CN117286289A - 一种检测非洲猪瘟病毒引物对、gRNA、试剂盒和方法 - Google Patents

一种检测非洲猪瘟病毒引物对、gRNA、试剂盒和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117286289A
CN117286289A CN202311026324.8A CN202311026324A CN117286289A CN 117286289 A CN117286289 A CN 117286289A CN 202311026324 A CN202311026324 A CN 202311026324A CN 117286289 A CN117286289 A CN 117286289A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rpa
grna
cas12a
reaction
kp177r
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311026324.8A
Other languages
English (en)
Inventor
彭军
栾好瑞
刘彤
王刚
吴家强
姜世金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Agricultural University
Original Assignee
Shandong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Agricultural University filed Critical Shandong Agricultural University
Priority to CN202311026324.8A priority Critical patent/CN117286289A/zh
Publication of CN117286289A publication Critical patent/CN117286289A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测非洲猪瘟病毒引物对、gRNA、试剂盒和方法。所述引物对包括：RPA‑F：GACAATTTCTACATTGCTTATTGCTCTTAT，RPA‑R：CCACAATCTTTATCTACTTTACAGACCTTT。本发明经过大量研究，在非洲猪瘟病毒基因组中得到了一个高度保守的基因KP177R，针对该基因中特定位置设计相应的RPA引物对进行扩增可以实现非洲猪瘟病毒的高效检出，以尽早发现环境中的病毒和感染猪，显著提高生物安全防控水平，阻断感染，对于现有的养猪业具有重要的应用价值。

Description

一种检测非洲猪瘟病毒引物对、gRNA、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测非洲猪瘟病毒引物对、gRNA、试剂盒和方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV virus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、烈性动物传染病，临床上以高热、出血为主要特征，可感染不同品种及日龄的家猪和野猪，致死率可达100％。由于其严重危害性，世界动物卫生组织(WorldOrganization for Animal Health，WOAH)将其列为法定报告动物疫病，如何防治ASFV一直是养猪业的难题。ASFV属于非洲猪瘟病毒科的非洲猪瘟病毒属，它的双链DNA分子大小为170至190kb。ASFV是一种囊膜病毒，病毒粒子呈二十面体对称，直径约为200～260nm。它包含150～167个开放阅读框，可以编码近200种蛋白质。ASFV的结构复杂，病毒粒子由五个部分组成，从外到内依次是外囊膜、衣壳、内囊膜、核壳和内核。ASFV是非洲猪瘟病毒科唯一的成员，它的囊膜和衣壳在维持病毒粒子的稳定性方面起着重要作用。该病毒可以通过节肢动物、接触或者空气传播。ASFV结构复杂，研究人员对其众多蛋白的功能尚未有充分了解，所以迄今世界范围内尚未研制出商品化疫苗，对感染猪也无有效的治疗方法。当前，采取严格的生物安全防控措施来阻断病毒感染，或者通过快速准确检测及全面扑杀来控制和消除疫情是行之有效的方法。其中，尽早地发现环境、各种设备中的病毒以及感染的猪，对发现疫情和及时清除病毒是至关重要的。
针对ASF的监测，可以采用病原筛查和抗体检测两种方式来进行。在抗体检测方面，猪感染ASFV后，可在感染4天时检测到IgM，可在感染6-8天后检测到IgG。抗体可以在感染与病毒同时循环至少6个月，并在首次接触后数年内保持可检测性。IgM产生的早、但生成量少，IgG等大量免疫球蛋白生成需要约1周时间，拖延的这些时间不利于尽早发现病毒，因为能检测到抗体时病毒已在动物机体内感染和复制增殖了至少一周时间，并且已经向环境中排放病毒。所以，要想尽早地发现病毒，应该及时对环境或疑似感染猪进行病原检测，例如每天或每半天就采样而检测一次。
ASFV病毒检测常用的方法有聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR(RT-qPCR)、血凝试验(HAT)等。其中，King报道PCR的检测下限为40DNA拷贝，Fernández-Pinero报道RT-qPCR的检测下限为18DNA拷贝，HAT的灵敏度明显低于前两者，但HAT是检测ASF的参考标准。以上检测方法需依赖多种实验室的仪器设备，并且具有复杂的操作步骤，还需要训练有素的专业技术人员才能完成，这极大地限制了上述检测技术在生猪生产现场开展检测，难以满足病毒快速检测的需求。因此，开发一种操作步骤简单、试剂需求较少、不需专业仪器设备、灵敏度高、适合养殖场现地使用的ASFV检测方法，对于ASFV病原的即时筛查具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术问题，本发明提供一种检测非洲猪瘟病毒引物对、gRNA、试剂盒和方法。
为了第一时间发现环境中的病毒和感染猪，从而达到非洲猪瘟防控和净化的目标，研发适合猪场现场使用的、仪器设备要求不高、不必需专业技术人员、可视化的检测方法至关重要。为了减少对热循环仪器和熟练的操作员等的依赖，达到用简单的加温设备、在较低的温度下即可扩增基因片段的目的，本发明采用近年来新出现的等温扩增核酸技术。有代表性的等温扩增技术包括环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶介导的等温扩增技术(RAA/RPA)等。LAMP技术开发及应用较早，但其所需反应温度较高(60℃以上)，加热设备仍然要求较高，且需要多个引物，影响了该技术的推广应用。相比于LAMP方法，近年发展起来的RPA技术则在37℃上下即可完成整个实验过程，该温度要求不高，在养殖场等场合很容易达到。该反应温度与人体体温较为接近，在某些特别艰苦地区的一线现场，如果缺少加热仪器，甚至可通过人体体温的加热来使反应正常进行，经验证亦可完成核酸的扩增，所以RPA技术更契合加热设备要求低的需求。
本发明利用CRISPR/Cas系统切割目的基因高度特异性的优势，提高RPA反应体系测定病毒核酸的灵敏度。CRISPR/Cas系统由CRISPR和Cas蛋白构成，是一种存在于细菌体内的先天性免疫防御系统，该系统已经广泛应用于基因编辑。近年来应用较多的Cas12a蛋白结构简单，单个启动子可同时启动多个crRNA，使CRISPR/Cas12a编辑系统在结构和作用机制上更具优势，被广泛应用于多个领域的疾病检测当中。
在此基础上，本发明提供一种RPA-CRISPR/Cas12a结合的检测方法实现了对非洲猪瘟病毒的快速、高效的检出。既满足了猪场现地使用需求，又达到了高的检测灵敏度。并且，与以前文献报道最大的不同点在于，本发明建立方法的检测靶标是ASFV KP177R基因，前述报道的检测方法基本都以p30、p72蛋白为检测靶点。而本发明通过研究100个ASFV毒株的KP177R基因序列(其分别来自非洲(4个)，欧洲(38个)，中亚与俄罗斯(14个)，北美洲(1个)，东亚(38个)，东南亚(3个)，南亚(2个))发现其中绝大多数(90％)和本发明所选取的ASFV China/2018/AnhuiXCGQ毒株具有100％的同源性，另外1株为99.8％、7株为97.6％、1株为97.4％、1株为96.0％，说明KP177R基因是高度保守的。此外，有研究表明缺失KP177R基因没有影响病毒在体外和细胞内的复制，也没有影响病毒的毒力，该基因在病毒的基本关键功能中也没有发挥作用。至少基于如上研究结果，本发明将KP177R基因作为检测非洲猪瘟病毒的检测靶点。
但是需要说明的是，本发明提供的RPA-CRISPR/Cas12a结合的检测方式并不是必须绑定使用的，例如单独使用本发明提供的RPA引物对或gRNA对待测样品进行扩增，扩增产物可以采用本领域除了CRISPR/Cas12a之外的其他常规手段进行检测，同样能够达到一定的检出非洲猪瘟病毒的效果。
针对KP177R基因，本发明研究发现即使其是一个高度保守的基因，但是针对不同区域设计的引物对仍然有较大的差异，本发明设计了四对RPA扩增引物，经过核酸扩增及比对，仅筛选到一对引物具有良好的扩增效率和特异性，而其他三对引物则存在非特异性扩增及低扩增效率等缺点，不能用于后续试验。
第一方面，本发明提供一种引物对，包括：
RPA-F：GACAATTTCTACATTGCTTATTGCTCTTAT，
RPA-R：CCACAATCTTTATCTACTTTACAGACCTTT。
第二方面，本发明提供一种gRNA，包括：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACAUUGCUUAUUGCUCUUA。
在CRISPR/Cas系统中，Cas蛋白以gRNA为向导，通过对PAM序列的识别使Cas蛋白与靶标dsDNA结合，此时Cas蛋白的切割活性会被激活。设计的gRNA关系到与靶标序列的特异性结合，所以其序列选择非常重要。本发明根据Casl2a蛋白结合的PAM序列特点，以ASFV高度保守的KP177R基因靶标区域为模板，选取其中特定区域的TTTN碱基序列为起点，往后选取20nt，在该碱基片段前面加上发卡结构序列，从而更好的特异性识别靶标序列。
第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述引物对，和/或，gRNA。
进一步地，还包括Cas12a蛋白或其编码基因，或信号报告分子中的一种或多种。
进一步地，所述信号报告分子为荧光报告分子或生物素标记分子。
进一步地，所述荧光报告分子包括6-FAM、6-HEX、6-TET、6-ROX、6-TAMRA、6-JOE、Cy3或Cy5中的一种。
进一步地，所述生物素标记分子包括Biotin、Biotin-EA、Biotin-NHS ester、Biotin-Sulfo-NHS ester、Biotin-LC-Hydrazide或Biotin alkyne中的一种。
进一步地，所述试剂盒还包括NEBuffer2.1。
本发明进一步提供所述的引物对，所述的gRNA，或所述的试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。
第四方面，本发明提供一种检测非洲猪瘟病毒的方法，包括：
提取待测样品的DNA；采用所述的引物对，或所述的试剂盒进行RPA反应后进行检测；根据检测结果进行判断。
进一步地，所述进行检测包括：
采用所述的gRNA进行CRISPR/Cas12a反应后进行检测。
进一步地，所述RPA反应的条件为金属浴中在35～40℃的条件下反应25～45分钟。
进一步地，所述根据检测结果进行判断包括：
根据信号报告分子类型对应的检测结果判断所述待测样品中是否包括检测非洲猪瘟病毒。
进一步地，当所述信号报告分子为荧光报告分子时，对应的检测结果是在35～40℃的条件下反应25～40分钟后得到的，反应体系中所用的Cas12a蛋白浓度为90～110nM，gRNA浓度为90～110nM；当所述信号报告分子为生物素标记分子时，对应的检测结果是在37～42℃的条件下反应15～25分钟，之后在试纸条上孵育6～10分钟得到的。
本发明具备如下有益效果：
本发明经过大量研究，得到ASFV中高度保守的基因KP177R，针对该基因特定位置开发RPA引物对，其对于ASFV的检出具有高度特异性和灵敏度(最低检测限为68copies/μL)，具有重要的应用价值。
本发明基于该RPA引物对，将CRISPR/Cas12a技术与之相结合，针对KP177R基因特定位置开发gRNA，通过gRNA引导Cas12a蛋白靶向目标基因，并且经由信号报告分子对于检测结果进行报告，形成了一套操作简便、无需复杂设备、灵敏度高、适合猪场实地使用的肉眼可视化ASFV检测方法，以期能够尽早发现环境中的病毒和感染猪，有利于提高生物安全防控水平以阻断感染，或者通过拔牙等方式及时清除感染猪，从而更好地防控非洲猪瘟。这对于猪养殖产业具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供的Cas12a蛋白的表达、纯化与鉴定结果示意图；其中a为Cas12a基因扩增结果，M为5000bp ladder marker，1为Cas12a基因；b为pET-28a-Cas12a双酶切鉴定结果，M为5000bp ladder marker，1为pET-28a-Cas12a经过BamHI和XHoI双酶切的结果，2为阴性对照；c为采用RPA扩增KP177R基因片段的结果，M为2000bp ladder marker，1-4分别为引物RPA F1/R1,RPA F2/R2,RPA F3/R3和RPA F4/R4对应的扩增产物；d为Cas12a表达蛋白的SDS-PAGE分析结果，M为250kDa ladder marker，1为目的基因转化菌菌体裂解后纯化的Cas12a蛋白，2为目的基因转化菌菌体裂解后未纯化的上清液蛋白，3为目的基因转化菌菌体裂解后未纯化的沉淀蛋白，4为空载体转化菌裂解后未纯化的蛋白；e为Westernblot鉴定Cas12a表达蛋白(以His标签抗体为一抗)的结果，M为250kDa ladder marker，1为目的基因转化菌菌体裂解后纯化的Cas12a蛋白，2为目的基因转化菌菌体裂解后未纯化的上清液蛋白，3为目的基因转化菌菌体裂解后未纯化的沉淀蛋白，4为空载体转化菌裂解后未纯化的蛋白。
图2是本发明实施例1提供的荧光素标记反应体系条件优化结果示意图；其中a为在96孔板中配制包含完全组分，分别缺少gRNA、KP177R、Cas12a、ssDNA不完全组分的对照组，体系分别在20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃七个温度下进行反应，经由酶标仪测定相应的荧光值的结果；b为在EP管中配置包含完全组份的组分别在不同温度下进行反应，经由蓝光照射记录荧光反应的结果，1-7依次为20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃；c为在96孔板中配制包含完全组分，分别缺少gRNA、KP177R、Cas12a、ssDNA不完全组分的对照组，体系分别在反应10、20、30、40、50、60min的时间，经由酶标仪测定相应的荧光值的结果；d为在最佳反应温度和反应时间情况下，不同Cas12a和gRNA浓度梯度的RFU检测结果；e为配制为20μL体积，37℃反应30min的条件下，在常温下蓝光照射的检测结果，1-5分别对应完全组分，以及分别缺少gRNA、KP177R、Cas12a、ssDNA不完全组分的对照组。
图3是本发明实施例1提供的生物素标记反应体系条件优化结果示意图；其中a为不同反应温度下生物素标记反应体系的检测结果，1-7分别为20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃；b为ImageJ对于a中测试线(T)和对照线(C)处信号强度测定以及相对密度比结果；c为在20℃温度下反应不同时间的检测结果，1-5分别为5min、10min、15min、20min、25min；d为ImageJ对于c中测试线(T)和对照线(C)处信号强度测定以及相对密度比结果；e为在20℃温度下反应20min，将反应液滴加于试纸条分别孵育不同时间的检测结果，1-5分别为孵育2min、4min、6min、8min、10min；f为ImageJ对于e中测试线(T)和对照线(C)处信号强度测定以及相对密度比结果。
图4是本发明实施例1提供的KP177R RPA-CRISPR/Cas12a测定的特异性验证结果示意图；其中a为蓝光照射下，不同病毒样品的荧光结果，1-7依次为ASFV、PRRSV、PCV2、PEDV、PDCoV、PRV和无模板对照(NTC)；b为酶标仪针对不同病毒样品的荧光结果，以相对荧光单位显示其荧光强度；c为试纸条针对不同病毒样品的荧光结果，1-7依次为ASFV、PRRSV、PCV2、PEDV、PDCoV、PRV和无模板对照(NTC)；d为ImageJ对于c中测试线(T)和对照线(C)处信号强度测定以及相对密度比结果。
图5是本发明实施例1提供的KP177R RPA-CRISPR/Cas12a测定的灵敏度验证结果；其中a为在蓝光照射下，不同浓度核酸样品的荧光结果，1-11依次为6.83×109–6.83×100copies/μL ASFV DNA以及无模板对照；b为酶标仪针对不同浓度核酸样品的荧光结果，6条线分别代表6.83×109、6.83×106、6.83×103、6.83×101、6.83×100和无模版对照；c为试纸条针对不同浓度核酸样品的检测结果，1-11依次为6.83×109–6.83×100copies/μL ASFVDNA以及无模板对照(NTC)；d为ImageJ对于c中测试线(T)和对照线(C)处信号强度测定以及相对密度比结果。
图6是本发明实施例1提供的KP177R RPA-CRISPR/Cas12a测定的重复性验证结果；其中a中1-3为RPA扩增产物为6.83×107copies/μL的强阳性KP177RDNA分别在第一、第二和第三个月进行检测的结果；4-6为RPA扩增产物为6.83×105copies/μL的中度阳性KP177RDNA分别在第一、第二和第三个月进行检测的结果；7-9为RPA扩增产物为6.83×103copies/μL的弱度阳性KP177R DNA分别在第一、第二和第三个月进行检测的结果；b为ImageJ密度法测定LFD中T线和C线的信号强度，并计算经核酸样本和NTC的相对密度比。
图7是本发明实施例1提供的KP177R RPA-CRISPR/Cas12a和RT-qPCR检测临床样本中KP177R基因的符合率结果；其中a和b为用荧光素标记的KP177RRPA-CRISPR/Cas12a检测10个KP177R基因片段，a中1-6号管为显示阳性的绿色荧光管；b中1-4号管为显示无荧光阴性的管；c和d为用生物素标记的KP177RRPA-CRISPR/Cas12a检测10个KP177R基因片段，c中1-6号试纸为显示阳性的红色印迹试纸，d中1-4号试纸显示无红色印迹阴性试纸；e通过RT-qPCR检测10个KP177R基因片段，其中曲线1-6代表阳性结果，7-10代表阴性结果，11为NTC。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种检测非洲猪瘟病毒的方法，具体如下：
1、试验材料
1.1病毒毒株和核酸
本发明使用的ASFV KP177R基因序列来源于ASFV China/2018/AnhuiXCGQ毒株(GenBank No.MK128995.1)，该基因的核苷酸片段由擎科生物科技有限公司合成。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CSR1801株(GenBank No.OM743305.1)、猪圆环病毒(PCV2)CSR2301株(GenBank No.OQ865055.1)由本实验室分离并保存。猪流行性腹泻病毒(PEDV)CHM2013株(GenBank No.KM887144.1)、猪δ冠状病毒(PDCoV)CHN-HN-1601株(GenBankNo.MG832584.1)的cDNA和猪伪狂犬病毒(PRV)HB1201株(GenBank No.KU057086.1)的DNA由中国农业大学动物医学院惠赠。
1.2核酸提取
参照CWbio Ultrapure RNAkit(CWbio,Beijing,China)步骤提取PRRSV病毒的RNA；参照MonscriptTM RTⅢMix with dsDNase kit(Monad,Suzhou,China)步骤对提取的总RNA进行去基因组dsDNA，收集总RNA溶液。配制合成cDNA体系：模板RNA 1μg、MonScriptTMdsDNase EX(Monad)1μL、MonScriptTM 10×dsDNase Buffer 1μL、Nuclease-Free water to10μL，轻柔吹打混匀后，放入PCR仪中，反应条件为50℃温育15min；85℃温育5min终止反应收集PRRSV cDNA，保存于-20℃。参照TIANamp Genomic DNA kit(Tiangen,Beijing,China)步骤提取PCV2病毒的DNA，保存于-20℃。
1.3Cas12a表达质粒构建
以6His-MBP-TEV-huLbCas12a质粒(Addgene,Watertown,MA,USA)为模板，设计带有同源臂的Cas12a扩增引物：Cas12a-F：CAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGAGCAAGCTGGAGAAGTTTACA，Cas12a-R：GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTGCTTCACGCTGGTCTGGG)，该引物前后两端分别携带BamHI和XHoI酶切位点。
PCR扩增Cas12a基因，25μL的反应体系，其中包含2μL的Cas12a质粒模板、1μL的Cas12a-F、1μL的Cas12a-R、12.5μL的2×Es Taq Master Mix、8.5μL ddH2O。
反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环反应，在4℃保存。
PCR反应结束，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因并测序进行鉴定，将回收的目的基因保存于-20℃。将pET-28a载体进行BamHI和XHoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收经双酶切的pET-28a目的片段，该载体片段与添加了同源重组位点的Cas12a片段在T4 DNA ligase作用下进行连接反应，连接产物转化至DH5α感受态细胞中，挑选卡那霉素抗性的单克隆，使用引物Cas12a-F、Cas12a-R进行PCR验证、测序鉴定，获得基因序列正确的Cas12a原核表达质粒，命名为pET-28a-Cas12a，-80℃保存备用。
1.4Cas12a蛋白表达与纯化
将重组质粒pET-28a-Cas12a转化至BL21(DE3)菌株，挑取单克隆菌落，接种卡那抗性的LB液体培养基，当OD600值达到0.6～0.8时加入IPTG进行蛋白的诱导表达。IPTG分别设定为100μmol/L、300μmol/L、500μmol/L及700μmol/L，温度设定为18℃和37℃，220rpm转速下培养4h、6h、8h，从而筛选最佳诱导表达条件。
在上述最佳诱导表达条件下，pET-28a-Cas12a在LB液体培养基大量诱导表达。收集菌液，8,000rpm离心10min，收集菌体沉淀，按照比例加入细菌裂解液和蛋白酶抑制剂混合物，超声破碎菌体(300W,3s bursts with 6s pauses,for 30min on ice)，离心收集沉淀并用8M的尿素溶液进行重悬，12,000rpm离心20min离心取上清，用0.45μm滤器过滤以去除杂质。按照Ni-Agarose说明书方法，纯化Cas12a蛋白。具体而言，将上述包涵体蛋白溶液负载于上样柱中，加入洗脱液将目的蛋白洗脱下来。收集纯化的Cas12a蛋白，用Micro BCAProtein Assay Kit(CWBio,Beijing,China)测定蛋白浓度，分装、加入甘油，-80℃保存。
1.5SDS-PAGE and Western Blot
本发明将上述经纯化收集的Cas12a蛋白用SDS-PAGE分离、Western blot进行鉴定，具体流程如下：
将Cas12a蛋白加入至12％ SDS-PAGE分离胶加样孔内，电泳进行蛋白分离，上层胶采用80V电压电泳20min，下层胶采用120V电压电泳90min。取出蛋白分离胶在电流200mA、1.5h进行转膜，将胶上面的蛋白整体转到PVDF膜。然后经过PBST洗涤、5％脱脂奶粉封闭，再次洗涤后加入His标签小鼠抗体(1:3,000)作为一抗，4℃孵育过夜。洗涤后加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗(1:5,000)，室温孵育2h。洗涤后加入Enhancedchemiluminescence detection kit(Thermo Fisher Scientific)以形成目的蛋白印迹，使用ChemiDocTM MP成像系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)拍摄图像。
1.6gRNA设计和ssDNA报告分子合成
KP177R是ASFV的高度保守基因。以ASFV AnhuiXCGQ毒株的KP177R基因为靶标模板，选择其特定核苷酸区域，设计Cas12a蛋白的向导RNA(guide RNA,gRNA)，其基因序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACAUUGC UUAUUGCUCUUA，并通过NCBI在线BLAST工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)对比分析序列特异性，以免该gRNA非特异性结合其他碱基序列片段。合成该gRNA并稀释到10μM浓度，-80℃保存。Cas12a蛋白先与特异性gRNA结合，gRNA识别到需要检测的靶标DNA序列就可激活Cas12a蛋白的切割特性，并对单链DNA(single strand DNA,ssDNA)进行任意切割。
为检测靶标DNA序列，针对Cas12a蛋白和靶标序列，本发明将TTATT设为ssDNA的基本序列。在ssDNA报告分子的5′端修饰FAM荧光显色基团，在3′端修饰BHQ1猝灭基团，ssDNA报告分子序列为5′-FAM-TTATT-BHQ1-3′，该荧光报告分子命名为ssDNA-F。在ssDNA报告分子的5′端修饰FAM荧光显色基团，在3′端修饰Biotin生物素基团，ssDNA报告分子序列为5′-FAM-TTATT-Biotin-3′，该生物素报告分子命名为ssDNA-B。以上两个报告分子由擎科生物科技有限公司合成。
1.7RPA引物设计与KP177R RPA反应
根据ASFV AnhuiXCGQ毒株的全基因序列，合成ASFV完整的KP177R基因片段，以此为模板设计PCR引物(KP177R-F,5′-ATGTTTAATATTAAAATGA CAATTTCTACATTGC-3′；KP177R-R,5′-TTATGCATGTTTATGATTTCTAGGTA AGGC-3′)扩增该基因片段，PCR反应条件为95℃预变性5min、95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环反应。将PCR产物转化DH5α感受态细胞并挑取单菌落进行验证，将重组质粒命名为pMD18-T-KP177R，保存以备后续试验使用。
RPA扩增引物应该根据gRNA的结合位点进行设计，引物需要包含待检测靶点的序列。本研究设计并合成四对RPA特异性扩增引物(RPA-F1/RPA-R1、RPA-F2/RPA-R2、RPA-F2/RPA-R2、RPA-F3/RPA-R3、RPA-F4/RPA-R4)，引物序列见表1，分别扩增KP177R基因中120bp、428bp、424bp、476bp长度的基因片段。使用上述RPA-F/RPA-R引物，以pMD18-T-KP177R质粒为模版，按照DNA恒温快速扩增试剂盒说明书(Amp-Future,Changzhou,China)进行基因扩增。
主要步骤如下，在体系中加入29.4μL Buffer A、2μL RPA-F(10μM)、2μL RPA-R(10μM)，12.1μL ddH2O、2μL pMD18-T-KP177R(420ng/μL)、2.5μL Buffer B，充分混匀，金属浴中37℃反应30min。反应结束后，加入Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提液，1:1充分混匀，12,000rpm离心5min，取三层中最上层的上清液，琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。
表1本发明提供的引物序列
1.8KP177R RPA-CRISPR/Cas12a
gRNA-CRISPR/Cas12a检测体系包括靶标dsDNA KP177R基因的RPA反应产物、Cas12a蛋白、NEBuffer2.1、ssDNA报告分子、gRNA以及ddH2O。为判定整个反应体系是否稳定运行，使用酶标仪测定荧光强度，检测体系设置为50μL，包含5μL NEBuffer2.1、5μL KP177RRPA扩增产物抽提上清液、5μL Cas12a蛋白(2.5μg/μL)、2.5μL gRNA(10μM)、5μL荧光素标记ssDNA报告分子(ssDNA-F,10μM)，27.5μL ddH2O，将该反应体系转入96孔酶标板。同时，按照上述反应体系，设置分别缺少KP177R RPA扩增产物、Cas12a蛋白、gRNA、ssDNA报告分子的四组独立反应体系作为对照。将配制完成的检测体系置于酶标仪内，设置激发光波长为485nm、发射光波长为521nm，37℃下反应1h，每隔2min测定一次荧光强度，收集连续的荧光值。上述检测反应分别进行三次独立试验，统计分析结果。
为建立便于临床现地的可视化荧光检测方法，将上述方法的检测体系设置为20μL：2μL NEBuffer2.1、3μL KP177R RPA扩增产物抽提上清液、1μL Cas12a蛋白(2.5μg/μL)、2μL gRNA(10μM)、1μL ssDNA-F报告分子(10μM)、11μL ddH2O，将该反应体系充分混匀加入PCR八连管(Roche)，金属浴37℃反应30min，反应结束后置于凝胶成像仪蓝光下肉眼观察并记录荧光状态。
与上述荧光反应体系类似，把荧光反应体系中的荧光报告分子ssDNA-F替换为生物素标记报告分子ssDNA(ssDNA-B)，反应产物与试纸条上面的底物形成印迹来测定靶向基因。参照上述荧光反应体系的试剂比例，配制生物素报告分子反应体系，包含5μLNEBuffer2.1、5μL KP177R RPA扩增产物抽提上清液、5μL Cas12a(2.5μg/μL)、2.5μL gRNA(10μM)、5μL ssDNA-B(10μM)、27.5μL ddH2O，置于金属浴37℃，分别在反应的0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min，50μL反应产物滴加于标记了生物素底物的侧向流试纸条，孵育10min，采用Image J软件测定试纸条检测T线和对照C线的印迹密度，计算相应的T/C值进行统计分析。
1.9 KP177R RPA-CRISPR/Cas12a试验条件优化
为确定KP177R RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的最佳反应温度和反应时间，选用荧光素标记报告分子ssDNA-F在96孔板中配制检测体系：5μL NEBuffer2.1、5μL KP177R RPA扩增产物抽提上清液、5μL Cas12a(2.5μg/μL)、2.5μL gRNA(10μM)、5μL ssDNA-F(10μM)、27.5μL ddH2O，置于酶标仪中，设置不同的反应温度：20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃，设置激发光为485nm、发射光为521nm，每隔2min测定一次荧光度值、共检测1h，记录连续的荧光值，统计分析后判定荧光标记反应体系的最佳反应温度和反应时间。同时，在EP管内配置20μL的反应体系，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃温度下反应30min，蓝光照射下根据荧光强度判定最佳反应温度。
为确定Cas12a蛋白、gRNA的最佳反应浓度，将Cas12a蛋白浓度设置为400nM、200nM、100nM、50nM和25nM，将gRNA浓度设置为200nM、100nM、50nM、25nM，进行棋盘试验，选用荧光报告分子ssDNA-F配制检测体系，设置激发光为485nm，发射光为521nm，37℃下检测1h，每隔2min检测一次，测定荧光强度并得到连续的荧光值报告。反应结束后采用Graphpad软件中的Heatmap功能制图并进行比较分析，确定最佳的Cas12a蛋白和gRNA反应浓度。
为确定生物素标记反应体系的最佳反应温度，根据上述试验确定的Cas12a蛋白和gRNA最佳反应浓度，选用生物素标记报告分子配制CRISPR/Cas检测体系：5μLNEBuffer2.1、5μL KP177R RPA扩增产物抽提上清液、5μL Cas12a(100nM)、2.5μL gRNA(100nM)、5μL ssDNA-B(10μM)、27.5μL ddH2O，置于金属浴，设置不同的反应温度20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃，反应20min，采用Image J软件测定试纸条检测线(T)和对照线(C)的颜色密度，计算相应的T/C值。
为确定生物素标记反应体系的最佳反应时间，根据上述试验确定的最佳反应温度，配置生物素标记报告分子反应体系，在40℃反应5min、10min、15min、20min、25min，测定T线和C线的颜色密度，计算相应的T/C值。为确定生物素标记反应产物与试纸条的最佳孵育时间，根据上述试验确定的最佳反应温度、反应时间，配置生物素标记报告分子检测体系，在40℃反应20min后将反应产物滴加入试纸条，孵育时间设置为2min、4min、6min、8min、10min，测定T线和C线的颜色密度，计算相应的T/C值。
2、试验结果
2.1 Cas12a蛋白的表达、纯化与鉴定
结果如图1所示，本发明以6His-MBP-TEV-huLbCas12a质粒为模板，PCR扩增Cas12a基因的结果见图1中的a，构建得到的表达质粒pET-28a-Cas12a，经过双酶切(BamHⅠ和XhoⅠ)反应后结果如图1中的b所示，目的基因大小的条带，分子量大小约为3684bp。本发明将成功构建的重组质粒pET-28a-Cas12a转化BL21(DE3)表达菌株，诱导表达Cas12a蛋白。对孵育温度、IPTG浓度、诱导时间进行优化筛选，确定在37℃下经过100μM IPTG诱导表达6h为最佳条件。离心收集菌体，超声破碎后将上清与沉淀分别进行SDS-PAGE分析，结果如图1中的d所示：Cas12a蛋白以可溶性表达和包涵体表达方式存在于菌体破碎后的上清液和沉淀。本发明采用Ni柱亲和层析获得纯化的Cas12a蛋白，Western blot鉴定该蛋白，结果如图1中的e所示：在分子量约为143kDa处有一条明显的印迹，与Cas12a目的蛋白分子量相符。
2.2RPA扩增
本发明以合成的ASFV KP177R完整片段为模板，使用KP177R-F/KP177R-R引物扩增该片段，扩增产物连接pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-T-KP177R，测序结果显示该质粒与基因原始序列相符。以pMD18-T-KP177R质粒为模板，四对引物：正向引物(RPA-F1-F4)and反向引物(RPA-R1-R4)分别扩增KP177R中120bp长度的基因片段，结果如图1中的c所示：1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示RPA-F1/R1引物的扩增条带与目的大小相符，且无非特异性杂带出现，回收该引物扩增的基因片段作为待检测的dsDNA，选用RPA-F1/R1引物作为后续试验中RPA的引物。
2.3KP177R RPA-CRISPR/Cas12a反应条件的优化
2.3.1荧光素标记反应体系
本发明为测定Cas12a蛋白活性、gRNA的引导作用以及gRNA-CRISPR/Cas12a检测体系是否工作，在96孔酶标板内配制gRNA-CRISPR/Cas荧光检测体系，同时设置四组单一组分缺失的对照。配制完成后置于酶标仪内在不同温度20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃下反应30min进行荧光强度检测，得到连续的荧光值报告，统计分析每组的荧光值。得到如图2中的a所示的结果：包含KP177R模版的完全成份组的荧光值随着时间逐步升高，而其他分别缺少Cas12a蛋白、ssDNA分子、gRNA、靶标dsDNA的四个对照组则始终没有荧光值。上述结果显示，gRNA-CRISPR/Cas荧光检测体系在反应温度为37℃时荧光强度最高，也就是此温度下反应体系中Cas12a蛋白可高效切割靶向基因，由此可确定该检测体系的最佳反应温度为37℃。
同时，本发明在EP管中配置包含完全组份的组分别在20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃七个温度下进行反应，结果如图2中的b所示：蓝光照射时该反应体系在37℃荧光强度最高。上述酶标板和EP管中反应结果相符，均显示该gRNA-CRISPR/Cas12a荧光标记反应体系在37℃时荧光强度最高。以上结果表明，前述设计的gRNA可完全识别待检的核酸靶序列，纯化后的Cas12a蛋白对靶向基因ASFV KP177R具有良好的核酸切割活性，ssDNA-F报告分子具有良好的荧光显色活性。该gRNA-CRISPR/Cas12a检测体系在37℃能够稳定工作且荧光反应最强，靶向切割ASFV KP177R基因显示特异性的绿色荧光。
在37℃反应温度下，为测定最佳反应时间，本发明在96孔酶标板中配置gRNA-CRISPR/Cas12a反应体系，每隔2min进行荧光强度检测，共检测60min，分析每组的荧光强度值。结果如图2中的c所示，gRNA-CRISPR/Cas荧光检测体系在反应30min时荧光强度升至最高、维持平台期，因此选择该检测体系的最佳反应时间为30min。
为了筛选Cas12a蛋白和gRNA的最佳反应浓度，本发明将Cas12a蛋白与gRNA分别设置不同的浓度梯度置于酶标仪中进行棋盘试验，37℃反应30min时检测荧光强度值。如图2中的d所示，当Cas12a蛋白浓度为100nM、gRNA浓度为100nM时荧光强度最高，因此确定Cas12a蛋白与gRNA的最佳反应浓度分别为100nM、100nM。适用于临床现地检测使用的可视化荧光反应设置为20μL体系，37℃反应30min，结果如图2中的e所示：包含完全组份的一组显示明显的绿色荧光，而其他分别缺少Cas12a蛋白、ssDNA分子、gRNA、靶标dsDNA的四个对照组则没有荧光显示。
2.3.2生物素标记反应体系
本发明采用生物素报告分子反应体系来测定靶向基因KP177R，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃反应，20min后将适量的反应溶液滴加于试纸条，采用Image J软件测定试纸条检测线(T)和对照线(C)的颜色密度，计算相应的T/C值。结果如图3中的a和b所示：该生物素报告分子反应体系的最佳反应温度为40℃。
相类似地，在上述确定40℃为最优反应温度的情况下，本发明分别在反应时长5min、10min、15min、20min、25min时将50μL反应溶液滴加于试纸条，计算相应的T/C值，结果如图3中的c和d所示：在反应20min时T/C值最高。
上述反应体系在40℃反应20min后，将反应液滴加于试纸条，分别孵育2min、4min、6min、8min、10min，结果如图3中的e和f所示：孵育8min时T/C值最高。
上述结果表明，生物素标记报告分子反应体系在40℃反应20min、滴加于试纸条孵育8min为最佳反应条件。
2.4KP177R RPA-CRISPR/Cas12a测定的特异性
本发明为测定建立的检测方法对ASFV是否具有特异性，分别对ASFV、PRRSV、PCV2、PEDV、PDCoV、PRV进行RPA扩增，设立ddH2O作为阴性对照，分别配制包含荧光标记报告分子和生物素标记报告分子的检测体系对其进行检测，反应结束后观察荧光显色反应及试纸条T检测线显示状况。结果如图4所示，a显示通过蓝光照射，只有ASFV核酸模板组发出绿色荧光，其余对照组无荧光；b显示酶标仪在37℃下测定1h，也只有ASFV模板组显示荧光信号。c和d显示相应地，试纸条检测只有ASFV组T线出现条带，其余对照组无条带出现。上述结果表明，该KP177R RPA-gRNA-CRISPR/Cas12a检测方法特异性良好。
2.5KP177R RPA-CRISPR/Cas12a测定的灵敏度
本发明将KP177R阳性质粒模板pMD18-T-KP177R进行十倍系列稀释，获得6.83×109、6.83×108、6.83×107、6.83×106、6.83×105、6.83×104、6.83×103、6.83×102、6.83×101、6.83×100copies/μL系列稀释度的核酸样品作为RPA扩增模板。分别配制包含荧光标记报告分子和生物素标记报告分子的检测体系对其进行gRNA-CRISPR/Cas12a检测。结果如图5所示：a显示在蓝光照射下，最低可在6.83×101copies/μL浓度模板的管中观察到绿色荧光反应；b酶标仪在37℃下测定1h，最低可在6.83×101copies/μL浓度模板的管中检测到荧光信号。c和d显示相应地，试纸条检测时最低可在6.83×101copies/μL浓度模板的反应液中观察到T线出现以及T/C比值。以上结果表明KP177R RPA-CRISPR/Cas12a荧光素标记检测体系和生物素标记检测体系的检测灵敏度较高，检测限均可达6.83×101copies/μL浓度的病毒核酸。
2.6KP177R RPA-CRISPR/Cas12a测定的重复性
本发明选择6.83×107、6.83×105、6.83×103copies/μL 3个浓度的KP177RDNA的RPA扩增产物作为模板，测定CRISPR/Cas12a检测的重复性。在三个月的采样过程中，相同浓度的ASFV DNA对应T线的信号强度与C线的比值没有明显变化(图6)。结果表明，KP177RRPA-CRISPR/Cas12a具有良好的重复性。
2.7KP177R RPA-CRISPR/Cas12a测定与RT-qPCR的符合率
从临床样本中扩增出10个KP177R基因片段，同时使用KP177RRPA-CRISPR/Cas12a和RT-qPCR进行检测。这两种方法的符合率为100％，其对应kappa值为1.000(p<0.001)。检测结果(如图7所示)表明KP177RRPA-CRISPR/Cas12a与RT-qPCR针对同一批临床样本具有良好的检测结果符合率。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种引物对，其特征在于，包括：
RPA-F：GACAATTTCTACATTGCTTATTGCTCTTAT，
RPA-R：CCACAATCTTTATCTACTTTACAGACCTTT。
2.一种gRNA，其特征在于，包括：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACAUUGCUUAUUGCUC UUA。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对，和/或权利要求2所述的gRNA。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Cas12a蛋白或其编码基因，或信号报告分子中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述信号报告分子为荧光报告分子或生物素标记分子。
6.权利要求1所述的引物对，或权利要求2所述的gRNA，或权利要求3-5任一项所述的试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。
7.一种检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，包括：
提取待测样品的DNA；采用权利要求1所述的引物对，或权利要求3-5任一项所述的试剂盒进行RPA反应后进行检测；根据检测结果进行判断。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RPA反应的条件为金属浴中在35～40℃的条件下反应25～45分钟。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述根据检测结果进行判断包括：
根据信号报告分子类型对应的检测结果判断所述待测样品中是否包括检测非洲猪瘟病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，当所述信号报告分子为荧光报告分子时，对应的检测结果是在35～40℃的条件下反应25～40分钟后得到的，反应体系中所用的Cas12a蛋白浓度为90～110nM，gRNA浓度为90～110nM；当所述信号报告分子为生物素标记分子时，对应的检测结果是在37～42℃的条件下反应15～25分钟，之后在试纸条上孵育6～10分钟得到的。
CN202311026324.8A 2023-08-15 2023-08-15 一种检测非洲猪瘟病毒引物对、gRNA、试剂盒和方法 Pending CN117286289A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311026324.8A CN117286289A (zh) 2023-08-15 2023-08-15 一种检测非洲猪瘟病毒引物对、gRNA、试剂盒和方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311026324.8A CN117286289A (zh) 2023-08-15 2023-08-15 一种检测非洲猪瘟病毒引物对、gRNA、试剂盒和方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117286289A true CN117286289A (zh) 2023-12-26

Family

ID=89247034

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311026324.8A Pending CN117286289A (zh) 2023-08-15 2023-08-15 一种检测非洲猪瘟病毒引物对、gRNA、试剂盒和方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117286289A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110760620A (zh) 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法
CN106957927A (zh) 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用
WO2018059195A1 (zh) 一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的hrm检测引物、试剂盒及方法
CN111286559B (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
CN111471797B (zh) 用于检测猫冠状病毒的rt-rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法
Postel et al. Development of a new LAMP assay for the detection of CSFV strains from Cuba: a proof-of-concept study
Zhang et al. An isothermal molecular point of care testing for African swine fever virus using recombinase-aided amplification and lateral flow assay without the need to extract nucleic acids in blood
Li et al. Development of a recombinase-aided amplification combined with lateral flow dipstick assay for the rapid detection of the African swine fever virus
CN108624713B (zh) 一种猪伪狂犬病疫苗毒与野毒鉴别检测的方法及试剂盒
CN110804677B (zh) 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的巢式二重pcr检测引物及试剂盒
KR102019804B1 (ko) 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 검출방법
CN113862262A (zh) 用于检测丙型肝炎病毒的raa引物、试剂盒及其应用
CN113718045A (zh) 用于检测4种鲍特菌和特异性检测百日咳鲍特菌的dna片段、引物、探针和试剂盒及应用
CN109486973A (zh) 一种利用重组酶聚合酶等温扩增技术快速检测淋病奈瑟菌的可视化方法
CN116814857A (zh) 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法
CN116814859A (zh) 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法
AU2021103861A4 (en) Method and kit for differentially detecting porcine pseudorabies vaccine virus and wild virus
AU2021104086A4 (en) Detection reagent for fluorescent duplex pcr for classical swine fever virus and african swine fever virus, kit, and detection method
CN117286289A (zh) 一种检测非洲猪瘟病毒引物对、gRNA、试剂盒和方法
KR101498705B1 (ko) 결핵 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 결핵 진단 방법
CN108676922A (zh) 用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法
KR101503039B1 (ko) Ｃ형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 ｃ형 간염 바이러스 진단 방법
CN103882150A (zh) 猪细环病毒ii型检测的引物、探针及实时荧光pcr检测方法
CN103882151A (zh) 猪细环病毒i型检测的引物、探针及实时荧光pcr检测方法
CN116875744B (zh) 一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination