20-3.13(m,5H),3.12-3.09(m,3H),2.69-2.55(m,8H),2.53(s,3H),2.52(s,3H),2.41-2.32(m,3H),2.19-2.09(m,5H),2.06-1.88(m,8H),1.83-1.74(m,6H),1.72-1.56(m,18H),1.45-1.39(m,8H),1.34-1.31(m,6H),1.26-1.18(m,8H),0.95-0.84(m,24H).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ205.1,204.9,201.4,197.3,173.2,172.5,172.0,171.8,171.3,170.8,169.8,169.7,169.5,168.5,161.5,158.8,130.5,130.0,129.9,114.3,81.7,81.6,70.8,70.5,68.1,68.0,59.1,57.9,57.6,57.4,57.3,55.8,55.4,54.8,49.7,49.0,48.6,47.2,41.5,41.4,38.9,38.8,36.6,36.4,34.2,34.1,31.5,30.9,28.1,27.4,27.3,27.2,26.4,25.2,25.0,24.9,24.8,24.1,24.0,23.7,23.6,22.5,21.5,21.4,21.1,21.0,18.8,18.7,17.1,17.0,16.4,16.1,15.4,14.9,14.8,11.8.HRMS(ESI):calcd forC57H87N7O15Na[M+Na]+1132.6152,found1132.6153.
图3为保护基策略制备脱氢膜海鞘素B的高分辨质谱和二级质谱分析。
图4为化合物5的高分辨质谱和二级质谱分析。
图5为化合物6的高分辨质谱和二级质谱分析。
实施例3
本实施例通过选择性氧化策略，利用TEMPO/NaClO氧化高效制备脱氢膜海鞘素B，路线及步骤如下：
(1)膜海鞘素B(130.0mg，0.12mmol)溶于720微升乙酸乙酯和甲苯的混合液(体积比1：1)中，冷却至0℃；
(2)溴化钠(13.6mg，0.13mmol)溶于60微升水中，滴加到上述溶液中；
(3)催化量的TEMPO加入到上述溶液中；
(4)NaClO(0.13mmol)和NaHCO3(30.2mg)溶于380微升水中，缓慢滴加到上述溶液中，滴加时间为一小时；
(5)滴加完毕后，保温反应一小时；
(6)反应完毕后，反应液用1.5mL的乙酸乙酯和0.5mL的水进行稀释，水相用同体积的乙酸乙酯分别萃取两次；
(7)有机相合并后，分别用10％的亚硫酸氢钠溶液，水，饱和食盐水进行洗涤，用无水硫酸钠进行干燥。干燥后的有机相旋蒸除去溶剂并用制备型HPLC进行纯化得脱氢膜海鞘素B(收率92％)。
脱氢膜海鞘素B(2)的核磁数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.85(d,1H,J＝9.2Hz),7.80(d,1H,J＝9.2Hz),7.60(d,1H,J＝5.8Hz),7.19(t,1H,J＝9.4Hz),7.08(d,2H,J＝8.6Hz),7.07(d,2H,J＝8.6Hz),7.05(d,1H,J＝6.6Hz),6.85(d,2H,J＝8.6Hz),6.84(d,2H,J＝8.6Hz),5.39(dd,1H,J＝3.8,11.3Hz),5.33-5.27(m,2H),5.21-5.15(m,3H),5.12-5.08(m,1H),4.83-4.77(m,2H),4.71(t,1H,J＝7.0Hz),4.66(dd,1H,J＝2.2,6.5Hz),4.64-4.60(m,2H),4.57(dd,1H,J＝2.0,5.6Hz),4.22(q,1H,J＝6.8,13.7Hz),4.18(q,1H,J＝6.8,13.7Hz),4.13-4.02(m,4H),4.02-3.97(m,1H),3.89-3.83(m,1H),3.82-3.76(m,7H),3.74-3.67(m,3H),3.62-3.56(m,4H),3.35(dd,2H,J＝4.1,14.3Hz),3.24(dd,2H,J＝7.2,16.7Hz),3.20-3.13(m,5H),3.12-3.09(m,3H),2.69-2.55(m,8H),2.53(s,3H),2.52(s,3H),2.41-2.32(m,3H),2.19-2.09(m,5H),2.06-1.88(m,8H),1.83-1.74(m,6H),1.72-1.56(m,18H),1.45-1.39(m,8H),1.34-1.31(m,6H),1.26-1.18(m,8H),0.95-0.84(m,24H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ205.1,204.9,201.4,197.3,173.2,172.5,172.0,171.8,171.3,170.8,169.8,169.7,169.5,168.5,161.5,158.8,130.5,130.0,129.9,114.3,81.7,81.6,70.8,70.5,68.1,68.0,59.1,57.9,57.6,57.4,57.3,55.8,55.4,54.8,49.7,49.0,48.6,47.2,41.5,41.4,38.9,38.8,36.6,36.4,34.2,34.1,31.5,30.9,28.1,27.4,27.3,27.2,26.4,25.2,25.0,24.9,24.8,24.1,24.0,23.7,23.6,22.5,21.5,21.4,21.1,21.0,18.8,18.7,17.1,17.0,16.4,16.1,15.4,14.9,14.8,11.8.HRMS(ESI):calcd for C57H87N7O15Na[M+Na]+1132.6152,found1132.6153.图6为TEMPO/NaClO氧化制备脱氢膜海鞘素B的高分辨质谱和二级质谱分析。
实施例4
本实施例通过选择性氧化策略，利用IBX氧化高效制备脱氢膜海鞘素B，路线及步骤如下：
(1)膜海鞘素B(13.0mg，0.012mmol)溶于200微升二甲基亚砜和四氢呋喃的混合液(体积比1:1)中；
(2)2-碘酰苯甲酸(IBX)(4.0mg，0.014mmol，1.2eq.)加入到上述溶液中；
(3)室温反应8-12小时；
(4)反应完毕后，反应液用0.5mL的水进行稀释，水相用乙酸乙酯萃取(3×1.0mL)；
(5)有机相合并后，分别用10％的亚硫酸氢钠溶液，水，饱和食盐水进行洗涤，用无水硫酸钠进行干燥。干燥后的有机相旋蒸除去溶剂并用制备型HPLC进行纯化得脱氢膜海鞘素B(11.0mg，收率81％)。
脱氢膜海鞘素B(2)的核磁数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.85(d,1H,J＝9.2Hz),7.80(d,1H,J＝9.2Hz),7.60(d,1H,J＝5.8Hz),7.19(t,1H,J＝9.4Hz),7.08(d,2H,J＝8.6Hz),7.07(d,2H,J＝8.6Hz),7.05(d,1H,J＝6.6Hz),6.85(d,2H,J＝8.6Hz),6.84(d,2H,J＝8.6Hz),5.39(dd,1H,J＝3.8,11.3Hz),5.33-5.27(m,2H),5.21-5.15(m,3H),5.12-5.08(m,1H),4.83-4.77(m,2H),4.71(t,1H,J＝7.0Hz),4.66(dd,1H,J＝2.2,6.5Hz),4.64-4.60(m,2H),4.57(dd,1H,J＝2.0,5.6Hz),4.22(q,1H,J＝6.8,13.7Hz),4.18(q,1H,J＝6.8,13.7Hz),4.13-4.02(m,4H),4.02-3.97(m,1H),3.89-3.83(m,1H),3.82-3.76(m,7H),3.74-3.67(m,3H),3.62-3.56(m,4H),3.35(dd,2H,J＝4.1,14.3Hz),3.24(dd,2H,J＝7.2,16.7Hz),3.20-3.13(m,5H),3.12-3.09(m,3H),2.69-2.55(m,8H),2.53(s,3H),2.52(s,3H),2.41-2.32(m,3H),2.19-2.09(m,5H),2.06-1.88(m,8H),1.83-1.74(m,6H),1.72-1.56(m,18H),1.45-1.39(m,8H),1.34-1.31(m,6H),1.26-1.18(m,8H),0.95-0.84(m,24H).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ205.1,204.9,201.4,197.3,173.2,172.5,172.0,171.8,171.3,170.8,169.8,169.7,169.5,168.5,161.5,158.8,130.5,130.0,129.9,114.3,81.7,81.6,70.8,70.5,68.1,68.0,59.1,57.9,57.6,57.4,57.3,55.8,55.4,54.8,49.7,49.0,48.6,47.2,41.5,41.4,38.9,38.8,36.6,36.4,34.2,34.1,31.5,30.9,28.1,27.4,27.3,27.2,26.4,25.2,25.0,24.9,24.8,24.1,24.0,23.7,23.6,22.5,21.5,21.4,21.1,21.0,18.8,18.7,17.1,17.0,16.4,16.1,15.4,14.9,14.8,11.8.
HRMS(ESI):calcd for C57H87N7O15Na[M+Na]+1132.6152,found1132.6153.
图7为IBX氧化制备脱氢膜海鞘素B的高分辨质谱和二级质谱分析。
实施例5
本实施例制备膜海鞘素衍生物(3)，路线及步骤如下：
(1)膜海鞘素B(18.0mg,0.016mmol)溶于干燥二氯甲烷(0.2mL)中。
(2)TPAP(1.0mg,0.003mmol)和NMO(5.7mg,0.049mmol)加入到上述溶液中，反应一小时。
(3)反应完毕后，反应溶液用二氯甲烷(0.8mL)稀释，然后分别用10％的亚硫酸氢钠溶液(1.0mL)，水(1.0mL)，饱和氯化钠溶液(1.0mL)进行洗涤。
(4)有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，旋蒸除去溶剂，并用制备型HPLC制备得新型膜海鞘素衍生物(3)(15.4mg，收率86％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.00(d,2H,J＝9.3Hz),7.96-7.90(m,1H),7.85(d,1H,J＝10.3Hz),7.58(d,1H,J＝6.0Hz),7.09-7.04(m,4H),6.87-6.82(m,4H),5.40(dd,1H,J＝3.8,11.3Hz),5.34-5.28(m,2H),5.22-5.18(m,2H),5.12-5.08(m,1H),4.93(dd,1H,J＝2.3,6.9Hz),4.86-4.82(m,1H),4.78(t,2H,J＝11.0Hz),4.72(t,1H,J＝7.2Hz),4.61-4.51(m,3H),4.30(t,1H,J＝6.6Hz),4.19(d,1H,J＝3.0Hz),4.16(d,1H,J＝3.0Hz),4.09(q,1H,J＝6.7,13.6Hz),4.04(q,1H,J＝6.6,13.6Hz),4.02-3.97(m,2H),3.89-3.83(m,2H),3.82-3.76(m,6H),3.74-3.67(m,3H),3.62-3.56(m,4H),3.34(dd,2H,J＝4.4,14.5Hz),3.27-3.18(m,2H),3.12(s,3H),3.07(s,3H),2.64-2.60(m,5H),2.54-2.50(m,5H),2.42-2.28(m,3H),2.27-2.12(m,6H),2.09-1.86(m,10H),1.83-1.56(m,24H),1.40(t,7H,J＝6.6Hz),1.32(d,6H,J＝7.0Hz),1.26-1.18(m,8H),0.95-0.84(m,42H).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ205.3,204.9,202.9,201.3,197.3,173.3,172.5,172.1,171.6,171.5,171.0,170.2,169.9,168.3,166.7,166.6,164.9,161.6,161.1,160.4,158.8,131.0,130.5,129.8,129.0,114.3,81.8,77.4,77.2,77.0,70.8,70.6,66.8,66.7,65.7,62.8,62.5,59.1,57.7,57.4,56.8,55.4,54.9,54.8,50.3,50.3,49.6,49.0,48.6,47.3,45.0,44.8,41.2,38.9,38.8,36.6,36.3,34.0,31.7,31.6,31.5,31.4,30.7,29.8,28.3,28.1,27.4,27.2,26.4,26.2,26.1,25.5,25.1,24.9,24.8,24.0,23.7,23.6,22.5,21.5,21.4,21.1,21.0,18.8,16.9,16.3,16.0,15.8,15.0,14.9,11.3,11.2.
HRMS(ESI):calcd for C57H85N7O15Na[M+Na]+1130.5996,found1130.6003.
图8为膜海鞘素B衍生物(化合物3)的高分辨质谱和二级质谱分析。
实施例6
本实施例制备膜海鞘素衍生物(4)，路线及步骤如下：
(1)膜海鞘素B(1)(20.0mg，0.018mmol)溶于DMF(0.2mL)中，冷却至0℃。
(2)分别加入咪唑(3.7mg，0.054mmol)，TBSCl(5.4mg，0.036mmol)，反应2小时。
(3)待反应完毕后，用水(2.0mL)进行稀释，然后用乙酸乙酯(3×2.0mL)进行萃取，有机相分别用水(1.0mL)，饱和氯化钠溶液(1.0mL)进行洗涤，无水硫酸钠进行干燥。
(4)除去溶剂得TBS保护的膜海鞘素B(7)，直接用于下一步反应。
(5)化合物7(15mg,0.012mmol)溶于干燥二氯甲烷(0.2mL)中，加入NaHCO3(1.5mg,0.018mmol)和DMP(7.8,0.018mmol)，室温反应2小时。
(6)待反应完毕后，用二氯甲烷(5.0mL)进行稀释，有机相分别用水(3.0mL)，饱和氯化钠溶液(3.0mL)进行洗涤，无水硫酸钠进行干燥。
(7)除去溶剂得化合物8。
(8)化合物8溶于HCOOH-THF-H2O(0.4mL,3:6:1)中，室温反应过夜。
(9)待反应完毕后，用乙酸乙酯(1.0mL)进行稀释，有机相分别用水(1.0mL)，饱和碳酸氢钠溶液(1.0mL)，饱和氯化钠溶液(1.0mL)进行洗涤，无水硫酸钠进行干燥。
(10)旋蒸除去溶剂，制备型HPLC进行纯化得膜海鞘素衍生物(4)(三步反应总收率67％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.97-7.86(t,1H),7.65(d,1H,J＝5.3Hz),7.07(d,2H,J＝8.0Hz),6.85(d,2H,J＝8.0Hz),5.46-5.33(m,2H),5.19(d,1H,J＝3.4Hz),4.85-4.74(m,3H),4.65-4.52(m,2H),4.44-4.33(m,1H),4.15-4.05(m,2H),3.79(s,3H),3.76-3.53(m,5H),3.44-3.32(m,2H),3.25-3.18(m,1H),3.12(s,3H),2.61(s,3H),2.40-2.11(m,6H),2.09-1.89(m,5H),1.85-1.50(m,11H),1.41(t,7H,J＝6.8Hz),1.32(d,3H,J＝6.8Hz),1.29-1.22(m,3H),0.96-0.84(m,30H).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ204.7,203.7,174.1,173.0,172.0,171.5,171.0,170.2,169.8,168.5,166.8,158.8,130.5,130.0,114.3,81.7,70.6,66.8,66.2,62.4,57.5,57.3,56.9,55.4,55.0,50.1,49.6,47.3,47.2,44.9,41.3,38.8,36.3,36.2,33.9,31.4,31.3,29.8,28.5,28.2,26.3,26.1,25.5,25.0,23.9,23.5,21.5,21.1,20.4,18.8,17.0,16.4,15.7,14.9,11.4.
HRMS(ESI):calcd for C57H87N7O15Na[M+Na]+1132.6152,found1132.6182.
图9为膜海鞘素B衍生物(化合物4)的高分辨质谱和二级质谱分析。
图10为化合物7的高分辨质谱和二级质谱分析。
图11为化合物8的高分辨质谱和二级质谱分析。
图12为膜海鞘素B、脱氢膜海鞘素B、膜海鞘素衍生物3和4的液相色谱-高分辨质谱，蒸发光散射检测器(ELSD)，紫外吸收联用检测含量和纯度。
实施例7
本实施例评价脱氢膜海鞘素B及其衍生物的细胞毒性，测定方法如下：
培养基：HCT116细胞(人结肠癌细胞)以DMEM培养；RKO细胞(人结肠癌细胞)以1640培养
铺板：以一定的密度(HCT116细胞密度为1x105；RKO细胞密度为1.5x105)将100ul细胞悬液(含10％FBS血清双抗的完全培养基)铺于96孔板中培养24h。
给药：将紫杉烯醇、膜海鞘素B、脱氢膜海鞘素B、衍生物3、衍生物4以八个浓度(0.001nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM、500nM、1000nM)每个浓度四个复孔进行给药。将原有培养基吸出，再加入100ul含有药物的培养基(含2％FBS血清双抗的完全培养基)培养48h。
CCK8法测定：用100ul含10％CCK8的培养基(含10％FBS血清双抗的完全培养基)替换原有含药培养基，孵育1h后在450nm波长处测值。
结果计算：细胞活力＝(给药组平均值-空白平均值)/(对照组平均值-空白平均值)*100，
使用Graphpad Prism 8软件进行IC50计算。结果如表3所示。
表3脱氢膜海鞘素B及其衍生物、膜海鞘素B的细胞毒性测定结果
细胞活性测试表明衍生物3(IC50约为1027nM)和4(IC50约为570nM)对HCT116细胞的细胞毒性相较于膜海鞘素B(IC50约为13nM)和脱氢膜海鞘素B(IC50约为28nM)大大降低。相同的趋势也在RKO细胞测试中获得，膜海鞘素B、脱氢膜海鞘素B、衍生物3、衍生物4对应的的IC50分别为约22nM、约24nM、约1500nM、约1100nM。鉴于目前细胞毒性是影响膜海鞘素类化合物通过临床测试的重要因素，因此衍生物3和4的毒性降低对通过临床测试更加重要，并且微摩尔级别的活性仍然为良好的抗肿瘤效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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8.Xu Y,Kersten RD,Nam SJ et al.Bacterial biosynthesis and maturationof the didemnin anti-cancer agents.J Am Chem Soc 2012；134:8625–32.
Claims (13)
1.一种制备脱氢膜海鞘素B的方法，所述方法以膜海鞘素B为起始物，以如下路线进行：
所述方法包括以下步骤：
步骤1：选择性地保护膜海鞘素B上的iso-sta-OH，获得化合物5，所述化合物5上的R1为羟基保护基TMS；所述步骤1包括：在有机溶剂以及碱的存在下，使TMSCl或TMSOTf与膜海鞘素B上的iso-sta-OH形成硅醚，反应在0-2℃下进行2-5小时；之后，对产物进行分离以获得化合物5；
步骤2：对所述化合物5上的Lac-OH进行氧化生成羰基，获得化合物6；所述氧化在TPAP和NMO存在的条件下进行；所述步骤2包括：在有机溶剂的存在下，以TPAP和NMO为氧化剂体系进行氧化反应，所述反应在室温进行1-5小时；之后，对产物进行分离以获得化合物6；
步骤3：在室温、酸性条件下脱除化合物6上的羟基保护基R1，生成脱氢膜海鞘素B。
2.根据权利要求1所述的方法，步骤3中，所述酸性条件为乙酸存在的条件。
3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤3具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述步骤3中的脱保护反应进行至少8小时；
(2)所述步骤3包括：在有机溶剂和乙酸的存在下，对化合物6进行脱保护；之后，对产物进行分离和纯化。
4.根据权利要求3所述的方法，所述步骤3具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述步骤3的脱保护反应进行8-12小时；
(2)所述有机溶剂为甲醇；
(3)所述分离为通过萃取进行分离；
(4)所述纯化为通过制备型HPLC进行纯化。
5.一种制备脱氢膜海鞘素B的方法，所述方法以膜海鞘素B为起始物，以如下路线进行：
所述方法包括以下步骤：通过氧化反应选择性地对膜海鞘素B上的Lac-OH进行氧化；
所述氧化反应为IBX氧化；所述方法包括以下步骤：
步骤(1)：将膜海鞘素B溶于二甲基亚砜和四氢呋喃的混合液中；
步骤(2)：将IBX加入到上述溶液中；
步骤(3)：室温反应8-12小时；
步骤(4)：对产物进行分离和纯化。
6.根据权利要求5所述的方法，所述分离为通过萃取进行分离，和/或，所述纯化为通过制备型HPLC进行纯化。
7.一种制备脱氢膜海鞘素B的方法，所述方法以膜海鞘素B为起始物，以如下路线进行：
所述方法包括以下步骤：通过氧化反应选择性地对膜海鞘素B上的Lac-OH进行氧化；所述氧化反应为TEMPO/NaClO氧化，所述方法包括：以TEMPO为催化剂，以NaClO为氧化剂，以NaBr为助催化剂，在包含甲苯、乙酸乙酯和水的两相体系中进行氧化反应；
所述方法包括以下步骤：
步骤(1)：将膜海鞘素B溶于乙酸乙酯和甲苯的混合液中，冷却至0℃；
步骤(2)：将溴化钠溶于水中，滴加到步骤(1)获得的溶液中；
步骤(3)：将催化量的TEMPO加入到步骤(2)获得的溶液中；
步骤(4)：将NaClO和NaHCO3溶于水中，缓慢滴加到步骤(3)获得的溶液中；
步骤(5)：滴加完毕后，保温反应；
步骤(6)：对产物进行分离和纯化。
8.根据权利要求7所述的方法，所述分离为通过萃取进行分离，和/或，所述纯化为通过制备型HPLC进行纯化。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，膜海鞘素B是通过采用替斯崔纳菌(Tistrella)在包含碳源、氮源和无机盐的培养基里，进行有氧发酵得到的。
10.根据权利要求9所述的方法，所述替斯崔纳菌为运动替斯崔纳菌(Tistrellamobilis)。
11.根据权利要求10所述的方法，所述运动替斯崔纳菌为Tistrella mobilis(MCCC1A11766)。
12.根据权利要求9所述的方法，以重量百分比计，所述培养基包含N-乙酰葡萄胺0.38％-0.4％、明胶蛋白胨0.38％-0.4％、甘油0.38％-0.4％、酵母提取物0.57％-0.6％、蛋白胨1.9％-2.0％以及水。
13.根据权利要求12所述的方法，所述培养基还含有氨基酸和/或亚抑制浓度的抗生素。
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