CN117285636A - 一种一抗后试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种一抗后试剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种一抗后试剂及其制备方法和应用。本发明的一抗后试剂的制备方法，包括如下步骤：(1)将含有抗鼠IgG抗体的血清通过proteinA/G纯化填料柱初步纯化，收集第一洗脱液；(2)步骤(1)所述的第一洗脱液经人IgG‑鼠IgG串联纯化柱亲和纯化，洗脱鼠IgG纯化柱并收集第二洗脱液；(3)步骤(2)所述的第二洗脱液经阴离子交换柱纯化，收集流穿液；(4)将步骤(3)所述的流穿液中溶剂置换获得一抗后试剂。本发明一抗后试剂的制备方法中增加了proteinA/G填料纯化和阴离子交换纯化，经实验验证，增加了一抗后试剂的特异性和灵敏度，适用于低表达蛋白的免疫组化检测。

Description

一种一抗后试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种一抗后试剂及其制备方法和应用，属于生物学检测技术领域及免疫学技术领域。
背景技术
免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)是指通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位对病理组织中相应抗原显色进行定性、定位或定量测定的一项免疫学检测技术。
免疫组织化学(免疫组化)实验过程起始于组织玻片的前处理，一抗孵育，二抗的滴加，DAB显色，终止于苏木素复染，最后在镜下进行观察和作出判断。其中，免疫组化二抗检测系统，又称“免疫组化一抗诊断试剂信号显示和放大系统”，它在一抗单克隆抗体特异性抗原-抗体反应后使用，起着特异、敏感和稳定的信号显示和放大的作用，是免疫组化能否取得良好结果的重要一环。传统的免疫组化二抗检测系统是组织细胞中的抗原与一抗相结合，二抗再与一抗相结合，通过显色液对二抗上的标记物进行显色，达到微观可见。随着人们对免疫组化检测灵敏度和特异性要求的提高，以及对一些表达丰度低的蛋白检测的需求量增加，逐渐开发出二步法检测系统。二步法检测系统与传统的免疫组化二抗检测系统相比，增加了一抗后试剂，组织细胞中的抗原与一抗相结合后，一抗后试剂先与一抗相结合，二抗再与一抗后试剂相结合进行显色。二步法检测系统由于具有背景低、操作简便，增强了抗体的特异性，提高抗体的稀释比，节约了成本等优点，近几年被广泛应用。
目前，在国内市场，罗氏诊断，徕卡病理，安捷伦-DAKO等国际巨头通过将全自动IHC染色仪与自主研发的二抗检测系统试剂(包括一抗后试剂和二抗试剂等)绑定，形成闭环模式，垄断了85％左右的市场份额，获取了高额利润。由于国内相关产业链的薄弱和此项技术的欠缺，国产免疫组化品牌迈新、中杉等以进口原料和分装试剂为主。而且，目前市场上存在的一抗后试剂针对低丰度蛋白(低表达蛋白)的第一抗体的结合活性参差不齐，检测灵敏度和特异性均相对不高。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种一抗后试剂的制备方法，以解决现有技术中一抗后试剂检测的灵敏度和特异性相对较低的问题。
本发明的第二个目的是提供一种一抗后试剂，以解决现有技术中一抗后试剂针对低表达蛋白的第一抗体的结合活性参差不齐，检测灵敏度和特异性均相对不高的问题。
本发明的第三个目的是提供一抗后试剂在免疫组化低表达蛋白检测中应用，以解决现有技术中低表达蛋白检测的灵敏度和特异性相对较低的问题。
本发明的第四个目的是提供一抗后试剂在制备免疫组化检测试剂和/或检测试剂盒中的应用，以解决现有技术中低表达蛋白检测的灵敏度和特异性相对较低的问题。
为了实现上述目的，本发明中一抗后试剂的制备方法的技术方案是：
一种一抗后试剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将含有抗鼠IgG抗体的血清通过proteinA/G纯化填料柱初步纯化，收集第一洗脱液；
(2)步骤(1)所述的第一洗脱液经人IgG-鼠IgG串联纯化柱亲和纯化，洗脱鼠IgG纯化柱并收集第二洗脱液；
(3)步骤(2)所述的第二洗脱液经阴离子交换柱纯化，收集流穿液；
(4)将步骤(3)所述的流穿液中溶剂置换获得一抗后试剂。
上述技术方案的有益效果在于：与现有技术相比，本发明一抗后试剂的制备方法中增加了proteinA/G填料纯化和阴离子交换纯化，而且抗体亲和纯化阶段将用于去除交叉的人IgG亲和纯化柱与用于亲和反应的鼠IgG亲和柱串联，减少抗体的纯化步骤，进而减少抗体经多步纯化致使抗体活性受损，进一步提高抗体的特异性和灵敏度。经实验验证，增加了一抗后试剂的特异性和灵敏度。而且本发明的方法步骤简单，适合大规模生产获得大量的一抗后试剂。
作为进一步地改进，步骤(1)中所述含有抗鼠IgG抗体的血清为含有抗鼠IgG抗体的兔血清。
上述技术方案的有益效果在于：本发明通过纯化方式和具体纯化步骤的选择优化，开发出一套适合含有抗鼠IgG抗体的兔血清的纯化过程。兔相比山羊，具有价格低、生长周期短、易于饲养的优点，能显著降低一抗后试剂的生产成本。
作为进一步地改进，步骤(1)(2)包括第一洗脱液和第二洗脱液的中和；所述中和为加入pH为8～8.5、浓度为0.1～0.2M的Tris缓冲液。
上述技术方案的有益效果在于：将Tris缓冲液快速加入洗脱液中并混匀，达到调整洗脱液pH值至pH7.2～7.5，减少抗体活性受损。
作为进一步地改进，步骤(3)中所述第二洗脱液中抗体的浓度为1～1.5mg/mL。
上述技术方案的有益效果在于：将洗第二洗脱液中抗体的浓度调整1～1.5mg/mL范围内，再进行阴离子交换柱纯化，能有效地利用阴离子交换柱纯化去除杂质蛋白，提高一抗后试剂的抗体纯度。
作为进一步地改进，步骤(4)中所述溶剂置换为流穿液经超滤将溶剂置换为PBS缓冲液或TBS缓冲液。具体地，所述置换还可以采用透析的方式。
上述技术方案的有益效果在于：将流穿液的溶剂置换为PBS或TBS缓冲液，能减少后续免疫组化实验时，无关离子对免疫组化结果的影响，提高检测的灵敏度。
作为进一步地改进，所述超滤的截留分子量为30～35KD。
作为进一步地改进，步骤(4)中所述一抗后试剂中抗体的浓度为5～10mg/mL。
为了实现上述目的，本发明中一抗后试剂的技术方案是：
一种由上述一抗后试剂的制备方法制备的一抗后试剂。
上述技术方案的有益效果在于：本发明一抗后试剂的制备方法制备获得的一抗后试剂，特异性好，灵敏度高。经检测证明，同等反应条件时，浓度为1.5μg/mL的一抗后试剂的免疫组化染色，与浓度为2μg/mL的市售进口一抗后试剂的免疫组化染色效果相当。
为了实现上述目的，本发明中一抗后试剂在免疫组化低表达蛋白检测中应用的技术方案是：
一抗后试剂在免疫组化低表达蛋白检测中应用。
上述技术方案的有益效果在于：本发明的一抗后试剂灵敏度高，节省使用原料，并且原料易于规模化生产。
为了实现上述目的，本发明中一抗后试剂在制备免疫组化检测试剂和/或检测试剂盒中的应用的技术方案是：
一抗后试剂在制备免疫组化检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
上述技术方案的有益效果在于：本发明的一抗后试剂特异性好、灵敏度高，可以制备成免疫组化检测试剂或/和检测试剂盒。
具体地，所述检测包括基础研究和/或临床病理诊断。所述基础研究包括确定细胞内抗原和/或对其进行定位、定性及半定量的分析；所述临床病理诊断包括判断肿瘤的来源、分类、鉴别诊断和/或评估临床治疗。
附图说明
图1为本发明实验例1中肺组织中CK7免疫组化染色图(A为使用2μg/mL的市售进口一抗后试剂；B、C分别为使用1.5μg/mL和2μg/mL实施例2制备的一抗后试剂，100×)；
图2为本发明实验例1中肺组织中P63免疫组化染色图(A为使用2μg/mL的市售进口一抗后试剂；B、C分别为使用1.5μg/mL和2μg/mL实施例2制备的一抗后试剂，100×)；
图3为本发明实验例1中乳腺组织中ER免疫组化染色图(A为使用2μg/mL的市售进口一抗后试剂；B、C分别为使用1.5μg/mL和2μg/mL实施例2制备的一抗后试剂，100×)；
图4为本发明实验例2中胰腺组织中CK7免疫组化染色图(A为使用1.5μg/mL的实施例2制备的一抗后试剂；B为使用1.5μg/mL对比例1制备制备的一抗后试剂，100×)；
图5为本发明实验例2中乳腺组织中HER2免疫组化染色图(A为使用1.5μg/mL的实施例2制备的一抗后试剂；B为使用1.5μg/mL对比例1制备制备的一抗后试剂，100×)；
图6为本发明实验例2中肠组织中MSH2免疫组化染色图(A为使用1.5μg/mL的实施例2制备的一抗后试剂；B为使用1.5μg/mL对比例1制备制备的一抗后试剂，100×)；
图7为本发明实验例3中肠组织中MSH2免疫组化染色图(A为兔抗鼠IgG抗体浓度为1mg/mL进行离子交换制备的一抗后试剂，使用浓度为1.5ug/mL；B为兔抗鼠IgG抗体浓度为5mg/mL离子交换制备的一抗后试剂，使用浓度为1.5ug/mL，100×)；
图8为本发明实验例3中阑尾组织中MSH6免疫组化染色图(A为兔抗鼠IgG抗体浓度为1mg/mL进行离子交换制备的一抗后试剂，使用浓度为1.5ug/mL；B为兔抗鼠IgG抗体浓度为5mg/mL离子交换制备的一抗后试剂，使用浓度为1.5ug/mL，100×)；
图9为本发明实验例3中淋巴瘤组织中MUM1免疫组化染色图(A为兔抗鼠IgG抗体浓度为1mg/mL进行离子交换制备的一抗后试剂，使用浓度为1.5ug/mL；B为兔抗鼠IgG抗体浓度为5mg/mL离子交换制备的一抗后试剂，使用浓度为1.5ug/mL，100×)；
图10为本发明实验例4中肠组织中MSH2免疫组化染色图(A为5倍稀释市售一抗后试剂；B为5倍稀释本发明一抗后试剂，100×)；
图11为本发明实验例4中阑尾组织中MSH6免疫组化染色图(A为5倍稀释市售一抗后试剂；B为5倍稀释本发明一抗后试剂，100×)；
图12为本发明实验例4中扁桃体组织中CD30免疫组化染色图(A为5倍稀释市售一抗后试剂；B为5倍稀释本发明一抗后试剂，100×)。
具体实施方式
本发明提供一抗后试剂的制备方法，本发明所指的一抗后试剂为兔抗鼠抗体，所述的制备方法如下：
(1)获取鼠IgG抗体，将抗体加入弗氏佐剂中，得到免疫试剂，免疫健康的未经免疫的SPF级新西兰兔，免疫剂量为200μg/只。采用腿部肌肉注射方法进行免疫，每次间隔14～21天，每次免疫剂量均相同，经免疫3～5次后采集血液。将获得的全血37℃水浴1h，离心分离血细胞获得兔血清；
(2)取兔血清使用5～9倍体积pH7～8的平衡缓冲液(0.02M Na2HPO4，0.15M NaCl)进行稀释，稀释过的抗体溶液由纯化仪纯化，所用的纯化柱为：protein A/G，将抗体溶液流经纯化柱，再用5～6个柱体积的平衡缓冲液冲洗纯化柱，最后使用2～4个柱体积洗脱缓冲液(pH2.5～3.00.1M甘氨酸缓冲液)洗脱柱子，洗脱产物中含有兔抗鼠抗体。在得到的洗脱液中加入8～12％体积的pH 8～8.5 1M Tris缓冲液进行中和。
(3)将中和后的溶液通过上端为人IgG多抗的亲和填料柱下端为鼠IgG的亲和填料柱的组合填料柱，再用5～6倍柱体积平衡缓冲液冲洗纯化柱，最后使用2～3倍柱体积的洗脱缓冲液(pH2.5～3.0 0.1M甘氨酸缓冲液)洗脱鼠IgG纯化柱，在流出的洗脱缓冲液中加入8～12％体积的pH 8～8.5 1M Tris缓冲液进行中和。
(4)将步骤(3)得到的抗体通过超滤将溶液置换为pH5.5～6.5 0.2M柠檬酸钠缓冲液，并调整浓度为1～1.5mg/mL。将抗体通过Q阴离子交换柱，收集流穿液。将得到的流穿液使用PBS或TBS缓冲液在30～35KD超滤管中超滤3～4次，去除柠檬酸盐缓冲液，并调整浓度为5～10mg/mL，所得试剂即为一抗后试剂。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；但这些实施例仅是个范例，并不对本发明的范围构成任何限制，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂家购买得到的。
实验材料：
抗体纯化填料protein A/G由nProtein A Sepharose FF和Protein G Sepharose4Fast Flow填料以1：1比例混合，nProtein A Sepharose FF填料采购cytiva公司，货号：17528001；Protein GSepharose 4Fast Flow填料采购cytiva公司，货号：17061801；Q阴离子交换柱填料采购cytiva公司，货号：17051010；第一抗体CK7，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：CCM-0992；第一抗体P63，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：CPM-0160；第一抗体ER，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：CEM-0081；第一抗体HER2，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：CCM-0844；第一抗体MSH2，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：CMM-0190；第一抗体MSH6，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：CMM-0202；第一抗体MUM1，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：CMM-0303；第一抗体CD30，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：CMM-0523；羊抗兔二抗，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD5300。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
一、本发明一种一抗后试剂及其制备方法的具体实施例
实施例1小鼠IgG免疫原制备
本实施例制备小鼠IgG免疫原，具体实施方式如下：
1、取8～10只未经过免疫的SPF级小鼠分别采血3mL，将获得的小鼠全血37℃水浴1h，离心分离血细胞获得血清。
2、在小鼠血清中加入9倍体积的pH7.4平衡缓冲液(0.02M Na2HPO4，0.15M NaCl)稀释，并用0.22μm的滤膜过滤。
3、将稀释过滤后的血清使用纯化柱进行纯化，纯化柱中为proteinA填料，血清流经纯化柱后，使用5倍柱体积的pH7.4平衡缓冲液清洗，然后使用4倍柱体积洗脱缓冲液(pH2.5的0.1M甘氨酸缓冲液)进行洗脱，最终得到洗脱液(洗脱液为包含小鼠IgG的洗脱产物)。
4、在得到的洗脱液中加入10％体积的pH 8.0 1M Tris缓冲液进行中和，得到的中和溶液中含有小鼠IgG免疫原。
5、通过超滤的方法，将中和溶液中的溶剂置换为PBS缓冲液，并调整IgG的浓度为10mg/mL。
实施例2一抗后试剂的制备
本实施例使用实施例1制备的小鼠IgG免疫原免疫健康的新西兰兔，获得血清后，经过初步proteinA/G填料纯化、亲和纯化及人IgG的交叉反应的去除和阴离子交换纯化，获得一抗后试剂，具体实施方式如下：
2.1动物免疫
使用实施例1制备的小鼠IgG免疫原，免疫成年健康新西兰兔，免疫方式采取腿部肌肉注射免疫，免疫佐剂为弗氏佐剂，具体过程如下：
1、将实施例1获得的小鼠IgG免疫原按照1：1的体积比例加入弗氏佐剂中并乳化，得到免疫试剂。
2、挑选健康的未经免疫的SPF级新西兰兔，采用腿部肌肉注射方法进行免疫，共免疫三次，每次间隔14天，免疫剂量均相同，为200μg/只。
3、第三次免疫后第7天采耳缘静脉血对免疫效果进行评估，经ELISA检测血清效价不小于64万，血清效价合格后对兔子进行免疫原冲击免疫，第四天时通过心脏采血采集血液。
4、将全血37℃水浴1h，离心分离血细胞获得血清。
2.2抗体初步纯化
将2.1获得的兔血清经过纯化柱进行初步纯化，纯化柱中为proteinA/G填料，具体过程如下：
1、将兔血清使用pH7.4的平衡缓冲液稀释9倍体积，并使用0.22μm滤膜过滤以免纯化时堵塞纯化柱。
2、将稀释后的兔血清使用纯化柱进行纯化，纯化柱中为proteinA/G填料，血清流经纯化柱后，使用5倍柱体积pH7.4的平衡缓冲液(0.02M Na2HPO4，0.15M NaCl)清洗，然后使用洗脱缓冲液(pH2.5的0.1M甘氨酸缓冲液)进行洗脱，最终得到4倍柱体积的洗脱液(洗脱液为包含抗体的洗脱产物)。
3、在得到的洗脱液中加入10％体积的pH 8.0 1M Tris缓冲液进行中和，得到的缓冲液中含有兔抗鼠IgG抗体。
2.3亲和纯化及人IgG的交叉反应的去除
1、将人IgG纯化柱和鼠IgG纯化柱串联，人IgG纯化柱在上。
2、将2.2得到的含有兔抗鼠IgG抗体的缓冲液(使用9倍体积的平衡缓冲液稀释)通过串联纯化柱，再用5倍柱体积pH7.4的平衡缓冲液冲洗纯化柱。
3、解除纯化柱串联，使用2-3倍柱体积的洗脱缓冲液(pH2.5的0.1M甘氨酸缓冲液)洗脱鼠IgG纯化柱，最终得到洗脱液。
4、在流出的洗脱缓冲液中加入10％体积的pH 8.0 1M Tris缓冲液进行中和，得到的缓冲液中含有兔抗鼠IgG抗体。
2.4阴离子交换纯化
1、将2.3得到的缓冲液通过超滤将溶剂置换为pH5.5 0.2M柠檬酸钠缓冲液，并调整兔抗鼠IgG抗体浓度为1mg/mL。
2、将抗体溶液以0.5mL/min流速通过1mL Q阴离子交换柱，收集流穿液。
3、将得到的流穿液使用PBS缓冲液在30KD超滤管中超滤3次，去除柠檬酸盐缓冲液，并调整兔抗鼠IgG抗体浓度为5mg/mL。所得的试剂即为一抗后试剂。
二、对比例
对比例1
本对比例使用实施例1制备的小鼠IgG免疫原，与实施例2的区别在于：不含有阴离子交换纯化的步骤。兔血清经过初步proteinA/G填料纯化、亲和纯化及人IgG的交叉反应的去除后，将含有兔抗鼠IgG抗体的缓冲液通过超滤方式，将缓冲液中的溶剂置换成PBS缓冲液，并调整兔抗鼠IgG抗体浓度为5mg/mL，所得的试剂即为一抗后试剂。
对比例2
本对比例使用实施例1制备的小鼠IgG免疫原，与实施例2的区别在于：在阴离子交换纯化的步骤中调整兔抗鼠IgG抗体浓度为5mg/mL。兔血清经过初步proteinA/G填料纯化、亲和纯化及人IgG的交叉反应的去除后，将含有兔抗鼠IgG抗体的缓冲液通过超滤方式，将缓冲液中的溶剂置换成pH5.5 0.2M柠檬酸钠缓冲液，并调整兔抗鼠IgG抗体浓度为5mg/mL，再进行Q阴离子交换柱，收集流穿液，超滤去除柠檬酸盐缓冲液，并调整兔抗鼠IgG抗体浓度为5mg/mL，所得的试剂即为一抗后试剂。
三、实验例一抗后试剂在免疫组化低表达蛋白检测中应用
实验例1
为了验证本发明所制备一抗后试剂的可用性和特异性，选取乳腺、肺、肠等病理组织进行免疫组化验证，验证步骤如下：
1、选取乳腺、肺石蜡组织样本切片(所述的乳腺石蜡组织切片为同一块石蜡包埋乳腺组织连续切割获得，肺石蜡组织切片同乳腺石蜡组织切片)，切片厚度为3μm，65℃烤片2h。
2、脱蜡与水化：
步骤1中烤片完成后的石蜡切片依次经过以下处理进行脱蜡与水化：二甲苯15min-二甲苯15min-无水乙醇5min-无水乙醇5min-90％乙醇5min-80％乙醇5min-70％乙醇5min，纯化水浸泡5min。
3、抗原修复：
pH9.0的EDTA抗原修复液加热煮沸后放入组织切片，微沸模式水浴20min，室温冷却5min，流动自来水冲洗至室温后，取出切片并纯化水浸泡5min，TBST冲洗浸泡5min。
4、封闭：
在修复后的切片上加过氧化物酶封闭剂，100μL/张，室温孵育5min，TBST冲洗浸泡5min/次，共2次。
5、一抗孵育：
每张切片加入一抗工作液100μL，室温孵育30min，TBST冲洗浸泡5min/次，共2次。所使用一抗为鼠源一抗，检测指标分别为CK7、P63、ER。
6、一抗后孵育：
每张切片加入一抗后试剂工作液100μL，室温孵育20min，TBST冲洗浸泡5min/次，共2次。
7、二抗孵育：
每张切片加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗工作液100μL，室温孵育30min，TBST冲洗浸泡5min/次，共2次。
8、显色：
每张切片滴加100μL DAB显色液，室温孵育4min，纯化水浸泡2次，5min/次。
9、复染：
每张切片滴加100μL苏木素染液，室温孵育4min，纯化水冲洗干净。
10、脱水透明：常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明。
11、中性树胶封片观察。
上述免疫组化实验的分组如下：
对照组：浓度为2μg/mL的市售进口一抗后试剂(品牌Jackson，AffiniPure RabbitAnti-Mouse IgG(H+L)Code：315-005-045)。
实验组1：浓度为1.5μg/mL的一抗后试剂。
实验组2：浓度为2μg/mL的一抗后试剂。
本实施例中所制备的一抗后试剂与进口产品的染色结果如图1、图2和图3所示。
由图中的对比结果可知，与对照一抗后试剂相比(图1A，图2A，图3A)，本发明制备一抗后试剂具有较好的特异性与亲和力，一抗后试剂浓度在1.5μg/mL(图1B，图2B，图3B)即可达到较强的染色效果以及较佳的背景。从图中可以看出，与对照组相比(图1A，图2A，图3A)，随一抗后试剂使用浓度的提高，CK7在肺组织以及坏死区染色强度、P63在肺组织中阳性区域染色以及ER在乳腺阳性区域染色强度提高(图1B-C，图2B-C，图3B-C)，且在1.5μg/mL工作浓度(图1B，图2B，图3B)下可达到与对照染色强度相当(图1A，图2A，图3A)。当2μg/mL工作浓度下染色强度明显提升，且染色背景仍保持干净(图1C，图2C，图3C)。
实验例2
为了验证本发明所制备一抗后试剂的可用性和特异性，使用对比例1制备的一抗后试剂。选取乳腺、肠、胰腺病理组织进行免疫组化验证，免疫组化验证步骤同实验例1所述。
对比免疫组化染色结果可知，在相同使用浓度下，未经离子交换制备的一抗后试剂染色效果差于经离子交换制备的一抗后试剂。未经离子交换组在免疫组化染色中表现阳性稍强，背景偏黄，存在非特异性染色的情况，如图4、5、6所示。与图4A对比，图4B阳性位置稍强，胰岛染色稍强，背景偏黄。与图5A对比，图5B在细胞膜和细胞质均有阳性着色，存在质染非特异性着色，背景黄。与图6A对比，图6B阳性位置发黄，坏死区染色重。
实验例3
为了验证本发明所制备一抗后试剂的可用性和特异性，使用对比例2制备的一抗后试剂。选取肠、阑尾、淋巴瘤病理组织进行免疫组化验证，免疫组化验证步骤同实验例1所述。
对比免疫组化染色结果可知，在相同使用浓度下，兔抗鼠IgG抗体浓度为5mg/mL离子交换制备的一抗后试剂染色效果差于经1mg/ml离子交换制备的一抗后试剂。5mg/mL经离子交换组在免疫组化染色中表现阳性稍强，背景偏黄如图7、8、9所示。与图7A对比，图7B阳性位置发黄，坏死区染色重。与图8A对比，图8B阳性位置染色重且发黄。与图9A对比，图9B阳性位置比例增加，细胞间质染色发黄。
实验例4
为了验证本发明所制备一抗后试剂的灵敏度，使用实施例2制备的一抗后试剂，与市售一抗后试剂，且均稀释5倍进行免疫组化染色的效果对比。选取肠、阑尾、扁桃体病理组织进行免疫组化验证，免疫组化验证步骤同实验例1所述。
对比免疫组化染色结果可知，在相同稀释倍数下即稀释5倍，本发明制备的一抗后试剂染色强度大于市售一抗后试剂。说明本发明制备的一抗后试剂灵敏度更高，更适合低表达蛋白的检测。与图10A对比，图10B阳性位置染色重；与图11A对比，图11B阳性位置染色重。与图12A对比，图12B阳性位置比例增加，染色重。
最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种一抗后试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将含有抗鼠IgG抗体的血清通过proteinA/G纯化填料柱初步纯化，收集第一洗脱液；
(2)步骤(1)所述的第一洗脱液经人IgG-鼠IgG串联纯化柱亲和纯化，洗脱鼠IgG纯化柱并收集第二洗脱液；
(3)步骤(2)所述的第二洗脱液经阴离子交换柱纯化，收集流穿液；
(4)将步骤(3)所述的流穿液中溶剂置换获得一抗后试剂。
2.根据权利要求1所述的一抗后试剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述含有抗鼠IgG抗体的血清为含有抗鼠IgG抗体的兔血清。
3.根据权利要求1所述的一抗后试剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)(2)包括第一洗脱液和第二洗脱液的中和；所述中和为加入pH为8～8.5、浓度为0.1～0.2M的Tris缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一抗后试剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述第二洗脱液中抗体的浓度为1～1.5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一抗后试剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述溶剂置换为流穿液经超滤将溶剂置换为PBS缓冲液或TBS缓冲液。
6.根据权利要求5所述的一抗后试剂的制备方法，其特征在于：所述超滤的截留分子量为30～35KD。
7.根据根据权利要求1所述的一抗后试剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述一抗后试剂中抗体的浓度为5～10mg/mL。
8.一种如权利要求1～7任一项所述的一抗后试剂的制备方法制备的一抗后试剂。
9.一种如权利要求8所述的一抗后试剂在免疫组化低表达蛋白检测中应用。
10.一种如权利要求8所述的一抗后试剂在制备免疫组化检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
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