CN117295738A - PKC-theta调节剂 - Google Patents

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CN117295738A CN202280033111.5A CN202280033111A CN117295738A CN 117295738 A CN117295738 A CN 117295738A CN 202280033111 A CN202280033111 A CN 202280033111A CN 117295738 A CN117295738 A CN 117295738A
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Abstract

本发明公开了用于治疗受PKC‑theta调节影响的疾病、综合征、病症和障碍的化合物、组合物和方法。此类化合物由式I表示，其中变量如本文所定义。

Description

PKC-theta调节剂
技术领域
本公开涉及能够调节PKC-theta磷酸化活性的新型化合物。这种磷酸化活性可以被本文所述的化合物抑制。本发明进一步描述了这些化合物的合成及其作为药物在PKC-theta调节可能有益的疾病或障碍中的用途。
背景
蛋白激酶构成了一个结构相关酶的大家族，负责调控细胞内的各种信号转导过程(参见Hardie,G和Hanks,S.The Protein Kinase Facts Book,I and II,Academic Press,San Diego,CA:1995)。
异常蛋白磷酸化和疾病之间的联系是众所周知的。因此，蛋白激酶是一组重要的药物靶标(参见例如Cohen,Nature,vol.1(2002),pp 309-315,Gaestel等人，Curr.Med.Chem,2007,pp 2214-223；Grim minger等人,Nat.Rev.Drug Disc.vol.9(12),2010,pp 956-970)。
蛋白激酶C(以下简称PKC)是丝氨酸和苏氨酸特异性蛋白激酶家族。PKC家族成员磷酸化多种蛋白靶标，并且已知参与多种细胞信号传导途径。PKC家族的每个成员具有特定的表达谱，并且被认为具有独特的作用。
PKC成员可分为三组：I组(Ca2+和DAG(二酰甘油)依赖性)：PKC-α、PKC-βΙ、PKC-βΙΙ和PKC-γ；II组(Ca2+非依赖性):PKC-δ(下文的PKC-delta)、PKC-e、PKC-η(或PKC-eta)和PKC-θ(下文的PKC-theta)。III组(Ca2+和DAG非依赖性)：PKC-i、PKC-ζ和PKC-μ(Brezar等人,2015,Frontiers Immunol.)。
PKC的PKC-theta亚型的表达富集于T淋巴细胞，并且在T细胞受体(TCR)触发的T细胞激活中发挥重要作用。PKC-theta通过转录因子、包括NF-κB、NFAT和AP-1发出信号，导致IL-2和IFN-gamma等细胞因子的释放，以及随后T细胞增殖、分化和存活(Brezar等人，2015Front Immunol.)。与更广泛的生物免疫抑制机制(包括钙调神经磷酸酶抑制剂所表现的机制)不同，PKC-theta抑制已证明对免疫系统具有选择性作用(Brezar等人,2015,Frontiers Immunol.,6:530)。在缺乏PKC-theta活性的小鼠中抗病毒应答保持完整(Zhang等人,Adv Pharm.2013；66:267–31)。在调节性T细胞(Treg)中，PKC-theta信号传导并不是激活和发挥功能所必需的(Zhang等人,Adv Pharmacol.2013；66:267–31)。Prkcq-/-小鼠具有降低但显著比例的循环Treg，并且从Prkcq-/-小鼠分离的Treg保持抑制活性(Gupta等人,2008)。PKC-theta的药理学抑制保护Treg免受TNFα的灭活并增强小鼠免受炎性结肠炎的保护作用(Zanin-Zhorov等人,2010)。事实上，已有证据表明PKC-theta是Tregs功能的负调节子(Zhang等人,Adv Pharm.2013；66:267–31)。
在人类疾病中，通过全基因组关联研究已经确认了Prkcq基因座特异性单核苷酸多态性(SNP)与1型糖尿病(T1D)、类风湿性关节炎(RA)和乳糜泻(celiac disease)的关联(GWAS；Brezar等人,2015,Front Immunol.,6:530)。此外，PKC-θ的药理学抑制挽救了类风湿性关节炎患者的Tregs缺陷活性(Zanin-Zhorov等人,2010)。
PKC-theta活性在Th2(过敏性疾病)和Th17(自身免疫性疾病)反应和分化中至关重要(Zhang等人,Adv Pharm.,2013；66:267–31)。Prkcq-/-小鼠在过敏性肺部炎症和寄生虫感染的Th2模型中受到保护。同样，缺乏PKC-theta活性在Th17驱动的小鼠模型例如实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、佐剂诱导的关节炎和结肠炎小鼠模型中具有保护作用。
PKC-theta还牵涉于各种类型的癌症以及PKC-theta介导的调控癌症发生和发展的信号事件。在这些类型的癌症中，PKC-theta的高表达导致异常的细胞增殖、迁移和侵袭，导致恶性表型(Nicolle,A等人,Biomolecules,2021,11,221)。抑制PKC-theta也可有利于PKC-theta参与其中的癌症的治疗。
PKC-theta的小分子抑制剂是已知的，例如WO 2011/139273描述了基于吡唑并嘧啶骨架的抑制剂，并且WO 2015/095679描述了基于二氨基嘧啶核心的PKC-theta抑制剂。
迄今为止，尚无基于PKC-theta抑制的有效且经批准的医学治疗，主要是由于难以确保有效抑制以及PKC-theta亚型相对于其他亚型的适当的选择性，特别是PKC家族中的PKC-delta(第2组)和其他激酶。
本发明是考虑到上述观察结果而设计的。
发明概述
在本发明的一个方面，提供了式I的化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或立体异构体的混合物、互变异构体，或同位素形式，或其药学上活性代谢物，或其组合，其中：
A选自：N、C-Ra，其中Ra选自氢、卤素、C1-3烷基和CN；
G选自：CR1R2；O和NR1；
R1和R2独立地选自：氢、卤素、C1-3烷基；C3-7环烷基(例如CH2 cPr)；C1-3烷氧基(例如OMe)；C2-6环烷氧基(例如OcPr)；C2-6烷基烷氧基(例如CH2OMe)、羟基、C1-3烷基羟基(例如CH2OH)、氨基、C1-3烷基氨基(例如CH2NH2)；C1-4氨基烷基(例如NHMe或N(Me)2)、C2-7烷基氨基烷基(例如CH2NHMe或CH2N(Me)2)；和C1-3卤代烷基；或者
R1和R2一起形成3-5元任选取代的螺碳环或杂环；特别是4-5元任选取代的碳环或杂环螺环；其中在实施方案中，碳环或杂环螺环是未取代的；其中在替代性的实施方案中，碳环或杂环螺环被一个或多个选自以下的取代基取代：C1-2烷基、卤素；C1-2卤代烷基；羟基；和C1-2烷氧基；
B选自：N；CH和C-卤素(例如CF、C-Cl、C-Br)；
D选自：N和C-R3；
R3选自：氢；C1-3烷基(例如Me、Et)；C1-3卤代烷基(例如CF2H、CF3、CH2CF3)；C1-3烷氧基(例如OMe)；C2-5烷基烷氧基(例如CH2OMe)；和卤素(例如F、Cl、Br)；和
R4选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基(例如CF2H、CF3；CH2CF3)；OMe和卤素；或者
其中当D是C-R3时，R3和R4一起连接形成任选取代的芳基或杂芳基环，其具有选自以下的结构：
其中：
R7选自：氢和卤素；
R8选自：氢和卤素；
R9选自：氢；C1-3卤代烷基(例如CF2H、CF3、CH2CF3)和卤素；
R10选自：氢；卤素；C1-3卤代烷基(例如CF2H、CF3；CH2CF3)；和C1-3卤代烷基(例如OCFH2、OCF2H、OCF3)；并且其中：
n选自：0和1；
E选自：C-H；C-Ra，其中Ra选自卤素；C1-3烷基；C1-3烷基羟基(例如CH2OH)；C1-3卤代烷基(例如CH2F)；C2-6烷基烷氧基(例如CH2OMe)和C2-4烷基腈(例如CH2CN)；
R5和R6连接在一起以形成任选取代的、任选桥连的4-8元、适当地为5-7元饱和碳环或杂环。
在实施方案中，根据本公开的化合物具有结构式II：
在实施方案中，根据本发明的化合物具有结构式IIa：
其中，R17选自：
其中
R11选自：氢、卤素和C1-2烷基；
R12选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基羟基；和C1-2烷基腈；
R13选自：氢；卤素和C1-2烷基；
R14选自：氢和C1-2烷基；
R15选自：氢和C1-2烷基；
R16选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基羟基；C1-3烷基烷氧基；
n选自：0和1；
p选自：1和2；
X选自：CH2和O；
Y选自：CH2；O；NH和NMe。
在实施方案中，
R1选自：氢、Me、Et、OMe、OH、NH2和NHMe；
R2选自：氢、Me和Et；或者
R1和R2一起形成3-5元任选取代的螺碳环或杂环；特别是4-5元任选取代的碳环或杂环螺环；其中在实施方案中，碳环或杂环螺环是未取代的；其中在替代性的实施方案中，碳环或杂环螺环被一个或多个选自以下的取代基取代：C1-2烷基、卤素；C1-2卤代烷基；羟基；和C1-2烷氧基；
A选自：C-H；C-F；C-Cl和C-Br；
B选自：N；C-H、C-F；C-Cl和C-Br；
R17选自：
其中：
R18选自：氢；和卤素；
R19选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基羟基；
m选自：0和1；
R20选自：氢；卤素；
X选自：CH2和O；
R21和R22各自独立地选自：氢和C1-3烷基；
Y选自：CH2；O和NH；
R23选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基。
在实施方案中，根据本公开的化合物具有结构式III：
其中：
D选自：N；C-H和C-R3；
R3选自：C1-3烷基；C2-5烷基烷氧基；C1-3卤代烷基和卤素；
R4选自：氢；C1-3烷基；C2-5烷基烷氧基；C1-3卤代烷基和卤素。
在实施方案中，根据本公开的化合物具有结构式IIIa、IIIb或IIIc：
其中，
R17选自：
其中，
R11选自：氢；卤素和C1-2烷基；
R12选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基羟基；和C1-2烷基腈；
R13选自：氢；卤素和C1-2烷基；
R14选自：氢和C1-2烷基；
R15选自：氢和C1-2烷基；
R16选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基羟基；和C1-3烷基烷氧基；
n选自：0和1；
p选自：1和2；
X选自：CH2和O；
Y选自：CH2、O、NH和NMe。
在实施方案中，
R1选自：氢、Me、Et、OMe、OH、NH2和NHMe；
R2选自：氢；Me；和Et；或
R1和R2一起形成3-5元任选取代的螺碳环或杂环；
A选自：C-H、C-F、C-Cl和C-Br；
R17选自：
其中：
R18选自：氢和卤素；
R19选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基和羟基；
m选自：0和1；
R20选自：氢和卤素；
X选自：CH2；和O；
R21和R22各自独立地选自：氢和C1-3烷基；
Y选自：CH2；O和NH；
R23选自：氢；C1-3烷基；和C1-3卤代烷基。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含根据本公开的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或立体异构体的混合物、互变异构体或同位素形式，或其药学上活性代谢物，或其组合，以及一种或多种药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了根据本公开的化合物或根据本公开的药物组合物，其用于治疗选自自身免疫障碍和/或炎症性疾病和/或肿瘤疾病和/或癌症和/或HIV感染和复制的障碍或疾病。适当地，所述障碍或疾病选自：类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病和特应性皮炎。
在实施方案中，根据本公开使用的化合物或药物组合物是PKC-theta抑制剂。
在实施方案中，所述用途是在一种方法中，包括以以下方式施用所述化合物：口服、局部、通过吸入、通过鼻内施用或通过静脉内、腹膜内、皮下或肌内注射进行全身施用。在实施方案中，所述用途是在一种方法中，包括施用与一种或多种附加治疗剂组合的、根据本公开的化合物。在实施方案中，所述施用包括与所述一种或多种附加治疗剂同时、依次或分开施用根据本公开的化合物。
在实施方案中，所述用途包括向受试者施用有效量的根据本公开内容的化合物，其中所述有效量为在受试者的血液中约5nM至约10μM。
在本发明的另一方面，提供了治疗或预防PKC-theta介导的障碍，或通过抑制激酶例如PKC-theta可治疗或可预防的病症的方法。在实施方案中，所述疾病可以是在有需要的受试者中与自身免疫、炎症性疾病、癌症和/或肿瘤疾病和/或癌症和/或HIV感染和复制(特别是自身免疫障碍和/或炎症性疾病)相关的疾病。适当地，所述障碍或疾病选自：类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病和特应性皮炎。
在实施方案中，所述方法包括施用根据本公开的化合物或根据本公开的药物组合物。适当地，所述化合物是PKC-theta抑制剂，或所述药物组合物包括PKC-theta抑制剂。
在实施方案中，所述方法包括口服、局部、通过吸入、通过鼻内施用或通过静脉内、腹膜内、皮下或肌内注射进行全身施用所述化合物或药物组合物。在实施方案中，所述方法包括施用与一种或多种附加治疗剂组合的、根据本公开的化合物或根据本公开的药物组合物。在实施方案中，所述施用包括与所述一种或多种附加治疗剂同时、依次或分开施用根据本公开的化合物或根据本公开的药物组合物。
在实施方案中，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本公开的化合物，其中所述有效量为在受试者血液中约5nM至约10μM。
在本申请的范围内，明确表示，在前述段落中、在权利要求和/或在以下说明书和附图中阐述的各个方面、实施方案、实施例和备选方案，并且特别是其各个特征，可以单独或任意组合使用。也就是说，所有实施方案和/或任何实施方案的特征可以以任何方式和/或组合进行组合，除非这些特征不兼容。更具体地，特别表示，任何方面的任何实施方案可以形成任何其他方面的实施方案，并且所有此类组合都涵盖在本发明的范围内。相应地，申请人保留更改任何原始提交的权利要求或提交任何新的权利要求的权利，包括修改任何原始提交的权利要求以从属于任何其他权利要求和/或并入任何其他权利要求的任何特征的权利，尽管最初并未以该方式要求保护。
详细说明
本文描述的是化合物和组合物(例如，有机分子、研究工具、药物制剂和治疗剂)、本公开的化合物和组合物的用途(体外和体内)，以及相应的方法，无论是诊断、治疗还是研究应用。还描述了本公开的化合物的化学合成和生物测试。有利的是，所述化合物、组合物、用途和方法可用于研究和/或治疗动物例如人类的疾病或障碍。可以受益于PKC-theta调节的疾病或障碍包括例如自身免疫障碍、炎症性疾病、癌症和/或肿瘤疾病和/或HIV感染和复制，例如类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、哮喘、特应性皮炎和克罗恩病。
所述化合物还可以或可选择地用作先导分子，根据需要，用于选择、筛选和开发其他可具有一种或多种改善的有益药物性质的衍生物。这种进一步的选择和筛选可以使用例如在申请人较早期公开的专利申请WO 2011/061548中描述的专有计算进化算法来进行，该专利申请的全部内容通过引用并入本文。
本公开还包括本文所述化合物的盐、溶剂化物和官能衍生物。这些化合物可用于治疗可受益于PKC-theta调节的疾病或障碍，例如本文所确定的自身免疫性障碍、炎症性疾病、癌症和/或肿瘤疾病和/或HIV感染和复制。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同(例如有机、物理或理论化学；生物化学与分子生物学)。
除非另有说明，本发明的实践采用化学和化学方法、生物化学、分子生物学、药物制剂以及患者的递送和治疗方案中的常规技术，其在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术也在本文引用的文献中描述。本公开中引用的所有文件通过全文引用并入本文。
在阐述本发明的详细描述之前，提供了许多将有助于理解本公开的定义。
根据本公开，术语“分子(molecule)”或“分子(molecules)”与术语“化合物(compound)”或“化合物(compounds)”互换使用，有时也与术语“化学结构”互换使用。术语“药物(drug)”通常用于药物(pharmaceutical)、药物组合物(pharmaceuticalcomposition)、药剂(medicament)等的情况，其具有已知或预测的具有医学意义的生理或体外活性；但是在本公开的分子或化合物中不排除这样的特征和性质。因此，术语“药物”与替代性的术语和短语“治疗(剂)”、“药物(制剂)”和“活性(剂)”互换使用。根据本公开的治疗剂还包括包含本公开的化合物的组合物和药物制剂。
本公开化合物的前药和溶剂化物也包括在本公开的范围内。术语“前药”是指化合物(例如药物前体)，其在体内转化以产生本公开的化合物或该化合物药学上可接受的盐、溶剂化物或酯。所述转化可能通过多种机制(例如通过代谢或化学过程)发生，例如通过可水解键的水解，例如在血液中(参见Higuchi&Stella(1987),“Pro-drugs as NovelDelivery Systems”,vol.14of the A.C.S.Symposium Series、(1987),“BioreversibleCarriers in Drug Design”,Roche,ed.,American Pharmaceutical Association andPergamon Press)。因此，本公开的组合物和药物可以包含本公开化合物的前药。在一些方面和实施方案中，本公开的化合物本身是前药，其可在体内代谢以产生治疗有效的化合物。
本发明还包括本文公开的任何通式化合物的多种氘化形式，分别包括本发明的式I、II或III(包括本文定义的相应子通式)或其药学上可接受的盐和/或相应的互变异构体形式(包括如上定义的子通式)。每个可用的与碳原子连接的氢原子可以独立地被氘原子取替。本领域普通技术人员将会知道如何合成本文公开的任何通式的氘化形式，分别包括本发明的式(I)、(II)或(III)(包括本文定义的相应子通式)或其药学上可接受的盐和/或相应的互变异构体形式(包括如上定义的子通式)。例如，氘化材料如烷基，可以通过常规技术制备(参见例如：甲基-d3-胺，获自Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI,Cat.No.489,689-2)。
本发明还包括同位素标记的化合物，其与本文公开的任何通式中所述的化合物相同，分别包括本发明的式(I)、(II)或(III)(包括本文定义的相应子通式)或其药学上可接受的盐和/或相应的互变异构体形式(包括如上定义的子通式)，不同的是一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界中最常见的原子质量或质量数的原子所取代。可以掺入到本发明化合物中的同位素的实施例包括氢、碳、氮、氧、氟、碘和氯的同位素，例如3H、11C、14C、18F、123I或125I。包含上述同位素和/或其他原子的其他同位素的本发明的化合物以及所述化合物的药学上可接受的盐也在本发明的范围内。本发明的同位素标记化合物，例如已掺入放射性同位素如3H或14C的化合物，其可用于药物和/或底物组织分布测定。氚化同位素(即3H)和碳-14同位素(即14C)因其易于制备和可检测性而特别优选。11C和18F同位素在PET(正电子发射断层扫描)中特别有用。
在本公开的上下文中，术语“个体”、“受试者”，或“患者”可互换使用，以表示可能患有医学(病理)病症并且可能对本公开的分子、药物、医学治疗或治疗性治疗方案有反应的动物。所述动物适当地为哺乳动物，例如人、牛(cow)、绵羊(sheep)、猪、狗、猫、蝙蝠、小鼠或大鼠。特别地，所述受试者可以是人。
术语“烷基”是指单价的、任选取代的、饱和脂肪族烃基。可能存在任何数量的碳原子，但通常烷基中的碳原子数量可是1至约20、1至约12、1至约6或1至约4。有用地，碳原子数表示为例如C1-12烷基(或C1-12烷基)是指链中含有1至12个碳原子的任何烷基。烷基可能是直链(即线性)、支链或环状的。“低级烷基”是指链中含有1至6个碳原子的烷基，并且可能有1至4个碳原子，或1至2个碳原子。因此，低级烷基的代表性实例包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、异丙基、异丁基、异戊基、戊基(C5H11)、仲丁基、叔丁基、仲戊基、叔戊基、2-乙基丁基、2,3-二甲基丁基等。“高级烷基”是指7个碳及以上的烷基，包括正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、正二十烷基等，以及它们的支链变体。例如4至6个碳的线性碳链是指不包括任何位于支链上的碳的链长，而在支链中其指的是总数。烷基和其他基团的任选取代基如下所述。
术语“取代的”是指一个或多个氢原子(与碳或杂原子连接)被来自所示取代基组的所选基团所取代，条件是不超过在现有情况下指定原子的正常化合价。所述基团可以任选地在不显著干扰本发明范围内的化合物制备的位置上被特定的取代基取代，并且基于这样的理解，所述取代不会显著不利地影响化合物的生物活性或结构稳定性。取代基的组合只有在这种组合产生稳定的化合物时才是允许的。“稳定的化合物”或“稳定的结构”是指，化合物足够稳健，以经受得住从反应混合物中分离至有用的纯度和/或配制为有效的治疗剂。“任选取代的”是指所涉及的基团是未取代的，或者至少一个氢原子被指定的取代基、基团或部分之一取代。
本文所述的任何可被取代的(或任选取代的)基团(radical)/基团(group)/部分可以被一个或多个(例如1、2、3、4或5个)取代基取代，所述取代基独立地选自指定的取代基组。因此，除非另有说明，取代基可以选自：卤素(或“卤代”，例如F、Cl和Br)、羟基(-OH)、氨基或胺基(aminyl)(-NH2)、巯基(-SH)、氰基(-CN)、(低级)烷基、(低级)烷氧基、(低级)烯基、(低级)炔基、芳基、杂芳基、(低级)烷硫基、氧代、卤代烷基、羟烷基、硝基(-NO2)、磷酸盐/酯基、叠氮基(-N3)、烷氧羰基、羧基、烷基羧基、烷基氨基、二烷基氨基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、硫代烷基、烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、环烷基、杂环烷基。或者，当取代基位于芳基或其他环状环系上时，两个相邻原子可以被亚甲二氧基或亚乙二氧基取代。更合适地，所述取代基选自：卤素、羟基、氨基、巯基、氰基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、芳基(C1-C6)烷氧基、杂芳基、(C1-C6)烷硫基、氧代、卤代(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、硝基、磷酸盐/酯基、叠氮基、(C1-C6)烷氧羰基、羧基、(C1-C6)烷基羧基、(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、氨基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基氨基(C1-C6)烷基、二(C1-C6)烷基氨基(C1-C6)烷基、硫代(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、(C1-C6)烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、(C1-C6)烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、氨基甲酰基、(C1-C6)烷基氨基甲酰基、二(C1-C6)烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、(C1-C6)烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、(C1-C6)环烷基和杂环烷基。更合适地，所述取代基选自以下一种或多种：氟、氯、溴、羟基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)烷氧基、(C5-C6)芳基、5-或6-元杂芳基、(C4-C6)环烷基、4-至6-元杂环烷基、氰基、(C1-C6)烷硫基、氨基、-NH(烷基)、-NH((C1-C6)环烷基)、-N((C1-C6)烷基)2、-OC(O)-(C1-C6)烷基、-OC(O)-(C5-C6)芳基、-OC(O)-(C1-C6)环烷基、羧基和-C(O)O-(C1-C6)烷基。最合适地，所述取代基选自以下一种或多种：氟、氯、溴、羟基、氨基、(C1-C6)烷基和(C1-C6)烷氧基，其中烷基和烷氧基任选地被一个或多个氯取代。特别优选的取代基是：氯、甲基、乙基、甲氧基和乙氧基。
术语“卤代”或“卤素”是指选自氯、溴、碘和氟的一价卤素基团。“卤代”化合物是被一个或多个卤素取代基取代的化合物。优选的卤素基团是F、Cl和Br，最优选的是F。
当在本文中使用时，关于用一个或多个取代基取代母体部分，术语“独立地”是指母体部分可以被任何所列出的取代基单独地或组合地取代，并且可以使用任何数量的化学上可能的取代基。在任何实施方案中，当基团被取代时，其可包含至多5个、至多4个、至多3个或1和2个取代基。作为非限制性实例，有用的取代基包括：苯基或吡啶，其独立地被一个或多个低级烷基、低级烷氧基或卤素取代基取代，例如：氯苯基、二氯苯基、三氯苯基、甲苯基、二甲苯基、2-氯-3-甲基苯基、2,3-二氯-4-甲基苯基等。
如本文所用，术语“亚烷”或“亚烷基”是指通过从如上定义的烷基中除去氢原子而得到的双官能基团。亚烷基的非限制性实例包括亚甲基、亚乙基和亚丙基。“低级亚烷基”是指链中具有1至6个碳原子的亚烷基，并且可以是直链或支链的。亚烷基任选地被取代。
术语“烯基”是指单价的、任选取代的、不饱和脂肪族烃基。因此，烯基具有至少一个碳-碳双键(C＝C)。可以指出烯基中的碳原子数，例如2至约20。例如C2-12烯基(或C2-12烯基)是指在结构中含有2至12个碳原子的烯基。烯基可以是直链(即线性)、支链或环状的。“低级烯基”是指具有1至6个碳原子的烯基，并且可能具有1至4个碳原子或1至2个碳原子。低级烯基的代表性实例包括乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基、异丙烯基、异丁烯基等。高级烯基是指七个碳及以上的烯基，如1-庚烯基、1-辛烯基、1-壬烯基、1-癸烯基、1-十二碳烯基、1-十四碳烯基、1-十六碳烯基、1-十八碳烯基、1-二十碳烯基等，以及它们的支链变体。任选的取代基包括在别处描述的那些。
“亚烯基”是指通过从如上定义的烯基中除去氢而获得的双官能基团。亚烯基的非限制性实例包括-CH＝CH-、-C(CH3)＝CH-和-CH＝CHCH2-。
“炔基”和“低级炔基”的定义与术语“烯基”类似，除了它包括至少一个碳-碳三键。
术语“烷氧基”是指式RO-的单价基团，其中R是如本文所定义的任何烷基、烯基或炔基。烷氧基可任选地被本文所述的任何任选取代基取代。“低级烷氧基”具有式RO-，其中R基团是低级烷基、烯基或炔基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、正丁氧基、正戊氧基、正己氧基、异丙氧基、异丁氧基、异戊氧基、戊氧基(amyloxy)、仲丁氧基、叔丁氧基、叔戊氧基等。优选的烷氧基是甲氧基和乙氧基。
如本文所用，术语“芳基”是指含有5至约15个碳原子、优选5或6个碳原子的取代或未取代的芳族碳环基团。芳基可以仅具有一个单独的碳环，或者可以包含一个或多个稠环，其中至少一个环本质上是芳香族的。“苯基”是通过从苯环上除去氢原子形成的基团，并且可以是取代或未取代的。因此，“苯氧基”基团是式RO-的基团，其中R是苯基。“苄基”是式R-CH2-的基团，其中R是苯基，以及“苄氧基”是式RO-的基团，其中R是苄基。芳基的非限制性实例包括苯基、萘基、苄基、联苯基、呋喃基、吡啶基、茚满基、蒽醌基、四氢萘基、苯甲酸基、呋喃-2-羧酸基等。
“杂芳基”在本文中定义为取代或未取代的“芳基”，其中环结构中的一个或多个碳原子已被杂原子如氮、氧或硫替代。通常，杂芳基含有一个或两个杂原子。优选的杂原子是N，示例性杂芳基包括：呋喃、苯并呋喃、异苯并呋喃、吡咯、吲哚、异吲哚、噻吩、苯并噻吩、苯并[c]噻吩、咪唑、苯并咪唑、嘌呤、吡唑、吲唑、噁唑、苯并噁唑、异噁唑、苯并异噁唑、噻唑、苯并噻唑、吡啶、喹啉、异喹啉、吡嗪、喹喔啉、吖啶、嘧啶、喹唑啉、哒嗪和噌啉。
如本文所用，术语“杂环”或“杂环的”基团是指具有约4至约15个环原子、优选4、5-或6、7个环成员的单价基团。通常，杂环基团包含一个、两个或三个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。优选的杂原子是N。杂环基团可以仅具有一个单独的环，或者可以包含一个或多个稠环，其中至少一个环含有杂原子。它可以是完全饱和的或部分饱和的，并且可以是取代的或未取代的，如芳基和杂芳基的情况。仅具有一个杂原子的不饱和5元杂环的代表性实例包括2-或3-吡咯基、2-或3-呋喃基和2-或3-噻吩基。相应的部分饱和或完全饱和的基团包括3-吡咯啉-2-基、2-或3-吡咯烷基、2-或3-四氢呋喃基和2-或3-四氢噻吩基。代表性的具有两个杂原子的不饱和5元杂环基包括咪唑基、噁唑基、噻唑基、吡唑基等。还包括相应的完全饱和和部分饱和的基团。仅具有一个杂原子的不饱和6元杂环的代表性实例包括2-、3-或4-吡啶基、2H-吡喃基和4H-吡喃基。相应的部分饱和或完全饱和的基团包括2-、3-或4-哌啶基、2-、3-或4-四氢吡喃基等。代表性的具有两个杂原子的不饱和6元杂环基包括3-或4-哒嗪基、2-、4-或5-嘧啶基、2-吡嗪基、吗啉代基等。还包括相应的完全饱和和部分饱和的基团，例如2-哌嗪。杂环基团通过杂环中的可用碳原子或杂原子直接键合到实体上，或者通过连接体如亚烷基如亚甲基或亚乙基键合。
除非另有定义，“室温”是指约18至28℃的温度，通常在约18至25℃之间，更通常在约18至22℃之间。如本文所用，短语“室温”可被简化为“rt”或“RT”。
分子和化合物
本文公开了一种具有结构式I的化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或立体异构体的混合物、互变异构体，或同位素形式，或其药学上活性代谢物，或其组合，其中：
A选自：N、C-Ra，其中Ra选自氢、卤素、C1-3烷基和CN；
G选自：CR1R2；O和NR1；
R1和R2独立地选自：氢、卤素、C1-3烷基；C3-7环烷基(例如CH2 cPr)；C1-3烷氧基(例如OMe)；C2-6环烷氧基(例如OcPr)；C2-6烷基烷氧基(例如CH2OMe)、羟基、C1-3烷基羟基(例如CH2OH)、氨基、C1-3烷基氨基(例如CH2NH2)；C1-4氨基烷基(例如NHMe或N(Me)2)、C2-7烷基氨基烷基(例如CH2NHMe或CH2N(Me)2)；C1-3卤代烷基；或者
R1和R2一起形成3-5元任选取代的螺碳环或杂环；特别是4-5元任选取代的碳环或杂环螺环；其中在实施方案中，碳环或杂环螺环是未取代的；其中在替代性的实施方案中，所述碳环或杂环螺环被一个或多个选自以下的取代基取代：C1-2烷基、卤素；C1-2卤代烷基；羟基和C1-2烷氧基；
B选自：N；C-H和C-卤素(例如C-F、C-Cl、C-Br)；
D选自：N和C-R3；
R3选自：氢；C1-3烷基(例如Me、Et)；C1-3卤代烷基(例如CF2H、CF3；CH2CF3)；C1-3烷氧基(例如OMe)；C2-5烷基烷氧基(例如CH2OMe)；和卤素(例如F、Cl、Br)；以及
R4选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基(例如CF2H、CF3；CH2CF3)；OMe和卤素；或
其中当D是C-R3时，R3和R4连接在一起以形成任选取代的芳基或杂芳基环，其具有选自以下的结构：
其中：
R7选自：氢和卤素；
R8选自：氢和卤素；
R9选自：氢；C1-3卤代烷基(例如CF2H、CF3；CH2CF3)和卤素；
R10选自：氢；卤素；C1-3卤代烷基(例如CF2H、CF3；CH2CF3)；C1-3卤代烷氧基(例如OCFH2、OCF2H、OCF3)；以及
其中：
n选自：0和1；
E选自：C-H；和C-Ra，其中Ra选自卤素；C1-3烷基；C1-3烷基羟基(例如CH2OH)；C1-3卤代烷基(例如CH2F)；C2-6烷基烷氧基(例如CH2OMe)和C2-4烷基腈(例如CH2CN)；
R5和R6连接在一起以形成任选取代的、任选桥连的4-8元、适当地为5-7元饱和碳环或杂环。
在式I的具体实施方案中，D是C-R3、R3和R4连接在一起以形成任选取代的芳环，该芳环具有以下结构：
即通式II的化合物：
其中，A、B、E、G、R1、R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10和n如式I所定义。
在式II的具体实施方案中，化合物具有式IIa的结构：
其中，A、B、E、R1、R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10和n如式I所定义；
R17选自：
其中
R11选自：氢；卤素(例如F)和C1-2烷基(例如Me)；
R12选自：氢；C1-3烷基(例如Me)；C1-3卤代烷基(例如CH2F)；C1-3烷基羟基(例如CH2OH)；和C1-2烷基腈(例如CH2CN)；
R13选自：氢；卤素(例如F)和C1-2烷基(例如Me)；
R14选自：氢和C1-2烷基(例如Me)；
R15选自：氢和C1-2烷基(例如Me)；
R16选自：氢；C1-3烷基(例如Me)；C1-3卤代烷基(例如-CH2CH2F、CH2CHF2、CH2CF3)；C1-3烷基羟基(例如CH2OH)；和C1-3烷基烷氧基(例如CH2OMe)；
N选自：0和1；
P选自：1和2；
X选自：CH2和O；
Y选自：CH2、O、NH和NMe。
在式IIa的具体实施方案中，E、R5、R6、R7、R8、R9和R10如式I；
R1选自：氢、Me、Et、OMe、OEt、OH、NH2、NHMe和NHEt；以及
R2选自：氢、Me和Et；或者
R1和R2一起形成3-5元任选取代的螺碳环或杂环；特别是4-5元任选取代的碳环或杂环螺环；其中在实施方案中，碳环或杂环螺环是未取代的；其中在替代实施方案中，碳环或杂环螺环被一个或多个选自以下的取代基取代：C1-2烷基、卤素；C1-2卤代烷基；羟基；和C1-2烷氧基；
A选自：C-H；C-F；C-Cl和C-Br；
B选自：N；C-H和C-卤素(例如C-F；C-Cl和C-Br)；
R17选自：
其中：
R18选自：氢和卤素(例如F)；
R19选自：氢；C1-3烷基(例如Me)；C1-3卤代烷基(例如CH2F)；C1-3烷基羟基(例如CH2OH)；
m选自：0和1；
R20选自：氢和卤素(例如F)；
X选自：CH2和O；
R21和R22各自独立地选自：氢；和C1-3烷基(例如Me)；
Y选自：CH2、O和NH；
R23选自：氢；C1-3烷基(例如Me)和C1-3卤代烷基(例如-CH2CH2F、CH2CHF2、CH2CF3)。
在式I的替代性的实施方案中，化合物具有通式III：
其中，A、B、E、G、R1、R2、R5、R6和n如式I、II或IIa所定义；
D选自：N；C-H和C-R3；
R3选自：C1-3烷基；C2-5烷基烷氧基(例如OMe)；C1-3卤代烷基(例如CF3)和卤素；
R4选自：氢；C1-3烷基；C2-5烷基烷氧基(例如OMe)；C1-3卤代烷基(例如CF3)和卤素。
在式III的具体实施方案中，G是CR1R2，B或D中的一个是N，另一个是C-H；或B和D是C-H，即具有式IIIa、IIIb或IIIc结构的化合物：
其中，A、R1、R2、R3、R4、E、R5、R6和n如式III所定义；
R17选自：
其中：
R11选自：氢；卤素(例如F)和C1-2烷基(例如Me)；
R12选自：氢；C1-3烷基(例如Me)；C1-3卤代烷基(例如CH2F)；C1-3烷基羟基(例如CH2OH)；和C1-2烷基腈(例如CH2CN)；
R13选自：氢；卤素(例如F)和C1-2烷基(例如Me)；
R14选自：氢和C1-2烷基(例如Me)；
R15选自：氢和C1-2烷基(例如Me)；
R16选自：氢；C1-3烷基(例如Me)；C1-3卤代烷基(例如-CH2CH2F、CH2CHF2、CH2CF3)；C1-3烷基羟基(例如CH2OH)；和C1-3烷基烷氧基(例如CH2OMe)；
N选自：0和1；
P选自：1和2；
X选自：CH2和O；
Y选自：CH2、O、NH和NMe。
在式IIIa、IIIb和IIIc的具体实施方案中，A和n如式III中所示，和
R1选自：氢、Me、Et、OMe、OH、NH2和NHMe；以及
R2选自：氢；Me；和Et；或者
R1和R2一起形成3-5元任选取代的螺碳环或杂环；特别是4-5元任选取代的碳环或杂环螺环(例如环丁烯、环戊烷、四氢呋喃)；其中在实施方案中，碳环或杂环螺环是未取代的；其中在替代性的实施方案中，碳环或杂环螺环被一个或多个选自以下的取代基取代：C1-2烷基、卤素；C1-2卤代烷基；羟基；和C1-2烷氧基；
A选自：C-H、C-F、C-Cl和C-Br；
R17选自：
其中：
R18选自：氢和卤素(例如F)；
R19选自：氢；C1-3烷基(例如Me)；C1-3卤代烷基(例如CH2F)；和C1-3烷基羟基(例如CH2OH)；
m选自：0和1；
R20选自：氢和卤素(例如F)；
X选自：CH2和O；
R21和R22各自独立地选自：氢和C1-3烷基(例如Me)；
Y选自：CH2；O和NH；
R23选自：氢；C1-3烷基(例如Me)和C1-3卤代烷基(例如-CH2CH2F、CH2CHF2、CH2CF3)。
在另一方面，本发明提供了包含根据本公开的化合物的药物组合物。
本发明的化合物可具有如下所述的结构：
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表1：本公开的特定PKC-theta抑制剂化合物。
化合物的PKC-theta活性、前药和代谢物
PKC-theta在T淋巴细胞中选择性表达，并在T细胞抗原受体(TCR)触发的成熟T细胞活化和随后细胞因子如IL-2的释放以及T细胞增殖中起重要作用(Isakov和Altman,Annu.Rev.Immunol.,2002,20,761-94)。因此，IL-2水平的降低指示了期望应答，可以提供对如本文所述的疾病和障碍如自身免疫性和肿瘤学疾病的治疗。
由于参与T细胞活化，PKC-theta的选择性抑制可以减少由Th17介导的有害炎症(介导自身免疫性疾病)或由Th2介导的有害炎症(引起过敏)(Madouri等人,Journal ofAllergy and Clinical Immunology.139(5):2007,pp 1650–1666)，而其不削弱T细胞清除病毒感染细胞的能力。抑制剂可用于T细胞介导的适应性免疫应答。PKC-theta的抑制下调转录因子(NF-κB、NF-AT)并导致IL-2产生减少。据观察，没有PKC-theta的动物对一些自身免疫性疾病有抗性。(Zanin-Zhorov等人,Trends in Immunology.2011,32(8):358–363)。因此PKC-theta是潜在癌症和自身免疫疗法的令人感兴趣的靶标。
对PKC-theta-缺陷型小鼠的研究已经证明，尽管抗病毒应答不依赖于PKC-theta活性，但与自身免疫性疾病相关的T细胞应答是PKC-theta依赖性的(Jimenez等人,J.Med.Chem.2013,56(5)pp 1799-1810)。因此，PKC-theta的有效和选择性抑制有望阻断自身免疫性T细胞应答而不损害抗病毒免疫。然而，PKC亚型特别是PKC-delta的相似性以及相对于其他蛋白激酶的选择性对开发适合临床使用的PKC-抑制剂提出了挑战。
为了解决这些问题，在各个方面和实施方案中，本公开的化合物(或“活性剂”)可以有利地提供强效和选择性的(通过合适的量度，例如合适测定中的pIC50，选择性大于5倍，优选大于20倍)PKC-theta抑制，优于其它PKC-亚型例如PKC-delta和其它激酶。
本发明的活性剂或化合物可以作为本公开化合物的前药提供。
术语“活性剂”通常用于指对PKC-theta具有抑制活性的本发明化合物，特别是在生理条件下。然而，通常情况是，例如由于溶解度、半衰期或许多其它化学或生物学原因，活性剂可能难以施用或递送至相关的生理部位。因此，已知使用活性剂的“前药”以克服药物效率和/或毒性方面的物理化学、生物或其它障碍。此外，前药策略可用于增加药物对其预期靶标的选择性。因此，根据本公开，前药可能有益于将活性剂靶向到感兴趣的生物位点，同时有利地绕过例如胃(或肺)，在那里由于PKC-theta活性的局部抑制而可能出现不方便的副作用问题。
活性剂可以由本公开的化合物或前药、通过药物在体内的代谢、和/或通过前药在体内的化学或酶裂解形成。通常，前药可以是药理学上无活性的化合物，其需要化学或酶转化以在意欲具有治疗作用的体内成为有效的活性剂。另一方面，由于在一些实施方案中前药与活性剂具有非常接近的结构相似性，在一些这样的实施方案中，所述前药也可能具有针对PKC-theta靶标的活性。特别是这种情况，其中所述活性剂由本公开的前药化合物通过代谢或微小的化学转化形成，使得代谢物与母体化合物/前药密切相关。因此，本发明的前药可以是PKC-theta的活性抑制剂。然而，适当地，这类前药的特征可在于与衍生自本公开前药的药物/活性剂相比，具有更低的对PKC-theta的抑制活性。
另一方面，当治疗效果源自活性剂从较大化学实体的释放时，则最终的活性剂/化合物/药物与其所源自的前药相比可能具有显著的结构差异。在这种情况下，前药可以有效地“掩蔽”活性剂的形式，并且在这种情况下，前药在生理条件下可以完全(或基本上)完全无活性。
剂型、药物和药品
本公开化合物、分子或活性剂可用于治疗(例如治愈、缓解或预防)一种或多种疾病、感染或障碍。因此，根据本公开，所述化合物和分子可以被制备成药物，或者可以被掺入或配制到药物组合物中。
本公开的分子、化合物和组合物可以通过任何方便的途径施用，例如，施用方法包括皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、阴道内、透皮、直肠、通过吸入或局部施用至皮肤。还已知递送系统包括例如包封在脂质体、微凝胶、微粒、微胶囊、胶囊等中。还可以设想使用本领域已知的任何其它合适的递送系统。可以全身或局部施用。施用方式可由执业医师自行决定。
当然，施用的剂量将根据已知的因素如特定活性剂的药效学性质、选择的施用方式和途径、接受者的年龄、健康状况和体重、待治疗的疾病或障碍的性质、症状的程度、任何同时或并行的治疗、治疗频率以及预期效果等而变化。一般而言，可以预期活性剂的日剂量为约0.001至约1,000mg/kg体重。对于一些应用，剂量可以适当地在约0.01至约100mg/kg、约0.1至约25mg/kg之间、或约0.5至10mg/kg之间的范围内。
根据已知因素，例如上述那些因素，所需的活性剂剂量可以以单次日剂量施用，或总日剂量可以例如以每日两次、三次或四次的分次剂量施用。适当地，根据本公开的治疗性治疗方案被设计用于单次日剂量或用于分开的两次剂量的日剂量。
适于施用的本公开的药物组合物的剂型可以含有每单位约1mg至约2,000mg的活性成分。通常，化合物的日剂量可以是每人剂量至少约10mg和至多约1,500mg，例如约25至1,250mg之间或适当地约50至1,000mg之间。通常，化合物的日剂量可以是至多约1000mg。在此类组合物中，本发明的化合物通常以基于组合物总重量的约0.5-95重量％的量存在。
“有效量”或“治疗有效量”是指描述有效治愈、抑制、减轻、减少或预防待治疗疾病或障碍的副作用的本公开化合物或组合物的量，或实现生理或生化可检测效果所需的量。因此，在有效量下，所述化合物或活性剂能够产生与疾病或障碍相关的所需的治疗、改善、抑制或预防效果。有益地，有效量的本公开的化合物或组合物可具有抑制PKC-theta的作用。可受益于PKC-theta抑制的疾病或障碍包括例如自身免疫障碍、炎症性疾病、癌症和/或肿瘤疾病，如类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、干燥综合征(Sjogren's syndrome)和系统性红斑狼疮或血管炎疾病、造血起源的癌症(cancers of hematopoietic origin)或实体瘤，包括慢性髓性白血病、髓细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤和其它B细胞淋巴瘤。
对于治疗性应用，本公开的化合物/活性剂的有效量或治疗有效量可为在受试者血液中至少约50nM或至少约100nM，通常至少约200nM或至少约300nM。有效量或治疗有效量可以是在受试者血液中至多约5μM、至多约3μM、适当地至多约2μM且通常至多约1μM。例如，治疗有效量可以是至多约500nM，例如在约100nM和500nM之间。在一些实施方案中，测量受试者血清中治疗性化合物的量，并且随后可以将上述浓度应用于本公开化合物的血清浓度。
当向受试者施用时，本公开化合物适当地作为包含药学上可接受的载体或媒介物的组合物的组分施用。一种或多种另外的药学上可接受的载体(例如稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物)可以与本公开化合物组合在药物组合物中。E.W.Martin在“Re mington'sPharmaceutical Sciences”中描述了合适的药物载体。本公开的药物制剂和组合物被配制以符合监管标准并根据所选择的施用途径。
可接受的药物载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的液体，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物载体可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。此外，可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。当向受试者施用时，药学上可接受的媒介物通常是无菌的。当化合物静脉内施用时，水是合适的媒介物。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体媒介物，特别是用于注射溶液。合适的药物媒介物还包括赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉(dried skim milk)、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明的组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或缓冲剂。
本公开的药物和药物组合物可以采取溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂(pills)、小丸剂(pellets)、粉剂、凝胶、胶囊(例如含有液体或粉末的胶囊)、调节释放制剂(例如缓释或持续释放的制剂)、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、混悬剂或任何其它适合使用的形式。合适的药物媒介物的其它实例描述于Remington'sPharmaceutical Sciences,AlfonsoR.Gennaro ed.,Mack Publishing Co.Easton,Pa.,19th ed.,1995,参见例如第1447-1676页。
适当地，本公开的治疗组合物或药物根据常规程序被配制成适于口服施用(更适合用于人)的药物组合物。用于口服递送的组合物可以是例如片剂、锭剂、水性或油性混悬剂、颗粒剂、粉剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂或酏剂的形式。因此，在一个实施方案中，药学上可接受的媒介物是胶囊、片剂或丸剂。
口服施用的组合物可以含有一种或多种试剂，例如甜味剂如果糖、阿斯巴甜或糖精；调味剂如薄荷、冬青油或樱桃；着色剂；和防腐剂，以提供药学上适口的制剂。当组合物为片剂或丸剂形式时，可将组合物包衣以延缓在胃肠道中的崩解和吸收，从而在延长的时间内提供活性剂的持续释放。围绕渗透活性驱动化合物的选择性渗透膜也适用于口服施用的组合物。在这些剂型中，来自胶囊周围环境的流体被驱动化合物吸收，其膨胀以通过孔口置换活性剂或活性剂组合物。这些剂型可以提供基本上零级的递送曲线，与立即释放制剂的尖峰曲线相反。也可使用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。口服组合物可以包括标准媒介物，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。此类媒介物优选是药物级的。对于口服制剂，释放的位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。本领域技术人员能够制备在胃中不溶解但在十二指肠或肠的其他地方释放材料的制剂。适当地，所述释放将通过保护化合物(或组合物)或通过将化合物(或组合物)释放到胃环境之外(例如在肠中)而避免胃环境的有害作用。为了确保完全的胃耐受性，一种至少不渗透pH5.0的包衣是必不可少的。用作肠溶衣的更常见的惰性成分的实例是乙酸偏苯三酸纤维素(cellulose acetate trimellitate/CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和Shellac，它们可以作为混合薄膜使用。
虽然以适于口服施用的形式提供本公开的治疗组合物和/或化合物可能是有益的，例如，以改善患者依从性和便于施用，但是在一些实施方案中，本公开的化合物或组合物可能引起不期望的副作用，如肠道炎症，其可能导致治疗性治疗方案的提前终止。因此，在一些实施方案中，调整治疗性治疗方案以适应“治疗假期”，例如一天或多天的不施用。例如，本公开的治疗方案和治疗方法可以包括重复过程，所述重复过程包含连续多天施用治疗组合物或化合物，随后是连续一天或多天的治疗假期。例如，本公开的治疗方案可以包含连续1至49天、2至42天、3至35天、4至28天、5至21天、6至14天或7至10天的治疗组合物或化合物的重复施用周期；随后是连续1至14天、1至12天、1至10天或1至7天(例如1、2、3、4、5、6或7天)的治疗假期。
为了帮助治疗剂溶解到水性环境中，可以加入表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可以包括阴离子洗涤剂，例如十二烷基硫酸钠、琥珀酸二辛酯磺酸钠(dioctyl sodiumsulfosuccinate)和磺酸二辛酯钠(dioctyl sodium sulfonate)。可以使用阳离子去污剂，并且可以包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可以作为表面活性剂包含在制剂中的潜在非离子洗涤剂包括：聚桂醇(lauromacrogol)400、polyoxyl 40stearate、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯，聚山梨酯20、40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。当使用时，这些表面活性剂可以单独或以不同比例的混合物存在于化合物或衍生物的制剂中。
通常，用于静脉内施用的组合物包含无菌等张水性缓冲液。必要时，组合物还可以包括增溶剂。
本公开的治疗组合物的另一种合适的施用途径是通过肺部或鼻部递送。
可以包括添加剂以增强本公开治疗剂的细胞摄取，例如脂肪酸油酸、亚油酸和亚麻酸。
本公开的治疗剂也可以配制成用于局部施用至受试者皮肤的组合物。
当本发明提供一种以上的活性化合物/活性剂用于组合使用时，通常，活性剂可以单独配制或配制为单一剂型，取决于每种相关活性剂所规定的最合适的施用方案。当治疗剂分开配制时，本发明的药物组合物可以用于包括与其它一种或多种治疗剂同时、分开或顺序施用的治疗方案。其它一种或多种治疗剂可以包含本公开的化合物或本领域已知的治疗剂。
本公开的化合物和/或药物组合物可以被配制并且适于施用至中枢神经系统(CNS)和/或用于穿过血脑屏障(BBB)。
现将通过以下非限制性实施例描述本发明。
实施例
材料和方法
样品制备：将粉末溶解在DMSO-d6中，剧烈涡旋直至溶液澄清并转移至NMR管中以获得数据。
NMR光谱：
液态NMR实验在600MHz(14.1Tesla)Bruker Avance III NMR光谱仪(1H 600MHz,13C 151MHz)上记录，使用三重共振1H、15N、13C CP-TCI 5mm冷冻探头(Bruker Biospin,德国)。
液态NMR实验在500MHz(11.75Tesla)Bruker Avance I NMR光谱仪(1H 500MHz,13C125MHz)上记录，使用双共振BBI 5mm探头(Bruker Biospin,德国)。
液态NMR实验在400MHz(9.4Tesla)Bruker Avance NEO NMR光谱仪(1H 400MHz,13C100MHz)上记录，使用SEI 5mm探头(Bruker Biospin，德国)。
用于共振归属方法和解析产物结构的所有实验(1D 1H,2D 1H-1H-COSY,2D1H-1H-ROESY,2D 1H-13C-HSQC,2D 1H-13C-HMBC)均在300K下记录。1H化学位移以δ(ppm)报告为s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、dd(双重双峰)、m(多重峰)或br s(宽单峰)。
LCMS色谱法
使用以下仪器记录LCMS色谱：
-Waters HPLC:Alliance 2695,UV:PDA 996,MS:ZQ(简单四极杆)ZQ2
-Waters UPLC:Acquity,UV:Acquity PDA,MS:Qda
-Waters UPLC:Acquity,UV:Acquity TUV,MS:Qda
-Waters UPLC:Acquity,UV:Acquity PDA,MS:QDa,ELSD
使用Gemini NX-C18 Phenomenex柱(30×2mm)测试装置，3μm用于Waters HPLC或CSH C18 Waters(50×2.1mm)，1.7μm用于UPLC Waters。它们全部使用以下洗脱剂的组合：H2O+0.05％ TFA(v/v)和ACN+0.035％ TFA(v/v)，和正电喷雾ES+作为电离模式。UV检测在220和254nm进行。
温度以摄氏度(℃)表示。以下实施例中使用的反应物可以从商业来源获得，或者它们可以如本文所述或通过本领域已知的方法由可商购的起始材料制备。本发明的所有化合物都是根据本文所述的实施例合成的。本文所述反应的进程视情况通过例如LC、GC或TLC来监测，并且如本领域技术人员将容易意识到的，可以相应地调整反应时间和温度。
手性纯化
方法A：
仪器：Waters Prep SFC80
固定相：Chiralcel IC 5μm，250×20mm
流动相：CO2/(EtOH+0.5％ IPAm)70/30
流速：50mL/min
UV检测：λ＝220nm
温度：40℃
压力：100巴
方法B：
仪器：Waters Prep SFC80
固定相：Chiralcel OJ-H 5μm，250×20mm
流动相：CO2/(EtOH+0.5％ IPAm)70/30
流速：50mL/min
UV检测：λ＝254nm
温度：40℃
压力：100巴
缩写
除了以上定义之外，在以上合成方案和以下实施例中还使用了以下缩写。如果本文中使用的缩写没有定义，则其具有普遍接受的含义：
Ac 乙酰
ACN 乙腈
AcOH 乙酸
BH3 硼烷
Boc 叔丁氧羰基
B(OiPr)3 硼酸三异丙酯
CMBP 氰基亚甲基三丁基膦
Cs2CO3 碳酸铯
DAST 二乙氨基三氟化硫
DBU 1,8-二氮杂双环(5.4.0)十一碳-7-烯
DCM 二氯甲烷
DIPEA 二异丙基乙胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
Et 乙基
EtOAc 乙酸乙酯
Et3N 三乙胺
EtOH 乙醇
Et2O 二乙醚
h 小时
H2O 水
HCl 盐酸
iPrOH 异丙醇
K3PO4 磷酸三钾
KOAc 乙酸钾
KOH 氢氧化钾
min 分钟
Me 甲基
MeCN 乙腈
MeO或OMe 甲氧基
MeOH 甲醇
MgSO4 硫酸镁
MS 质谱
ms 甲磺酰基
NaOH 氢氧化钠
Na2SO4 硫酸钠
NaHCO3 碳酸氢钠
Na2CO3 碳酸钠
nBuLi 正丁基锂
NBS N-溴代琥珀酰亚胺
NH4Cl 氯化铵
NH4HCO3 碳酸氢铵
Pd(PPh3)4 四(三苯基膦)钯
Pd(dppf)Cl2 双(二苯基膦)二茂铁二氯化钯(II)
Pd/C 钯/碳
Ph 苯基
rt 室温(18至22℃)
TBAF 四丁基氟化铵
TBDPSCl 叔丁基二苯基氯硅烷
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TMEDA 四甲基乙二胺
Xantphos 4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基呫吨
XPhos 双环己基[2',4',6'-三(丙-2-基)[1,1'-联苯]-2-基]膦
实施例1–化学合成路线
骨架
二甲基骨架合成
4-溴-3,3-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在250mL三颈圆底烧瓶中，通过加料漏斗将1M双(三甲基甲硅烷基)氨基锂溶液(33mL，33.4mmol，3.8当量)在-78℃下逐滴添加到4-溴-1,3-二氢-2H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(2.00g，8.92mmol，1当量)的无水THF(44mL，0.2N)溶液中。将所述混合物在-78℃下搅拌10min。然后添加碘甲烷(1.4mL，22.3mmol，2.5当量)。使反应物升温至室温并在室温下搅拌1h。然后添加NH4Cl饱和水溶液和乙酸乙酯。分离两相，水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到粗产物。通过快速色谱法在硅胶上使用二氯甲烷/乙酸乙酯梯度纯化所述粗产物。将其在Dicalite(硅藻土)上通过固相转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到4-溴-3,3-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮，其为淡黄色粉末(63％收率)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.26(s,1H),7.95(d,J＝5.7Hz,1H),7.19(d,J＝5.7Hz,1H),1.39(s,6H)、m/z＝241.2,243.2[M+H]+。
4-溴-3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在20mL微波小瓶中，将3,4-二氢-2H-吡喃(0.68mL，7.47mmol，3当量)添加到4-溴-3,3-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(600mg，2.49mmol)和对甲苯磺酸水合物(95mg，0.498mmol，0.2当量)在无水甲苯(12mL，0.2N)中的溶液中。将反应物在90℃下搅拌5h。在真空下除去溶剂，得到粗产物，其为橙色油状物。通过快速柱色谱法在硅胶上使用庚烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到4-溴-3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(750mg，93％收率)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.07(d,J＝5.6Hz,1H),7.32(d,J＝5.6Hz,1H),5.40(dd,J＝11.3,2.1Hz,1H),3.97(d,J＝10.8Hz,1H),3.56(qd,J＝11.2,10.8,5.0Hz,1H),2.85(qd,J＝13.7,12.7,3.8Hz,1H),2.01–1.86(m,1H),1.68–1.48(m,4H),1.42(s,6H),m/z＝325.2,327.0[M+H]+。
3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2- 基)吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在氮气下，向密封小瓶中添加4-溴-3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(0.75g，2.31mmol)、双(频哪醇合)二硼(0.88g，3.46mmol，1.5当量)、乙酸钾(715mg,6.92mmol,3当量)和[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(193mg,0.231mmol,0.1当量)的无水二噁烷(8mL,0.3N)溶液。将小瓶密封并用氮气脱气。将反应混合物在100℃下搅拌过夜。将反应混合物通过Dicalite垫过滤，将滤液蒸发至干，得到粗产物，其为黑色油状物。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(490mg,57％收率)其为黄色油状物。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.19(d,J＝5.1Hz,1H),7.24(d,J＝5.1Hz,1H),5.42(dd,J＝11.3,2.0Hz,1H),3.96(d,J＝11.1Hz,1H),3.64–3.44(m,1H),2.89(d,J＝11.4Hz,1H),1.91(s,1H),1.73–1.46(m,4H),1.40(s,6H),1.35(s,12H).m/z＝373.4[M+H]+。
乙基/甲基骨架合成
3,4-二溴-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在10min内，向搅拌的4-溴-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(460mg,2.07mmol)的叔丁醇(16mL,0.13N)溶液中，分小份添加三溴化吡啶鎓(pyridinium bromide-perbromide)(1.46g,4.56mmol,2.2当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在真空下除去叔丁醇。添加水，然后添加乙酸乙酯。分离两相并用EtOAc萃取水相。将合并的有机相用水洗涤，经Na2SO4干燥，在高真空下浓缩，得到3,4-二溴-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(660mg,96％收率)，其为白色固体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.77(s,1H),8.04(d,J＝5.7Hz,1H),7.32(d,J＝5.7Hz,1H),2.07(s,3H)；(产品在LCMS中不稳定)。
4-溴-3-甲基-1,3-二氢吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在50mL圆底烧瓶中，在室温下，将锌粉(847mg,13.0mmol,2当量)分批添加到3,4-二溴-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(2.00g，6.01mmol)在甲醇(30mL)和乙酸(15mL)的混合物中的搅拌悬浮液中。将反应物在室温下搅拌10min。将混合物用NaHCO3水溶液中和直至pH＝6。将溶液过滤，并用乙酸乙酯萃取水相。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到4-溴-3-甲基-1,3-二氢吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(1.08g,76％收率)，其为白色固体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.22(s,1H),7.95(dd,J＝5.7,0.8Hz,1H),7.18(d,J＝5.7Hz,1H),3.66–3.49(m,1H),1.43(d,J＝7.6Hz,3H)；m/z＝227.1,229.1[M+H]+。
4-溴-3-乙基-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在-78℃，在氩气流下，将1M[双(三甲基甲硅烷基)氨基]锂溶液(2.2mL,2.16mmol,2当量)逐滴添加到4-溴-3-甲基-1,3-二氢吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(350mg,1.08mmol)的无水四氢呋喃(2.7mL,0.4N)溶液中。将反应物在-78℃搅拌10min。然后添加碘乙烷(0.087mL,1.08mmol,1当量)，并将混合物在氩气流下在室温搅拌1h。然后缓慢添加1N HCl水溶液至pH 6-7，随后加入乙酸乙酯。分离两相并用乙酸乙酯萃取水相。使用相分离器干燥合并的有机相并蒸发，得到粗产物，其为橙色固体。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。将其通过固相转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到4-溴-3-乙基-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(155mg,56％收率)，其为米色粉末。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.30(s,1H),7.96(d,J＝5.7Hz,1H),7.21(d,J＝5.7Hz,1H),2.21–2.05(m,1H),1.77(dq,J＝14.7,7.4Hz,1H),1.38(s,3H),0.50(t,J＝7.4Hz,3H)、m/z＝255.1,257.1[M+H]+。
在SFC条件下通过外消旋混合物的手性分离获得两种对映体。
仪器：Novasep SFC Superprep
固定相：Chiralpak AD-H 20μm,300×50mm
流动相：CO2/MeOH 73/27
流速：1000g/min UV检测:λ＝295nm
温度：45℃
压力：130巴
样品：溶解于MeOH
rt(MeEt异构体1)＝4.74min和rt(MeEt异构体2)＝7.06min
S-异构体被任意指定为MeEt异构体1，并且R-异构体被任意指定为MeEt异构体2。相同的命名法已用于描述所有相关的衍生物。
对于外消旋混合物和纯对映体，后续步骤相同。用外消旋混合物描述硼酸酯的合成。
4-溴-3-乙基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在50mL小瓶中添加4-溴-3-乙基-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(2.14g,6.79mmol)、3,4-二氢-2H-吡喃(1.9mL,20.4mmol,3当量)和对甲苯磺酸水合物(271mg,1.43mmol,0.2当量)在无水甲苯(34mL,0.2N)中的溶液。将反应混合物在80℃搅拌过夜。使反应混合物达到室温。然后添加水并将反应混合物用EtOAc萃取。使用相分离器干燥合并的有机层并在真空下浓缩，得到粗产物，其为橙色固体。通过快速色谱法在硅胶上使用环己烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。将其在dicalite上通过固相转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到4-溴-3-乙基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(1.45g,62.951％收率)，其为黄色油状物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.08(d,J＝5.6Hz,1H),7.33(d,J＝5.7Hz,1H),5.42(dd,J＝11.4,1.8Hz,1H),3.97(d,J＝10.9Hz,1H),3.54(tt,J＝11.2,2.9Hz,1H),2.86(pd,J＝13.1,3.9Hz,1H),2.18(ddh,J＝15.0,7.5,3.5Hz,1H),1.93(d,J＝10.8Hz,1H),1.81(dqd,J＝14.7,7.3,1.7Hz,1H),1.69–1.45(m,4H),1.40(d,J＝0.8Hz,3H),0.45(t,J＝7.4Hz,3H).m/z＝338.9,340.8[M+H]+。
3-乙基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷- 2-基)吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在20mL微波小瓶中，加入双(频哪醇合)二硼(2.19g,8.61mmol,2当量)、乙酸钾(1.33g,12.9mmol,3当量)、4-溴-3-乙基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(1460mg,4.30mmol)和[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(352mg,0.430mmol,0.1当量)的无水二噁烷(43mL,0.1N)溶液。将混合物用氮气脱气，然后在100℃下搅拌2h。使反应混合物达到室温并通过dicalite垫过滤。用EtOAc洗涤dicalite。将合并的有机相在真空下浓缩，得到粗物质，其为棕色油状物。通过快速色谱法在硅胶上使用环己烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。将其在dicalite上通过固相转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到3-乙基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(1.08g,52％收率)，其为淡黄色油状物。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.19(d,J＝5.2Hz,1H),7.25(d,J＝5.1Hz,1H),5.43(dd,J＝11.4,2.0Hz,1H),3.96(d,J＝11.1Hz,1H),3.64–3.49(m,1H),3.01–2.79(m,1H),2.33–2.16(m,1H),1.93(d,J＝11.0Hz,1H),1.87–1.73(m,2H),1.71–1.43(m,6H),1.34(s,12H),0.38(t,J＝7.4Hz,3H)；m/z＝387.0[M+H]+。
Me/OH骨架合成
4-溴-3-羟基-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(OHMe)的合成
在N2条件下，向圆底烧瓶中添加氢化钠(60％,203mg,5.09mmol,1.1当量)的THF(10mL)溶液。将混合物冷却至0℃，并逐滴添加4-溴-3-甲基-1,3-二氢吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(1.05g,4.62mmol)的THF(13mL)溶液。然后将反应物敞口并在室温下暴露在空气中过夜。然后添加1N HCl水溶液。用乙酸乙酯萃取水相。将合并的有机相经相分离器干燥并蒸发，得到粗产物。将所述产物在DCM中研磨，得到4-溴-3-羟基-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(697mg,62％收率)，其为浅黄色固体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.11(s,1H),7.95(d,J＝5.7Hz,1H),7.18(d,J＝5.7Hz,1H),6.11(s,1H),1.50(s,3H)；m/z＝243.1,245.1[M+H]+。
在SFC条件下通过外消旋混合物的手性分离获得两种对映体。
仪器：Waters prep SFC Supersep
固定相：Chiralpak AD-H 20μm,250×50mm
流动相：CO2/MeOH 87/13
流速：1000g/min UV检测:λ＝290nm
温度：40℃
压力：150巴
样品：溶解于MeOH
rt(OHMe异构体1)＝6.05min和rt(OHMe异构体2)＝8.34min
S-异构体被任意指定为OHMe异构体1，并且R-异构体被任意指定为OHMe异构体2。相同的命名法已用于描述所有相关的衍生物。
对于外消旋混合物和纯对映体，后续步骤相同。将从OHMe异构体1开始描述硼酸酯的合成。
(3R)-4-溴-3-羟基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在密封小瓶中，将3,4-二氢-2H-吡喃(3.0mL,32.9mmol,4当量)添加至搅拌的(3R)-4-溴-3-羟基-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(2.00g,8.23mmol)和对甲苯磺酸水合物(313mg,1.65mmol,0.2当量)在无水甲苯(27mL,0.3N)中的溶液中。将反应物在90℃搅拌过夜。然后将混合物冷却至0℃并添加4M氯化氢(4.1mL,16.5mmol,2当量)。将所述混合物在室温下搅拌2h。将溶液在真空下浓缩。添加二氯甲烷和NaHCO3水溶液。用二氯甲烷萃取水相。将有机相在相分离器上干燥并在真空下浓缩。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并蒸发，得到(3R)-4-溴-3-羟基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(1.02g,36％收率)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.07(dd,J＝5.6,1.2Hz,1H),7.31(dd,J＝5.7,0.8Hz,1H),6.28(d,J＝6.8Hz,1H),5.37(dd,J＝11.3,1.9Hz,1H),4.02–3.90(m,1H),3.54(td,J＝11.0,10.6,3.2Hz,1H),2.90–2.73(m,1H),1.93(d,J＝10.0Hz,1H),1.69–1.44(m,7H)；m/z＝327.0,328.9[M+H]+。
(3R)-3-羟基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环 戊烷-2-基)吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
向小瓶中添加双(频哪醇合)二硼(640mg,2.52mmol,1.5当量)、乙酸钾(521mg,5.04mmol,3当量)、(3R)-4-溴-3-羟基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(0.55g,1.68mmol)和[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(140mg,0.168mmol,0.1当量)的无水二噁烷(5.6mL,0.3N)溶液。将小瓶密封并用氮气脱气。将反应混合物在100℃搅拌2h。将反应混合物通过dicalite垫过滤，并将滤液蒸发至干，得到粗产物，其为黑色油状物。通过快速色谱法在硅胶上使用二氯甲烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。将其在dicalite上通过固相转移。收集馏分并在真空下浓缩，得到(3R)-3-羟基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(211mg,28％收率)，其为黄色胶状物。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.18(d,J＝5.0Hz,1H),7.14(d,J＝5.1Hz,1H),5.92(d,J＝6.4Hz,1H),5.38(d,J＝9.9Hz,1H),3.96(d,J＝11.0Hz,1H),3.59–3.49(m,1H),2.86(q,J＝13.4,12.5Hz,1H),1.92(s,1H),1.70–1.41(m,7H),1.33(d,J＝7.0Hz,12H)、m/z＝293.2[M+H]+。
Me/OMe骨架合成
(3R)-4-溴-3-甲氧基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合 成
在50mL圆底烧瓶中，在0℃、氮气下，将氢化钠(60％,378mg,9.44mmol,1.5当量)添加到搅拌的(3R)-4-溴-3-羟基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(2.06g,6.30mmol)的无水DMF(32mL,0.2N)溶液中。将反应物在室温下搅拌30min。然后在0℃下逐滴添加含2M碘甲烷的叔丁基甲基醚(6.3mL,12.6mmol,2当量)。将反应物在0℃搅拌15min并使其达到室温。在室温下45min后，用水淬灭反应并添加EtOAc。分离两相并用EtOAc萃取水相。将合并的有机相用水洗涤，使用相分离器干燥并蒸发，得到(3R)-4-溴-3-甲氧基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮，其为橙色胶状物(1.49g,63％收率)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.16(d,J＝5.6Hz,1H),7.40(dd,J＝5.6,0.8Hz,1H),5.42(dt,J＝11.4,2.6Hz,1H),4.00–3.93(m,1H),3.61–3.49(m,1H),2.91(s,3H),2.87–2.75(m,1H),1.94(d,J＝10.9Hz,1H),1.70–1.41(m,7H)、m/z＝341.1,343.1[M+H]+。
(3R)-3-甲氧基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂 环戊烷-2-基)吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在氮气气氛下，向反应小瓶中添加三环己基膦(459μL,0.290mmol,0.075当量)、双(频哪醇合)二硼(1.96g,7.73mmol,4当量)、(3R)-4-溴-3-甲氧基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(1.45g,3.87mmol)和无水二噁烷(19mL,0.2N)。然后添加乙酸钾(767mg,7.73mmol,4当量)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(186mg,0.193mmol,0.05当量)。将反应物在100℃搅拌2h。蒸发溶剂。然后添加水和二氯甲烷。分离两相并用二氯甲烷萃取水相。使用相分离器干燥合并的有机相并蒸发，得到粗产物，其为橙色胶状物。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。将其通过固相转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到(3R)-3-甲氧基-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(665mg,43％收率)，其为橙色胶状物。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.26(d,J＝5.1Hz,1H),7.22(dd,J＝5.1,1.7Hz,1H),5.42(ddd,J＝11.4,5.4,2.1Hz,1H),4.01–3.94(m,1H),3.62–3.48(m,1H),2.89–2.76(m,4H),1.94(d,J＝11.4Hz,1H),1.73–1.46(m,7H),1.33(d,J＝2.6Hz,12H)、m/z＝307.2[M+H]+(酸形式)。
Et/OH骨架合成
3-溴-4-氯-3-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
向搅拌的4-氯-3-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶盐酸盐(3.00g,13.8mmol)的叔丁醇(106mL,0.13N)溶液中分小份添加三溴化吡啶鎓(11.05g,34.5mmol)。将反应物在室温下搅拌3h。在真空下除去叔丁醇。将产物在水中研磨并过滤，得到3-溴-4-氯-3-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(2.95g,77％收率)，其为米色固体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.89(s,1H),8.18(d,J＝5.7Hz,1H),7.21(d,J＝5.7Hz,1H),2.84–2.56(m,1H),2.47–2.23(m,1H),0.62(t,J＝7.4Hz,3H)。
4-氯-3-乙基-1,3-二氢吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在室温下，向搅拌的3-溴-4-氯-3-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(2.95g,10.7mmol)在THF(33mL,0.3N)中的悬浮液中添加锌(1.05g,16.1mmol)，并且随后滴加水(0.58mL,32.1mmol)。所述混合物在室温下搅拌2h。然后将溶液在Dicalite下过滤以除去所有锌残留物。将滤液在真空下浓缩，得到4-氯-3-乙基-1,3-二氢吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(2.1g,98％收率)，其为黄色固体；m/z＝197.1,199.1[M+H]+。
4-氯-3-乙基-3-羟基-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-2-酮的合成
将10N氢氧化钠水溶液(2.7mL,26.7mmol)添加至4-氯-3-乙基-1,3-二氢吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(2.10g,10.7mmol)在乙醇(49mL,0.2N)中的溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物在真空下浓缩，加入NH4Cl水溶液和MeTHF的混合物。分离各相，将有机相干燥并在真空下浓缩，得到4-氯-3-乙基-3-羟基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(2.2g,94％收率)，其为黄色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.07(d,J＝5.7Hz,1H),7.06(d,J＝5.7Hz,1H),6.19(s,1H),2.13(tt,J＝14.3,7.8Hz,1H),2.03–1.87(m,1H),0.55(t,J＝7.5Hz,3H)；m/z＝213.1,215.1[M+H]+。
在SFC条件下通过外消旋混合物的手性分离获得两种对映体：
仪器：Waters prep SFC200
固定相：Chiralpak IC 5μm,250×30mm
流动相：CO2/MeOH 80/20
流速：100mL/min UV检测:λ＝210nm
温度：40℃
压力：100巴
样品：溶解于MeOH
rt(OHEt异构体1)＝4.82min和rt(OHEt异构体2)＝6.74min
S-异构体被任意指定为OHEt异构体1，并且R-异构体被任意指定为OHEt异构体2。相同的命名法已用于描述所有相关的衍生物。
Et/OMe骨架的合成
4-氯-3-乙基-3-羟基-1-四氢吡喃-2-基吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在密封小瓶中，将3,4-二氢-2H-吡喃(0.79mL，8.67mmol，4当量)添加至搅拌的4-氯-3-乙基-3-羟基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(614mg，2.89mmol)和对甲苯磺酸水合物(110mg，0.578mmol)在无水甲苯(12Ml,0.2N)中的溶液中。将反应物在90℃搅拌过夜。然后将混合物冷却至0℃并添加4M氯化氢(1.4mL，5.78mmol，2当量)。将混合物在室温下搅拌3h。将溶液在真空下浓缩。添加乙酸乙酯和NaHCO3水溶液。水相用乙酸乙酯萃取。在相分离器上干燥有机相，并在真空下浓缩。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并蒸发，得到4-氯-3-乙基-3-羟基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(446mg，52％收率)，其为黄色油状物。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.19(d,J＝5.7Hz,1H),7.18(d,J＝5.7Hz,1H),6.34(d,J＝4.5Hz,1H),5.39(d,J＝11.3Hz,1H),3.97(d,J＝10.5Hz,1H),3.55(t,J＝11.2Hz,1H),2.92–2.73(m,1H),2.17(dtd,J＝15.4,7.7,3.5Hz,1H),1.99–1.88(m,2H),1.64–1.44(m,4H),0.50(t,J＝7.6Hz,3H)；m/z＝297.1,299.1[M+H]+。
4-氯-3-乙基-3-甲氧基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在N2下，于0℃向4-氯-3-乙基-3-羟基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(220mg，0.741mmol)在无水DMF(3.7mL，0.2N)中的溶液中添加氢化钠(60％，44mg，1.11mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌20min，然后在0℃下滴加碘甲烷(0.092mL，1.48mmol)，将混合物在0℃下搅拌5min并使其达到室温。将所得混合物在N2下室温搅拌30min。将混合物用水淬灭，并用EtOAc萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，在相分离器上干燥，并在真空下浓缩，得到4-氯-3-乙基-3-甲氧基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(213mg,90％收率)，其为黄色油状物。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.29(d,J＝5.7Hz,1H),7.29(dd,J＝5.7,1.2Hz,1H),5.43(d,J＝11.3Hz,1H),3.98(d,J＝11.0Hz,1H),3.55(t,J＝11.1Hz,1H),3.28(d,J＝4.8Hz,1H),2.95(d,J＝1.2Hz,3H),2.81(d,J＝11.4Hz,1H),2.18(ddd,J＝13.2,7.7,2.4Hz,1H),1.98(dd,J＝13.3,7.5Hz,1H),1.57(d,J＝45.7Hz,4H),0.55(t,J＝7.5Hz,3H),m/z＝311.2-313.2[M+H]+。
骨架Me/NMe
4-溴-3-甲基-3-(甲基氨基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在反应小瓶中，在-30℃下将甲胺在THF中的溶液(6.0mL，8.04mmol，1.34N)(在-30℃下冷却)添加至3,4-二溴-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(500mg，1.63mmol)中。使混合物达到0℃并在0℃下搅拌7h，将溶液浓缩至干，得到黄色胶状物。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。将其在24g Redisep柱上、于DCM中通过液体注射转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到4-溴-3-甲基-3-(甲基氨基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮，其为白色固体(179mg，43％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.23(s,1H),7.96(d,J＝5.7Hz,1H),7.20(d,J＝5.7Hz,1H),1.90(s,3H),1.41(s,3H)；m/z＝256.0,258.0[M+H]+。
其他骨架
7-溴-1,3-二氢咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮的合成
将4-溴吡啶-2,3-二胺(5.00g,25.3mmol)和1,1'-羰基二咪唑(8.19g,50.5mmol)添加至密封的小瓶中。加入THF(140mL)，并将混合物在60℃下搅拌过夜。将烧瓶用冰浴冷却5min。将沉淀物通过玻璃料(glass-frit)过滤并用冷THF洗涤一次，然后用水洗涤。将固体在真空下干燥。得到7-溴-1,3-二氢咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮，其为棕色粉末(5.14g,94％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.60(s,1H),11.39(s,1H),7.74(d,J＝5.7Hz,1H),7.17(d,J＝5.7Hz,1H)；m/z＝214.0,216.0[M+H]+。
7-溴-3-四氢吡喃-2-基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮的合成
向7-溴-1,3-二氢咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮(500mg,2.34mmol)在无水THF(17.5mL,0.1N)中的溶液中添加3,4-二氢-2H-吡喃(0.64mL,7.01mmol,3当量)和对甲苯磺酸水合物(89mg,0.467mmol,0.2当量)。将混合物在75℃搅拌过夜。添加3,4-二氢-2H-吡喃(0.64mL,7.01mmol,3当量)并将反应混合物在75℃搅拌3h。使反应达到室温，并用水淬灭。添加EtOAc并分离两层。水层用EtOAc萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩，得到粗产物，其为棕色油状物。通过快速色谱法使用环己烷/EtOAc梯度纯化所述粗混合物。将其在dicalite上通过固体沉积进行转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到7-溴-3-四氢吡喃-2-基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮(452mg,65％收率)，其为黄色固体。1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.77(s,1H),7.84(d,J＝5.6Hz,1H),7.28(d,J＝5.7Hz,1H),5.41(dd,J＝11.3,2.2Hz,1H),4.02–3.92(m,1H),3.58(td,J＝11.3,3.4Hz,1H),2.94(qd,J＝12.6,4.1Hz,1H),1.99–1.90(m,1H),1.76–1.45(m,4H)；m/z＝298.0；300.0[M+H]+。
3-四氢吡喃-2-基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-咪唑 并[4,5-b]吡啶-2-酮的合成
向7-溴-3-四氢吡喃-2-基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮(300mg,1.01mmol)在无水二噁烷(10mL,0.1N)中的溶液中添加乙酸钾(420mg,4.02mmol,4当量)和双(频哪醇合)二硼(767mg,3.02mmol,3当量)。将混合物用N2脱气并添加[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)(78mg,0.101mmol,0.1当量)。将所得混合物在N2下于95℃搅拌2h。将所述混合物在dicalite上过滤并浓缩，得到3-四氢吡喃-2-基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮(1.1g,57％收率)，其为黑色油状物。所述粗产物无需进一步纯化即可用于下一步。m/z＝264.1[M+H]+(硼酸)。
7-溴-1-甲基-3-四氢吡喃-2-基-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮的合成
在0℃下向7-溴-3-四氢吡喃-2-基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮(502mg,1.63mmol)在无水DMF(8.3mL,0.1N)中的溶液中添加氢化钠(78mg,1.95mmol,1.2当量,60％)。将混合物搅拌15min并在相同温度下添加碘甲烷(125μL,2.01mmol,1.2当量)。将反应混合物搅拌1h。添加水，并将所得的沉淀物过滤并用水洗涤。将固体在40℃下真空干燥，得到7-溴-1-甲基-3-四氢吡喃-2-基-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮(0.40g,77％收率)，其为粉红色固体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)7.86(d,J＝5.6Hz,1H),7.32(d,J＝5.6Hz,1H),5.49(dd,J＝11.3,2.2Hz,1H),3.97(dd,J＝11.2,2.0Hz,1H),3.59(s,4H),2.92(qd,J＝13.5,13.0,4.4Hz,1H),2.03–1.89(m,1H),1.79–1.41(m,4H)；m/z＝312.1,314.1[M+H]+。
7-溴-3H-噁唑并[4,5-b]吡啶-2-酮的合成
将2-氨基-4-溴吡啶-3-醇(200mg,1.01mmol)和1,1'-羰基二咪唑(0.33g,2.01mmol,2当量)添加至密封的小瓶中。添加THF(6mL,0.2N)并将混合物在60℃搅拌过夜。将溶液在真空下蒸发并将粗产物在DCM中研磨。将所得固体过滤并在真空下干燥，得到7-溴-3H噁唑并[4,5-b]吡啶-2-酮，其为棕色粉末(140mg,32％收率)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)7.85(d,J＝5.8Hz,1H),7.25(d,J＝5.8Hz,1H)。
4-溴螺[1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3,1'-环戊烷]-2-酮的合成
将4-溴-1,3-二氢-2H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(500mg，2.35mmol)在无水THF(7.8mL，0.3N)中的溶液冷却至-78℃，并添加1M[双(三甲基甲硅烷基)氨基]锂溶液(8.2mL，8.21mmol，3.5当量)。搅拌30分钟后，逐滴添加1,4-二碘丁烷(371μL，2.82mmol，1.2当量)。使反应混合物加热至室温并搅拌过夜。用饱和NH4Cl水溶液淬灭反应，并用EtOAc萃取。使用相分离器干燥有机相，并蒸发得到油状的粗产物。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。将其在二氧化硅上通过固相转移。收集相关的馏分并浓缩，得到4-溴螺[1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3,1'-环戊烷]-2-酮(258mg，41％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.12(s,1H),7.91(d,J＝5.7Hz,1H),7.19(d,J＝5.7Hz,1H),2.15(dd,J＝8.1,5.5Hz,2H),2.08–1.82(m,6H)；m/z＝267.1,269.1[M+H]+。
4'-溴-1'-四氢吡喃-2-基-螺[环戊烷-1,3'-吡咯并[2,3-b]吡啶]-2'-酮的合成
将3,4-二氢-2H-吡喃(0.26mL，2.90mmol，3当量)添加至搅拌的4-溴螺[1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3,1'-环戊烷]-2-酮(258mg，0.966mmol)和对甲苯磺酸水合物(37mg，0.193mmol，0.2当量)在无水甲苯(4.8mL，0.2N)中的溶液中。将反应物在90℃下搅拌过夜。在真空下除去溶剂。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到4'-溴-1'-四氢吡喃-2-基-螺[环戊烷-1,3'-吡咯并[2,3-b]吡啶]-2'-酮(238mg,70％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝5.6Hz,1H),7.32(d,J＝5.7Hz,1H),5.37(dd,J＝11.3,2.1Hz,1H),3.96(d,J＝11.3Hz,1H),3.53(td,J＝11.2,4.0Hz,1H),2.95–2.76(m,1H),2.17(dd,J＝13.2,5.9Hz,2H),2.04–1.87(m,7H),1.69–1.50(m,4H)；m/z＝351.2-353.2[M+H]+。
1'-四氢吡喃-2-基-4'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)螺[环戊 烷-1,3'-吡咯并[2,3-b]吡啶]-2'-酮的合成
向小瓶中添加双(频哪醇合)二硼(258mg,1.02mmol,1.5当量)、乙酸钾(210mg,2.03mmol,3当量)、4'-溴-1'-四氢吡喃-2-基-螺[环戊烷-1,3'-吡咯并[2,3-b]吡啶]-2'-酮(238mg,0.68mmol)和[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(57mg,0.068mmol,0.1当量)的无水二噁烷(2.2mL,0.3N)溶液。将小瓶密封并用氮气脱气。将反应混合物在100℃下搅拌过夜。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并将滤液蒸发至干，得到粗产物，其为黑色油状物。通过快速色谱法在硅胶上使用二氯甲烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。将其在dicalite上通过固相转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到1'-四氢吡喃-2-基-4'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)螺[环戊烷-1,3'-吡咯并[2,3-b]吡啶]-2'-酮(190mg,35％收率)。1H NMR(三氯甲烷-d,400MHz):δ(ppm)8.16(d,J＝5.2Hz,1H),7.28(d,J＝5.1Hz,1H),5.52(dd,J＝11.3,2.2Hz,1H),4.21–4.10(m,1H),3.69(td,J＝11.9,2.2Hz,1H),3.00(qd,J＝13.1,12.6,4.1Hz,1H),2.29–1.95(m,9H),1.85–1.60(m,4H),1.35(s,12H)；m/z＝399.4[M+H]+。
4-溴-5-氯-3,3-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在50mL圆底烧瓶中，在室温下，将N-氯代丁二酰亚胺(133mg,0.996mmol,1.6当量)添加到搅拌的4-溴-3,3-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(150mg,0.622mmol)和乙酸钠(26mg,0.311mmol,0.5当量)在乙酸(0.8mL,0.8N)中的混悬液中。将混合物在60℃下加热2h。添加N-氯代丁二酰亚胺(133mg,0.996mmol,1.6当量)并将溶液在80℃搅拌过夜。将反应混合物用水稀释并用1M Na2S2O3水溶液淬灭。将获得的固体通过玻璃料过滤，得到4-溴-5-氯-3,3-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(143mg,82％收率)，其为黄色粉末。所述产物无需进一步纯化即可用于下一步。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.41(s,1H),8.27(s,1H),1.41(s,6H)；m/z＝275.0,277.0[M+H]+。
4-氯-5-氟-3,3-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在圆底烧瓶中，在0℃下，将1M[双(三甲基甲硅烷基)氨基]锂溶液(38mL,37.7mmol,3.7当量)逐滴添加到搅拌的4-氯-5-氟-1H,2H,3H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(2.00g,10.2mmol)在无水2-甲基四氢呋喃(26mL,0.4N)中的溶液中。将混合物在0℃下搅拌10min。然后在0℃下逐滴添加碘甲烷(1.6mL,25.5mmol,2.5当量)并在该温度下搅拌混合物3h。缓慢添加饱和NH4Cl水溶液。添加水并用EtOAc萃取混合物。将合并的有机层用水、盐水洗涤，经相分离器干燥并浓缩，得到绿色固体。将粗产物在二异丙醚/Et2O(50/50)的混合物中研磨并过滤，得到4-氯-5-氟-3,3-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(1.8g,78％收率)，其为绿色固体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.32(s,1H),8.24(d,J＝2.2Hz,1H),1.41(s,6H).m/z＝215.2,217.2[M+H]+。
4-氯-5-氟-3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
向20mL小瓶中依次添加4-氯-5-氟-3,3-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(830mg,3.87mmol)、无水甲苯(13mL,0.3N)、对甲苯磺酸水合物(147mg,0.773mmol,0.2当量)和3,4-二氢-2H-吡喃(1.1mL,11.6mmol,3当量)。将反应混合物在90℃搅拌过夜。然后添加3,4-二氢-2H-吡喃(0.5mL)，并将反应混合物在90℃下再搅拌过夜。蒸发溶剂，得到粗产物，其为棕色油状物。通过快速柱色谱法在硅胶上使用庚烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。将其通过固相转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到4-氯-5-氟-3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(785mg,67％收率)，其为橙色胶状物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.37(d,J＝2.0Hz,1H),5.38(dd,J＝11.3,2.1Hz,1H),3.97(d,J＝10.7Hz,1H),3.55(td,J＝11.3,4.0Hz,1H),2.82(qd,J＝13.7,12.9,4.1Hz,1H),1.97–1.88(m,1H),1.69–1.48(m,4H),1.44(s,6H),m/z＝299.2,301.2[M+H]+。
5-氟-3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊 烷-2-基)吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在氮气气氛下，向反应小瓶中加入三环己基膦(284μL,0.180mmol,0.075当量)、双(频哪醇合)二硼(1.22g,4.79mmol,2当量)、4-氯-5-氟-3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(715mg,2.39mmol)和无水二噁烷(12mL,0.2N)。然后添加乙酸钾(475mg,4.79mmol,2当量)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(115mg,0.120mmol,0.05当量)。将反应物在100℃下搅拌过夜。将混合物在dicalite上过滤并浓缩，得到粗产物，其为黑色油状物。通过快速柱色谱法在硅胶上使用庚烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。得到5-氟-3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(670mg,22％收率)，其为黄色固体(产物和脱溴酮的混合物)。m/z＝391.4[M+H]+。
5-氟-3-甲基-1,3-二氢吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮盐酸盐的合成
将4M氯化氢的二噁烷溶液(1.0mL,4.00mmol,5当量)添加至5-氟-3-甲基-2-氧代-3H-吡咯并[2,3-b]吡啶-1-甲酸叔丁酯(210mg,0.752mmol)的无水二噁烷(2mL,0.3N)溶液中。将小瓶密封并将反应物在60℃搅拌1h。将溶液浓缩至干，得到5-氟-3-甲基-1,3-二氢吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮盐酸盐(139mg,84％收率)，其为白色固体。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.01(br s,1H),8.03(t,J＝1.83Hz,1H),7.69(dd,J＝2.20,8.31Hz,1H),3.54-3.61(m,1H),1.35(d,J＝7.58Hz,3H)；m/z＝167.1[M+H]+。
3-乙基-5-氟-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
在2-5mL小瓶中，在0℃下，将1M[双(三甲基甲硅烷基)氨基]锂溶液(1.7mL,1.71mmol,3.8当量)通过注射器逐滴添加到搅拌的5-氟-3-甲基-1,3-二氢吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮盐酸盐(98mg,0.445mmol)在无水2-甲基四氢呋喃(1.5mL,0.3N)中的悬浮液中。将反应混合物在0℃搅拌10min。在0℃下滴加碘乙烷(0.065mL,0.813mmol,1.8当量)，并将反应物在室温下搅拌过周末。添加水并用HCl水溶液将混合物酸化至pH＝5。添加EtOAc。分离两相并用EtOAc萃取水相。将合并的有机相用盐水洗涤，使用相分离器干燥并蒸发，得到3-乙基-5-氟-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(104mg,90％收率)，其为橙色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),8.05(dd,J＝2.7,1.9Hz,1H),7.75(dd,J＝8.3,2.8Hz,1H),1.86–1.69(m,2H),1.28(s,3H),0.57(t,J＝7.4Hz,3H).m/z＝195.2[M+H]+。
3-乙基-5-氟-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮的合成
向2-5mL小瓶中添加3-乙基-5-氟-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(126mg,0.519mmol)、3,4-二氢-2H-吡喃(0.14mL,1.56mmol,3当量)和对甲苯磺酸水合物(20mg,0.104mmol,0.2N)在无水甲苯(1.7mL,0.3N)中的溶液。将所得混合物在95℃下搅拌过夜并浓缩至干。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物，得到3-乙基-5-氟-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(80mg,51％收率)。1H NMR(DMSO-d6,600MHz):δ(ppm)8.17-8.18(m,1H),7.85(dd,J＝8.2,2.8Hz,1H),5.36(d,J＝10.4Hz,1H),3.95(dt,J＝11.4,2.0Hz,1H),3.53(tt,J＝11.4,2.8Hz,1H),2.79-2.94(m,1H),1.89-1.95(m,1H),1.74-1.86(m,2H),1.53-1.65(m,2H),1.45-1.55(m,2H),1.29(s,3H),0.51(td,J＝7.4,3.4Hz,3H)；m/z＝279.2[M+H]+。
5-乙基-3-氟-5-甲基-7-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环 戊烷-2-基)-7H-环戊二烯并[b]吡啶-6-酮的合成
在N2下于-60℃在密封的2-5mL小瓶中，将1M二异丙基氨基锂溶液(0.60mL,0.600mmol,2.3当量)逐滴添加到搅拌的3-乙基-5-氟-3-甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(78mg,0.256mmol)在无水THF(2mL,0.1N)中的溶液中。将反应物在-60℃搅拌30min。在-60℃逐滴添加硼酸三异丙酯(0.15mL,0.650mmol,2.5当量)。将反应物在-60℃下搅拌30min，并将混合物加热至室温4h。然后向所述混合物中添加2,3-二甲基丁烷-2,3-二醇(0.60mL,0.512mmol,2当量)，10分钟搅拌后，添加乙酸(0.015mL,0.269mmol,1.05当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物通过Dicalite过滤。在N2气流下部分蒸发溶剂并用5％NaOH水溶液萃取溶液。收集所得水层并在0℃下通过滴加3N HCl酸化至pH＝6，然后用EtOAc萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，使用相分离器干燥并蒸发，得到5-乙基-3-氟-5-甲基-7-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-7H-环戊二烯并[b]吡啶-6-酮(50mg,26％收率)，其为棕色胶状物。m/z＝323.2[M+H]+(酸形式)(不纯)。
骨架偶联-一般程序(吲哚)
1.光延反应(Mitsunobu reaction)
向搅拌的吲哚I(1.66mmol)在无水甲苯(8mL，0.2N)中的混合物中添加氰基亚甲基三丁基正膦(3.31mmol，2当量)和醇I'(2.48mmol，1.5当量)。将反应在80℃下搅拌过夜。加入氰基亚甲基三正丁基膦(3.31mmol，2当量)和醇I'(2.48mmol，1.5当量)，并将混合物在80℃下再搅拌4h。将反应混合物浓缩至干，通过快速色谱柱使用EtOAc/环己烷梯度洗脱纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到预期产物II。
实施例：4-吲哚-1-基哌啶-1-甲酸叔丁酯(n＝1，G＝CMe2)的合成
白色油状物，收率82％，1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)7.60–7.52(m,2H),7.50(d,J＝3.2Hz,1H),7.13(t,J＝7.8Hz,1H),7.02(t,J＝7.4Hz,1H),6.45(d,J＝3.2Hz,1H),4.58(ddt,J＝11.7,7.7,3.8Hz,1H),4.13(d,J＝12.2Hz,2H),2.98(s,2H),1.94(d,J＝10.4Hz,2H),1.83(qd,J＝12.3,4.3Hz,2H),1.44(s,9H)；m/z＝245.3[M+H-tBu]+。
2.溴化
将N-溴琥珀酰亚胺(1.45mmol，1.05当量)添加至取代吲哚II(1.38mmol)在无水DMF(13.8mL，0.1N)中的溶液中。将所得混合物在N2下于室温搅拌6h。添加N-溴琥珀酰亚胺(1当量)，并将反应混合物在N2下室温搅拌过夜。添加水，并将混合物用EtOAc萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，在相分离器上干燥并在真空下浓缩。将粗产物在硅胶柱上使用庚烷/EtOAc梯度纯化。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到溴化产物III。
实施例：4-(3-溴吲哚-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(n＝1，G＝CMe2)的合成
白色油状物，收率83％，1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)7.77(s,1H),7.65(d,J＝8.3Hz,1H),7.42(d,J＝7.9Hz,1H),7.28–7.20(m,1H),7.16(t,J＝7.4Hz,1H),4.75–4.51(m,1H),4.26–3.91(m,2H),2.96(s,2H),2.07–1.73(m,4H),1.44(s,9H)；m/z＝323.1,325.1[M+H-tBu]+。
3.硼酸的形成
在-78℃下向溴代吲哚III(0.854mmol)在无水THF(4.3mL，0.2N)中的溶液中逐滴添加1.2M丁基锂溶液(1.1mL，1.28mmol，1.5当量)，在N2下于-78℃搅拌所得混合物20min。然后加入硼酸三异丙酯(0.59mL，2.56mmol，3当量)，并将溶液搅拌4h 30min，同时使温度升至室温。添加水/MeOH(1:1.3mL)的混合物以淬灭反应。添加水，并将混合物用乙醚萃取。将有机相用盐水洗涤，在相分离器上干燥并浓缩，得到预期的硼酸IV。
实施例：[1-(1-叔丁氧基羰基-4-哌啶基)吲哚-3-基]硼酸(n＝1，G＝CMe2)绿色固体的合成，收率51％，m/z＝245.3[M+H-Boc]+
4.铃木(Suzuki)偶联
向反应小瓶中添加硼酸IV(0.218mmol，1.05当量)、溴骨架II'(0.207mmol)、碳酸二钠(0.622mmol，3当量)在DMF(1.5mL)和水(0.5mL)的混合物。将混合物脱气，添加四三苯基膦钯(0.0207mmol，0.1当量)。将所得混合物在N2下于90℃搅拌过夜。将混合物在dicalite上过滤并在真空下蒸发。粗产物在硅胶柱上使用庚烷/EtOAc梯度纯化。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到铃木偶联产物V。
实施例：合成4-[3-(3,3-二甲基-2-氧代-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吲哚-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(n＝1，G＝CMe2)
米色固体；收率20％；m/z＝461.4[M+H]+
5.脱保护
将4M氯化氢的二噁烷溶液(0.16mmol，4当量)添加至铃木偶联化合物V(0.041mmol)在无水甲醇(0.2mL，0.2当量)中的溶液中。将反应物在室温下搅拌过夜。将二异丙醚添加至混合物中，并过滤沉淀物以得到胶状物。将沉淀物在MeOH中稀释，并将溶液在真空下浓缩，得到终化合物，其为盐酸盐。
实施例7：3,3-二甲基-4-[1-(4-哌啶基)吲哚-3-基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮二盐酸盐(n＝1，G＝CMe2)的合成
橙色固体；收率95％，1H NMR(DMSO-d 6，500MHz)：δ(ppm)11.09(s，1H)，8.55-9.02(m，2H)，8.11(d，J＝5.4Hz，1H)，7.71(d，J＝8.3Hz，1H)，7.51(s，1H)，7.35(d，J＝7.8Hz，1H)，7.26(td，J＝7.6，1.0Hz，1H)，7.10(td，J＝7.3，0.5Hz，1H)，6.92(d，J＝5.4Hz，1H)，4.85(tt，J＝11.5，4.7Hz，1H)，3.48(br d，J＝13.4Hz，3H)，3.10-3.23(m，2H)，2.17-2.29(m，4H)，1.13(s，6H)；m/z＝361.1。
骨架偶联-特定实施例
吲哚I或者从商业来源获得，或者根据以下方法通过标准技术合成。
骨架偶联-特定方法(特定吲哚1)
1.铃木偶联
向反应小瓶中连续添加溴骨架I'(1.12mmol)、3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吲哚-1-甲酸叔丁酯I(1.58mmol，1.4当量)、碳酸二钠(3.35mmol，3当量)和四三苯基膦钯(0.112mmol，0.1当量)在DMF(9mL)和水(1.9mL)的混合物。将小瓶密封，在真空下抽空并用氩气再填充。将反应在100℃下搅拌过夜。将反应混合物用EtOAc稀释，过滤，用水洗涤，用Na2SO4干燥并蒸发。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到预期的铃木偶联产物II。
实施例：4-(1H-吲哚-3-基)-3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(G＝CMe2)的合成
棕色胶；收率37％，1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.47(s,1H),8.21(d,J＝5.4Hz,1H),7.51(d,J＝2.5Hz,1H),7.48(d,J＝8.2Hz,1H),7.30(d,J＝8.0Hz,1H),7.22–7.11(m,1H),7.06–6.97(m,2H),5.48(dd,J＝11.3,2.0Hz,1H),3.99(d,J＝11.7Hz,1H),3.65–3.51(m,1H),3.08–2.87(m,1H),1.95(s,1H),1.71–1.45(m,4H),1.14(d,J＝4.1Hz,6H)；m/z＝362.1[M+H]+。
2.迈克尔加成反应(Michael reaction)
向4mL反应小瓶中连续添加环亚丁基乙腈(0.387mmol，2当量)、铃木偶联产物II(0.194mmol，1当量)的无水乙腈(0.95mL，0.2N)和DBU(0.387mmol，2当量)溶液。将反应物在85℃下搅拌过夜。然后添加1当量的环亚丁基乙腈，并将反应物搅拌2h。过滤反应混合物，并用乙腈洗涤沉淀物，得到产物III。
实施例：2-[1-[3-(3,3-二甲基-2-氧代-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吲哚-1-基]环丁基]乙腈(G＝CMe2)的合成
白色粉末；收率29％，1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.22(d,J＝5.4Hz,1H),7.46(s,1H),7.43(d,J＝8.3Hz,1H),7.33(d,J＝7.8Hz,1H),7.22(t,J＝7.7Hz,1H),7.11(t,J＝7.2Hz,1H),6.99(d,J＝5.3Hz,1H),5.52–5.41(m,1H),3.99(d,J＝10.9Hz,1H),3.58(t,J＝11.1Hz,1H),3.48(s,2H),2.95(d,J＝11.4Hz,1H),2.76(t,J＝11.2Hz,2H),2.63(t,J＝9.2Hz,2H),2.28–2.12(m,1H),1.97(d,J＝11.4Hz,2H),1.73–1.40(m,4H),1.16(d,J＝3.7Hz,6H)；m/z＝455.4[M+H]+。
3.脱保护
将4M氯化氢的二噁烷溶液(1.14mmol，20当量)添加至前述化合物III(0.057mmol)的二噁烷(0.2mL，0.3N)溶液中。将反应物在45℃下搅拌过夜。然后加入4M氯化氢的二噁烷溶液(1.14mmol，20当量)，并将混合物在50℃下再搅拌一夜。蒸发溶剂。在中性条件下通过制备HPLC纯化粗产物。合并相关的馏分并浓缩，得到预期化合物IV。
实施例21：2-[1-[3-(3,3-二甲基-2-氧代-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吲哚-1-基]环丁基]乙腈(G＝CMe2)的合成
白色粉末；收率37％，1H NMR(DMSO-d6,600MHz):δ(ppm)11.04(s,1H),8.09(d,J＝5.4Hz,1H),7.43(s,1H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),7.34(d,J＝7.9Hz,1H),7.21(td,J＝7.7,1.0Hz,1H),7.07-7.12(m,1H),6.89(d,J＝5.3Hz,1H),3.46(s,2H),2.72-2.81(m,2H),2.58-2.66(m,2H),2.13-2.26(m,1H),1.92-2.03(m,1H),1.15(s,6H)；m/z＝371.0[M+H]+。
骨架偶联-一般方法(吲唑1)
1.光延反应
在氮气气氛下，向密封小瓶中依次添加溴吲唑I(1.23mmol)、无水甲苯(4mL，0.3M)、羟基哌啶-1-甲酸酯I'(2.46mmol，2当量)和氰基亚甲基三丁基正膦(2.46mmol，2当量)。将反应物在90℃下搅拌过夜。蒸发溶剂，得到粗产物，其为棕色液体。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。将其在dicalite上通过固体形式转移。收集馏分并在真空下浓缩。得到2种非对映异构体II的混合物。将混合物用于下一步骤。
实施例：外消旋-(3R,4R)-4-(3-溴吲唑-1-基)-3-氟-哌啶-1-甲酸叔丁酯(R1＝R2＝R3＝R5＝H；R4＝F；n＝0；m＝p＝1)的合成
黄色油状物；非对映异构体，定量收率，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.81(d,J＝8.6Hz,1H),7.60(d,J＝8.2Hz,1H),7.57–7.50(m,1H),7.32–7.26(m,1H),5.09(dd,J＝18.2,9.2Hz,1H),4.90–4.68(m,1H),4.35(s,1H),4.09–4.01(m,1H),3.06(s,2H),2.07(qd,J＝10.0,3.8Hz,2H),1.45(s,9H)；m/z＝342.0,344.0[M-tBu+H]+。
2.硼酸酯的形成
在10mL反应小瓶中添加在无水二噁烷(2.5mL，0.3N)中的取代的溴吲唑II(0.753mmol)、联硼酸频那醇酯(1.13mmol，1.5当量)和双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)(0.0753mmol，0.1当量)。将混合物用N2脱气并在100℃下搅拌过夜。将混合物在dicalite上过滤并在真空下浓缩，得到粗物质，其为黑色油状物。粗产物III无需进一步纯化即可用于下一步。
实施例：外消旋-(3R,4R)-3-氟-4-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吲唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(R1＝R2＝R3＝R5＝H；R4＝F；n＝0；m＝p＝1)的合成
黑色油状物；m/z＝364.0[M+H]+(硼酸形式)。
3.铃木偶联
在10mL小瓶中添加溴骨架II'(0.332mmol)、硼酸酯III(0.602mmol，1.8当量)和碳酸二钠(0.996mmol，3当量)的DMF(3mL)和水(0.6mL)混合物。将混合物脱气，并添加四(三苯基膦)钯(0.033mmol，0.1当量)。将反应物在100℃下加热4h。添加水。将产物沉淀并过滤。然后将其溶于DCM中，并将有机相在相分离器上干燥并在真空下浓缩。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。收集馏分并在真空下浓缩，得到预期的铃木偶联化合物IV。
实施例：外消旋-(3R,4R)-4-[3-(3,3-二甲基-2-氧代-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吲唑-1-基]-3-氟-哌啶-1-甲酸叔丁酯(R1＝R2＝R3＝R5＝H；R4＝F，n＝0；m＝p＝1；G＝CMe2；L＝H)的合成。
米黄色粉末；收率63％；1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ(ppm)11.13(s,1H),8.24(d,J＝5.6Hz,1H),7.80-7.90(m,2H),7.47-7.57(m,1H),7.36(d,J＝5.4Hz,1H),7.23-7.31(m,1H),5.20-5.36(m,1H),4.71-4.98(m,1H),4.26-4.49(m,1H),4.03-4.12(m,1H),2.94-3.23(m,2H),2.03-2.27(m,2H),1.44(s,9H),1.34(d,J＝8.3Hz,6H)；m/z＝480.2[M+H]+。
4.脱保护
将4M氯化氢的二噁烷溶液(1.04mmol，5当量)添加至铃木偶联产物IV(0.21mmol)的甲醇(2mL，0.1N)溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物在真空下浓缩。将产物在乙醚中研磨并过滤。然后在40℃下真空干燥，得到最终的预期产物V，其为盐形式。
实施例36的外消旋物：3,3-二甲基-4-[1-[外消旋-(3R,4R)-3-氟-4-哌啶基]吲唑-3-基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮；二盐酸盐(R1＝R2＝R3＝R5＝H；R4＝F，n＝0；m＝p＝1；G＝CMe2)的合成
黄色粉末；收率91％，1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 11.16(s,1H)；8.97-10.01(m,2H),8.24(d,J＝5.38Hz,1H)；7.84(dd,J＝8.31,5.62Hz,2H),7.50-7.59(m,1H),7.34(d,J＝5.62Hz,1H),7.27-7.32(m,1H),5.37-5.48(m,1H),5.19-5.37(m,1H)；3.85(br s,1H)；3.46-3.54(m,1H),3.24-3.34(m,1H),3.13-3.24(m,1H),2.29-2.49(m,2H),1.36(d,J＝13.20Hz,6H)；m/z＝380.0。
骨架偶联-一般方法(吲唑2)
1.光延反应
向搅拌的溴吲唑I(1.97mmol)在无水甲苯(8mL，0.25N)中的混合物中添加氰基亚甲基三丁基正膦(5.91mmol，3当量)和羟基吡咯烷I'(3.94mmol，2当量)。将反应物在100℃下搅拌过夜。将反应混合物浓缩至干，通过快速色谱法使用EtOAc/环己烷梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到预期产物II。
实施例：(3S)-3-(3-溴吲唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(n＝0，R1＝R2＝R3＝R4＝H)的合成
无色油状物，收率44％，1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ(ppm)7.80(d,J＝8.6Hz,1H),7.59(d,J＝8.1Hz,1H),7.52(ddd,J＝8.4,7.0,1.0Hz,1H),7.20-7.33(m,1H),5.35-5.60(m,1H),3.69-3.83(m,1H),3.55(dd,J＝11.0,4.9Hz,2H),3.43(br d,J＝6.6Hz,1H),2.20-2.45(m,2H),1.32-1.50(m,9H)；m/z＝366.2-368.2[M+H]+。
2.铃木偶联
向6-20mL反应小瓶中依次添加含取代的溴吲唑II(0.41mmol)、碳酸二钠(1.23mmol，3当量)、硼酸酯II'(0.491mmol，1.2当量)的DMF(2.6mL)和水(0.7mL)的混合物。将混合物脱气，并添加四(三苯基膦)钯(0.0410mmol，0.01当量)。将反应物在100℃下搅拌过夜。将反应混合物倒入水中。过滤沉淀物。滤液用二氯甲烷溶解。在相分离器上干燥有机相并蒸发以得到粗产物。然后通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到预期产物III。
实施例：(3S)-3-[3-(3,3-二甲基-2-氧代-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吲唑-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(n＝0，R1＝R2＝R3＝R4＝H，G＝CMe2)的合成
米色泡沫；收率56％；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.35(d,J＝5.4Hz,1H),7.87(dd,J＝13.2,8.4Hz,2H),7.54(ddd,J＝8.3,6.9,0.9Hz,1H),7.43(d,J＝5.4Hz,1H),7.32–7.27(m,1H),5.62(s,1H),5.51–5.47(m,1H),4.00(d,J＝11.3Hz,1H),3.89(s,1H),3.73(d,J＝10.6Hz,1H),3.62–3.46(m,3H),2.94(d,J＝11.4Hz,1H),2.49-2.52(m,1H),2.33(s,1H),1.95(s,1H),1.71–1.49(m,4H),1.40(d,J＝5.2Hz,9H),1.37(s,3H),1.31(d,J＝3.6Hz,3H),m/z＝532.4[M+H]+。
3.脱保护
将4M氯化氢的二噁烷溶液(9.18mmol，40当量)添加至铃木偶联化合物III(0.229mmol)在无水甲醇(0.5mL，0.5N)中的溶液中。将反应物在65℃下搅拌过夜。过滤反应混合物，得到终化合物IV(60mg，62％收率)，其为盐酸盐。
实施例16：3,3-二甲基-4-[1-[(3S)-吡咯烷-3-基]吲唑-3-基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮二盐酸盐(R1＝R2＝R3＝R4＝H，G＝CMe2)的合成
白色粉末；收率62％，1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ(ppm)11.14(br s,1H),8.23(d,J＝5.4Hz,1H),7.87(d,J＝8.6Hz,1H),7.82(d,J＝8.3Hz,1H),7.53(t,J＝7.7Hz,1H),7.28(q,J＝4.8Hz,2H),5.60(s,1H),3.51-3.72(m,2H),3.37(br s,4H),2.44-2.48(m,1H),2.33(br d,J＝5.9Hz,1H),1.91(s,1H),1.36(s,3H),1.31(s,3H)；m/z＝348.0。
骨架偶联-一般方法(吲唑3)
1.迈克尔加成反应
在20mL biotage小瓶中依次添加3-溴-1H-吲唑I(2.46mmol)、反应物I'(2.46mmol)和1,8-二氮杂双环[5.4.0]和C-7-己烷(4.92mmol，2当量)的无水乙腈(12mL，0.2N)溶液。将混合物在85℃下搅拌过夜。将混合物在真空下浓缩。通过快速色谱法使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到相应的产物II。
实施例：2-[1-(3-溴吲唑-1-基)环丁基]乙腈(Y＝C-H，R1＝H，Z＝CH2)的合成
白色固体，收率83％，1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ(ppm)7.60-7.64(m,2H),7.47-7.52(m,1H),7.26-7.32(m,1H),3.38(s,2H),2.80-2.94(m,2H),2.52-2.61(m,2H),2.17(dquin,J＝11.3,9.0Hz,1H),1.95(dtt,J＝11.2,9.8,3.2Hz,1H)；m/z＝290.1-292.1[M+H]+。
2.铃木偶联
在20mL biotage小瓶中，将取代的溴吲唑II(0.59mmol，1.1当量)溶于DMF(4mL)和水(1.3mL)的混合物中，然后添加硼酸酯II'(0.53mmol)和碳酸二钠(1.60mmol，3当量)。将溶液用N2脱气，并添加四三苯基膦钯(0.053mmol，0.01当量)。将混合物在3小时内加热至75℃。将溶液冷却并添加水。将产物用EtOAc萃取几次。收集有机相，在相分离器上过滤并在真空下浓缩，得到粗产物。然后通过快速色谱法使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到预期化合物III。
实施例：2-[1-[3-(3-羟基-3-甲基-2-氧代-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吲唑-1-基]环丁基]乙腈(Y＝C-H，R1＝H，G＝COHMe，Z＝CH2)的合成
淡黄色固体；收率15％；1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.40(dd,J＝5.5,0.9Hz,1H),8.09(d,J＝8.4Hz,1H),7.72(d,J＝8.6Hz,1H),7.61(dd,J＝5.5,2.0Hz,1H),7.58–7.51(m,1H),7.40–7.34(m,1H),6.11(d,J＝5.3Hz,1H),5.47(d,J＝11.2Hz,1H),4.00(d,J＝8.7Hz,1H),3.54-3.62(m,1H),3.50(s,2H),3.28-3.31(m,1H),3.05–2.81(m,3H),2.71–2.58(m,2H),2.31–2.17(m,1H),1.94-2.06(d,J＝1.8Hz,1H),1.59(d,J＝50.3Hz,4H),1.51(d,J＝1.4Hz,3H)；m/z＝458.4[M+H]+。
3.脱保护
将4M氯化氢的二噁烷溶液(1.5mmol，20当量)添加至铃木偶联化合物III(0.075mmol)在无水甲醇(0.5mL，0.3N)中的溶液中。将反应物在室温下搅拌过夜，然后在50℃下再搅拌一夜。将混合物用NaHCO3水溶液碱化，用DCM萃取，并蒸发溶剂以得到粗产物。然后使用H2O/乙腈梯度在反相中纯化。收集含有产物的馏分并浓缩，得到预期产物IV。
实施例25：2-[1-[3-(3-羟基-3-甲基-2-氧代-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吲唑-1-基]环丁基]乙腈(Y＝C-H，R1＝H，G＝COHMe，Z＝CH2)的合成
白色粉末；收率26％，1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ(ppm)11.09(br s,1H),8.27(d,J＝5.4Hz,1H),8.09(d,J＝8.3Hz,1H),7.70(d,J＝8.6Hz,1H),7.54(ddd,J＝8.4,7.2,1.0Hz,1H),7.51(d,J＝5.6Hz,1H),7.36(dd,J＝7.8,6.8Hz,1H),5.98(s,1H),3.49(d,J＝2.2Hz,2H),2.79-3.05(m,2H),2.64(ddd,J＝12.2,8.9,2.7Hz,2H),1.93-2.30(m,2H),1.48(s,3H)；m/z＝374.2[M+H]+。
骨架偶联-一般方法(吲唑4)
1.光延反应
在室温下，在10mL小瓶中，将氰基亚甲基三丁基正膦(0.68mL，2.49mmol，2当量)添加至搅拌的溴吲唑I(1.24mmol，1当量)和醇(1.24mmol，1当量)在无水甲苯(3.7mL，0.3N)中的溶液中。将反应混合物在80℃下搅拌5h。使反应物达到室温，在真空下浓缩，得到粗物质，其为棕色油状物。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。将其通过在DCM中的液体注射进行转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到预期化合物II。
实施例：合成4-苄基-3-[(3-溴吲唑-2-基)甲基]-3-甲基-吗啉(R1＝H，R2＝Me)
无色胶状物，45％收率，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.82(d,J＝8.6Hz,1H),7.60(d,J＝8.2Hz,1H),7.54–7.41(m,1H),7.40–7.16(m,6H),4.83(d,J＝14.7Hz,1H),4.54(d,J＝14.7Hz,1H),3.93–3.79(m,1H),3.75(d,J＝13.9Hz,1H),3.63(dd,J＝9.8,5.0Hz,1H),3.51(ddd,J＝11.2,8.2,3.2Hz,1H),3.43(d,J＝11.3Hz,1H),3.26(d,J＝11.3Hz,1H),2.69(ddd,J＝11.7,8.2,3.3Hz,1H),2.43–2.28(m,1H),1.06(s,3H)；m/z＝400.3,402.3[M+H]+。
2.铃木偶联
在6-20mL反应小瓶中依次添加取代的溴吲唑II(0.532mmol)、3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(0.532mmol，1当量)、磷酸三钾(229mg，1.06mmol，3)、XPhos(10mg，0.021mmol，0.04当量)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(0.011mmol，0.02当量)、二噁烷(2.2mL)和水(0.4mL)。将小瓶密封，在真空下抽空并用氩气再填充。将反应物在95℃下搅拌过夜。添加水和EtOAc。分离两相，水相用EtOAc萃取。使用相分离器干燥合并的有机相并蒸发以得到粗产物。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。将其通过在DCM中的液体注射进行转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到预期产物III。
实施例：4-[1-[(4-苄基-3-甲基-吗啉-3-基)甲基]吲唑-3-基]-3,3-二甲基-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(R1＝H，R2＝Me)的合成
白色泡沫；67％的收率；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.34(d,J＝5.38Hz,1H),7.90(d,J＝8.56Hz,1H),7.79(d,J＝8.31Hz,1H),7.50(t,J＝7.61Hz,1H),7.39(d,J＝5.38Hz,1H),7.19-7.32(m,6H),5.47-5.50(m,1H),4.95(d,J＝14.43Hz,1H),4.65(d,J＝14.67Hz,1H),3.91-4.01(m,2H),3.68-3.78(m,2H),3.51-3.64(m,3H),3.26-3.29(m,1H),2.90-2.99(m,1H),2.75(br t,J＝8.80Hz,1H),2.37-2.42(m,1H),1.96(br d,J＝11.49Hz,1H),1.49-1.69(m,4H),1.31-1.39(m,6H),1.11(s,3H)；m/z＝566.5[M+H]+。
3.苄基的脱保护
将铃木偶联产物III(0.09mmol)溶于无水甲醇(2.2mL，0.04N)中。添加甲酸铵(0.62mmol，7当量)和Pd/C 10％ Engelhard(0.09mmol，1当量)。将反应小瓶密封，在真空下抽空并用氩气再填充。将悬浮液在110℃下搅拌3h。将反应混合物过滤，用MeOH洗涤并浓缩，得到苄基脱保护产物。
实施例：合成3,3-二甲基-4-[1-[(3-甲基吗啉-3-基)甲基]吲唑-3-基]-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(R1＝H，R2＝Me)
棕色胶状物；61％收率；1H NMR(600MHz,DMSO-D6,300K)δ(ppm)＝8.33(d,J＝5.3Hz,1H),7.84(d,J＝8.5Hz,1H),7.78(d,J＝8.2Hz,1H),7.50(ddd,J＝0.9,7.1,8.3Hz,1H),7.38(d,J＝5.4Hz,1H),7.27-7.20(m,1H),5.49(dd,J＝2.1,11.4Hz,1H),4.69(d,J＝14.5Hz,1H),4.54(d,J＝14.5Hz,1H),3.99(td,J＝1.9,11.4Hz,1H),3.65(td,J＝3.8,11.0Hz,1H),3.61-3.46(m,3H),3.13-3.06(m,1H),3.04-2.83(m,1H),2.78-2.70(m,1H),2.37-2.14(m,1H),1.96(br dd,J＝2.5,10.0Hz,1H),1.72-1.44(m,5H),1.37(d,J＝1.0Hz,6H),0.94(s,3H)；m/z＝476.5[M+H]+。
4.THP的脱保护
将4M氯化氢的二噁烷溶液(8mmol，8当量)添加至前述化合物(0.17mmol)在无水甲醇(0.8mL，0.2N)中的溶液中。将反应物在65℃下搅拌过夜。冷却后，添加NaHCO3水溶液，用EtOAc萃取混合物。将合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到预期化合物IV，其为盐酸盐。
实施例31的外消旋前体：3,3-二甲基-4-[1-[(3-甲基吗啉-3-基)甲基]吲唑-3-基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮(R1＝H，R2＝Me)的合成
白色粉末；收率62％，1H NMR(DMSO-d6,600MHz):δ(ppm)11.10(s,1H),8.21(d,J＝5.4Hz,1H),7.83(d,J＝8.7Hz,1H),7.80(d,J＝8.2Hz,1H),7.49(ddd,J＝8.3,7.0,1.0Hz,1H),7.29(d,J＝5.4Hz,1H),7.22-7.26(m,1H),4.69(d,J＝14.5Hz,1H),4.53(d,J＝14.5Hz,1H),3.65(dt,J＝10.8,3.8Hz,1H),3.58(d,J＝11.2Hz,1H),3.49(ddd,J＝10.8,8.3,2.9Hz,1H),3.28-3.30(m,1H),3.10(ddd,J＝12.3,8.6,3.2Hz,1H),2.71-2.78(m,1H),2.33(br s,1H),1.36(d,J＝1.6Hz,6H),0.94(s,3H)；m/z＝392.1[M+H]+。
手性纯化后得到对映体化合物。
在甲醇中苄基脱保护期间，获得实施例63的副产物。
骨架偶联-一般方法(吲唑5)
1.3-甲基磺酰氧基吡咯烷-1,3-二甲酸-O1-叔丁酯O3-甲酯的合成
在室温下，将甲磺酰氯(1.2mL，14.9mmol，2当量)添加至搅拌的三乙胺(2.1mL，14.9mmol，2当量)和3-甲基-3-羟基吡咯烷-1,3-二甲酸1-叔丁酯(1.90g，7.44mmol，2当量)在无水二氯乙烷(62mL，0.12N)中的悬浮液中。将反应物在55℃下搅拌过夜。添加水，并将混合物用DCE萃取。将有机相干燥并在真空下浓缩。通过快速色谱法使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到3-甲基磺酰氧基吡咯烷-1,3-二甲酸-O1-叔丁酯O3甲酯(1.5g，63％收率)，其为黄色油状物。1H NMR(氯仿-d,400MHz):δ(ppm)3.92(t,J＝14.9Hz,5H),3.69–3.49(m,2H),3.18(s,3H),2.66–2.41(m,2H),1.46(s,9H)。
2.取代
向反应小瓶中添加氢化钠(1.99mmol，1.5当量)和无水THF(0.05mL)。然后添加溴吲唑I(300mg，1.33mmol)的无水THF(0.1mL)。在室温下逐滴添加3-甲基磺酰氧基吡咯烷-1,3-二甲酸-O1-叔丁酯O3-甲酯(1.99mmol，2当量)的无水THF(0.35mL)。将反应物在室温下搅拌过夜。加入氢化钠(1.5当量)并将反应物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂。将该残余物溶解在乙酸乙酯中并添加水。分离两相。用1N HCl水溶液中和合并的水相，并用二氯甲烷萃取。用相分离器干燥合并的有机相并蒸发以得到产物II。
实施例：3-(3-溴-6-氟-吲唑-1-基)-1-叔丁氧基羰基-吡咯烷-3-甲酸(R1＝F)的合成
无色胶状物，37％收率，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.72(s,1H),7.69(dd,J＝8.9,5.2Hz,1H),7.46(s,1H),7.26–7.17(m,1H),4.37–4.10(m,2H),3.02–2.83(m,2H),2.42(s,1H),2.15(s,1H),1.42(s,9H)；m/z＝400.3,402.3[M+H]+。
3.还原
向2mL反应小瓶中添加取代的吲唑II(0.487mmol)，并添加1M硼烷四氢呋喃(0.974mmol，2当量)溶液。将反应物在室温下搅拌3h。将反应混合物倒入饱和NH4Cl水溶液中。并用二氯甲烷萃取。将合并的有机相经相分离器干燥并蒸发，得到粗产物，其为棕色固体。通过快速色谱法在硅胶上使用二氯甲烷/乙酸乙酯梯度纯化粗产物。将其在IsoluteHM-N上通过固体形式转移，收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到预期产物III。
实施例：3-(3-溴-6-氟-吲唑-1-基)-3-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(R1＝F)的合成
白色泡沫；44％收率；m/z＝358,360[M+H-tBu]+。
4.铃木
向12mL反应小瓶中添加含前述化合物III(0.222mmol)、硼酸酯I'(0.222mmol，1当量)和四(三苯膦)钯(0.0222mmol，0.1当量)的DMF(1.7mL)和水(0.6mL)的混合物。将混合物用N2脱气，然后添加碳酸二钠(0.666mmol，3当量)。再次用N2对混合物脱气，然后在90℃下搅拌3h。将水添加至该冷却的混合物中，过滤沉淀物，并用水洗涤，然后溶于DCM。在相分离器上过滤有机相，并在真空下浓缩。将粗产物用庚烷/EtOAc梯度纯化，收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到预期化合物IV。
实施例：3-[6-氟-3-(2'-氧代-1'-四氢吡喃-2-基-螺[环戊烷-1,3'-吡咯并[2,3-b]吡啶]-4'-基)吲唑-1-基]-3-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(R1＝F，G＝CC环戊基)的合成
米色固体，24％收率，m/z＝606.3[M+H]+。
5.脱保护
将4M氯化氢的二噁烷溶液(1.9mmol，40当量)添加至前述化合物IV(0.05mmol)在无水甲醇(0.1mL，0.5N)中的溶液中。将反应物在65℃下搅拌过夜。浓缩溶液。将产物溶于水，用EtOAc萃取杂质。将水相在真空下浓缩，得到预期化合物IV，其为盐酸盐。
实施例55：二盐酸4-[6-氟-1-[3-(羟甲基)吡咯烷-3-基]吲唑-3-基]螺[1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3,1'-环戊烷]-2-酮的合成(R1＝F，G＝CC环戊基)
黄色粉末；57％的收率；1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ(ppm)11.02(s,1H),9.18-9.66(m,2H),8.19(d,J＝5.4Hz,1H),7.65-7.84(m,2H),7.17(td,J＝9.0,2.1Hz,1H),7.11(d,J＝5.4Hz,1H),4.10(dt,J＝12.0,6.0Hz,2H),3.80-3.97(m,3H),3.40-3.52(m,1H),3.23-3.34(m,1H),2.66-2.93(m,2H),2.10-2.28(m,2H),1.77-1.90(m,4H),1.60(br d,J＝2.7Hz,2H)；m/z＝422.1[M+H]+。
为了获得实施例77，在脱保护之前再进行一个步骤：
3-[3-(3,3-二甲基-2-氧代-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吲唑- 1-基]-3-(氟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的合成
在5mL反应小瓶中，在0℃下，将DAST(0.019mL，0.142mmol，1.5当量)滴加至搅拌的3-[3-(3,3-二甲基-2-氧代-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吲唑-1-基]-3-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(53mg，0.0944mmol)在无水DCM(1.2mL，0.08N)中的溶液中。使反应混合物达到室温并在室温下搅拌过夜。添加DAST(0.019mL，0.142mmol，3当量)，并将反应混合物在室温下搅拌过周末。将反应混合物用1M NaOH水溶液淬灭直至pH＝12，用二氯甲烷萃取，并在相分离器上干燥。并蒸发溶剂，得到3-[3-(3，3-二甲基-2-氧代-1-四氢吡喃-2-基-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吲唑-1-基]-3-(氟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(35.3mg，66％收率)，其为淡黄色胶状物。其无需进一步纯化即用于下一步。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.36(d,J＝5.4Hz,1H),7.94–7.77(m,2H),7.58–7.48(m,1H),7.41(d,J＝6.3Hz,1H),7.37–7.27(m,1H),5.49(d,J＝11.1Hz,1H),5.10–4.78(m,2H),4.09–3.95(m,1H),3.57(d,J＝10.2Hz,2H),2.97(dq,J＝13.7,6.9Hz,3H),2.75(q,J＝7.2Hz,3H),1.95(s,1H),1.71–1.45(m,4H),1.38(d,J＝12.7Hz,6H),1.07(dt,J＝20.1,7.2Hz,9H)；m/z＝564.2[M+H]+。
骨架偶联-特定方法(特定吲唑1)
步骤1：叔丁基-(1H-吲唑-7-基氧基)-二苯基硅烷的合成
在室温下向7-羟基-1H-吲唑(95％，1.44g，10.2mmol)在无水DMF(14mL，0.5N)中的溶液中添加叔丁基氯二苯基硅烷(6.8mL，25.5mmol，2.5当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。添加叔丁基-氯二苯基硅烷(6.8mL，25.5mmol，2.5当量)，并将所得混合物在80℃下搅拌过夜。将反应物倒入NaHCO3水溶液中，并用EtOAc萃取。分离两相，并将有机相用水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。将其通过在DCM中的液体注射进行转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到叔丁基-(1H-吲唑-7-基氧基)-二苯基-硅烷(1.4g，37％收率)，其为白色泡沫状。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ(ppm)13.36(s,1H),8.07(s,1H),7.71-7.74(m,4H),7.40-7.51(m,6H),7.23(d,J＝8.1Hz,1H),6.63(t,J＝7.8Hz,1H),6.13(d,J＝7.3Hz,1H),1.09(s,9H)；m/z＝373.4[M+H]+。
步骤2：4-[7-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基吲唑-1-基]哌啶-1-甲酸酯的合成
向搅拌的叔丁基-(1H-吲唑-7-基氧基)-二苯基-硅烷(650mg，1.74mmol)在无水甲苯(5mL，0.3N)中的混合物中加入氰基亚甲基三丁基正膦(0.91mL，3.49mmol，2当量)和4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.70g，3.49mmol，2当量)。在85℃下搅拌反应5h。再添加4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.70g，3.49mmol，2当量)和氰基亚甲基三丁基正膦(0.91mL，3.49mmol，2当量)，并将反应物在85℃下搅拌过夜。将反应混合物浓缩至干，并通过快速色谱柱使用EtOAc/环己烷梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到4-[7-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基吲唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(180mg，18％)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)位移8.09(s,1H),7.71-7.76(m,4H),7.38-7.52(m,6H),7.23(d,J＝8.02Hz,1H),6.64(t,J＝7.85Hz,1H),6.21(d,J＝7.63Hz,1H),5.57(tt,J＝5.28,10.27Hz,1H),4.14(br d,J＝12.03Hz,2H),2.78(br s,2H),2.02-2.11(m,4H),1.38-1.45(m,9H),1.11(s,9H)；m/z＝556.4[M+H]+。
步骤3：4-(7-羟基吲唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成
在50mL圆底烧瓶中，在室温下，将1M氟化四丁基铵溶液(0.49mL，0.486mmol，1.5当量)添加至搅拌的4-[7-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基吲唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(180mg，0.324mmol)在无水THF(1.6mL，0.2N)中的溶液中。将反应物在室温下搅拌1h。将反应物用盐水淬灭并添加EtOAc。分离两相并将有机相用水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥并蒸发至干。将粗产物在DCM中研磨。过滤固体并在高真空下干燥，得到4-(7-羟基吲唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(70mg，68％收率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.20(s,1H),7.95(s,1H),7.14(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),6.96–6.82(m,1H),6.69(dd,J＝7.4,0.6Hz,1H),5.25(p,J＝7.9,7.4Hz,1H),4.09(d,J＝11.7Hz,2H),2.93(s,2H),2.02–1.87(m,4H),1.43(s,9H)；m/z＝318.1[M+H]+。
步骤4：4-[7-(二氟甲氧基)吲唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成
在-78℃下，在2-5mL密封管中，将[溴(二氟)甲基]膦酸二乙酯(0.080mL，0.429mmol，2当量)一次性添加至4-(7-羟基吲唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(68mg，0.214mmol)和氢氧化钾(240mg，4.29mmol，20当量)在乙腈(1.1mL)和水(1.1mL)的混合物中的冷却溶液中。将反应物升温至室温并搅拌1h。将反应混合物用EtOAc稀释。分离两相，水相用EtOAc萃取。将合并的有机相用盐水、水洗涤，用Na2SO4干燥，并蒸发，得到4-[7-(二氟甲氧基)吲唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯，其为棕色胶状物。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δppm 8.17(s,1H),7.63-7.67(m,1H),7.27-7.53(m,1H),7.16-7.19(m,1H),7.11-7.15(m,1H),4.95-5.04(m,1H),4.03-4.18(m,2H),2.71-3.11(m,2H),1.83-2.06(m,4H),1.43(s,9H)；m/z＝312.2[M+H]+。
步骤5：4-[3-溴-7-(二氟甲氧基)吲唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成
将N-溴琥珀酰亚胺(23mg，0.128mmol，1.05当量)添加至4-[7-(二氟甲氧基)吲唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(64mg，0.122mmol)在乙腈(0.3mL，0.4N)中的溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜。在真空下除去溶剂，并将残余物溶于EtOAc。将有机溶液用NaOH水溶液、水洗涤，用Na2SO4干燥，并在真空下浓缩，得到4-[3-溴-7-(二氟甲氧基)吲唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(69mg，85％收率)，其为紫色胶状物。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ(ppm)7.15-7.71(m,4H),4.89-5.07(m,1H),3.99-4.19(m,2H),2.75-3.10(m,2H),1.72-2.15(m,4H),1.36-1.46(m,9H)；m/z＝390.2,392.2[M+H-tBu]+。
下一步骤与一般方法-吲唑2类似。
骨架偶联-特定方法(特定吲唑2)
在氮气气氛下，在6mL密封小瓶中依次添加3-溴-1H-吲唑(120mg，0.59mmol)、(三丁基-λ～5-亚膦基)乙腈(0.31mL，1.18mmol)和化合物I'的无水甲苯(2mL)溶液。将反应物在80℃下搅拌过夜。蒸发溶剂，得到粗产物。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/乙酸乙酯梯度纯化。将其在12g Redisep Gold柱上、在Isolute HM-N上通过固体形式转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到化合物II。
实施例：N-[外消旋-(1R,2R,4R)-4-(3-溴吲唑-1-基)-2-氟-环己基]氨基甲酸叔丁酯(R1＝F)的合成
米色固体，58％收率，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.88(d,J＝8.6Hz,1H),7.58(d,J＝8.2Hz,1H),7.29–7.23(m,1H),7.13–7.03(m,1H),4.81(s,1H),4.63(s,1H),4.50(s,1H),3.57(s,1H),2.42(d,J＝5.2Hz,1H),2.21–2.08(m,1H),1.91(d,J＝7.3Hz,2H),1.45(d,J＝7.0Hz,2H),1.42(s,9H)。
骨架偶联-特定方法(特定吲唑3)
步骤1：2-[1-(3-溴吲唑-1-基)环丁基]乙腈的合成
向20mL Biotage小瓶中依次添加3-溴-1H-吲唑(500mg，2.46mmol)、环亚丁基乙腈(0.25mL，2.46mmol)、1,8-二氮杂双环[5.4.0]和呋喃(0.73mL，4.92mmol)的无水乙腈(12mL)溶液。将混合物在85℃下搅拌48h。将混合物在真空下浓缩。得到橙色油状物，并在12g硅胶柱上用庚烷/EtOAc梯度纯化。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到2-[1-(3-溴吲唑-1-基)环丁基]乙腈(600mg，83％收率)，其为白色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.63(d，J＝9.1Hz，2H)，7.57-7.42(m，1H)，7.30(dd，J＝8.7，7.0Hz，1H)，3.39(s，2H)，2.87(dt，J＝12.5，9.7Hz，2H)，2.64-2.53(m，2H)，2.25-2.09(m，1H)，2.09-1.89(m，1H)；m/z＝290.0，292.0[M+H]+。
步骤2：2-[1-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吲唑-1-基]环 丁基]乙腈的合成
在小瓶中添加双(频哪醇)乙硼烷(1.5g，6.00mmol)、乙酸钾(589mg，6.00mmol)、2-[1-(3-溴吲唑-1-基)环丁基]乙腈(580mg，2.00mmol)和双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)(147mg，0.200mmol)的无水二噁烷(20mL)溶液。将小瓶密封，在真空下抽空并用氩气再填充。将反应混合物在110℃下搅拌2h，然后使其达到室温，过滤，用EtOAc洗涤，在真空下浓缩，得到粗产物，其为褐色油状物。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。将其在70g柱上、于DCM中通过液体注射转移。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到2-[1-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吲唑-1-基]环丁基]乙腈，其为橙色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝8.1Hz,1H),7.62(d,J＝8.5Hz,1H),7.41–7.36(m,1H),7.26–7.21(m,1H),3.42(s,2H),2.90(dt,J＝12.4,9.8Hz,2H),2.66–2.56(m,2H),2.28–2.11(m,1H),2.01–1.88(m,1H),1.36(s,12H)；m/z＝256.3[M+H]+。
骨架偶联-一般方法(吡唑)
第一步：烷基化或光延
1a.烷基化(X＝Br)
在反应小瓶中，将碳酸铯(532mg，1.63mmol，1.2当量)添加至3-溴-1H-吡唑I(200mg，1.36mmol)和4-溴哌啶-1-甲酸叔丁酯(431mg，1.63mmol，1.2当量)的无水DMF(14mL，0.1N)溶液中。将混合物加热至70℃过夜。添加4-溴哌啶-1-甲酸叔丁酯(431mg，1.63mmol，2当量)和碳酸铯(532mg，1.63mmol，2当量)，将混合物加热至80℃过夜。再次添加4-溴哌啶-1-甲酸叔丁酯(2当量)和碳酸铯(2当量)，将混合物加热至80℃持续4h以上。添加水，并将混合物用乙酸乙酯萃取。将有机相干燥并在真空下浓缩，得到粗产物。通过快速色谱法在硅胶上使用DCm/EtOAc梯度纯化粗产物。将其通过在DCM中的液体注射进行转移。收集相关的馏分(UV中不可见)并在真空下浓缩，得到4-(3-溴吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯II(266mg，54％收率)，其为淡色油状物。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)7.83(d,J＝2.4Hz,1H),6.38(d,J＝2.3Hz,1H),4.35(tt,J＝11.5,4.0Hz,1H),4.03(d,J＝12.3Hz,2H),2.88(s,2H),2.04–1.92(m,2H),1.73(qd,J＝12.4,4.4Hz,2H),1.42(s,9H)；m/z＝276.1[M+H]+。
1b.光延反应(X＝OH)
将氰基亚甲基三丁基正膦(1.7mL，6.12mmol，3当量)添加至3-溴-1H-吡唑I(300mg，2.04mmol)和顺式-4-羟基环己基氨基甲酸叔丁酯(1.32g，6.12mmol，3当量)在无水甲苯(10mL，0.2N)中的溶液中。将反应混合物在90℃下搅拌过夜。在真空下浓缩溶液。通过快速色谱法在硅胶上使用庚烷/EtOAc梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到N-[4-(3-溴吡唑-1-基)环己基]氨基甲酸叔丁酯II(288mg，41％收率)，其为黄色固体。1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)7.79(d,J＝2.3Hz,1H),6.80(d,J＝7.9Hz,1H),6.34(d,J＝2.3Hz,1H),4.09(tt,J＝11.9,3.9Hz,1H),3.22-3.30(m,1H),2.04–1.65(m,6H),1.51–1.20(m,11H),m/z＝288.1-290.1[M+H-tBu]+。
相同的合成用于以下步骤。
2.硼酸酯
在反应小瓶中添加含取代的溴吡唑II(0.806mmol)、双(频哪醇合)二硼(1.21mmol，1.5当量)和乙酸钾(2.42mmol，3当量)的无水二噁烷(2.7mL，0.3N)。用N2使混合物脱气，加入双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)(0.081mmol，0.1当量)。将反应混合物在100℃下搅拌过夜。将混合物在dicalite上过滤并在真空下浓缩，得到粗产物III。粗产物无需进一步纯化即可用于下一步。
实施例：合成4-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吡唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(R＝NHBoc，R2＝H)
深色油状物，m/z＝240.3[M+H-tBu]+(酸形式)
3.铃木偶联
向反应小瓶中添加含硼酸酯III(0.709mmol，2当量)、溴骨架I'(0.332mmol)、碳酸二钠(0.996mmol，3当量)和四(三苯基膦)钯(0.0332mmol，0.1当量)的DMF(3.2mL)和水(0.6mL)的混合物。将小瓶用氮气脱气并在100℃下搅拌4h。添加水，过滤沉淀并溶解在DCM中。在相分离器上干燥有机相，并在真空下浓缩。通过快速色谱法在硅胶上使用环己烷/EtOAc梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到铃木偶联产物IV。
实施例：4-[3-(3,3-二甲基-2-氧代-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吡唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(R＝NHBoc，R2＝H，G＝CMe2)合成
黄色固体，54％收率，1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.01(s,1H),8.07(d,J＝5.5Hz,1H),7.95(d,J＝2.4Hz,1H),7.24(d,J＝5.6Hz,1H),6.83(d,J＝2.4Hz,1H),4.49(ddt,J＝11.4,7.9,4.0Hz,1H),4.13–3.99(m,2H),2.91(d,J＝14.5Hz,2H),2.06(d,J＝10.0Hz,2H),1.86(qd,J＝12.4,4.2Hz,2H),1.45(d,J＝14.7Hz,15H)；m/z＝412.4[M+H]+。
4.脱保护
将4M氯化氢的二噁烷溶液(0.73mmol，4当量)添加至铃木偶联化合物IV(0.18mmol)在无水甲醇(0.16mL，0.1N)中的溶液中。将反应物在室温下搅拌过夜。在真空下浓缩溶液。将产物在DCM中研磨，并在40℃下真空干燥过夜，得到终化合物IV，其为盐酸盐。
实施例：3,3-二甲基-4-[1-(4-哌啶基)吡唑-3-基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-酮二盐酸盐(R＝NH，R2＝H，G＝CMe2)的合成
白色粉末，73％收率，1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ(ppm)11.06(s,1H),8.62-9.21(m,2H),8.08(d,J＝5.6Hz,1H),7.93(d,J＝2.4Hz,1H),7.25(d,J＝5.6Hz,1H),6.86(d,J＝2.4Hz,1H),4.59(tt,J＝10.3,5.0Hz,1H),4.25(br s,1H),3.43(br d,J＝13.0Hz,2H),3.02-3.14(m,2H),2.13-2.29(m,4H),1.48(s,6H)；m/z＝312.1[M+H]+。
骨架偶联-一般方法(吡咯)
1.光延反应
在10mL反应小瓶中添加3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡咯(200mg，1.02mmol)I、4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(409mg，2.03mmol，2当量)和无水甲苯(5mL，0.2N)。密封该小瓶，添加氰基亚甲基三丁基正膦(0.55mL，2.03mmol，2当量)。将反应混合物在110℃下搅拌3h。添加4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(409mg，2.03mmol，2当量)和氰基亚甲基三丁基正膦(0.55mL，2.03mmol，2当量)，并将反应混合物在110℃下搅拌4h。再添加4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(2当量)和氰基亚甲基三丁基正膦(2当量)，并将反应混合物在110℃下搅拌过夜。终止反应，并在真空下除去溶剂。通过反相色谱法在中性条件下(MeCN/水)纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到4-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吡咯-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(106mg，28％)，其为白色固体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)7.14(t,J＝1.7Hz,1H),6.88(t,J＝2.3Hz,1H),6.21–6.17(m,1H),4.16–3.95(m,3H),2.82(s,2H),1.91(d,J＝12.5Hz,2H),1.76–1.59(m,2H),1.42(s,9H),1.23(s,12H)；m/z＝377.3[M+H]+。
2.铃木偶联
向反应小瓶中添加含4-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吡咯-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯II(0.282mmol，1.1当量)、溴骨架I'(0.256mmol)、碳酸二钠(81mg，0.768mmol)和四三苯基膦钯(30mg，0.0256mmol，0.1当量)的DMF(2.5mL)和水(0.5mL)的混合物。将小瓶密封，用氮气脱气并在100℃下搅拌过夜。终止反应，并将反应混合物通过dicalite垫过滤，然后用DCM洗涤。在真空下除去溶剂，得到粗产物。通过快速色谱法在硅胶上使用环己烷/EtOAc梯度，随后使用甲苯/丙酮梯度纯化粗产物。收集相关的馏分并在真空下浓缩，得到预期产物III。
实施例：合成4-[3-(2-氧代-1,3-二氢咪唑并[4,5-b]吡啶-7-基)吡咯-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(G＝NH)
白色固体；收率13％；1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)11.22(s,1H),10.63(s,1H),7.86(dd,J＝5.2,1.4Hz,1H),7.79(d,J＝5.6Hz,1H),7.66(s,1H),7.12(d,J＝5.6Hz,1H),6.59(s,1H),4.12(s,3H),2.86(s,2H),2.05–1.69(m,4H),1.44(s,9H)；m/z＝384.5[M+H]+。
3.脱保护
将4M氯化氢的二噁烷溶液(0.36mmol，10当量)添加至铃木偶联化合物III(0.032mmol)在无水甲醇(0.16mL，0.2N)中的溶液中。将反应物在室温下搅拌过夜。过滤反应混合物并用戊烷洗涤产物，并在40℃下真空干燥，得到终化合物，其为盐酸盐。
实施例6：7-[1-(4-哌啶基)吡咯-3-基]-1,3-二氢咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮；二盐酸盐(G＝NH)合成
白色粉末；收率50％，1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ(ppm)11.77(br s,1H),10.97(br s,1H),9.08(br s,1H),8.89(br s,1H),7.82(d,J＝5.9Hz,1H),7.64(s,1H),7.22(d,J＝5.9Hz,1H),7.00(t,J＝2.2Hz,1H),6.70(br s,1H),4.28(tt,J＝11.4,3.6Hz,1H),3.53(br s,1H),3.36-3.46(m,2H),3.05(q,J＝12.1Hz,2H),2.23(br d,J＝12.5Hz,2H),2.06-2.18(m,2H)；m/z＝284.2[M+H]+。
实施例2–生物学测定
PKC-theta和PKC-delta抑制测定
根据制造商的说明(Cisbio，目录号61ST1PEJ)，使用PKC-theta HTRF KinEASEkit试剂盒测量PKC-theta和PKC-delta生化活性。简而言之，该试剂盒的激酶缓冲液成分补充有10mM MgCl2、1mM DTT和0.1％吐温20。对于PKC-theta测定，添加STK底物和ATP以分别提供525nM和6.5μM的最终测定浓度。对于PKC-delta测定，添加STK底物和ATP以分别提供243nM和5.7μM的最终测定浓度。根据制造商的说明，将链霉亲和素_XL665和STK抗体-穴状化合物检测试剂混合。测试化合物在DMSO中以10个半对数阶梯剂量系列稀释，将10nL每个化合物剂量分配在384孔板中。将重组人PKC-theta(His标签362-706)或PKC-delta(His标签345-676)稀释到激酶缓冲液中，以提供10ng/mL的最终测定浓度，并在冰上添加到测试化合物中达30分钟。通过添加底物和ATP开始反应，并在25℃下分别孵育30分钟或20分钟进行PKC-theta和PKC-delta测定。添加检测试剂，将板避光孵育2h。在Envision 2103酶标仪上测量荧光，光学设置为HTRF模式下的激发波长为665nM，发射波长为620nM。计算每个孔的受体和供体发射信号的比率。根据不同剂量的HTRF比率计算抑制百分比值，并拟合到4参数逻辑曲线，以确定IC50值(参见表1)。
效应记忆T细胞IL-2释放测定
通过量化治疗和刺激后人效应记忆T细胞(TEM)分泌的IL-2来评估测试化合物介导的T细胞中NFκB信号传导的抑制。从法国血库获得的健康捐献者的血沉棕黄层(buffycoat)中分离人类TEM细胞。首先，通过Pancoll(PAN BIOTECH，cat#P04-60500)在400xg密度梯度离心20分钟，从用DPBS(Gibco，cat#14190-094)1:1稀释的血沉棕黄层中纯化外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商的说明，使用人CD4+效应记忆T细胞分离试剂盒(Miltenyi，cat#30-094-125)、通过负免疫磁性细胞分选进一步富集TEM细胞。在气相氮气中，将3x 10E6纯化的TEM细胞的等分试样冷冻保存在Cryo-SFM培养基(PromoCell，cat#C-29912)中直至使用。通过流式细胞术分析200 000个PFA固定的细胞来验证细胞纯度，这些细胞先前用单克隆抗体抗CD4-PerCP-Cy5.5(BD Pharmigen，cat#332772)、抗CD8-V500(BD Biosciences，cat#561617)、抗CD14-Pacific Blue(Biolegend，cat#325616)、抗CD45 RA-FITC(Biolegend，cat#304106)和抗CCR7-APC(位于CD4+效应记忆T细胞分离试剂盒中，Miltenyi，cat#130-094-125)。
将TEM细胞重悬于完全RPMI培养基中，其组成为：RPMI 1640(Gibco，cat#31870-025)、10％热灭活胎牛血清(Sigma，cat#F7524)、2mM GlutaMAX(Gibco，cat#35050-038)、1mM丙酮酸钠100X(Gibco，cat#11360-039)、1％ MEM非必需氨基酸溶液(Gibco，cat#11140-035)和100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Sigma-Aldrich，cat#11074440001)。将每孔5,000个细胞铺板到平坦透明底部的384孔板(Corning，cat#3770)上。将5,000个DynabeadsHuman T-Activator CD3/CD28(Gibco，cat#11132D)添加到每个孔中以进行细胞刺激。最后，将最初通过连续半对数步骤稀释在DMSO中制备的10个剂量的测试化合物也一式三孔添加到细胞中。孔中最终DMSO浓度为100μL完全培养基总体积的0.1％。将板在37℃、5％CO2气氛中孵育24h。孵育后，将细胞悬浮液以400×g离心，回收培养物上清液并储存在-80℃。用可固定活力染料eFluor 780(Invitrogen，cat#65-0865-14)对细胞染色后，通过流式细胞术评估细胞活力。使用HTRF人IL-2检测试剂盒(Cisbio，cat#62HIL02PEH)测定细胞上清液中的IL-2水平。将不同化合物剂量下的IL-2数据拟合至4参数逻辑曲线，以确定IC50值，对应于导致每个实验中观察到的最大IL-2水平降低50％的化合物浓度。类似地分析活力数据，以排除细胞毒性作为IL-2减少的原因(见表1)。
/>
/>
表2：本公开的代表性化合物的生化数据。在所示的各列中，数据已根据测量值分入A至H类别，如下所示。
对于PKC-theta HTRF：
A表示测量的pIC50为9.0及以上；
B表示测量的pIC50在8.5和9.0之间；
C表示测量的pIC50在8.0和8.5之间；
D表示测量的pIC50在7.5和8.0之间；
E表示测量的pIC50在7.0和7.5之间；
F表示测量的pIC50在6.5和7.0之间；
G表示测量的pIC50在6.0和6.5之间；
H表示测量的pIC50<6.0。
对于PKC-theta CD4Tc IL-2：
A表示测量的pIC50在8.5和9.0之间；
B表示测量的pIC50在8.0和8.5之间；
C表示测量的pIC50在7.5和8.0之间；
D表示测量的pIC50在7.0和7.5之间；
E表示测量的pIC50在6.5和7.0之间；
F表示测量的pIC50在6.0和6.5之间；
G表示测量的pIC50<6.0。
对于PKC-theta/PKC-delta选择性：
A表示50至120之间的比率；
B表示30至50之间的比率；
C表示20至30之间的比率；
D表示10至20之间的比率；
E表示5至10之间的比率；
F表示1至5之间的比率；
G表示0与1之间的比率。
在不脱离所附权利要求所限定的本发明的范围的情况下，可以对上述实施例进行修改。

Claims (16)

1.一种具有结构式I的化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或立体异构体的混合物、互变异构体，或同位素形式，或其药学上活性代谢物，或其组合，其中：
A选自：N、C-Ra，其中Ra选自氢、卤素、C1-3烷基和CN；
G选自：CR1R2；O和NR1；
R1和R2独立地选自：氢、卤素、C1-3烷基；C3-7环烷基；C1-3烷氧基；C2-6环烷氧基；C2-6烷基烷氧基；羟基、C1-3烷基羟基；氨基、C1-3烷基氨基；C1-4氨基烷基；C2-7烷基氨基烷基；和C1-3卤代烷基；或者
R1和R2一起形成3-5元任选取代的螺碳环或杂环；
B选自：N；C-H和C-卤素；
D选自：N；和C-R3；
R3选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷氧基；C2-5烷基烷氧基；和卤素；
R4选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；OMe；和卤素；或者
其中当D是C-R3时，R3和R4连接在一起以形成任选取代的芳基或杂芳基环，其具有选自以下的结构：
其中；
R7选自：氢；和卤素；
R8选自：氢；和卤素；
R9选自：氢；C1-3卤代烷基；和卤素；
R10选自：氢；卤素；C1-3卤代烷基；C1-3卤代烷氧基；并且其中：
n选自：0；和1；
E选自：C-H；和C-Ra，其中Ra选自卤素；C1-3烷基；C1-3烷基羟基；C1-3卤代烷基；C2-6烷基烷氧基和C1-3烷基腈；
R5和R6连接在一起以形成任选取代的、任选桥连的4-8元饱和碳环或杂环。
2.权利要求1的化合物，具有结构式II：
3.权利要求1或权利要求2的化合物，具有结构式IIa：
其中，R17选自：
其中
R11选自：氢；卤素和C1-2烷基；
R12选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基羟基；和C1-2烷基腈；
R13选自：氢；卤素和C1-2烷基；
R14选自：氢和C1-2烷基；
R15选自：氢和C1-2烷基；
R16选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基羟基；和C1-3烷基烷氧基；
n选自：0和1；
p选自：1和2；
X选自：CH2和O；
Y选自：CH2；O；NH和NMe。
4.权利要求3的化合物，其中：
R1选自：氢、Me、Et、OMe、OEt、OH、NH2、NHMe和NHEt；
R2选自：氢、Me和Et；或
R1和R2一起形成3-5元任选取代的螺碳环或杂环；特别是4-5元任选取代的碳环或杂环螺环；其中在实施方案中，碳环或杂环螺环是未取代的；其中在替代性的实施方案中，碳环或杂环螺环被一个或多个选自以下的取代基取代：C1-2烷基、卤素；C1-2卤代烷基；羟基；和C1-2烷氧基；
A选自：C-H；C-F；C-Cl和C-Br；
B选自：N；C-H、C-F；C-Cl和C-Br；
R17选自：
其中
R18选自：氢；和卤素；
R19选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基羟基；
m选自：0和1；
R20选自：氢；卤素；
X选自：CH2和O；
R21和R22各自独立地选自：氢和C1-3烷基；
Y选自：CH2；O和NH；
R23选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基。
5.权利要求1的化合物，具有结构式III：
其中；
D选自：N；C-H和C-R3；
R3选自：C1-3烷基；C2-5烷基烷氧基；C1-3卤代烷基和卤素；
R4选自：氢；C1-3烷基；C2-5烷基烷氧基；C1-3卤代烷基和卤素。
6.权利要求5的化合物，具有结构式IIIa、IIIb或IIIc：
其中，
R17选自：
其中
R11选自：氢；卤素和C1-2烷基；
R12选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基羟基；和C1-2烷基腈；
R13选自：氢；卤素和C1-2烷基；
R14选自：氢和C1-2烷基；
R15选自：氢和C1-2烷基；
R16选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基羟基；和C1-3烷基烷氧基；
n选自：0和1；
p选自：1和2；
X选自：CH2和O；
Y选自：CH2、O、NH和NMe。
7.权利要求6的化合物，其中：
R1选自：氢、Me、Et、OMe、OH、NH2和NHMe；
R2选自：氢；Me；和Et；或者
R1和R2一起形成3-5元任选取代的螺碳环或杂环；
A选自：C-H、C-F、C-Cl和C-Br；
R17选自：
其中：
R18选自：氢和卤素；
R19选自：氢；C1-3烷基；C1-3卤代烷基；C1-3烷基和羟基；
m选自：0和1；
R20选自：氢和卤素；
X选自：CH2；和O；
R21和R22各自独立地选自：氢和C1-3烷基；
Y选自：CH2；O和NH；
R23选自：氢；C1-3烷基；和C1-3卤代烷基。
8.根据表1的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或立体异构体的混合物、互变异构体、同位素形式，或其药学上活性代谢物，或其组合。
9.药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或立体异构体混合物、互变异构体或同位素形式或其药学上活性代谢物或其组合，以及一种或多种药学上可接受的载体。
10.权利要求1至8中任一项的化合物或权利要求9的药物组合物，用于治疗选自自身免疫性障碍和/或炎症性疾病和/或肿瘤疾病和/或癌症和/或HIV感染和复制的障碍或疾病。
11.根据权利要求10所述使用的化合物或药物组合物，其中所述障碍或疾病选自：类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、特应性皮炎。
12.根据权利要求10或权利要求11所述使用的化合物或药物组合物，其中所述化合物是PKC-theta的抑制剂。
13.根据权利要求10至12中任一项所述使用的化合物或药物组合物，其中所述用途是在一种方法中，包括以以下方式施用所述化合物：口服、局部、通过吸入、通过鼻内施用，或通过静脉内、腹膜内、皮下或肌内注射进行全身施用。
14.根据权利要求10至13中任一项所述使用的化合物或药物组合物，其中所述用途是在一种方法中，包括施用根据权利要求1至8中任一项所述的化合物与一种或多种附加治疗剂的组合。
15.根据权利要求14所述使用的化合物或药物组合物，其中所述施用包括与所述一种或多种附加治疗剂同时、依次或分开施用根据权利要求1至8中任一项所述的化合物。
16.根据权利要求10至15中任一项所述使用的化合物或药物组合物，其包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中所述有效量为在所述受试者血液中约5nM至约10μM。
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