CN117279889A - 经取代的氟硫酸盐及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种经取代的氟硫酸盐及其用途，并且在本申请中研发了具有增强反应性的氟取代的氟硫酸盐和非天然氨基酸(共价氨基酸，PrUAA)。
Description
背景技术
共价药物以其独特的性质吸引了基础科研和工业界的广泛关注。共价药物共价结合抗原的过程分为两步：首先，通过可逆的非共价相互作用与靶标结合；然后，在邻近效应的促进下药物中的活性基团同靶标上的亲电氨基酸残基反应，从而形成共价键连接的偶联物。额外形成的共价键使药物分子不再从靶标上解离，从而延长了药物分子的作用时间。因此，与非共价形式的药物相比，共价药物将具有更强，更持久的功效。
受限于小分子药物的自身结构，它们通常以抑制剂的形式结合在靶蛋白的“口袋”中。而以抗体为代表的蛋白质药物则可以特异性地结合大面积的相互作用表面，从而破坏蛋白-蛋白相互作用。在临床实践中，完整的IgG抗体具有优越的药代动力学性质，但由于其尺寸较大，只能与组织表面的抗原结合。片段抗体具有更好的组织渗透性，但半衰期较差。如果片段抗体同抗原共价结合，长久的停留在作用部位，则可以在克服半衰期短缺点的同时保留浸润性的优点。
借助遗传密码子扩展技术，我们可以将带有新的化学官能团的非天然氨基酸引入靶蛋白中，从而大大扩展了蛋白质工程化的空间。原则上，共价蛋白药物应特异性地与靶抗原交联，同时避免与体系中的活性化合物或其他蛋白质反应。该特性要求引入的邻近反应性非天然氨基酸(共价氨基酸，PrUAA)的残基必须具有适度的反应性，既可以在复杂的生物系统中稳定地存在，又在结合靶标后快速发生交联反应。显然，共价氨基酸的“头部官能团”弹头是影响共价蛋白药物交联效率的关键因素之一，然而满足上述条件的官能团很少。因此，开发生物相容和高邻近反应性的官能团和对应的共价氨基酸将极大地促进共价蛋白药物的发展。
发明内容
本申请提供了一种取代氟硫酸盐及其用途。并且在本申请中开发了氟代氟硫酸盐和相关的具有增强反应性的共价氨基酸。共价蛋白药物以其独特的理化性质吸引了基础科研和工业界的广泛关注，利用遗传密码子扩展技术将具有邻近反应性的非天然氨基酸(PrUAAs)插入到蛋白质的特定位点中是赋予蛋白质共价结合能力的重要方法之一，遗憾的是目前可供选择的共价氨基酸有限，极大地限制了共价蛋白药物的发展。氟硫酸盐具有良好的生物相容性，可以在生物体内稳定存在，然而初步的实验结果表明其邻近反应活性较差。因此，我们通过生物酶催化和化学合成相结合的方法得到了氟取代氟硫酸盐和邻近反应性增强的PrUAAs。在此基础上，我们进一步开发了一系列靶向PD-L1的共价单域抗体，并证实了它们在恢复T细胞活性方面的拥有更强的功效，展示了共价抗体作为新一代生物药物的潜力。
一方面，本申请提供了一种具有以下结构(I)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种具有以下结构(II)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种具有以下结构(I-A)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种具有以下结构(I-P)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种具有以下结构(II-A)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种具有以下结构(II-P)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种具有以下结构的化合物：
其中，所述X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种具有以下结构的化合物：
其中，所述X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种蛋白质，其包含本申请任一项所述的化合物的结构。
另一方面，本申请提供了一种包含具有以下结构(I)的非天然氨基酸的蛋白质：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种包含具有以下结构的非天然氨基酸的蛋白质：
另一方面，本申请提供了一种核酸，其包含编码本申请中任一项所述的蛋白质的序列。
另一方面，本申请提供了一种合成酶，其位于如SEQ ID NO：29的序列中所示的第366位和/或第367位的包含突变体。
另一方面，本申请提供了一种合成酶，其位于如SEQ ID NO：29的序列中所示的第366位和/或第367位的丙氨酸。
另一方面，本申请提供了一种合成酶，其包含序列SEQ ID NO:31和/或34。
另一方面，本申请提供了一种核酸，其包含编码本申请中任一项所述的合成酶的序列。
另一方面，本申请提供了一种核酸，其包含序列SEQ ID NO:30和/或33的序列。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请中任一项所述的核酸。
另一方面，本申请提供了一种组合，其包含本申请中任一项所述的合成酶和本申请中任一项所述的化合物。
另一方面，本申请提供了一种制备本申请中任一项所述的蛋白质的方法，其中所述方法包括提供本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的化合物和/或任何本申请中任一项所述的组合。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的的蛋白质、本申请中任一项所述的的核酸、本申请中任一项所述的的合成酶、本申请中任一项所述任一项的核酸、本申请中任一项所述的载体和/或本申请中任一项所述的组合。
另一方面，本申请提供了一种组合物，其包含本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的蛋白质、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的载体、本申请中任一项所述的组合和/或本申请中任一项所述的细胞，以及任选的药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的蛋白质、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的载体、本申请中任一项所述的组合、本申请中任一项所述的细胞和/或本申请中任一项所述的组合物。
另一方面，本申请提供了一种抑制PD-L1蛋白与PD-L1配体结合的方法，其中所述方法包括提供本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的蛋白质、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的载体、本申请中任一项所述的组合、本申请中任一项所述的细胞、本申请中任一项所述的组合物、本申请中任一项所述的组合物、和/或本申请种任一项所述的试剂盒。另一方面，本申请提供了一种交联PD-L1蛋白的方法，其中所述方法包括提供本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的蛋白质、本申请中任一项所述的核酸，本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的载体、本申请中任一项所述的组合、本申请中任一项所述的细胞、本申请中任一项所述的组合物和/或本申请中任一项所述的试剂盒。
另一方面，本申请提供了一种激活免疫细胞的方法，其中所述方法包括提供本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的蛋白质、本申请中任一项所述的核酸，本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的载体、本申请中任一项所述的组合、本申请中任一项所述的细胞、本申请中任一项所述的组合物和/或本申请中任一项所述的试剂盒。
另一方面，本申请提供了一种制备具有以下结构(M)的化合物的方法：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团；其中所述方法包括提供包含选自以下组成的组的序列的连接酶：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。
另一方面，本申请提供了一种连接酶，其包含选自以下组成的组的序列：SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27，所述连接酶用于制备具有以下结构(M)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
根据以下详细描述，本公开的附加方面和优点对于本领域技术人员来说将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开的说明性实施例。如将认识到的，本公开可以有其他不同的实施例，并且其若干细节能够在各种明显的方面被修改，所有这些都没有背离本公开。因此，附图和描述应被视为本质上是说明性的，而不是限制性的。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如每个单独的出版物、专利或专利申请都具体且单独地指明通过引用并入一样。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是具有增强反应性的吸电子的氟取代的氟硫酸盐的一般结构。
图2显示的是氟取代苯基硫酰氟的化学结构。
图3A-3D显示的是LC分析模型反应来测定氟取代苯基硫酰氟的邻近反应性。
图4显示的是氟取代苯基硫酰氟邻近反应性的结果。
图5显示的是不同来源的TPL对2-氟-L-酪氨酸合成的特异活性。
图6显示的是Cf TPL和Fn TPL在合成二氟取代的L-酪氨酸中的高效性。
图7显示的是TPL催化合成的氟取代的L-酪氨酸的化学结构。
图8显示的是氟取代的氟硫酸盐L-酪氨酸的化学结构。
图9A-9D显示的是LC分析模型反应来测定氟硫酸盐L-酪氨酸的邻近反应性。
图10显示的是氟取代氟硫酸盐L-酪氨酸的邻近反应性的结果。
图11A-11C显示的是tRNA合成酶文库的测序结果。在四轮阳性选择后，从随机突变的文库中获得了一种用于氟硫酸盐-2,6-二氟-L-酪氨酸的主要克隆V366A。(A)选择前。(B)三轮阳性选择后。(C)额外一轮阳性选择后。
图12显示的是通过GFP报告基因测定法检测琥珀抑制效率。GFP N194TAG在tRNA合成酶和相应的PrUAA的存在下表达。每组的荧光强度通过酶标仪测量，并按最大荧光强度进行归一化。
图13显示的是蛋白质免疫印迹分析琥珀抑制效率。在C端具有6xHis标签的GFPN194TAG在tRNA合成酶和相应的PrUAA的存在的下表达。每组的荧光强度通过酶标仪测量，并按最大荧光强度进行归一化。
图14A-14D显示的是通过ESI-MS将PrUAA成功掺入Nb-PD-L1的结果。(A)对于FSY，测得的分子量为16147Da(计算值为16148Da)。(B)对于m-F FSY，测得的分子量为16166Da(计算值为16147Da)。(C)对于o-F FSY，测得的分子量为16166DA(计算值为16166Da)。(D)对于2,5-diF FSY，测得的分子量为16183Da(计算值为16184Da)。
图15显示的是不同胶水抗体(Gluebody)与PD-L1的交联效率的比较。将纯化的蛋白质与PD-L1在37℃下孵育1小时后进行SDS-PAGE和考马斯蓝染色。
图16显示的是在与用指定蛋白药物处理的PD-L1+aAPC共培养12小时后，T细胞中荧光素酶活性的定量分析。方框和误差条表示平均值±平均值的标准误差(n＝3)。。
图17显示的是用pCMV EGFP Y40TAG和tRNA合成酶/tRNA转染的293T细胞的荧光图像。转染后将细胞与相应的PrUAA孵育24小时，然后进行荧光成像。比例尺＝150μm。
具体实施方式
虽然本文已经显示和描述了本发明的各种实施例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，这里描述的本发明实施例的各种替代方案可能被使用。
当取代基由其从左到右书写的常规化学式指定时，它们同样涵盖将由从右到左书写结构产生的化学相同的取代基，例如，-CH2O-等同于-OCH2-。
除非另有说明，否则“烷基”一词本身或作为另一取代基的组成部分时意指直链(即无支链)或支链碳链(或碳)，或其组合，可以是全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可以包括单价、二价和多价自由基。烷基可以包括指定数量的碳(例如，C1-C10意指一个到十个碳)。烷基为未环化的链。饱和烃基的示例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、甲基、同系物和异构体，例如正戊基、正己基、正庚基等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的示例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高价同系物和异构体。烷氧基是通过氧链(-O-)连接到分子余下部分的烷基。烷基部分可以是烯基部分。烷基部分可以是炔基部分。烷基部分可以是全饱和的。烯基可以包括一个以上的双键和/或除了一个或多个双键外的一个或多个三键。炔基可以包括一个以上的三键和/或除了一个或多个三键外的一个或多个双键。
除非另有说明，否则“烯基”一词本身或作为另一取代基的组成部分时意指从烷基衍生出的双价自由基，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-。通常，烷基(或烯基)基团将具有1到24个碳原子，其中在此更优选具有10个或更少碳原子的自由基。“低价烷基”或“低价烯基”是链较短的烷基或亚烷基基团，一般具有八个或更少的碳原子。除非另有说明，否则“亚烯基”一词本身或作为另一取代基的组成部分时意指从烯烃衍生出的双价自由基。
除非另有说明，否则“杂烷基”本身或作为另一术语的组成部分时意指一条稳定的直链或支链，或其组合，其中包括至少一个碳原子和至少一个杂原子(例如，O、N、P、Si和S)，并且其中氮原子和硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。杂原子(例如，N、S、Si或P)可以置于杂烷基的任何内部位置或烷基与分子其余部分连接的位置。杂烷基是一条非环化的链。例如包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CHO-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N(CH3)-CH3、-O-CH3、-O-CH2-CH3和-CN。最多可以不间断地具有两个或三个杂原子，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。杂烷基部分可以包括1、2、3、4或5个杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。杂烷基部分可以包括多达8个任选地不同杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。除非另有说明，否则“杂烯基”一词本身或作为另一术语的组成部分时意指包括至少一个双键的杂烷基。杂烯基可以任选地包括一个以上的双键和/或除了一个或多个双键外的一个或多个三键。除非另有说明，否则“杂炔基”一词本身或作为另一术语的组成部分时意指包括至少一个三键的杂烷基。杂炔基可以任选地包括一个以上的三键和/或除了一个或多个三键外的一个或多个双键。
除非另有说明，否则“杂亚烷基”本身或作为另一术语的组成部分时意指从杂烷基衍生的二价自由基，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基基团，杂原子也可以占据链末端中的一者或两者(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。此外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的公式书写方向并非暗示连接基团的定向。例如，公式-C(O)2R'表示-C(O)2R'-和-R'C(O)2-。如上所述，如本文所使用的，杂烷基基团包括通过杂原子连接到分子余下部分的基团，诸如-C(O)R'，-C(O)NR'，-NR'R"，-OR'，-SR'和/或-SO2R'。在描述诸如-NR'R"等特定杂烷基后描述“杂烷基”的情况下，应理解为术语杂烷基和-NR'R"并非冗余或互相排斥的。相反，描述特定杂烷基基团是为了增加清晰度。因此，术语“杂烷基”在本文不应被解释为排除特定的杂烷基基团，诸如-NR'R"等。
除非另有说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或于其他术语组合时分别意指“烷基”和“杂烷基”的环形版本。环烷基和杂环烷基都不是芳香族。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环连接到分子余下部分的位置。环烷基的示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的示例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。“环亚烷基”和“杂环亚烷基”单独使用或作为另一取代基的组成部分时意指分别从环烷基和杂环烷基中衍生的二价自由基。
在实施方案中，术语“环烷基”意指单环、双环或多环环烷基环体系。在某些方面，单环环系统为含有3至8个碳原子的环形烃基团，其中此类基团可以是饱和的或不饱和的，但不是芳香族的。在某些方面，环烷基基团是完全饱和的。单环环烷基的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。双环环烷基环体系是桥接的单环环或稠合的双环环。在某些方面，桥接的单环环包含一个单环形环烷基环，其中单环环的两个非相邻碳原子通过一个含有1至3个额外碳原子的亚烷基桥连接(即形式为(CH2)w的桥接基团，其中w为1、2或3)。
在实施方案中，环烷基是环烯基。术语“环烯基”按其平常的含义使用。在某些方面，环烯基是单环、双环或多环环烯基环体系。在某些方面，单环环烯基环系统是含有3至8个碳原子的环形烃基团，其中此类基团是不饱和的(即，至少含有一个环形碳碳双键)，但不是芳香族的。
在实施方案中，杂环烷基是一种杂环基。如本文所使用的，术语“杂环基”意指单环、双环或多环杂环。杂环基单环杂环是含有至少一个杂原子(独立地选自以下组成的组：O、N和S)的3、4、5、6或7元环，其中该环可以是饱和或不饱和的，但不是芳香族的。
除非另有说明，否则术语“卤”或“卤素”本身或作为另一取代基的组成部分时意指氟、氯、溴或碘原子。
除非另有说明，否则术语“酰基”意指-C(O)R，其中R是经取代或未取代的烷基、经取代或未取代的环烷基、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的杂环烷基、经取代或未取代的芳基或经取代或未取代的杂芳基。
除非另有说明，否则术语“芳基”意指一种多不饱和的芳香族烃取代基，其可以是单环或稠合在一起或共价键连接的多环(优选1到3个环)(即稠环芳基)。稠环芳基是指多个环稠合在一起，其中稠环中至少一个环是芳基环。术语“杂芳基”是指含有至少一个杂原子(诸如N、O或S)的芳基基团(或环)，其中氮原子和硫原子任选地被氧化，并且氮原子任选地被季铵化。
以上术语(例如，“烷基”，“杂烷基”，“环烷基”，“杂环烷基”，“芳基”和“杂芳基”)中的每个术语都包括所示自由基的经取代和未取代的形式。
环的取代基(例如，环烷基，杂环烷基，芳基，杂芳基，环亚烷基，杂环亚烷基，亚芳基，或杂亚芳基)可以被描绘呈环上的取代基，而不是某个环的特定原子上的取代基(通常被称为浮动取代基)。
两个或更多个取代基可以任选地连接以形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基基团。此类所谓的成环取代基通常(但不一定)与环状碱结构连接。
在实施方案中，在本文化合物中描述的每个经取代的基团都被至少一个取代基基团所取代。更具体地，在某些方面，在本文化合物中描述的每个经取代的烷基，经取代的杂烷基，经取代的环烷基，经取代的杂环烷基，经取代的芳基，经取代的杂芳基，经取代的亚烷基，经取代的杂亚烷基，经取代的环亚烷基，经取代的杂环亚烷基，经取代的亚芳基和/或经取代的杂亚芳基都被至少一个取代基基团所取代。在某些方面，这些基团中的至少一个或全部被至少一个大小受限的取代基基团所取代。在某些方面，这些基团中的至少一个或全部被至少一个低价取代基基团所取代。
本公开的某些化合物具有不对称碳原子(光学或手性中心)或双键；对映异构体、消旋体、非对映体、互变异构体、几何异构体、可以在绝对立体化学上定义为(R)-或(S)-或对于氨基酸定义为(D)-或(L)-的立体异构体形式、以及独立的异构体都包括在本公开的范围内。本公开的化合物不包括本领域已知过于不稳定而无法合成和/或分离的那些。本公开旨在包括消旋体形式和光学纯形式的化合物。光学活性(R)-和(S)-异构体或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用传统技术进行分解。当本文所述化合物含有烯键或其他几何不对称中心时，除非另外指出，否则该化合物同时包括E和Z几何异构体。
如本文所使用的，术语“异构体”是指具有相同数量和种类的原子并因此具有相同的分子量、但在原子的结构排列或构型方面存在差异的化合物。
如本文所使用的，术语“互变异构体”是指存在于平衡状态下并且可以轻易地从一种异构体形式转变为另一种形式的两个或更多结构异构体中的一个。
除非另有说明，否则本文所描绘的结构也意在包括该结构的所有立体化学形式；即每个不对称中心的R构型和S构型。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体和非对映异构体混合物均在本公开的范围内。
除非另有说明，否则本文所描绘的结构还意在包括仅在是否存在一个或多个同位素富集原子上不同的化合物。例如，除了将氢替换为氘或氚、或将碳替换为13C或14C富集的碳之外，具有本发明结构的化合物均处于本公开的范围内。
本公开的化合物还可以包含在构成此类化合物的一个或多个原子上存在非天然比例的同位素。例如，这些化合物可以用放射性同位素(诸如，例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)标记。本公开的化合物的所有同位素变体，无论是否具有放射性，均处于本发明的范围内。
应当指出的是，在整个申请中，以马库什组撰写替代方案，例如，每个包含一种以上可能的氨基酸的氨基酸位置。具体设想到，应当分别考虑马库什组的每个成员，从而构成另一种实施方案，而不是将马库什组视为单个单元。
“类似物”或“相似物”根据其在化学和生物学中的普通含义而使用，是指在结构上类似于另一种化合物(即所谓的“参考”化合物)但在组成上(例如通过用不同元素的原子替换一个原子)或在特定官能团的存在上、或在通过用另一个官能团替换一个官能团上、或在参考化合物的一个或多个手性中心的绝对立体化学上不同的化合物。因此，类似物是在功能和外观上类似或可比较、但在结构或来源上与参考化合物不同的化合物。
如本文所使用的，“一(a)”或“一(an)”意指一个或多个。如本文所使用的，短语“由一……取代的”意指指定基团可以用任何或所有所提及的取代基中的一个或多个替换。例如，在某个基团(诸如烷基或杂芳基基团)“被未取代的C1-C20烷基或未取代的2到20元杂烷基取代”的情况下，该基团可以包含一个或多个未取代的C1-C20烷基，和/或一个或多个未取代的2到20元杂烷基。
此外，在某个部分被R取代基取代的情况下，该基团可以被称为“R取代的”。在某个部分是R取代的情况下，该部分被至少一个R取代基取代，并且每个R取代基任选地是不同的。在描述某个化学种属(诸如式(I))时存在一个特定的R基团的情况下，可以使用罗马字母符号来区分该特定R基团的每次出现。例如，在存在多个R13取代基的情况下，每个R13取代基可以被区分为R13A、R13B、R13C、R13D等，其中R13A、R13B、R13C、R13D等中的每一者都在R13的定义范围内并且任选地是是不同的。
对本公开的化合物的描述受本领域技术人员所知的化学键合原理的限制。因此，在一个基团可以被多个取代基中的一个或多个取代基取代的情况下，此类取代被选择为符合化学键合原理，并且产生不会在本质上不稳定和/或本领域普通技术人员将认为在环境条件下(诸如水性、中性和几种已知的生理条件下)可能不稳定的化合物。例如，根据本领域技术人员已知的化学键合原理，杂环烷基或杂芳基通过环杂原子与分子的其余部分相连，从而避免本质上不稳定的化合物。
本领域普通技术人员将理解，当化合物或化合物种属(例如，本文所述的种属)的变型(例如，部分或连接子)用填入所有价的单独化合物的名称或公式来描述时，该变型的未填入的价将由背景而定。例如，当本文所述化合物的变型通过单一键连接(例如，键合)到化合物的其余部分时，该变型被理解为表示单独化合物的单价形式(即，由于未填入的价而能够形成单键)(例如，如果该变型在一个实施方案中被命名为“甲烷”，但该变型已知是通过单键附接到化合物的其余部分的，则本领域普通技术人员将理解该变型实际上是甲烷的单价形式，即甲基或-CH3)。
如本文所述，序列的互补性可以是部分的，即只有一些核酸根据碱基配对匹配，或变完整，其中所有核酸都根据碱基配对匹配。因此，彼此互补的两个序列可能具有特定百分比的相同核苷酸(即在指定区域具有大约60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸起作用的氨基酸类似物和模拟物。天然存在的的氨基酸是由基因密码编码的氨基酸，以及之后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、-羧谷氨酸和O-磷酰丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即α-碳与氢、羧基基团、氨基基团和R基团(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基硫)结合。此类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构、但功能与天然存在的的氨基酸类似的化合物。术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然氨基酸”是指未在自然界中发现的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，其在实施方案中，该聚合物可以与不由氨基酸组成的部分缀合。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为对应的天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，还适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然的氨基酸聚合物。
一方面，本申请提供了一种具有结构式((I)的化合物：
其中，该n大于0，并且X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种具有结构式((II)的化合物：
其中，该n大于0，并且X选自吸电子基团。
例如，吸电子基团(EWG)可以将电子从反应中心吸走。当该中心为富电子的碳负离子或醇盐负离子时，吸电子取代基的存在起到了稳定化的作用。吸电子基团的例子可以是卤素(例如F、Cl)。
例如，该化合物可以是一种生物分子。例如，该化合物可以是具有上述结构的蛋白质。例如，该化合物可以是具有结构为上述结构的非天然氨基酸的蛋白质。例如，该化合物可以将上述结构用作分子间连接子。例如，该化合物可以将上述结构用作分子内连接子。
例如，其中该结构(I)和/或结构(II)与连接基团R1连接，该R1为任选取代的取代基。例如，该化合物可以是具有结构为上述结构的非天然氨基酸的蛋白质。例如，R1可以是氨基酸的R链。例如，该结构(I)和/或结构(II)可以与氨基酸的R链连接。
例如，该R1是键或选自以下组成的组：-S(O)2-、-NR1A-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NR1A-、-NR1AC(O)-、-NR1AC(O)NR1B-、-C(O)O-、-OC(O)-、任选取代的亚烷基、任选取代的杂亚烷基、任选取代的环亚烷基、任选取代的杂环亚烷基、任选取代的亚芳基和任选取代的杂亚芳基，该R1A和R1B各自独立地为氢、任选取代的烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。
例如，其中该连接基团R1连接到连接基团R2，该R2是任选取代的取代基。例如，该化合物可以是具有结构为上述结构的非天然氨基酸的蛋白质。例如，R2可以是氨基酸的肽键。
例如，该R2为键或者选自以下组成的组：任选取代的肽部分、任选取代的核酸部分和任选取代的碳水化合物部分。
例如，其中该结构(I)和/或结构(II)通过任选取代的酪氨酸与该R2连接。
另一方面，本申请提供了一种具有结构(I-A)的化合物：
其中，该n大于0，并且X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种具有结构(I-P)的化合物：
其中，该n大于0，并且X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供了一种具有以下结构(II-A)的化合物：
其中，该n大于0，并且X选自吸电子基团。
另一方面，本申请提供一种具有以下结构(II-P)的化合物：
其中，该n大于0，并且X选自吸电子基团。
例如，其中该n选自以下组成的组：1、2、3和4。例如，其中该n为1。例如，其中该n为2。例如，其中该n为3。例如，其中该n为4。
例如，其中该化合物具有以下结构：/>
例如，其中该化合物具有以下结构：
例如，该结构可具有更好的反应性。
例如，其中该化合物具有以下结构：
例如，其中该化合物具有以下结构：
另一方面，本申请提供了一种具有以下结构的化合物：其中，该X选自吸电子基团。/>
在另一个方面，本申请提供了一种具有以下结构的化合物：
其中，该X选择自吸电子基团。
例如，其中每个该X独立地为卤素。
例如，其中每个该X独立地为F。
例如，其中该化合物具有以下结构：
例如，其中该化合物具有以下结构： />例如，该结构可具有更好的反应性。
例如，其中该化合物具有以下结构：
例如，其中该化合物具有以下结构：
例如，其中该化合物具有以下结构：
例如，其中该化合物具有以下结构：
例如，其中该化合物具有以下结构：
例如，其中该化合物具有以下结构： />
例如，其中该化合物具有以下结构：
例如，其中该化合物具有以下结构：
例如，其中该化合物具有以下结构：
例如，其中该化合物具有以下结构：
另一方面，本申请提供了一种蛋白质，其包含本申请中任一项所述的化合物的结构。
另一方面，本申请提供了一种蛋白质，其包含具有以下结构(I)的非天然氨基酸的蛋白质：
/>
其中，该n大于0，并且X选自吸电子基团。
例如，其中该蛋白质包含具有本申请中任一项所述的化合物的结构的非天然氨基酸。
另一方面，本申请提供了一种包含具有以下结构的非天然氨基酸的蛋白质：
例如，其中该蛋白质包含位于如PD-L1结合蛋白或其片段的序列中所示的第108位的该非天然氨基酸。
例如，其中该蛋白质包含位于如抗PD-L1纳米抗体或其片段的的序列中所示的第108位的该非天然氨基酸。
例如，其中该蛋白质包含位于如SEQ ID NO:1的序列中所示的第108位的该非天然氨基酸。例如，其中该蛋白质还可以包含p62、LC3、核苷酸8-硝基环单磷酸鸟苷(8-nitro-cGMP)、甘露糖-6-磷酸、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、细胞穿透肽和/或溶酶体分选序列。
另一方面，本申请提供了一种核酸，其包含编码本申请中任一项所述的蛋白质的序列。
另一方面，本申请提供了一种合成酶，其包含位于如SEQ ID NO:29的序列中所示的第366位和/或第367位的突变体。
另一方面，本申请提供了一种合成酶，其包含位于如SEQ ID NO:29的序列中所示的第366位和/或第367位的丙氨酸。例如，本申请的合成酶的氨基酸包含丙氨酸，而不是原始的chFSYRS。例如，本申请的合成酶的氨基酸包含丙氨酸，而不是SEQ ID NO:29的原始氨基酸。
另一方面，本申请提供一种合成酶，其包含SEQ ID NO:31和/或34的序列。
另一方面，本申请提供了一种核酸，其包含编码本发明中任一项所述的合成酶的序列。
另一方面，本申请提供了一种核酸，其包含SEQ ID NO:30和/或33的序列。
另一方面，该申请提供了一种载体，其包含本申请中任一项所述的核酸。
另一方面，本申请提供了一种组合，其包含本申请中任一项所述的合成酶和本申请中任一项所述的化合物。
另一方面，本申请提供了一种制备本申请中任一项所述的蛋白质的方法，其中该方法包括提供本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的化合物和/或本申请中任一项所述的组合。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的蛋白质、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的载体和/或本申请中任一项所述的组合。
另一方面，本申请提供了一种组合物，其包含本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的蛋白质、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的载体、本申请中任一项所述的组合和/或本申请中任一项所述的细胞，以及任选的药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的蛋白质、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的载体、本申请中任一项所述的组合、本申请中任一项所述的细胞和/或本申请中任一项所述的组合物。
另一方面，本申请提供了一种抑制PD-L1蛋白与PD-L1配体结合的方法，其中该方法包括提供本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的蛋白质、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的载体、本申请中任一项所述的组合、本申请中任一项所述的细胞、本申请中任一项所述的组合物和/或本申请中任一项所述的试剂盒。另一方面，本申请提供了一种交联PD-L1蛋白的方法，其中该方法包括提供本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的蛋白质、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的载体、本申请中任一项所述的组合、本申请中任一项所述的细胞、本申请中任一项所述的组合物和/或本申请中任一项所述的试剂盒。
另一方面，本申请提供了一种激活免疫细胞的方法，其中该方法包括提供本申请中任一项所述的化合物、本申请中任一项所述的蛋白质、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的合成酶、本申请中任一项所述的核酸、本申请中任一项所述的载体、本申请中任一项所述的组合、本申请中任一项所述的细胞、本申请中任一项所述的组合物和/或本申请中任一项所述的试剂盒。。
例如，其中该免疫细胞包括T细胞。
例如，其中该激活通过荧光素酶测定进行检测。
例如，其中该方法可以是体外方法。
另一方面，本申请提供了一种制备具有以下结构(M)的化合物的方法：
其中，该n大于0，并且X选自吸电子基团，其中，该方法包括提供包含选自以下组成的组的序列的连接酶：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。
另一方面，本申请提供了一种连接酶，其包含选自以下组成的组的序列：SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27，该连接酶用于制备具有以下结构(M)的化合物：
其中，该n大于0，并且X选自吸电子基团。
例如，其中该方法包括提供由选自以下组成的组的序列编码的连接酶：SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26。
例如，其中该n选自以下组成的组：1、2、3和4。
例如，其中该化合物包含以下结构：
例如，其中每个X独立地为卤素。
例如，其中每个X独立地为F。例如，其中该化合物包含以下结构：
实施例
以下实施例旨在针对如何制作和使用本发明为本领域普通技术人员提供完整的披露和描述，并非旨在限制发明人所认为的其发明的范围，也不旨在表示下面的实验是进行的所有或仅有的实验。已经努力确保数字的准确性(例如，量，温度等)，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为重量平均分子量，温度单位为摄氏度，并且压力处于或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp：碱基对；kb：千碱基；pl：皮升；s或sec：秒；min：分钟；h或hr：小时；aa：氨基酸；nt：核苷酸；i.m.：肌肉注射；i.p.：腹腔注射；s.c.：皮下注射；等等。
实施例1
具有增强邻近反应性的氟取代的氟硫酸盐的开发
5.5g氟取代的苯酚溶于50mLDCM和10mL Et3N(1.5当量)中。将混合物室温搅拌10分钟。然后，利用轻度真空去除溶液上方气氛，并用针从填充有气体的球囊中引入SO2F2气体。在室温下剧烈搅拌反应混合物6-72小时，通过TLC进行监测。
苯基硫酰氟
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.63-7.55(m,4H),7.55-7.47(m,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ150.22(s),131.33(s),129.70(s),121.48(s).19F NMR(377MHz,DMSO)δ38.24.MS:175.0[C6H4FO3S]-。
如图1所示，本申请提供了一种具有增强反应性的吸电子的氟取代的氟硫酸盐。
如图2所示，本申请提供了氟取代的苯基硫酰氟的化学结构。
2-氟苯基硫酰氟
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.70-7.57(m,2H),7.43(d,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ163.88,161.41,150.13,132.65,118.15-116.96,116.89,110.22,110.02-108.68.19F NMR(377MHz,DMSO)δ38.79.MS:193.0[C6H3F2O3S]-。
3-氟苯基硫酰氟
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.79(t,1H),7.64-7.52(m,2H),7.44-7.35(m,1H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ154.39,151.89,136.83,131.65,126.60,124.15,118.51.19F NMR(377MHz,DMSO)δ39.41,-129.92.MS:193.0[C6H3F2O3S]-。
2,6-二氟苯基硫酰氟
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.64(dt,1H),7.49(t,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ155.53,153.00,131.68,125.76,114.19.19F NMR(377MHz,DMSO)δ41.12,-126.70.MS:211.0[C6H2F3O3S]-。
2,5-二氟苯基硫酰氟
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.92(ddd,1H),7.68(td,1H),7.47(ddt,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ159.24,156.79,151.27,148.81,136.47,119.44,118.36,55.24.19F NMR(377MHz,DMSO)δ40.29,-113.99,-134.31.MS:211.0[C6H2F3O3S]-。
2,3-二氟苯基硫酰氟
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.73-7.59(m,2H),7.44(tdd,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ152.02,149.53,143.76,141.31,126.01,119.67,119.08,55.25.19F NMR(377MHz,DMSO)δ39.90,-134.30,-152.73.MS:211.2[C6H2F3O3S]-。
3,5-二氟苯基硫酰氟
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.65-7.55(m,2H),7.50(tt,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ164.26,150.17,131.27,107.20,107.00,105.97.19F NMR(377MHz,DMSO)δ39.50,-106.03.MS:211.1[C6H2F3O3S]-。
2,3,6-三氟苯基硫酰氟
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.77(tdd,1H),7.57(tdd,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ151.73,149.24,148.40,145.95,144.63,142.08,126.53,118.81,113.25。
19F NMR(377MHz,DMSO)δ41.61,-130.78,-138.40,-147.59.MS:229.1[C6H1F4O3S]-。
LC分析模型反应来测定苯基硫酰氟的邻近反应性
为了测试氟取代的苯基硫酰氟对亲核基团的邻近反应性，设计了模式反应，其中咪唑的浓度是硫酰氟的100倍，以使反应加速。具体来说，将100μL 10mM氟取代的苯基硫酰氟的CH3CN溶液与900μL 110mM咪唑溶液(pH 8.5)混合在1.5mL的EP管中。将管子放置于热振荡器中，并在30℃以1000rpm进行反应4小时。混合物进行UPLC分析，监测苯基团在260nm处的吸收，并且使用下式计算转化率：产物峰面积/(产物峰面积+反应物峰面积)×100％。
如在图3A-3D和图4中所汇总的，吸电子的氟原子的位置和数量都对硫酰氟的反应性有影响。尤其是，单个氟取代只会略微加速反应，而双氟取代会显著加速反应。
实施例2
化学酶法合成氟取代的氟硫酸盐-L-酪氨酸
编码酪氨酸苯酚裂解酶(TPL)突变体的质粒的构建
编码TPL的氨基酸序列从Uniprot(www.uniprot.org)数据库、专利(CN109897845A)和文献(《欧洲有机化学期刊》，2020，8，1050-1054；《工业微生物学与生物技术杂志》，2019，12，1631-1641)中获取。由金唯智(GENEWIZ，中国上海)合成相应的DNA序列，以大肠杆菌(E.coli)为宿主进行密码子优化。合成的基因在N末端带有6×His标签，两侧为Nco I和Not I地核酸内切酶位点，该基因分别被两种相应的限制性酶消化，并且插入到具有相同限制性酶(被称为pET-28a(+)-XX TPL质粒)的预消化载体pET-28a(+)中。
| 酪氨酸苯酚裂解酶 | SEQ ID NO: |
| Ci TPL M379V基因 | 12 |
| Ci TPL M379V蛋白质 | 13 |
| Ci TPL E313M基因基因 | 14 |
| Ci TPL E313M蛋白质 | 15 |
| St TPL M380V基因 | 16 |
| St TPL M380V蛋白质 | 17 |
| Eh TPL S20C N161S基因 | 18 |
| Eh TPL S20C N161S蛋白质 | 19 |
| Ki TPL M66V M288I基因 | 20 |
| Ki TPL M66V M288I蛋白质 | 21 |
| Mm TPL基因 | 22 |
| Mm TPL蛋白质 | 23 |
| Fn-TPL基因 | 24 |
| Fn-TPL蛋白质 | 25 |
| Cf TPL基因 | 26 |
| Cf TPL蛋白质 | 27 |
过表达TPL的大肠杆菌的制备
质粒pET-28a(+)-XX TPL通过热冲击法转化到BL21(DE3)中。转化体铺板于LB-卡那霉素琼脂平板上，并且在37℃孵育过夜。在37℃将单个菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的10mL LB培养基中。次日，将10mL过夜细胞培养物稀释到1L新鲜LB培养基中，并在37℃剧烈搅拌。当OD600达到0.4～0.6时，加入IPTG至最终浓度为0.5mM，然后在30℃诱导12小时。以6,000g离心20分钟收集细胞，并且在使用前储存在-80℃冰箱中。
通过补料分批法TPL催化合成氟取代的酪氨酸的一般步骤
在100mL含有50mM的丙酮酸钠、50mM氯化铵、10mM氟苯酚、1.0mM PLP、0.1g/LTritonX-100、2.0g/L EDTA钠和15.0g/L重组大肠杆菌的反应混合物中，通过氨调节pH8.5，生物合成氟取代的酪氨酸。在30℃以170rpm震荡反应24小时。在反应过程期间，每4小时分别补加5.0g/L丙酮酸钠、2.0g/L氟苯酚和3.5g/L氯化铵。通过19F NMR监测反应。
合成反应完成后，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至1-2，并剧烈搅拌1小时，然后过滤除去沉淀。然后收集滤液，并逐渐用氨水(25-28％)滴定至pH 7.0。减压去除过量水分，直至残留物约为100mL。此后，过滤回收在氨水滴定期间生成的L-酪氨酸衍生物，用冰冷水洗涤两次，并用乙醇再洗涤一次，然后在60℃干燥。
如图5所示，本申请提供了来自不同源的TPL对2-氟-L-酪氨酸合成的特异活性。
如图6所示，本申请显示了Cf TPL和Fn TPL在合成二氟取代的L-酪氨酸中展现出高效性。
如图7所示，本申请提供了TPL催化合成氟取代的L-酪氨酸的化学结构。
3-氟-L-酪氨酸
1H NMR(400MHz,D2O)δ6.59(d,1H),6.54-6.45(m,2H),3.89-3.81(m,1H),2.78(dd,5.6Hz,1H),2.67(dd,1H)；19F NMR(377MHz,D2O)δ-136.80(dt,7.7Hz)；MS:198.3[C9H9FNO3]-。
2-氟-L-酪氨酸
1H NMR(400MHz,D2O)δ6.71(dd,1H),6.25-6.19(m,2H),3.87(t,1H),2.85(dd,1H),2.71(dd,1H)；13C NMR(101MHz,D2O)δ170.79,162.65,160.23,156.69,132.15,112.00-111.29,103.10,102.85,52.95,28.58；19F NMR(377MHz,D2O)δ-115.85--116.00；MS:198.2[C9H9FNO3]-。
3,5-二氟-L-酪氨酸
19F NMR(377MHz,D2O)δ-132.86--133.09(m)；MS:216.3[C9H8F2NO3]-。
2,5-二氟-L-酪氨酸
1H NMR(400MHz,D2O)δ6.72(dd,1H),6.43(dd,1H),3.97(t,1H),2.93(dd,1H),2.79(dd,1H)；19F NMR(377MHz,D2O)δ-121.24--121.43,-142.09；MS:218.1[C9H10F2NO3]+。
2,3-二氟-L-酪氨酸
1H NMR(400MHz,D2O)δ6.46(td,1H),6.30(t,1H),3.85(t,1H),2.86(dd,1H),2.72(dd,1H)；19F NMR(377MHz,D2O)δ-141.33,-161.29--161.54；MS:216.3[C9H8F2NO3]-。
2,6-二氟-L-酪氨酸
1H NMR(400MHz,D2O)δ6.24-6.14(m,2H),3.94(t,1H),2.93(dd,1H),2.86(dd,1H)；19F NMR(377MHz,D2O)δ-114.41(d,J＝9.4Hz)；MS:216.2[C9H8F2NO3]-。
从氟取代的L-酪氨酸合成氟取代的氟硫酸盐-L-酪氨酸的一般步骤
5g氟取代的L-酪氨酸溶于50mL 1M NaOH和50mL二氧六环中，然后再室温搅拌下，滴加10mL(Boc)2O(1eq)2h。混合物又搅拌1h。然后，减压除去溶剂，并将残留物溶于100mLDCM中，用0.1N HCl(2×75mL)、饱和NaCl溶液(2×75mL)洗涤。收集水层并除去溶剂后，无需进一步纯化直接用于后续反应。
向装有磁力搅拌棒的2L双颈圆底烧瓶中加入5mmol Boc保护的氟取代的L-酪氨酸、200mL CH2Cl2和800mL饱和硼砂溶液。混合物剧烈搅拌20min。将反应体系抽真空，直至双相溶液开始脱气，并用SO2F2重复填充3次。反应混合物在室温下剧烈搅拌过夜。使用旋转蒸发仪减压去除CH2Cl2。然后在搅拌的同时向反应混合物中缓慢加入1M HCl(210mL)水溶液，析出白色固体。过滤混合物，用冰冷水(3×75mL)洗涤固体。将白色固体真空干燥过夜，得到Boc保护的氟取代的氟硫酸盐-L-酪氨酸，无需进一步纯化直接用于下一步。将5mmol Boc保护的氟取代的氟硫酸盐-L-酪氨酸用4M HCl的二氧六环(11mL))溶液处理，并且反应混合物室温下搅拌4h，此后如果没有白色固体析出，则向混合物中加入50mL醚。固体经过滤和冷醚(2×10mL)洗涤，得到目标氟取代的L-酪氨酸盐酸盐。产物进行LC-MS分析并通过反相制备HPLC进一步纯化。
如图8所示，本申请提供了氟取代的氟硫酸盐L-酪氨酸的化学结构。
氟硫酸盐-L-酪氨酸
1H NMR(400MHz,D2O):δ(ppm)3.23-3.41(m,2H),4.32-4.34(m,1H),7.45-7.53(m,4H)；13C NMR(400MHz,D2O):δ(ppm)38.9,57.2,125.0,135.3,139.5,153.5,173.3；19FNMR(400MHz,D2O):δ(ppm)38.9,57.2；MS:264.0[M+H]+。
氟硫酸盐-L-酪氨酸
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.38(s,4H),4.28(dd,1H),3.34-3.24(m,1H),3.19(dd,1H)；13C NMR(101MHz,D2O)δ171.04,149.44,135.18,131.51,121.59,66.53,53.82,34.87；19FNMR(377MHz,D2O)δ37.49；MS:262.2[C9H9FNO5S]-。
氟硫酸盐-3-氟-L-酪氨酸
1H NMR(500MHz,D2O):δ(ppm)3.21-3.25(m,1H),3.32-3.36(m,1H),4.21-4.24(t,1H),7.22-7.58(m,3H)；13C NMR(500MHz,D2O):δ(ppm)35.24,54.28,118.79,123.79,126.55,136.30,137.86,153.14,171.66；19F NMR(500MHz,D2O):δ(ppm)-128.22,38.82；MS:282.0
[C9H10F2NO5S]+,305.0[C9H9F2NO5SNa]+。
氟硫酸盐-2-氟-L-酪氨酸
1H NMR(500MHz,D2O):δ(ppm)3.19-3.23(m,1H),3.33-3.37(m,1H),4.18-4.20(t,1H),7.26-7.46(m,3H)；13C NMR(500MHz,D2O):δ(ppm)29.24,53.34,109.67,117.50,122.79,133.19,149.32,161.54,171.48；19F NMR(500MHz,D2O):δ(ppm)-112.16,37.85；MS:282.0
[C9H10F2NO5S]+,305.0[C9H9F2NO5SNa]+。
氟硫酸盐-2,3-二氟-L-酪氨酸
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.35(t,J＝7.7Hz,1H),7.25-7.18(m,1H),4.31-4.21(m,1H),3.38(dd,J＝14.7,6.4Hz,1H),3.25(dd,J＝14.7,7.1Hz,1H)；13C NMR(101MHz,D2O))δ170.81,151.13,148.65,144.03,141.49,137.09,126.26,124.79,118.48,66.53,52.77,29.16；19FNMR(377MHz,D2O)δ39.15,-136.33,-150.44；MS:298.1[C9H7F3NO5S]-,597.2
[C18H15F6N2O10S2]-。
氟硫酸盐-2,5-二氟-L-酪氨酸
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.02(dd,J＝8.8,6.4Hz,1H),6.94(dd,J＝10.1,6.6Hz,1H),3.89(t,J＝6.8Hz,1H),2.92(dd,J＝14.7,6.4Hz,1H),2.80(dd,J＝14.7,7.1Hz,1H)；13CNMR(151MHz,D2O)δ170.16,150.23,148.58,135.64,123.73,119.80,111.21,52.53,28.77；19F NMR(377MHz,D2O)δ39.04,-117.77,-133.37；
MS:298.2[C9H7F3NO5S]-,597.4[C18H15F6N2O10S2]-。
氟硫酸盐-3,5-二氟-L-酪氨酸
1H NMR(500MHz,D2O):δ(ppm)3.17-3.20(m,1H),3.28-3.32(m,1H),4.20-4.22(t,1H),7.14-7.16(d,3H)；13C NMR(500MHz,D2O):δ(ppm)35.31,53.87,114.22,125.22,138.00,153.28,171.25；19F NMR(500MHz,D2O):δ(ppm)-124.96,40.65；MS:300.0[C9H9F3NO5S]+,323.0[C9H8F3NO5S Na]+。
氟硫酸盐-2,6-二氟-L-酪氨酸
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.68(t,2H),4.03-3.92(m,1H),3.27(dd,1H),3.18(dd,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ170.05,162.85,160.37,148.77,113.91,106.88,66.81,56.45,51.44,23.75,19.00.19F NMR(377MHz,DMSO)δ(ppm)40.28,-109.06。
MS:299.8[C9H9F3NO5S]+。
LC分析模型反应来测定氟硫酸盐-L-酪氨酸衍生物的邻近反应性
/>
完成类似的反应测试氟取代的L-酪氨酸对亲核基团的邻近反应性：将100μL 10mM氟取代的L-酪氨酸溶液与900μL 110mM咪唑溶液(pH 8.5)混合于1.5mL EP管中。将管子置于热振荡器中并在30℃以1000rpm反应4h。混合物进行UPLC分析并监测260nm处的吸收。以下式计算转化率：产物峰面积/(产物峰面积+反应物峰面积)×100％。
结果汇总于图.9A-图9C和图10中，吸电子的氟原子的位置和数量都对硫酰氟的反应性有影响。
实施例3
针对氟硫酸盐-3,5-二氟-L-酪氨酸的氨酰-tRNA合成酶的选择
pBK-chFSYRS S4突变体库质粒的构建
通过不依赖于连接的克隆，将FSYRS编码基因从pSup chFSYRS克隆到pBK载体中，生产pBK chFSYRS。简言之，FSYRS基因用以下引物扩增，进行纯化并用Exnase II(Vazyme，Cat:C112-01)连接。
| 引物名称 | 序列 | SEQ ID |
| pBK载体，正向 | TAACTGCAGTTACAGGTTAGTGTAGGCACTGC | 2 |
| pBK载体，反向 | ATGGGATTCCTCAAAGCGTAAACAACGTATAAC | 3 |
| chFSYRS，正向 | CTTTGAGGAATCCCATATGGATAAGAAGCCGCTG | 4 |
| chFSYRS，反向 | CCTGTAACTGCAGTTACAGGTTAGTAGAAATACC | 5 |
考虑到OMEY-MmPylRS合成酶的晶体结构，4个残基邻近酪氨酸衍生物的主链，可能与新引入的氟原子发生相互作用。因此，利用全质粒扩增的迭代饱和突变(ISM)方法构建了嵌合体Mm/MbPylRS的pBK-chFSYRS突变体库(S364NNK、V366NNK、G384NNK、G386NNK)，该方法通过在目标残基上使用含有一个或多个简并密码子的合成DNA寡核苷酸，在PCR期间引入突变。首先，使用包含简并密码子(NNK)的引物S364-V366-NNK正向和引物S364-V366-NNK反向扩增pBK-chFSYRS质粒。然后，用DpnI处理以所得库来消除亲代甲基化DNA链，并将该库转化到DH10B细胞中。收集细胞并用小提试剂盒提取质粒，得到pBK-chFSYRS S2突变体库。以pBK-chFSYRS S2突变体库为模板，用包含简并密码子(NNK)的引物G384-G386-NNK正向和引物G384-G386-NNK反向重复上述过程，最终得到具有107个克隆的pBK-chFSYRS S4突变体库。
通过三轮阳性选择和随后的阴性选择，选出UAA的活性嵌合FSYRS变异体。首先将pBK载体中的ChPheRS库电穿孔到具有阴性选择质粒pPOS-CAT112TAGchPheT-GFP190TAG的DH10B感受态细胞中，该阴性选择质粒包含分别带有琥珀密码子(CAT为112TAG，GFP为190TAG)的CAT和GFP双报告基因。用100ng pBK-chFSYRS S4突变体库，通过电穿孔进一步转化具有pPOS选择报告基因的DH10B细胞(100μL)。电穿孔的细胞立即用1mL预热的SOC培养基回收，并在37℃剧烈搅拌1小时，然后加入氟硫酸盐-3,5-二氟-L-酪氨酸至终浓度为1mM，并在37℃再剧烈搅拌1小时。将回收的细胞直接铺板到补充有1mM氟硫酸盐-3,5-二氟-L-酪氨酸、12.5μg mL-1的50μg/ml卡那霉素(Kan)、100μg/mL氨苄西林(Amp)和34μg/mL氯霉素(Cm)的LB-琼脂选择板上。将选择板在37℃孵育48小时，然后室温储存。存在氟硫酸盐-3,5-二氟-L-酪氨酸依赖性生长的57个克隆被认为符合要求，并通过桑格测序进一步表征。在阳性选择期间，将pBK-chFSYRS S4突变体库平行电穿孔到具有阴性选择质粒pNEG-Barnase-Q3TAG-D45TAG-chPheT的DH10B感受态细胞中。转化后的细胞在37℃回收1小时，然后铺板在含有50μg/mL kan、100μg/mL Amp和34μg/ml Cm的LB琼脂上，并铺板在LB-琼脂选择板上。在37℃孵育24小时后，平板上未发现克隆，这表明合成酶与天然氨基酸正交。最后，基于测序结果生成更小的合成酶库，并且进行一轮额外的阳性选择。
在测序结果中发现了一个独特的氨基酸序列(S364S，V366A，G384G，G386G)。虽然这四个位点是随机突变的，但其中三个作为原始残基被富集，这表明它们是高度保守的。利用以下引物将丙氨酸突变特异性引入chFSYRS，生成pSup chFSYRS V366A质粒：
进一步表征pSup chFSYRS V366A(图11A～11C)，测定其他氟取代的非天然氨基酸的保真度和持续合成能力。
在大肠杆菌中评估琥珀抑制效率
携带GFP-149TAG的质粒pBAD GFP 149TAG和携带相应的嵌合合成酶的质粒pSupchFSYRS V366A或pSup chFSYRS V366A分别共转化到化学感受态DH10B细胞中。转化后的细胞在37℃振荡下在SOC培养基中回收1小时，并在37℃铺板于含有34μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上12小时。挑取单个菌落，在含有所需抗生素的2ml LB培养基中在37℃生长至OD 600达到0.4～0.6，并加入1mM相应的非天然氨基酸，然后在30℃孵育30分钟。细胞培养物用0.2％阿拉伯糖诱导，并在30℃孵育10小时。诱导后，离心收集1ml细胞培养物，然后用150μl BugBuster蛋白提取试剂(Millipore)在37℃裂解10分钟。将裂解物上清液(100μl)转移到96孔细胞培养板(Costar)中。并且GFP信号由TECAN SPARK酶标仪用背景减法进行记录，并通过也由TECAN SPARK酶标仪测量的细菌密度(OD 600)进行归一化。
同时，离心收集1ml细胞培养物，并用100μL 1x上样缓冲液重悬，在95℃加热30分钟，将10μL样品上样于4-20％或8-16％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行电泳，并转移到0.22μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)中。蛋白质转移后，在TBST缓冲液(20mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，0.1％吐温20)中，轻轻震荡，用5％牛血清白蛋白室温封闭膜1小时。膜与一抗(1:1,000；His标签抗体)室温孵育1小时。与一抗孵育后，用TBST缓冲液洗膜3次(每次5分钟)。然后膜与辣根过氧化物酶(HRP)缀合兔抗小鼠IgG抗体(1:5,000稀释)室温孵育1小时。最后，用TBST缓冲液洗膜三次(每次5分钟)。使用电化学发光(ECL)蛋白质印迹底物(Millipore，类别号：WBKLS0500)，检测蛋白质印迹条带。
| 合成酶基因/蛋白 | SEQ ID NO: |
| chFSYRS(原核)基因 | 28 |
| chFSYRS(原核)蛋白质 | 29 |
| chFSYRS V366A(原核)基因 | 30 |
| chFSYRS V366A(原核)蛋白质 | 31 |
| chFSYRS(真核)基因 | 32 |
| chFSYRS(真核)蛋白质 | 29 |
| chFSYRS V366A(真核)基因 | 33 |
| chFSYRS V366A(真核)蛋白质 | 34 |
与chFSYRS相比，chFSYRS V366A变体显示掺入氟硫酸盐-3,5-二氟-L-酪氨酸的GFP荧光增加了9倍，这验证了上述筛选的阳性结果(图12-图13)。此外，chFSYRS V366A在掺入氟硫酸盐-2-二氟-L-酪氨酸、氟硫酸盐-2,5-二氟-L-酪氨酸和氟硫酸盐-2,3-二氟-L-酪氨酸时效率增加，但掺入氟硫酸盐-L-酪氨酸和氟硫酸盐-3-二氟-L-酪氨酸时效率低于chFSYRS。全长GFP表达的蛋白质印迹分析证实了荧光强度。我们提出合成酶第366位的氨基酸残基邻近元原子，而氟原子比氢原子稍大，丙氨酸残基最小化后将有助于降低空间位阻，并且丙氨酸的甲基基团可能与氟相互作用，从而稳定中间体。遗憾的是，chFSYRS V366A不能介导氟硫酸盐-2,6-二氟-L-酪氨酸的掺入，尽管该PrUAA不是添加二氟化物的氟硫酸盐-L-酪氨酸中具有最佳邻近反应性的一种。
哺乳动物细胞中琥珀抑制效率的评估
进一步测试氟取代的氟硫酸盐-3,5-二氟-L-酪氨酸在哺乳动物细胞蛋白质中的掺入。在Y40位点具有TAG突变的EGFP由金唯智(中国)合成，并在CMV的控制下插入到pcDNA3.4载体中，得到pcDNA3.4-EGFP-Y40TAG作为报告质粒，并且抑制Y40TAG密码子将产生全长EGFP，使细胞发出荧光。针对人类细胞优化密码子的嵌合合成酶和tRNA基因由金唯智(中国)合成，并在CMV和U6启动子的控制下，通过Gibson Assembly插入到pCMV载体中，分别得到pCMV 8tRNA-chFSYRS和pCMV 8tRNA-chFSYRS V366A。HEK 293T细胞在补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中生长。细胞用合成酶质粒和报告质粒以1:1(μg:μg)的比例共转染。在添加或不添加相应的氨基酸的情况下，根据制造商的方案通过PEI进行转染。转染后24小时进行成像。HEK 293T活细胞通过配备10×物镜(PlanFluor，SOPTOP)的XD倒置荧光显微镜以FITC通道进行成像。所有图像均使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)进行分析和处理。
从转染有chFSYRS和chFSYRS V366A质粒的细胞中当加入相应的UAA时，观察到强EGFP荧光，这与大肠杆菌的琥珀抑制结果一致。值得注意的是，细胞形态保持正常，这表明氟取代的氟硫酸盐-3,5-二氟-L-酪氨酸对HEK 93T细胞没有明显的毒性，这是氟取代的氟硫酸盐-3,5-二氟-L-酪氨酸的一个重要特征，可能是由于细胞内芳基氟硫酸盐的本底反应性极低所致。这些结果证实，使用我们制成的tRNA合成酶将氟取代的氟硫酸盐-3,5-二氟-L-酪氨酸掺入到哺乳动物细胞的蛋白质中，具有高效率和特异性，但不会造成有害影响。
综上，开发了一系列具有增强反应性的双正交氟取代的氟硫酸盐-L-酪氨酸以及相应的tRNA合成酶。它们的遗传编码能力在大肠杆菌和哺乳动物细胞中都得到了验证。由于这些PrUAA可以通过SuFEx反应与通常存在于蛋白质表面和界面的His、Lys和Tyr的残基反应，因此我们的发明将在共价蛋白质药物的开发中有着广泛的应用。
实施例4
具有增强T细胞活性恢复的共价工程化PD-L1封闭纳米体(胶水抗体，GlueBody)
掺入PrUAA的抗PD-L1 VHH(胶水抗体)的表达和纯化质粒pBAD-Nb-PD-L1-HIS(TAG)分别与质粒pSupAR-chFSYRS或pSupAR-chFSYRS V366A共转化到DH10B感受态细胞中。将转化体铺板在LB-氨苄西林-氯霉素琼脂平板上，并在37℃孵育过夜。将单个菌落接种到37℃含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的10mL LB培养基中。次日，将10mL过夜细胞培养物稀释到1L新鲜的富含营养培养基(15g Na2HPO4·12H2O，6g KH2PO4，20g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，200mg CaCl 2，200mg MgCl 2，8g甘油，0.5g葡萄糖)中，并在37℃下剧烈搅拌。当OD600达到0.6时，用1mM PrUAA孵育细菌，并且当OD600达到0.8-1.0时用0.2％阿拉伯糖诱导细菌。在30℃诱导表达12小时后，以6000rpm离心30分钟收获细菌。然后，用100mL结合缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，20mM咪唑，1mg/mL溶菌酶和蛋白酶抑制剂)重悬细胞。用超声波破碎仪(SCIENTZ，30％输出，30分钟，1秒关闭，1秒开启)在冰水浴中超声处理细胞悬液，然后离心(15,000g，30分钟，4℃)。收集可溶性级分并上样到预装填的Ni-NTA色谱柱上，用NTA250缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，250mM咪唑)洗脱，然后立即在superdrex 75色谱柱上进一步纯化，并储存在-80℃以备将来分析。完整野生型和掺入UAA的蛋白质的分子量由Waters ACQUITY UPLC I-Class SQD 2MS光谱仪，利用电喷雾电离(ESI)进行分析。使用BEH300C4 Acquity色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)对分选酶介导的蛋白质缀合进行LC分离，ESI-MS选择阳性模式分析所有样品。使用MassLynxV4.1软件(Waters)计算蛋白质的总质量。
ESI-MS分析显示正确掺入了4种PrUAA，并且未检测到含有天然氨基酸的VHH或添加了活性分子的VHH，这验证了掺入的保真度并证实了我们的PrUAA的双正交性(图14A-图14D)。
GlueBobody与PD-L1的体外交联
纯化的胶水抗体与PD-L1(中生物，类别号：10084-HNAH)在37℃的PBS缓冲液中以1:1的摩尔比孵育5小时。PD-L1的量为2μg。向管中加入5倍缩减的上样缓冲液(康为世纪，类别号：CW0027)，并在95℃加热15分钟。然后通过8-16％ SDS-PAGE凝胶分离这些样品，之后用考马斯亮蓝染色。在ImageJ软件上对波段的灰度强度进行量化。
由于共价键不会被变性条件破坏，因此使用SDS-PAGE来区分共价结合和非共价结合。结果显示，在SDS-PAGE上观察到108位点含有PrUAA的所有Nb-PD-L1与靶PD-L1交联，作为分子量与Nb/Ag缀合物相对应的新条带。值得注意的是，含氟硫酸盐-2,5-二氟-L-酪氨酸(28％)和含氟硫酸盐-2-氟-L-酪氨酸(26％)的Nb-PD-L1显示出在交联比例上比FSY(15％)增加了约2倍，表明氟加成加速了共价键的形成(图15)。值得注意的是，尽管氟硫酸盐-3-氟-L-酪氨酸于氟硫酸盐-2-氟-L-酪氨酸相比对亲电咪唑的邻近反应性得到增强，但胶水抗体不具有理论上的共价结合能力，这可能是由于引入的氟和抗原中残基的额外相互作用所致。
PD-1/PD-L1阻断检测
为了验证交联增加是否将有助于增强T细胞活化恢复，我们进行了以下PD-1/PD-L1封闭检测。PD-1NFAT-萤光素酶/Jurkat细胞在含有10％ FBS、1％笔链球菌的RPMI 1640培养基中培养。PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞在含有10％ FBS、1％ Penn-Strep的Ham F-12(生长培养基)中培养。为了进行封闭检测，PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞以每孔10,000个细胞的密度，在100μL生长培养基中接种到白色96孔微孔板中。细胞附着后，从CHO-K1细胞中取出培养基，并用补充有HBSS，20nM胶水抗体的新鲜生长培养基孵育细胞22小时，之后洗去抗体,并在检测培养基(RPMI 1640，10％ FBS，1％ Pen-Strep)中加入10,000个PD-1NFAT-萤光素酶/Jurkat细胞以及相同的药物或对照。共培养5-6小时后，细胞裂解并使用萤光素酶报告基因检测试剂盒(Yeasen，类别号：11401ES76)进行萤光素酶检测。使用TECAN Spark酶标仪进行发光测量。
添加破坏工程化Jurkat细胞和CHO-K1细胞之间PD-1/PD-L1相互作用的抗体，将减少抑制信号并恢复T细胞受体(TCR)信号传导。因此，分别用胶水抗体或对照处理CHO-K1细胞。与非共价对应物相比，共价工程化Nb-PD-L1 L108FSY和Nb-PD-L1 L108m-F FSY两者显示出T细胞活化增强(图16)，并且更强的共价结合将有助于更强的活化，因为Nb-PD-L1L108m-F FSY的行为优于Nb-PD-L1 L108FSY的行为。传统抗体以动态方式与靶标结合，而抗体的解离不是期望的。相反，胶水抗体不可逆地与靶标结合，并且封闭性抗体在癌细胞上的积聚提供了更强且更可持续的效果。
虽然本文已展示和描述本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员而言将显而易见的是，这些实施方案仅仅通过示例的方式提供。本发明不受说明书中提供的具体实施例的限制。虽然已参考前述说明书对本发明进行描述，但本文中对实施方案的描述和说明并非是限制性。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到诸多变型、变化和替换。此外，将理解的是，本发明的所有方面均不限于本文所阐述的具体叙述、配置或相对比例，这些取决于各种条件和变量。应理解的是，可以采用本文所描述的本发明实施方案的各种替代方式来实践本发明。因此，设想本发明应同样涵盖任何此类替代方案、修改、变型或等效物。随附权利要求书旨在限定本发明的范围，并且借此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等效物。
Claims (50)
1.一种具有以下结构(I)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
2.一种具有以下结构((II)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的化合物，其中所述结构(I)和/或结构(II)连接至连接基团R1，所述R1为任选取代的取代基。
4.根据权利要求3所述的化合物，所述R1是键或选自以下组成的组：-S(O)2-、-NR1A-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NR1A-、-NR1AC(O)-、-NR1AC(O)NR1B-、-C(O)O-、-OC(O)-、任选取代的亚烷基、任选取代的杂亚烷基、任选取代的环亚烷基、任选取代的杂环亚烷基、任选取代的亚芳基和任选取代的杂亚芳基，所述R1A和R1B各自独立地为氢、任选取代的烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的化合物，其中所述连接基团R1连接至连接基团R2，所述R2是任选取代的取代基。
6.根据权利要求5所述的化合物，所述R2是键或选自以下组成的组：任选取代的肽基部分、任选取代的核酸部分和任选取代的碳水化合物部分。
7.根据权利要求5-6中任一项的化合物，其中所述结构(I)和/或结构(II)通过任选取代的酪氨酸连接到所述R2。
8.一种具有以下结构((I-A)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
9.一种具有以下结构(I-P)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
10.一种具有以下结构(II-A)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
11.一种具有结构(II-P)的化合物：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的化合物，其中所述n选自以下组成的组：1、2、3和4。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
和/或/>
14.根据权利要求1-13中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
15.根据权利要求1-14中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
和/或
16.一种具有以下结构的化合物：其中，所述X选自吸电子基团。
17.一种具有以下结构的化合物：
其中，所述X选自吸电子基团。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的化合物，其中每个所述X独立地为卤素。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中每个所述X独立地为F。
20.一种蛋白质，其包含权利要求1-19中任一项所述的化合物的结构。
21.一种包含具有结构(I)的非天然氨基酸的蛋白质：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团。
22.根据权利要求20-21中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含具有权利要求1-19中任一项所述的化合物的结构的非天然氨基酸。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质来源于抗原结合蛋白或其片段。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含位于如PD-L1结合蛋白或其片段的序列中所示的第108位的所述非天然氨基酸。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含位于如PD-L1纳米抗体或其片段的序列中所示的第108位的所述非天然氨基酸。
26.根据权利要求21-25中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含位于如SEQ IDNO:1的序列中所示的第108位的所述非天然氨基酸。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质还包含蛋白水解靶向部分。
28.根据权利要求20-27中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质还包含6-磷酸甘露糖、N-乙酰半乳糖胺GalNAc、细胞穿透肽和/或溶酶体分选序列。
29.一种核酸，其包含编码权利要求20-28中任一项所述的蛋白质的序列。
30.一种合成酶，其包含位于如SEQ ID NO:29的序列中所示的第366位和/或第367位的突变体。
31.一种合成酶，其包含位于如SEQ ID NO:29的序列中所示的第366位和/或第367位的丙氨酸。
32.一种合成酶，其包含SEQ ID NO:31和/或34的序列。
33.一种核酸，其包含编码权利要求30-32中任一项所述的合成酶的序列。
34.一种核酸，其包含SEQ ID NO:30和/或33的序列。
35.一种载体，其包含权利要求29和33-34中任一项所述的核酸。
36.一种组合，其包含权利要求30-32中任一项所述的合成酶和权利要求1-19中任一项所述的化合物。
37.一种制备权利要求20-28中任一项所述的蛋白质的方法，其中所述方法包括提供权利要求30-32中任一项所述的合成酶、权利要求1-19中任一项所述的化合物和/或权利要求36所述的组合。
38.一种细胞，其包含权利要求1-19中任一项所述的化合物、权利要求20-28中任一项所述的蛋白质、权利要求29和33-34中任一项所述的核酸、权利要求30-32中任一项所述的合成酶、权利要求29和33-34中任一项所述的核酸、权利要求35所述的载体和/或权利要求36所述的组合。
39.一种组合物，其包含权利要求1-19中任一项所述的化合物、权利要求20-28中任一项所述的蛋白质、权利要求29和33-34中任一项所述的核酸、权利要求30-32中任一项所述的合成酶、权利要求29和33-34中任一项所述的核酸、权利要求35所述的载体、权利要求36所述的组合和/或权利要求38所述的细胞，以及任选的药学上可接受的佐剂。
40.一种试剂盒，其包含权利要求1-19中任一项所述的化合物、权利要求20-28中任一项所述的蛋白质、权利要求29和33-34中任一项所述的核酸、权利要求30-32中任一项所述的合成酶、权利要求29和33-34中任一项所述的核酸、权利要求35所述的载体、权利要求36所述的组合、权利要求38所述的细胞和/或权利要求39所述的组合物。
41.一种抑制PD-L1蛋白与PD-L1配体结合的方法，其中所述方法包括提供权利要求1-19中任一项所述的化合物、权利要求20-28中任一项所述的蛋白质、权利要求29和33-34中任一项所述的核酸、权利要求30-32中任一项所述的合成酶、权利要求29和33-34中任一项所述的核酸、权利要求35所述的载体、权利要求36所述的组合、权利要求38所述的细胞、权利要求39所述的组合物和/或权利要求40所述的试剂盒。
42.一种激活免疫细胞的方法，其中所述方法包括提供权利要求1-19中任一项所述的化合物、权利要求20-28中任一项所述的蛋白质、权利要求29和33-34中任一项所述的核酸、权利要求30-32中任一项所述的合成酶、权利要求29和33-34中任一项所述的核酸、权利要求35所述的载体、权利要求36所述的组合、权利要求38所述的细胞、权利要求39所述的组合物和/或权利要求40所述的试剂盒。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述免疫细胞包括T细胞。
44.根据权利要求42-43中任一项所述的方法，其中所述激活通过荧光素酶测定进行检测。
45.一种制备具有以下结构(M)的化合物的方法：
其中，所述n大于0，并且X选自吸电子基团；其中所述方法包括提供包含选自以下组成的组的序列的连接酶：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述方法包括提供由选自以下组成的组的序列编码的酪氨酸苯酚裂解酶：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26。
47.根据权利要求45-46中任一项所述的方法，其中所述n选自以下组成的组：1、2、3和4。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述化合物包含以下结构：
和/或
49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中每个所述X独立地为卤素。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中每个所述X独立地为F。
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