CN117265062A - 一种尿液样本rna保存液及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种尿液样本RNA保存液，由以下材料组成：蛋白变性剂、还原剂、核酸酶抑制剂、缓冲液、助沉剂和表面活性剂，其中，蛋白变性剂的浓度为1—4mol/L；还原剂的浓度为0.06—0.1mol/L；核酸酶抑制剂的浓度为0.012—0.06mol/L。本发明含有沉淀剂，对于RNA含量较低的样本，可通过离心的方式沉淀RNA去上清，提取底部样本可得到相对较高浓度RNA，还原剂无异味，无需通风橱即可使用，稳定性高，在操作、使用以及保存的过程中不需要做预防措施来避免氧化发生，pH工作范围广，还原性强，对于大部分实验，5‑50mM TCEP·HCl即可提供足够的摩尔力，室温条件下作用几分钟即可充分还原二硫键，兼容性广，不含有硫醇基，进行下游的巯基修饰实验如马来酰亚胺偶联不需要提前去除此还原剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种尿液样本RNA保存液及应用。
背景技术
性传播疾病(Sexually Transmitted Disease,STD)是指性接触或类似性行为引起的一组感染性疾病。STD的常见病原体包括，病毒、衣原体、支原体、螺旋体、细菌、真菌、原虫和寄生虫等。
STD主要是有涂片镜检法、培养法、胶体金和分子检测法，各种方法各有优劣势。相比而言，分子检测更有优势。分子检测技术，尤其是RNA检测技术，因其灵敏、特异和无创的明显优势，为非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis，NGU)的精确诊断提供了有利的工具。RNA检测技术的出现，极大地提高了检测的敏感性和特异性，相比其他方法敏感性更高。另外，因RNA在死亡的病原体中很快降解，故以RNA为靶标可以直观反映病原体的存在状态，辅助进行疗效监测，指导临床精准用药，解决目前国内普遍存在的过度治疗，尤其是抗生素滥用问题，大幅降低整体医疗费用，缩短治疗时间，建议作为非淋菌性尿道炎的首选检测方法。
尿液样本一般仅适用于RNA检测方法，其优点为无创、方便、敏感性和特异性高。采用尿液标本进行检测，解除了男性患者通过尿道拭子采样的痛苦，适合所有疑似患者，无论有无临床症状。研究表明，虽然临床推荐采集清晨第一次尿，或停止排尿后2h的首段尿，但实际应用中任何时候采集的尿液对检测结果都没有明显影响。采集尿样时尿道口也无需消毒。
作为一种非侵入性的方法，采用尿液进行诊断检测大大提高了患者的便利性，然而，尿液中核酸含量较低，尿液中含大量的核酸酶，尿液样本分离后，其中RNA非常不稳定，极易被降解，通常需要在低温(-80℃)以下保存，这就限制了尿液样本在STD的应用。因此，开发一种能有效防止尿液样本中RNA降解同时又不影响后续检测结果的尿液RNA保存试剂，对尿液样本在STD领域应用具有重要意义，同时也可拓展尿液样本在临床其他方面检测的应用。
现有技术的不足：
目前，市面上针对RNA样本保存产品较少，且存在如下缺陷：
绝大部分专利针对的样本类型为组织、血液、拭子等RNA含量较高的样本，针对尿液等RNA含量很低的体液样本的保存液稀缺。且针对尿液样本，主要是用于对尿沉渣中核酸保存，尿液在保存前往往需要离心收集尿沉渣；现有的针对尿液RNA保存的保护剂如知名的Norgen的尿液保存管，保存成本高，对样本量有一定的要求；现有的保护剂中使用的还原剂如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇DTT效果较差，一般只能维持两至三天，需要定期添加，才能保持试剂性能。因此，需要寻找更稳定的还原剂，延长保护剂的保存效果对样本的保存应用也有一定意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液样本RNA保存液及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
一种尿液样本RNA保存液，由以下材料组成：蛋白变性剂、还原剂、核酸酶抑制剂、缓冲液、助沉剂和表面活性剂，其中，
蛋白变性剂的浓度为1—4mol/L；
还原剂的浓度为0.06—0.1mol/L；
核酸酶抑制剂的浓度为0.012—0.06mol/L。
作为本发明的进一步改进，由以下材料组成：蛋白变性剂、还原剂、核酸酶抑制剂、缓冲液、助沉剂和表面活性剂，其中，
蛋白变性剂的浓度为2mol/L；
还原剂的浓度为0.08mol/L；
核酸酶抑制剂0.05mol/L。
作为本发明的进一步改进，所述蛋白变性剂为异硫氰酸胍和盐酸胍中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，所述还原剂为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP-HCl)。
作为本发明的进一步改进，所述核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸钠盐和十二烷基硫酸钠中的至少一种，其中：
乙二胺四乙酸钠盐的浓度为0.012—0.06mol/L；
十二烷基硫酸钠的浓度在保存液中浓度为0.4％—0.8％。
作为本发明的进一步改进，所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的Ph范围为3-6.6。
作为本发明的进一步改进，所述助沉剂为PEG8000和异丙醇，其中：
PEG8000在保存液中浓度为6％—10％；
异丙醇在保存液中浓度为4％—12％。
作为本发明的进一步改进，所述表面活性剂为吐温20，所述吐温20在保存液中浓度为2％—6％。
作为本发明的进一步改进，所述蛋白变性剂、还原剂、核酸酶抑制剂、缓冲液、助沉剂和表面活性剂均采用灭菌纯化水配置。
本发明还提供了一种尿液样本RNA保存液的应用，所述RNA保存液用于保存尿液样本，所述RNA保存液使用的温度范围-80℃-37℃，所述RNA保存液与尿液的体积比为1：1。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明护剂中含有沉淀剂，对于RNA含量较低的样本，可通过离心的方式沉淀RNA去上清，提取底部样本可得到相对较高浓度RNA，所采用的还原剂无异味，无需通风橱即可使用，稳定性高，在操作、使用以及保存的过程中不需要做预防措施来避免氧化发生，pH工作范围广；还原性强，对于大部分实验，5-50mM TCEP·HCl即可提供足够的摩尔力，室温条件下作用几分钟即可充分还原二硫键，兼容性广，不含有硫醇基，进行下游的巯基修饰实验如马来酰亚胺偶联不需要提前去除此还原剂，经过试验测试，使用本保护剂保存尿液样本，在室温条件下保存效果可达30天，2～8℃达3个月。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本发明提供如下技术方案：一种尿液样本RNA保存液，由以下材料组成：蛋白变性剂、还原剂、核酸酶抑制剂、缓冲液、助沉剂和表面活性剂，其中，
蛋白变性剂的浓度为2mol/L，蛋白变性剂为异硫氰酸胍；
还原剂的浓度为0.08mol/L，还原剂为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP-HCl)；
核酸酶抑制剂0.05mol/L，核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸钠盐，乙二胺四乙酸钠盐的浓度为0.012—0.06mol/L；
缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的Ph为4.5；
助沉剂为PEG8000和异丙醇，其中：PEG8000在保存液中浓度为8％，异丙醇在保存液中浓度为8％；
表面活性剂为吐温20，吐温20在保存液中浓度为4％；
蛋白变性剂、还原剂、核酸酶抑制剂、缓冲液、助沉剂和表面活性剂均采用灭菌纯化水配置。
RNA保存液用于保存尿液样本，RNA保存液使用的温度范围-80℃-37℃，所述RNA保存液与尿液的体积比为1：1。
使用本尿液保护剂(保护剂3)保存含沙眼衣原体(CT)、生殖支原体(MG)尿液样本，第30天ΔCt＜3.3，结果如表一所示：
表一
采用本保护剂保存含淋球菌(NG)、生殖支原体(MG)尿液样本，和已注册同款试剂对比，此试剂推荐尿液保护剂比例为9：1，本保护剂效果明显优于同款试剂，结果如表二所示：
表二
采用本保护剂常温保存含淋球菌(NG)、生殖支原体(MG)尿液样本，和常温不加保护剂样本对比，可有效放置核酸降解，结果如表三所示：
表三
本发明中，经过试验测试，使用本保护剂保存尿液样本，在室温条件下保存效果可达30天，2～8℃达3个月，保护剂中含有沉淀剂，对于RNA含量较低的样本，可通过离心的方式沉淀RNA去上清，提取底部样本可得到相对较高浓度RNA，所采用的还原剂无异味，无需通风橱即可使用，稳定性高，在操作、使用以及保存的过程中不需要做预防措施来避免氧化发生，pH工作范围广，还原性强，对于大部分实验，5-50mM TCEP·HCl即可提供足够的摩尔力，室温条件下作用几分钟即可充分还原二硫键，兼容性广，不含有硫醇基，进行下游的巯基修饰实验如马来酰亚胺偶联不需要提前去除此还原剂。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种尿液样本RNA保存液，其特征在于：由以下材料组成：蛋白变性剂、还原剂、核酸酶抑制剂、缓冲液、助沉剂和表面活性剂，其中，
蛋白变性剂的浓度为1—4mol/L；
还原剂的浓度为0.06—0.1mol/L；
核酸酶抑制剂的浓度为0.012—0.06mol/L。
2.根据权利要求1所述的尿液样本RNA保存液，其特征在于：由以下材料组成：蛋白变性剂、还原剂、核酸酶抑制剂、缓冲液、助沉剂和表面活性剂，其中，
蛋白变性剂的浓度为2mol/L；
还原剂的浓度为0.08mol/L；
核酸酶抑制剂0.05mol/L。
3.根据权利要求1所述的尿液样本RNA保存液，其特征在于：所述蛋白变性剂为异硫氰酸胍和盐酸胍中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的尿液样本RNA保存液，其特征在于：所述还原剂为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP-HCl)。
5.根据权利要求1所述的尿液样本RNA保存液，其特征在于：所述核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸钠盐和十二烷基硫酸钠中的至少一种，其中：
乙二胺四乙酸钠盐的浓度为0.012—0.06mol/L；
十二烷基硫酸钠的浓度在保存液中浓度为0.4％—0.8％。
6.根据权利要求1所述的尿液样本RNA保存液，其特征在于：所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的Ph范围为3-6.6。
7.根据权利要求1所述的尿液样本RNA保存液，其特征在于：所述助沉剂为PEG8000和异丙醇，其中：
PEG8000在保存液中浓度为6％—10％；
异丙醇在保存液中浓度为4％—12％。
8.根据权利要求1所述的尿液样本RNA保存液，其特征在于：所述表面活性剂为吐温20，所述吐温20在保存液中浓度为2％—6％。
9.根据权利要求1所述的尿液样本RNA保存液，其特征在于：所述蛋白变性剂、还原剂、核酸酶抑制剂、缓冲液、助沉剂和表面活性剂均采用灭菌纯化水配置。
10.根据权利要求1-9所述的一种尿液样本RNA保存液的应用，其特征在于：所述RNA保存液用于保存尿液样本，所述RNA保存液使用的温度范围-80℃-37℃，所述RNA保存液与尿液的体积比为1：1。
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