CN117269395A - 奇楠沉香的气质指纹图谱的构建方法及其指纹图谱 - Google Patents

奇楠沉香的气质指纹图谱的构建方法及其指纹图谱 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种奇楠沉香的气质指纹图谱的构建方法，其包括如下步骤：(1)制备奇楠沉香供试品溶液；(2)采用气相色谱‑质谱联用法测定所述奇楠沉香供试品溶液；(3)建立奇楠沉香GC‑MS指纹图谱；以及(4)确定色谱峰母离子的精确质量数和分子式，鉴定奇楠沉香指纹图谱中共有成分的化学结构。该方法通过指纹图谱获取了奇楠沉香的共有挥发性成分，为全面揭示其奇楠沉香的物质基础提供数据支撑。

Description

奇楠沉香的气质指纹图谱的构建方法及其指纹图谱
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及奇楠沉香的气质指纹图谱的构建方法及其指纹图谱。
背景技术
沉香是瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria Lam.)或拟沉香属植物(Gyrinops Gaertn.)在伤害诱导防御反应下形成的含树脂木材。在我国，沉香药材主要来自瑞香科植物白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)，是临床常用传统名贵药材，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效，广泛应用于中成药、藏药和日本汉方药。
奇楠沉香是白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)的一种特殊种质所产沉香，在多个文献中作为优质的药用沉香记载，然而由于奇楠沉香的资源珍稀和历史原因，很长时间里奇楠沉香非常稀缺。近几年，随着奇楠沉香人工培育技术逐渐成熟，奇楠沉香初步形成产业并且仍在蓬勃发展。然而奇楠沉香产业目前存在缺乏质量标准以及对其开发利用不足等情况。为了有效推动奇楠沉香产业高质量发展，本发明从多个方面探索奇楠沉香的物质基础以及与普通沉香之间的区别，为奇楠沉香的质量标准制订提供依据。
发明内容
基于此，本发明提供了一种奇楠沉香的气质指纹图谱的构建方法，该构建方法包括如下步骤：
(1)制备奇楠沉香供试品溶液；
(2)采用气相色谱-质谱联用法测定该奇楠沉香供试品溶液；
(3)建立奇楠沉香GC-MS指纹图谱；以及
(4)确定色谱峰母离子的精确质量数和分子式，鉴定奇楠沉香指纹图谱中共有成分的化学结构。
进一步地，该步骤(3)包括如下步骤：将所有原始总离子流图经积分处理之后转换成TXT格式，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版相似度软件进行数据处理，按中位数法对齐，设定参照图谱并进行相似度分析，在全谱峰匹配之后获得由44个共有色谱峰构成的奇楠沉香GC-MS指纹图谱。
进一步地，该步骤(4)包括如下步骤：针对烷烃类成分和倍半萜类成分：在安捷伦OpenLAB Data Analysis工作台中利用NIST17库查找与其匹配的物质，其中反向匹配分数高于800；针对色酮类成分：结合保留时间及m/z、NIST17库、文献报道进行解析；一共鉴定了奇楠沉香的9个共有峰。
进一步地，该9个共有峰分别为1号峰a-檀香醇(a-Santalol)、2号峰脱氢哽酮(Dehydrofukinone)、3号峰缬草烯醇(Valerenol)、4号峰(4aR，5S)-1-羟基-4a，5-二甲基-3-(丙-2-亚基)-4，4a，5，6-四氢萘-2(3H)酮((4aR,5S)-1-Hydroxy-4a,5-dimethyl-3-(propan-2-ylidene)-4,4a,5,6-tetrahydronaphthalen-2(3H)-one)、5号峰喘诺木烯内酯(Reynosin)、6号峰2-苯乙基-4H-二烯-4-酮(2-Phenethyl-4H-chromen-4-one)、7号峰2-[2-(2-甲氧基苯基)乙基]色酮(2-[2-(2-methoxyphenyl)ethyl]chromone)、8号峰2-(4-甲氧基苯乙基)色酮(2-(4-methoxyphenethyl)chromone)和9号峰2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮(2-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]chromone)。
进一步地，以6号色谱峰为参比峰，其他8个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.43±0.05、2号色谱峰0.63±0.05、3号色谱峰0.68±0.05、4号色谱峰0.81±0.05、5号色谱峰0.93±0.05、7号色谱峰1.07±0.05、8号色谱峰1.09±0.05、9号色谱峰1.16±0.05。
进一步地，该9个共有峰的保留时间RSD(％)均小于0.3％。
根据本发明的另一个方面，提供了一种奇楠沉香气质指纹图谱，其由上述的奇楠沉香的气质指纹图谱的构建方法所构建获得。
根据本发明的另一个方面，提供了一种奇楠沉香和普通沉香的鉴别方法，该鉴别方法包括如下步骤：
(a)奇楠沉香供试品溶液的制备：在奇楠沉香粉末中添加水或醇，得到奇楠沉香溶液；以及该奇楠沉香溶液经过超声提取、振摇提取或回流提取之后，过滤得到该奇楠沉香供试品溶液；
(b)普通沉香供试品溶液的制备：在普通沉香粉末中添加水或醇，得到普通沉香溶液；以及该普通沉香溶液经过超声提取、振摇提取或回流提取之后，过滤得到该普通沉香供试品溶液；
(c)采用气相色谱-质谱联用法分别测定该奇楠沉香供试品溶液和该普通沉香供试品溶液；
(d)数据处理与统计分析：将GC-MS采集到的原始数据转换成netCDF格式，进行非靶向代谢组学数据预处理和多元统计分析；以及
(e)奇楠沉香与普通沉香的差异化合物鉴定：以P值<0.05、VIP值>1，FC值>2或<0.5为条件筛选奇楠沉香和普通沉香的差异成分并进行结构鉴定，共鉴定出18个差异成分，以普通沉香为参照，通过该18个差异成分可将奇楠沉香和普通沉香进行区分。
进一步地，该18个差异成分包括12个2-(2苯乙基)色酮类成分和6个倍半萜类成分。
进一步地，以普通沉香为参照，当某一普通沉香相似药材的6，7-二甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6，8-二羟基-2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6，7-二羟基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6，8-二羟基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6-甲氧基-2-[2-(3-甲氧基苯基)乙基]色酮的含量均显著低于普通沉香(P＜0.05)且2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)苯乙基]色酮、2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮、1(10),11-愈创木二烯-15-醛、6-羟基-2-(2-苯乙基)色酮、2-[2-(2-羟基苯基)乙基]色酮、正十六烷酸、6-(1-羟甲基乙烯基)-4，8a-二甲基-3，5，6，7，8，8a-六氢-1H-萘-2-酮、努特卡顿-11，12-环氧化物、环氧化物异芳香树烯和异长叶醇的含量均显著高于普通沉香(P＜0.05)时，则可将所述某一普通沉香相似药材鉴定为奇楠沉香。
进一步地，该奇楠沉香溶液通过以下方法获得：称取0.05g～2.5g的该奇楠沉香粉末，以及添加10mL～300mL的体积百分比浓度为10％～100％的乙醇水溶液浸泡0.2h～1h。
进一步地，该普通沉香溶液通过以下方法获得：称取0.05g～2.5g的该普通沉香粉末，以及添加10mL～300mL的体积百分比浓度为10％～100％的乙醇水溶液浸泡0.2h～1h。
进一步地，该奇楠沉香供试品溶液或者该普通沉香供试品溶液通过以下方法获得：室温超声提取20min～60min，放冷后补足失重，旋蒸去除溶液，并用无水乙醇溶解之后过滤。
进一步地，该奇楠沉香粉末或该普通沉香粉末与该乙醇水溶液的质量体积之比为1:(20～100)，例如约1:50。
进一步地，该浸泡的时间为约0.5h。
进一步地，该超声提取的时间为约40min。
进一步地，该超声的功率为约300W。
进一步地，该超声的频率为约53kHz。
进一步地，该气相色谱-质谱联用法的气相色谱条件：色谱柱HP-5弹性石英毛细管；柱温：50℃，以11℃/min升温至160℃，再以2℃/min升温至170℃，平衡10min之后，以10℃/min升温至270℃，再以3℃/min升温至300℃，平衡5min；气化室温度：230℃；载气：He，载气流量：1ml/min，进样量1μl，分流比：4:1，溶剂延迟时间：3min。
进一步地，该气相色谱-质谱联用法的质谱条件：离子源：EI离子源，70ev；离子源温度：230℃；接口温度230℃；四极杆温度150℃；扫描范围：40m/z～400m/z；全扫描模式。
进一步地，在步骤(d)中，该非靶向代谢组学数据预处理包括将GC-MS采集到的原始数据转换成netCDF格式并导入XCMS-在线软件，进行特征峰提取以及峰对齐的处理以得到包含m/z和保留时间以及峰面积信息的GC-MS数据矩阵；
进一步地，在步骤(d)中，该多元统计分析包括将该GC-MS数据集导入SIMCA软件进行主成分分析和正交偏最小二乘判别分析。
进一步地，在步骤(e)中，该奇楠沉香与普通沉香的差异化合物鉴定的步骤为：通过(i)交叉检查该差异化合物在原始数据中的存在；(ii)将该差异化合物的特征与NIST 17库中存在的特征进行匹配，其中反向匹配分数>800；以及(iii)与已知文献进行比较从而鉴定奇楠沉香和普通沉香的显著差异化合物。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述构建方法或上述奇楠沉香气质指纹图谱或上述鉴别方法在奇楠沉香的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
本发明的有益效果：
本发明采用气质技术测定了奇楠沉香和普通沉香的挥发性成分，结合NIST17数据库(反向匹配分数大于800)以及相关文献，共鉴定了81个奇楠沉香和普通沉香的挥发性成分，包括19个2-(2-苯乙基)色酮类化合物，36个倍半萜类化合物，9个有机酸类成分化合物，8个芳香族类化合物，5个烷烃类化合物，3个内酯类化合物以及1个醛类化合物。接着通过非靶向分析方法与多元统计分析获取奇楠沉香和普通沉香的挥发性差异成分，以P值<0.05、VIP值>1，FC值>2或<0.5为条件筛选差异成分并鉴定出18个奇楠沉香与普通沉香品质差异相关的挥发性成分，包括12个2-(2-苯乙基)色酮类成分和6个倍半萜类成分，奇楠沉香中富含的2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮，这些成分及其在加热后的裂解产物是沉香的气味的主要来源。这些成分在奇楠沉香中含量高于普通沉香，这也是奇楠沉香比普通沉香气味更浓郁的原因。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为12批奇楠沉香的气质色谱叠加图。
图2为奇楠沉香指纹图谱已鉴定共有峰示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
在本发明中，术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
正如背景技术部分所描述的，奇楠沉香产业目前存在缺乏质量标准以及对其开发利用不足等问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种奇楠沉香的气质指纹图谱的构建方法，该构建方法包括如下步骤：
(1)制备奇楠沉香供试品溶液；
(2)采用气相色谱-质谱联用法测定该奇楠沉香供试品溶液；
(3)建立奇楠沉香GC-MS指纹图谱；以及
(4)确定色谱峰母离子的精确质量数和分子式，鉴定奇楠沉香指纹图谱中共有成分的化学结构。
在一种优选的实施方式中，该步骤(3)包括如下步骤：将所有原始总离子流图经积分处理之后转换成TXT格式，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版相似度软件进行数据处理，按中位数法对齐，设定参照图谱并进行相似度分析，在全谱峰匹配之后获得由44个共有色谱峰构成的奇楠沉香GC-MS指纹图谱。
在一种优选的实施方式中，该步骤(4)包括如下步骤：针对烷烃类成分和倍半萜类成分：在安捷伦OpenLAB Data Analysis工作台中利用NIST17库查找与其匹配的物质，其中反向匹配分数高于800；针对色酮类成分：结合保留时间及m/z、NIST17库、文献报道进行解析；一共鉴定了奇楠沉香的9个共有峰。
在一种优选的实施方式中，该9个共有峰分别为1号峰a-檀香醇(a-Santalol)、2号峰脱氢哽酮(Dehydrofukinone)、3号峰缬草烯醇(Valerenol)、4号峰(4aR，5S)-1-羟基-4a，5-二甲基-3-(丙-2-亚基)-4，4a，5，6-四氢萘-2(3H)酮((4aR,5S)-1-Hydroxy-4a,5-dimethyl-3-(propan-2-ylidene)-4,4a,5,6-tetrahydronaphthalen-2(3H)-one)、5号峰喘诺木烯内酯(Reynosin)、6号峰2-苯乙基-4H-二烯-4-酮(2-Phenethyl-4H-chromen-4-one)、7号峰2-[2-(2-甲氧基苯基)乙基]色酮(2-[2-(2-methoxyphenyl)ethyl]chromone)、8号峰2-(4-甲氧基苯乙基)色酮(2-(4-methoxyphenethyl)chromone)和9号峰2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮(2-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]chromone)。
在一种优选的实施方式中，以6号色谱峰为参比峰，其他8个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.43±0.05、2号色谱峰0.63±0.05、3号色谱峰0.68±0.05、4号色谱峰0.81±0.05、5号色谱峰0.93±0.05、7号色谱峰1.07±0.05、8号色谱峰1.09±0.05、9号色谱峰1.16±0.05。
在一种优选的实施方式中，该9个共有峰的保留时间RSD(％)均小于0.3％。
根据本发明的另一个方面，提供了一种奇楠沉香气质指纹图谱，其由上述的奇楠沉香的气质指纹图谱的构建方法所构建获得。
根据本发明的另一个方面，提供了一种奇楠沉香和普通沉香的鉴别方法，该鉴别方法包括如下步骤：
(a)奇楠沉香供试品溶液的制备：在奇楠沉香粉末中添加水或醇，得到奇楠沉香溶液；以及该奇楠沉香溶液经过超声提取、振摇提取或回流提取之后，过滤得到该奇楠沉香供试品溶液；
(b)普通沉香供试品溶液的制备：在普通沉香粉末中添加水或醇，得到普通沉香溶液；以及该普通沉香溶液经过超声提取、振摇提取或回流提取之后，过滤得到该普通沉香供试品溶液；
(c)采用气相色谱-质谱联用法分别测定该奇楠沉香供试品溶液和该普通沉香供试品溶液；
(d)数据处理与统计分析：将GC-MS采集到的原始数据转换成netCDF格式，进行非靶向代谢组学数据预处理和多元统计分析；以及
(e)奇楠沉香与普通沉香的差异化合物鉴定：以P值<0.05、VIP值>1，FC值>2或<0.5为条件筛选奇楠沉香和普通沉香的差异成分并进行结构鉴定，共鉴定出18个差异成分，以普通沉香为参照，通过该18个差异成分可将奇楠沉香和普通沉香进行区分。
在一种优选的实施方式中，该18个差异成分包括12个2-(2苯乙基)色酮类成分和6个倍半萜类成分。
在一种优选的实施方式中，以普通沉香为参照，当某一普通沉香相似药材的6，7-二甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6，8-二羟基-2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6，7-二羟基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6，8-二羟基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6-甲氧基-2-[2-(3-甲氧基苯基)乙基]色酮的含量均显著低于普通沉香(P＜0.05)且2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)苯乙基]色酮、2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮、1(10),11-愈创木二烯-15-醛、6-羟基-2-(2-苯乙基)色酮、2-[2-(2-羟基苯基)乙基]色酮、正十六烷酸、6-(1-羟甲基乙烯基)-4，8a-二甲基-3，5，6，7，8，8a-六氢-1H-萘-2-酮、努特卡顿-11，12-环氧化物、环氧化物异芳香树烯和异长叶醇的含量均显著高于普通沉香(P＜0.05)时，则可将所述某一普通沉香相似药材鉴定为奇楠沉香。
在一种优选的实施方式中，该奇楠沉香溶液通过以下方法获得：称取0.05g～2.5g的该奇楠沉香粉末，以及添加10mL～300mL的体积百分比浓度为10％～100％的乙醇水溶液浸泡0.2h～1h。
在一种优选的实施方式中，该普通沉香溶液通过以下方法获得：称取0.05g～2.5g的该普通沉香粉末，以及添加10mL～300mL的体积百分比浓度为10％～100％的乙醇水溶液浸泡0.2h～1h。
在一种优选的实施方式中，该奇楠沉香供试品溶液或者该普通沉香供试品溶液通过以下方法获得：室温超声提取20min～60min，放冷后补足失重，旋蒸去除溶液，并用无水乙醇溶解之后过滤。
在一种优选的实施方式中，该奇楠沉香粉末或该普通沉香粉末与该乙醇水溶液的质量体积之比为1:(20～100)，例如约1:50。
在一种优选的实施方式中，该浸泡的时间为约0.5h。
在一种优选的实施方式中，该超声提取的时间为约40min。
在一种优选的实施方式中，该超声的功率为约300W。
在一种优选的实施方式中，该超声的频率为约53kHz。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约1:50”包括1:50的±5％，或从1:47.5到1:52.5；“约0.5”包括0.5的±5％，或从0.475到0.525；“约40”包括40的±5％，或从38到42；“约300”包括300的±5％，或从285到315；“约53”包括53的±5％，或从50.35到55.65。
在一种优选的实施方式中，该气相色谱-质谱联用法的气相色谱条件：色谱柱HP-5弹性石英毛细管；柱温：50℃，以11℃/min升温至160℃，再以2℃/min升温至170℃，平衡10min之后，以10℃/min升温至270℃，再以3℃/min升温至300℃，平衡5min；气化室温度：230℃；载气：He，载气流量：1ml/min，进样量1μl，分流比：4:1，溶剂延迟时间：3min。
在一种优选的实施方式中，该气相色谱-质谱联用法的质谱条件：离子源：EI离子源，70ev；离子源温度：230℃；接口温度230℃；四极杆温度150℃；扫描范围：40m/z～400m/z；全扫描模式。
在一种优选的实施方式中，在步骤(d)中，该非靶向代谢组学数据预处理包括将GC-MS采集到的原始数据转换成netCDF格式并导入XCMS-在线软件，进行特征峰提取以及峰对齐的处理以得到包含m/z和保留时间以及峰面积信息的GC-MS数据矩阵；
在一种优选的实施方式中，在步骤(d)中，该多元统计分析包括将该GC-MS数据集导入SIMCA软件进行主成分分析和正交偏最小二乘判别分析。
在一种优选的实施方式中，在步骤(e)中，该奇楠沉香与普通沉香的差异化合物鉴定的步骤为：通过(i)交叉检查该差异化合物在原始数据中的存在；(ii)将该差异化合物的特征与NIST 17库中存在的特征进行匹配，其中反向匹配分数>800；以及(iii)与已知文献进行比较从而鉴定奇楠沉香和普通沉香的显著差异化合物。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述构建方法或上述奇楠沉香气质指纹图谱或上述鉴别方法在奇楠沉香的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例一奇楠沉香和普通沉香的气质联用非靶向代谢组学研究
1.材料与仪器
1.1实验材料
所有样品(如表1所示)经中国中医科学院中药研究所张志杰研究员鉴定后收藏于中药所生药中心药材储藏室，样品在使用前经去杂，粉碎处理并编号。
表1奇楠沉香与普通沉香药材信息表
1.2仪器与试剂
Agilent 7980A-5975C型气相色谱-质谱联用仪(安捷伦科技公司)；AUW120D分析电子天平(日本岛津公司)；SK7210HP型超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；N13224型智能样品研磨仪(北京赫得科技有限公司)；N-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。
色谱级无水乙醇(美国杰帝贝柯化工产品公司，批号：0000192767)；乙酸乙酯(德国霍尼韦尔有限公司，批号：T3SG1H)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；其它试剂均为分析纯。
2.实验方法
2.1样品制备
2.1.1供试品制备
取普通沉香粉末0.2g，精密称定，置于50ml具塞锥形瓶中，加入10ml 95.0％乙醇中室温下浸泡半小时，称定重量，然后在室温下超声提取40min(功率300W，频率53kHz)，放冷后补足失重，旋蒸去除溶液，加入2ml无水乙醇溶解后过0.22μm微孔滤膜得供试品，储存在4℃保存。
取奇楠沉香粉末0.2g，精密称定，置于50ml具塞锥形瓶中，加入10ml 95.0％乙醇中室温下浸泡半小时，称定重量，然后在室温下超声提取40min(功率300W，频率53kHz)，放冷后补足失重，旋蒸去除溶液，加入2ml无水乙醇溶解后过0.22μm微孔滤膜得供试品，储存在4℃保存。
2.1.2质控(QC)样品的制备
取各样品等量粉末样品，混匀后按照“2.1.1”项下的方法进行提取，得QC样品溶液。将QC样品规律插入分析序列中，用来反映分析方法的精密性和稳定性以及定性数据的校正。
2.2 GC-MS分析条件
2.2.1色谱条件
色谱柱HP-5弹性石英毛细管(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温：50℃，以11℃/min升温至160℃，再以2℃/min升温至170℃，平衡10min之后，以10℃/min升温至270℃，再以3℃/min升温至300℃，平衡5min；气化室温度230℃；载气：He，载气流量：1ml/min，进样量1μl，分流比4:1，溶剂延迟3min。
其中，在确定上述柱温变化条件之前，针对编号为K2的奇楠沉香样品，针对柱温变化条件进行了以下条件摸索：
条件1：柱温：50℃，以10℃/min升温至130℃，再以2℃/min升温至170℃，再以3℃/min升温至230℃，230平衡2min，以8℃/mi升温至310℃，保持5min，气化室温度230℃；
条件2：柱温从50℃开始，并以5℃/min的速度增加到310℃，然后保持10分钟，气化室温度230℃。
条件3：柱温：50℃ 1min，随后以15℃/min的速率升温至143℃；在143℃下10分钟，以1℃/min的速率升温至155℃；在155℃下0分钟，以25℃/min的速率升温至225℃；在225℃下7分钟，以25℃/min的速率升至300℃；然后将温度保持在300℃ 5分钟；
条件4：柱温：50℃，以11℃/min升温至160℃，再以2℃/min升温至170℃，平衡10min之后，以10℃/min升温至270℃，再以3℃/min升温至300℃，平衡5min。
经过比较发现，从样品分离情况来看，在条件4下，显现的峰的数量明显更多，峰的分离度明显更优，因此确定条件4作为柱温变化条件。
2.2.2质谱条件
离子源：EI离子源，70ev；离子源温度：230℃；接口温度230℃；四极杆温度150℃；扫描范围：40-400m/z；全扫描(Full Scan)模式。
2.3化合物鉴定
对于普通沉香样品中烷烃类及倍半萜类等成分的定性：在安捷伦OpenLAB DataAnalysis工作台中利用NIST17库查找与其匹配的物质(反向匹配分数高于800)；对于色酮类成分的定性：结合保留时间及m/z、NIST17库、文献报道进行解析。
2.4非靶向代谢组学数据处理
所有原始数据导出为.netCDF文件，随后将导出CDF文件导入XCMS-Online软件(Version 3.7.1,the Scripps Center for Metabolomics,La Jolla,加利福尼亚州)对原始数据进行特征峰提取及峰对齐等处理以得到包含m/z和保留时间及峰面积等信息的数据矩阵。根据本发明中的样本分组，选择Pairwise方式进行差异分析，选择“GC/Single Quad(matchedFilter)”作为分析算法，参数如下：特征检测(method＝matchedFilter,step＝0.25,fwhm＝3,steps＝2,snthresh＝10,mzdiff＝0.5,max＝100,prefilter intensity＝50000),Rt correction(method＝peakgroups,ignore sample class,bw＝10,mzwid＝0.25,minfrac＝1,minsamp＝1,missing＝5,extra＝1,smooth＝loess,family＝gaussian),Grouping(method＝density,bw＝30,mzwid＝0.25,minfrac＝0.5,minsamp＝9),Kruskal Wallis检验。
2.5多元统计分析
对代谢组学数据预处理获得的GC-MS数据集进行进一步的多变量分析，使用SIMCA软件(Version 14.1.0，Umetrics，瑞士)进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，基于具有显着单变量测试的候选特征作为X变量，样本数作为Y变量。通过执行完全交叉验证以评估模型的可靠性。通过OPLS模型获得的投影值(VIP>1)和S-line分别来识别和可视化奇楠沉香和普通沉香的显著差异特征。代谢物特征的鉴定通过(i)交叉检查它们在原始数据中的存在，(ii)将它们的特征与NIST 17库中存在的特征进行匹配(反向匹配分数>800)，以及(iii)与现有的文献进行比较鉴定。
3.结果
3.1普通沉香挥发性成分定性研究
采用GC-Q-TOF-MS技术对奇楠沉香和普通沉香的挥发性化学成分进行比较分析。在高分离度、高灵敏度的条件下得到普通沉香中挥发性成分发精确分子量及碎片离子信息，利用NIST17数据库对其中的挥发性成分进行检索识别，筛选反向匹配分数大于800的化合物，同时结合人工解析推测未知成分，共鉴定获得81个化合物，其中19个2-(2-苯乙基)色酮类化合物，36个倍半萜类化合物，9个有机酸类成分化合物，8个芳香族类化合物，5个烷烃类化合物，3个内酯类化合物以及1个醛类化合物，具体成分信息如表2所示。
表2奇楠沉香与普通沉香中挥发性化学成分气质联用定性研究
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3.2奇楠沉香与普通沉香的挥发性差异成分分析
3.2.1非靶向代谢组学处理获取奇楠沉香与普通沉香的差异特征
气味也是奇楠沉香的一个重要特征，奇楠沉香具有比普通沉香更浓烈的气味，本发明通过基于气质联用非靶向代谢组学对12批奇楠沉香和12批普通沉香的挥发性成分进行分析，以期揭示奇楠沉香和普通沉香的气味差异的成分内涵。在数据预处理过程中，各样品化学图谱原始数据采用XCMS软件进行峰检测和峰对齐等数据预处理。本实验中非度量多维尺度分析未识别出潜在异常值的样本。非靶向分析结果从24批普通沉香样品的原始GC-MS数据获得了693个差异离子峰，232个峰组。
为了分析奇楠沉香和普通沉香的挥发性成分组成差异，对所有经过XCMS数据预处理后得到的特征峰(Features)进行多元统计分析。我们先对样本数据结果使用SIMCA软件进行PCA分析。PCA中两个主成分差异贡献占比为71.9％，其中主成分1(PC1)贡献占比60.6％，主成分2(PC2)占总差异的11.3％。PCA得分图中奇楠沉香样品明显聚集在PC1的左侧，普通沉香样品被聚在PC1的右侧，说明这两组样品在化学成分上有明显差异。同时在PC2上奇楠沉香样品有分散聚集的情况，说明奇楠沉香样品间同样存在一定的差异，但是差异程度较奇楠沉香与普通沉香样品间的差异小，奇楠沉香样品间的差异可能与样品的产地、结香时间、诱导方式等有关。由于奇楠沉香与普通沉香的成分差异明显，接着我们通过受监督的OPLS-DA模型获取奇楠沉香与普通沉香主要的差异化学成分。交叉验证评分图展示了OPLS-DA模型对两组沉香的分类情况，根据非靶向预处理后的气质数据该模型成功地分配了所有沉香样品，奇楠沉香组与普通沉香组明显分为两类。R2和Q2通常被用来评价模型的质量，本模型中R2X(cum)＝0.775，R2Y(cum)＝0.997，Q2(cum)＝0.958，说明该模型解释能力较好，预测能力强。我们采用了建立的OPLS-DA模型中的变量投射重要度(VIP值)来衡量各成分对奇楠沉香和普通沉香分类判别的影响强度和解释能力，S-line图中用feature ID展示了奇楠沉香和普通沉香中VIP值>1的差异离子特征。为了避免OPLS模型开发过程中的过拟合，我们进行了交叉验证和200次排列检验，并将R2和Q2值的结果绘制为回归线图，结果表明本模型具有较好的拟合以及预测能力。在本发明中，我们通过结合来自多变量统计参数的证据和方差分析统计检验，重点关注具有高置信度的离子特征，以P值<0.05、VIP值>1、FC值>2或<0.5为筛条件，从24批样品的GC-MS采集数据中共提取到242个特征离子，58个峰组。
3.2.2挥发性差异成分的鉴定
沉香挥发性成分中主要含有两类成分：2-(2-苯乙基)色酮类成分和倍半萜类成分，它们均与沉香的特殊香味形成有关。本发明通过NIST数据库搜索和相关文献对非靶向代谢获取的差异特征进行反向匹配及鉴定，表3展示18个与奇楠沉香和普通沉香气味差异相关的鉴定成分，包括12个2-(2-苯乙基)色酮类成分和6个倍半萜类成分，它们均可以作为奇楠沉香和普通沉香的挥发性成分差异的标志物。奇楠沉香中2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮的总含量较高(在奇楠沉香样品平均比例为58.5％)，加热后它们会热解成苯甲醛和4-甲氧基苯甲醛，从而释放出宜人的香味。Guaia-1(10),11-dien-15,2-olide具有强大持久的木质甜美的香味。Longifolol有一种花香和雪松木的香味，作为现代香水的天然化学成分很受人们喜爱。这些成分的含量在奇楠沉香中均显著高于普通沉香，因此可能是奇楠沉香比普通沉香的更具特殊香味的原因。
表3 GCMS非靶向代谢分析奇楠沉香与普通沉香的差异结果
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表注：a表示差异成分在奇楠沉香的含量水平较普通沉香的高低；b表示P值的大小(根据奇楠沉香与普通沉香中化合物定量离子响应值强度进行T检验计算)。
4.结论
本实验采用GC-Q-TOF-MS技术测定了12批奇楠沉香和12批普通沉香的挥发性成分，结合NIST17数据库(反向匹配分数大于800)以及相关文献，共鉴定了81个挥发性成分，包括19个2-(2-苯乙基)色酮类化合物，36个倍半萜类化合物，9个有机酸类成分化合物，8个芳香族类化合物，5个烷烃类化合物，3个内酯类化合物以及1个醛类化合物。接着通过非靶向分析方法与多元统计分析获取奇楠沉香和普通沉香的挥发性差异成分，以P值<0.05、VIP值>1，FC值>2或<0.5为条件筛选差异成分并鉴定出其中18个挥发性成分与奇楠沉香、普通沉香的品质差异相关，包括12个2-(2苯乙基)色酮类成分和6个倍半萜类成分，这些挥发性成分在奇楠沉香中含量显著高于普通沉香，是奇楠沉香比普通沉香气味更浓郁的主要原因。
实施例二奇楠沉香的气质指纹图谱挥发性成分研究
采用气质联用技术结合指纹图谱分析建立奇楠沉香的挥发性成分指纹图谱，以获取12批奇楠沉香的特征性成分，为全面揭示奇楠沉香化学成分基准提供参考。
1.材料与仪器
1.1实验材料
与实施例一相同。
2.实验方法
2.1样品制备
与实施例一相同。
2.2GC-MS分析条件
与实施例一相同。
2.3方法学考察
2.3.1精密度考察
精密称取QC样本粉末，按“2.1”项下方法进行制备供试品溶液，精密吸取同一供试品，按“2.2”项下条件连续进样6次。将所得气相图谱导入相似度评价软件进行分析，图谱相似度均大于0.9且主要色谱峰保留时间RSD％<5％，表明仪器精密度良好。
2.3.2稳定性考察
精密称取QC样本粉末，按“2.1”项下方法进行制备供试品溶液，精密吸取同一供试品，分别于0，4，6，12，24，48h按“2.2”项下条件进样分析将所得气相图谱导入相似度评价软件进行分析，图谱相似度均大于0.9且主要色谱峰保留时间RSD％<5％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.3.3重复性考察
精密称取QC样本粉末，按“2.1”项下方法进行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下条件进样分析。将所得气相图谱导入相似度评价软件进行分析，图谱相似度均大于0.9且主要色谱峰保留时间RSD％<5％，表明该方法重复性良好。
2.4指纹图谱研究
将12批奇楠沉香样品按上述气质联用条件分析后，将所有原始总离子流图经积分处理后转换成TXT.格式，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行数据处理，按中位数法对齐，设定参照图谱并进行相似度分析。
3.结果
12批奇楠沉香样品的挥发性成分指纹图谱如图1所示，从12批奇楠沉香中共识别出156个峰，以中位数法生成对照指纹图谱(如图2所示)。将各样品与R进行比较，得到S1～S12的相似度分别为0.994、0.956、0.963、0.995、0.989、0.995、0.997、0.995、0.998、0.996、0.925、0.985，各样品的相似度分布在0.925～0.998，表明不同产地的奇楠沉香在共有成分上具有高度相似性。从图谱中可以观察到保留时间33min之后，出现多个高响应值色谱，这些色谱峰多为2-(2-苯乙基)色酮类成分，这类成分在奇楠沉香的挥发性成分中同样占主导地位。在全谱峰匹配后共获得44个共有色谱峰，结合12批样品共有峰的保留时间RSD(％)＜0.3的要求选择其中峰面积相对较高以及分离度较好的9个共有峰。9个共有峰通过本章第一节“2.3”项下的方法进行识别，结果如表4所示。
表4奇楠沉香指纹图谱共有峰
4.结论
本实验建立了奇楠沉香的GCMS指纹图谱，并从12批奇楠沉香中识别出44个共有峰。对奇楠沉香样品的挥发性成分进行相似度分析，结果表明不同产区奇楠沉香的相似度范围在0.925～0.998，说明该条件下不同产地的奇楠沉香在共有成分上具有高度相似性。
在全谱峰匹配后共获得44个共有色谱峰，结合保留时间RSD(％)＜0.3％的要求选择其中峰面积相对较高以及分离度较好的9个共有峰作为特征峰进行鉴定，9个特征峰分别鉴定为a-檀香醇(a-Santalol)、脱氢哽酮(Dehydrofukinone)、缬草烯醇(Valerenol)、(4aR,5S)-1-羟基-4a,5-二甲基-3-(丙-2-亚基)-4,4a,5,6-四氢萘-2(3H)酮((4aR,5S)-1-Hydroxy-4a,5-dimethyl-3-(propan-2-ylidene)-4,4a,5,6-tetrahydronaphthalen-2(3H)-one)、喘诺木烯内酯(Reynosin)、2-苯乙基-4H-二烯-4-酮(2-Phenethyl-4H-chromen-4-one)、2-[2-(2-甲氧基苯基)乙基]色酮(2-[2-(2-methoxyphenyl)ethyl]chromone)、2-(4-甲氧基苯乙基)色酮(2-(4-methoxyphenethyl)chromone)、2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮(2-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]chromone)，其中2-苯乙基-4H-二烯-4-酮(2-Phenethyl-4H-chromen-4-one)、2-[2-(2-甲氧基苯基)乙基]色酮(2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]chromone)以及2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮(2-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]chromone)占生奇楠沉香对照品图谱总峰面积的79.96％，这些成分可以用于奇楠沉香的质量评价以及鉴别分析。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种奇楠沉香的气质指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
(1)制备奇楠沉香供试品溶液；
(2)采用气相色谱-质谱联用法测定所述奇楠沉香供试品溶液；
(3)建立奇楠沉香GC-MS指纹图谱；以及
(4)确定色谱峰母离子的精确质量数和分子式，鉴定奇楠沉香指纹图谱中共有成分的化学结构。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)包括如下步骤：将所有原始总离子流图经积分处理之后转换成TXT格式，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版相似度软件进行数据处理，按中位数法对齐，设定参照图谱并进行相似度分析，在全谱峰匹配之后获得由44个共有色谱峰构成的奇楠沉香GC-MS指纹图谱。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)包括如下步骤：针对烷烃类成分和倍半萜类成分：在安捷伦OpenLAB Data Analysis工作台中利用NIST17库查找与其匹配的物质，其中反向匹配分数高于800；针对色酮类成分：结合保留时间及m/z、NIST17库、文献报道进行解析；一共鉴定了奇楠沉香的9个共有峰；
优选地，所述9个共有峰分别为1号峰a-檀香醇(a-Santalol)、2号峰脱氢哽酮(Dehydrofukinone)、3号峰缬草烯醇(Valerenol)、4号峰(4aR，5S)-1-羟基-4a，5-二甲基-3-(丙-2-亚基)-4，4a，5，6-四氢萘-2(3H)酮((4aR,5S)-1-Hydroxy-4a,5-dimethyl-3-(propan-2-ylidene)-4,4a,5,6-tetrahydronaphthalen-2(3H)-one)、5号峰喘诺木烯内酯(Reynosin)、6号峰2-苯乙基-4H-二烯-4-酮(2-Phenethyl-4H-chromen-4-one)、7号峰2-[2-(2-甲氧基苯基)乙基]色酮(2-[2-(2-methoxyphenyl)ethyl]chromone)、8号峰2-(4-甲氧基苯乙基)色酮(2-(4-methoxyphenethyl)chromone)和9号峰2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮(2-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]chromone)；
优选地，以6号色谱峰为参比峰，其他8个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.43±0.05、2号色谱峰0.63±0.05、3号色谱峰0.68±0.05、4号色谱峰0.81±0.05、5号色谱峰0.93±0.05、7号色谱峰1.07±0.05、8号色谱峰1.09±0.05、9号色谱峰1.16±0.05；
优选地，所述9个共有峰的保留时间RSD(％)均小于0.3％。
4.一种奇楠沉香气质指纹图谱，其特征在于，其由权利要求1至3中任一项所述的奇楠沉香的气质指纹图谱的构建方法所构建获得。
5.一种奇楠沉香和普通沉香的鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法包括如下步骤：
(a)奇楠沉香供试品溶液的制备：在奇楠沉香粉末中添加水或醇，得到奇楠沉香溶液；以及所述奇楠沉香溶液经过超声提取、振摇提取或回流提取之后，过滤得到所述奇楠沉香供试品溶液；
(b)普通沉香供试品溶液的制备：在普通沉香粉末中添加水或醇，得到普通沉香溶液；以及所述普通沉香溶液经过超声提取、振摇提取或回流提取之后，过滤得到所述普通沉香供试品溶液；
(c)采用气相色谱-质谱联用法分别测定所述奇楠沉香供试品溶液和所述普通沉香供试品溶液；
(d)数据处理与统计分析：将GC-MS采集到的原始数据转换成netCDF格式，进行非靶向代谢组学数据预处理和多元统计分析；以及
(e)奇楠沉香与普通沉香的差异化合物鉴定：以P值<0.05、VIP值>1，FC值>2或<0.5为条件筛选奇楠沉香和普通沉香的差异成分并进行结构鉴定，共鉴定出18个差异成分，以普通沉香为参照，通过所述18个差异成分可将奇楠沉香和普通沉香进行区分；
优选地，所述18个差异成分包括12个2-(2苯乙基)色酮类成分和6个倍半萜类成分；
更优选地，以普通沉香为参照，当某一普通沉香相似药材的6，7-二甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6，8-二羟基-2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6，7-二羟基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6，8-二羟基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6-甲氧基-2-[2-(3-甲氧基苯基)乙基]色酮的含量均显著低于普通沉香(P＜0.05)且2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮、1(10),11-愈创木二烯-15-醛、6-羟基-2-(2-苯乙基)色酮、2-[2-(2-羟基苯基)乙基]色酮、正十六烷酸、6-(1-羟甲基乙烯基)-4，8a-二甲基-3，5，6，7，8，8a-六氢-1H-萘-2-酮、努特卡顿-11，12-环氧化物、环氧化物异芳香树烯和异长叶醇含量均显著高于普通沉香(P＜0.05)时，则可将所述某一普通沉香相似药材鉴定为奇楠沉香。
6.根据权利要求1所述的构建方法或权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于，所述奇楠沉香溶液通过以下方法获得：称取0.05g～2.5g的所述奇楠沉香粉末，以及添加10mL～300mL的体积百分比浓度为10％～100％的乙醇水溶液浸泡0.2h～1h；
优选地，所述普通沉香溶液通过以下方法获得：称取0.05g～2.5g的所述普通沉香粉末，以及添加10mL～300mL的体积百分比浓度为10％～100％的乙醇水溶液浸泡0.2h～1h；
优选地，所述奇楠沉香供试品溶液或者所述普通沉香供试品溶液通过以下方法获得：室温超声提取20min～60min，放冷后补足失重，旋蒸去除溶液，并用无水乙醇溶解之后过滤；
更优选地，所述奇楠沉香粉末或所述普通沉香粉末与所述乙醇水溶液的质量体积之比为1:(20～100)，例如约1:50；
更优选地，所述浸泡的时间为约0.5h；
更优选地，所述超声提取的时间为约40min；
更优选地，所述超声的功率为约300W；
更优选地，所述超声的频率为约53kHz。
7.根据权利要求1所述的构建方法或权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱联用法的气相色谱条件：色谱柱HP-5弹性石英毛细管；柱温：50℃，以11℃/min升温至160℃，再以2℃/min升温至170℃，平衡10min之后，以10℃/min升温至270℃，再以3℃/min升温至300℃，平衡5min；气化室温度：230℃；载气：He，载气流量：1ml/min，进样量1μl，分流比：4:1，溶剂延迟时间：3min；
优选地，所述气相色谱-质谱联用法的质谱条件：离子源：EI离子源，70ev；离子源温度：230℃；接口温度230℃；四极杆温度150℃；扫描范围：40m/z～400m/z；全扫描模式。
8.根据权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于，在步骤(d)中，所述非靶向代谢组学数据预处理包括将GC-MS采集到的原始数据转换成netCDF格式并导入XCMS-在线软件，进行特征峰提取以及峰对齐的处理以得到包含m/z和保留时间以及峰面积信息的GC-MS数据矩阵；
优选地，在步骤(d)中，所述多元统计分析包括将所述GC-MS数据集导入SIMCA软件进行主成分分析和正交偏最小二乘判别分析。
9.根据权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于，在步骤(e)中，所述奇楠沉香与普通沉香的差异化合物鉴定的步骤为：通过(i)交叉检查所述差异化合物在原始数据中的存在；(ii)将所述差异化合物的特征与NIST 17库中存在的特征进行匹配，其中反向匹配分数>800；以及(iii)与已知文献进行比较从而鉴定奇楠沉香和普通沉香的显著差异化合物。
10.根据权利要求1、2、3、6和7中任一项所述的构建方法或根据权利要求4所述的奇楠沉香气质指纹图谱或根据权利要求5至9中任一项所述的鉴别方法在奇楠沉香的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
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