CN117264774A - 一株白化蛹虫草菌株及其应用和栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株白化蛹虫草菌株及其应用和栽培方法，涉及生物技术领域。所述白化蛹虫草菌株为蛹虫草(Cordycepsmilitaris)BA1，已于2023年4月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2023518。该白化蛹虫草菌株菌丝生长速度快，出菇时间短、出菇整齐，菌丝和子实体颜色洁白，商品性状特殊，子实体产量高，能实现规模化生产白化蛹虫草，为新品种选育和杂交育种提供了稀缺种质资源。该白化蛹虫草菌株的菌丝生长力、长势和生物学效率均强于现有技术中涉及的白化菌株。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一株白化蛹虫草菌株及其应用和栽培方法。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militaris)隶属子囊菌门Ascomycota、肉座菌目Hypocreales、虫草菌科Cordycipitaceae、虫草属Cordyceps，又名北冬虫夏草(梁宗琦2007)。蛹虫草作为一种重要的药食两用真菌，其化学成分和生物活性物质与冬虫夏草极为相似，富含虫草素、多糖和喷司他丁等多种活性物质，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等疗效，表现出极高的经济价值和医疗保健功效，常在临床上作为冬虫夏草的替代品(左锦辉等2018，Tuli et al.2013)。2009年，我国卫生部将蛹虫草正式批准为新食品原料，国内外将虫草菌作为功能食品进行开发，形成产值数十亿的巨大产业，蛹虫草的种质资源多样性、人工培育及应用等已成为研究热点(张永杰和张姝2021，董彩虹等2016)。
蛹虫草是世界广布种，寄主专一性不强，适合人工栽培。菌种在大规模人工栽培过程中，普遍存在菌种退化、品质降低等问题，成为限制其产业发展的关键瓶颈，收集野生菌株建立种质资源库，并从中选育高产优质菌株，将为蛹虫草品种改良和产业持续发展提供种质资源和应用基础(韩利红等2022，李跃等2021)。目前，人们已获得一些自然突变形成或人工定向培育的农艺性状良好的白化植物、动物或食用菌等，并得到广泛应用，针对白化生物独特的生物学特性进行研究具有重要科学意义和应用价值(蒋倩婷等2011)。蛹虫草生产以黄色和橙红色为主，较少涉及其它品种。白化蛹虫草在自然生长过程中发生自然突变，失去原有色素而呈现白色。前人已获得少量白化蛹虫草菌株，发现其营养成分、有效活性成分与正常非白化菌株相比发生了明显变化，白化蛹虫草的虫草素和黄铜含量较高，具有更强抗氧化能力，对有机自由基的清除作用及对亚油酸自氧化的抑制作用均强于出发菌株(林培捷等2022，李信闯2022，张曦文等2017，马跃腾等2014，蒋倩婷等2011)。
但是，野生蛹虫草菌株的收集和研究工作，主要集中在中国中东部、东北部和东南部，野外生境海拔一般低于500m，较少涉及中国西南1500m以上高海拔地区，该区域生态条件适宜、植被多样，孕育了丰富的真菌资源，亟待大力开发和应用(杨祝良等2022，刘晴等2022，郭玉峰等2021，张园园等2020，王洪军等2009)。目前，尚未见报道中国西南高海拔山区的白化蛹虫草菌株、生物学特性和人工栽培条件。
发明内容
本发明的目的是提供一株白化蛹虫草菌株及其栽培方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一株从贵州获得的白化蛹虫草菌株，该菌株菌丝生长速度快，出菇时间短、出菇整齐，菌丝和子实体颜色洁白，商品性状特殊，子实体产量高，能实现规模化生产白化蛹虫草。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一株白化蛹虫草菌株，所述白化蛹虫草菌株为蛹虫草(Cordycepsmilitaris)BA1，于2023年4月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023518。
本发明还提供上述的白化蛹虫草菌株在农业种植中的应用。
本发明还提供上述的白化蛹虫草菌株及其提取物在制备保健品或食品中的应用。
本发明还提供一种白化蛹虫草的栽培方法，包括将上述的白化蛹虫草菌株接种至栽培料中，栽培得到所述白化蛹虫草的步骤。
进一步地，按重量份计，所述栽培料包括如下组分：小麦40-45份、大米40-45份、麸皮5-10份、松针5-10份和营养液40-50份，pH值自然；
所述营养液包括酵母浸膏5g/L、磷酸二氢钾1g/L、葡萄糖5g/L和七水硫酸镁1g/L，pH值自然。
进一步地，所述栽培方法包括以下步骤：
(1)将上述的白化蛹虫草菌株活化后培养得到原种；
(2)将所述原种接种至液体培养基得到栽培种；
(3)将所述栽培种接种至所述栽培料中，发菌并刺激原基形成；
(4)所述原基形成后，再经出菇管理，得到所述白化蛹虫草。
进一步地，在步骤(1)中，所述培养的条件为：20-23℃、140rpm下避光振荡培养6-7d。
进一步地，在步骤(2)中，所述发菌在19-20℃下避光进行。
进一步地，在步骤(2)中，所述刺激原基形成的方法包括：以夜间温度10-11℃维持10-12h，以日间温度21-22℃维持12-14h。
进一步地，在步骤(3)中，所述出菇管理包括：保持光照8-10h和湿度85％，并以夜间温度10-11℃维持10-12h，以日间温度21-22℃维持12-14h。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了一株采集自中国西南高海拔地区的白化蛹虫草菌株的突变菌株，该突变菌株菌丝生长速度快，出菇时间短、出菇整齐，菌丝和子实体颜色洁白，商品性状特殊，子实体产量高，能实现规模化生产白化蛹虫草，为新品种选育和杂交育种提供了稀缺种质资源。该突变菌株的菌丝生长力、长势和生物学效率均强于现有技术中涉及的白化菌株。采用本发明的栽培方法栽培白化蛹虫草，不仅解决了水稻和小麦麸皮的利用问题，较大降低了原材料的成本，增加培养料透气性的同时，也提高了生产经济效益，具有较高应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基于ITS序列采用最大似然法构建的系统发育树；
图2为白化蛹虫草菌株BA1的菌丝(A)、液体菌丝球(B)和子实体(C)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中使用的培养基配方如下：
PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蛋白胨1.5g，KH2PO41 g，Mg2SO4﹒7H2O 1.5g，Vb10.05 g，去离子水1000mL，pH值自然。
PDA液体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，KH2PO41 g，Mg2SO4﹒7H2O1.5g，Vb10.05 g，去离子水1000mL，pH值自然。
实施例1
1.菌株获得
自贵州松林下采集得到一株蛹虫草菌株，以该菌株为出发菌株，在人工栽培过程中通过基因突变获得了一株白化菌株，命名为BA1。
2.菌株鉴定
综合形态解剖学特征和分子生物学证据，对白化蛹虫草菌株BA1进行物种鉴定。借助显微镜和解剖镜等工具观察子实体，完成形态学鉴定。利用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒，提取蛹虫草菌株BA1菌丝的总DNA，利用通用引物ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS4(5’-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3’)进行分子片段扩增，由上海生物工程有限公司对其测序。结合本发明所得序列和GenBank下载序列，利用软件BioEdit进行比对排序和调整。利用软件RAxMLv 7.2.6构建分析系统进化树，结果见图1。
以下为白化菌株BA1的ITS序列(SEQ ID NO.1)：
>BA1Cordyceps_militaris
TGAGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTAACGAGTTTTCCAACTCCCAACCCTTTGTGAACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCAGCGCCTGGACGCGGGCCTGGGCGGCGGCCGTCGGGGGCCCCAAACACTGTATCTACCAGTTTTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACGTCCCCTGGGGGATGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGCCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGTAGTACTCCAACTCGCACCGGGAACCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACGCCCAACTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTAG。
鉴定结果：
BA1子实体洁白，棒状，粗壮；可育头部1～1.5cm×0.2～0.5cm，子囊壳近圆锥形；子囊长条形，310～540×2.1～5.6μm，具1～8个子囊孢子，子囊孢子细长，直径约1μm，初步鉴定人工培养出的子实体为蛹虫草。
分子系统发育结果显示，白化蛹虫草菌株BA1与来自GenBank中的蛹虫草ITS片段聚在一个支持率为100％的独立进化支系上，表明该支系样本隶属于同一物种。结合形态解剖学和分子生物学证据，可将菌株BA1鉴定为蛹虫草(Cordyceps militaris)。
3.保藏
菌株BA1于2023年4月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023518。
实施例2菌株BA1的生物学特性
在无菌条件下，使用打孔器取直径5mm的已经活化的BA1菌块，置于PDA固体培养基，在21℃条件下恒温培养两周，利用十字交叉法测量菌丝生长速度并记录菌落形态。取直径5mm的已经活化的白化蛹虫草菌块于PDA液体培养基，在21℃、150r/min避光振荡培养7d，6层纱布过滤得菌丝，使用蒸馏水缓慢均匀洗涤三次后，菌丝体于55℃烘干箱中烘干10h至恒重，测定菌丝生物量。BA1的菌丝、液体菌丝球和子实体如图2所示。
生物学特性研究结果：
培养初期的1-2d，菌丝生长缓慢，经过适应期后，生长速度加快。菌丝日均生长速度约3.25mm/d。菌落呈现放射状，边缘整齐且较稀薄，菌丝洁白，厚且致密，绒毛状(图2中A)。白化蛹虫草菌株BA1振荡培养7d后，生物量干重达到0.72g/100mL，液体培养基滑腻而粘稠，菌丝球呈白色，细小均一、密度大(图2中B)。该白化菌株的菌丝生长力、长势和生物量积累均强于现有技术中涉及的白化菌株。
实施例3
具体操作如下：
(1)原种制作
于PDA固体培养基活化7d(7-8d可达相同效果)为原种。将原种接种至液体培养基，20℃、140rpm下避光振荡培养6d，制成栽培种。
(2)栽培料制作
栽培料配方：400g小麦、450g大米、50g麸皮、100g粉碎松针和400g营养液，pH值自然；其中，营养液配方：酵母浸膏5g/L、磷酸二氢钾1g/L、葡萄糖5g/L和七水硫酸镁1g/L，pH值自然。
将松针粉碎成0.5cm左右的小段，按照上述栽培料配方，将各原料混匀，高温高压灭菌2h，装入栽培瓶备用。其中，每栽培瓶中的栽培料的初始基质干重为28.5±0.94g。
(3)种植
S1.将栽培种用无菌水稀释3倍后，通过无菌喷枪(或者无菌微量注射器)接种于栽培瓶中，每个栽培瓶接种液体菌种10mL。
接种过程中应注意以下两点：1)接种前和接种后栽培料均用高温蒸汽灭菌的筷子进行搅拌，一方面使各栽培瓶中培养料成分分布均匀，另一方面增大透气率；2)搅拌时，使栽培瓶中栽培料避免粘连于栽培瓶壁上。
S2.接种完成后用透气封口膜封瓶，在恒温培养箱中避光19℃下发菌，4d后，菌丝长满栽培料；用无菌接种针在透气封口膜上扎3个直径为1mm的孔，以增大通气量，并调节昼夜培养温度，以10-11℃(10h)的夜间温度和21-22℃(14h)的日间温度刺激原基形成，10d后原基出现。之后以光照8h、湿度85％、10-11℃(10h)的夜间温度和21-22℃(14h)的日间温度进行出草培育，培养28d，采收子实体(图2中C)，并计算生物学效率。
生物学效率(％)＝蛹虫草子座鲜重(g)/初始基质干重(g)×100％。
子实体洁白，棒状，粗壮；可育头部1～1.5cm×0.2～0.5cm。
本实施例中，栽培瓶收获子实体的平均鲜重为24.22±2.63g，生物学效率达84.98±1.39％。
实施例4
(1)原种制作
于PDA固体培养基活化8d为原种。将原种接种至液体培养基，20℃、140rpm下避光振荡培养7d，制成栽培种。
(2)栽培料制作
栽培料配方：450g小麦、400g大米、100g麸皮、50g粉碎松针和500g营养液，pH值自然；其中，营养液配方：酵母浸膏5g/L、磷酸二氢钾1g/L、葡萄糖5g/L和七水硫酸镁1g/L，pH值自然。
将松针粉碎成0.5cm左右的小段，按照上述栽培料配方，将各原料混匀，高温高压灭菌2h，装入栽培瓶备用。其中，每栽培瓶中栽培料的初始基质干重为28.5±0.94g。
(3)种植
S1.将栽培种用无菌水稀释4倍后，通过无菌喷枪(或者无菌微量注射器)接种于栽培瓶中，每个栽培瓶接种液体菌种12mL。
接种过程中应注意以下两点：1)接种前和接种后栽培料均用高温蒸汽灭菌的筷子进行搅拌，一方面使各栽培瓶中培养料成分分布均匀，另一方面增大透气率；2)搅拌时，使栽培瓶中栽培料避免粘连于栽培瓶壁上。
S2.接种完成后用透气封口膜封瓶，在恒温培养箱中避光20℃下发菌，5d后，菌丝长满栽培料；用无菌接种针在透气封口膜上扎4个直径为1mm的孔，以增大通气量，并调节昼夜培养温度，以10-11℃(12h)的夜间温度和21-22℃(12h)的日间温度刺激原基形成，12d后原基出现。之后以光照10h、湿度85％、10-11℃(12h)的夜间温度和21-22℃(12h)的日间温度进行出草培育，培养30d，采收子实体，并计算生物学效率。
生物学效率(％)＝蛹虫草子座鲜重(g)/初始基质干重(g)×100％。
子实体洁白，棒状，粗壮；可育头部1～1.5cm×0.2～0.5cm。
本实施例中，栽培瓶收获子实体的平均鲜重为23.95±1.27g，生物学效率达84.01％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一株白化蛹虫草菌株，其特征在于，所述白化蛹虫草菌株为蛹虫草(Cordycepsmilitaris)BA1，于2023年4月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023518。
2.一种如权利要求1所述的白化蛹虫草菌株在农业种植中的应用。
3.一种如权利要求1所述的白化蛹虫草菌株及其提取物在制备保健品或食品中的应用。
4.一种白化蛹虫草的栽培方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的白化蛹虫草菌株接种至栽培料中，栽培得到所述白化蛹虫草的步骤。
5.根据权利要求4所述的栽培方法，其特征在于，按重量份计，所述栽培料包括如下组分：小麦40-45份、大米40-45份、麸皮5-10份、松针5-10份和营养液40-50份，pH值自然；
所述营养液包括酵母浸膏5g/L、磷酸二氢钾1g/L、葡萄糖5g/L和七水硫酸镁1g/L，pH值自然。
6.根据权利要求5所述的栽培方法，其特征在于，所述栽培方法包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的白化蛹虫草菌株活化后培养得到原种；
(2)将所述原种接种至液体培养基得到栽培种；
(3)将所述栽培种接种至所述栽培料中，发菌并刺激原基形成；
(4)所述原基形成后，再经出菇管理，得到所述白化蛹虫草。
7.根据权利要求6所述的栽培方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述培养的条件为：20-23℃、140rpm下避光振荡培养6-7d。
8.根据权利要求6所述的栽培方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述发菌在19-20℃下避光进行。
9.根据权利要求6所述的栽培方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述刺激原基形成的方法包括：以夜间温度10-11℃维持10-12h，以日间温度21-22℃维持12-14h。
10.根据权利要求6所述的栽培方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述出菇管理包括：保持光照8-10h和湿度85％，并以夜间温度10-11℃维持10-12h，以日间温度21-22℃维持12-14h。
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