CN117257972A - 治疗猫脂肪肝的靶向复合物及其制备方法 - Google Patents
治疗猫脂肪肝的靶向复合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
治疗猫脂肪肝的靶向复合物及其制备方法,属于生物技术领域,用于解决猫脂肪肝治疗的问题,要点是复合物包括虾青素以及复合载体,其中,复合载体包括海参低聚肽、花胶低聚肽以及半乳糖基化细菌纤维素载体;虾青素与复合载体的质量比为1:(10~100),复合载体中的海参低聚肽、花胶低聚肽以及半乳糖基化细菌纤维素载体的质量比为(1~3):(1~3):1,效果是能够改善和治疗猫脂肪肝,且具有肝靶向性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种具有猫脂肪肝改善作用的肝靶向微胶囊及其制备方法。
背景技术
猫脂肪肝又称猫脂肪沉积综合征(Feline Hepatic Lipidosis,FHL),为猫特有的肝胆疾病。甘油三酯在肝细胞的蓄积导致肝脏重量和体积增加,并继发肝功能损伤,如果没有进行有效的救治会造成可观的致死率。猫脂肪肝好发于中年猫,雌性猫发病率一般高于雄性猫,继发性略多于原发性。随着生活水平的不断提升,宠物猫患脂肪肝的比例也在不断上升,长期的营养过剩是引起猫脂肪肝的主要原因,此外应激性因素及消化道的疾病也可能诱发脂肪肝,对宠物猫的健康造成了极大的影响。申请号为CN105250411B的发明专利揭示了一种治疗猫脂肪肝综合症的药物组合物,采用决明子等二十余种中药组合物用于治疗脂肪肝患猫,但存在成分复杂,见效较慢的弊端。此外临床上多采用的药物治疗通常具有不小的副作用。
多项研究表明,通过酶解技术获得的海参肽对于四氯化碳引起的急性肝损伤、利福平和异烟肼引起的药物性肝损伤以及酒精性肝损伤等具有改善肝脏肿大、氧化应激、炎症浸润及脂肪变性等病变的作用。而通过水解花胶获得的花胶肽具有很强的抗氧化活性,能够清除肝细胞内ROS、减轻肝细胞内脂质堆积和氧化应激、缓解脂质过氧化的作用,有望用于预防和治疗脂肪肝。但由于活性肽的稳定性、胃肠道生理障碍以及理化性质的限制,导致海参肽难以被完好地靶向递送至肝部并发挥功效。另一方面,虾青素(3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素),分布在海洋藻类、菌类和甲壳类动物中,其中雨生红球藻是最理想的天然虾青素来源。多项研究证实虾青素作为一种天然强抗氧化剂,在抑制肝纤维化、防治肝脏肿瘤发生、缓解肝脏胰岛素抵抗及非酒精性脂肪肝等方面具有重要作用。但同样虾青素存在水溶性低、稳定性差等问题,严重影响其在肝损伤治疗中的应用。
因此,如果能够提高海参肽、花胶肽及虾青素的生物利用度,可以在口服后达到良好的保肝护肝,缓解肝损伤的作用,构建合适的能够抵抗消化道环境影响、增强黏液与上皮屏障透过效果并稳定靶向肝细胞的载运体系是非常有效的技术手段,应用于猫脂肪肝的治疗时具有无毒副作用,见效迅速等优势。
发明内容
本发明针对上述目的,在第一方面上,为了解决肝靶向递送及对猫脂肪肝的治疗,在本申请的一些实施例中的治疗猫脂肪肝的靶向复合物,包括虾青素以及复合载体,其中,复合载体包括海参低聚肽、花胶低聚肽以及半乳糖基化细菌纤维素载体;
虾青素与复合载体的质量比为1:(10~100),复合载体中的海参低聚肽、花胶低聚肽以及半乳糖基化细菌纤维素载体的质量比为(1~3):(1~3):1。
在本申请的一些实施例中的治疗猫脂肪肝的靶向复合物,虾青素与复合载体的质量比为1:10。
在本申请的一些实施例中的治疗猫脂肪肝的靶向复合物,其中,海参低聚肽、花胶低聚肽以及半乳糖基化细菌纤维素载体的质量比为2:2:1。
在本申请的一些实施例中的治疗猫脂肪肝的靶向复合物,海参低聚活性肽的氨基酸序列包括Tyr-Pro-Asp-Cys-Pro-Gly-Pro。
在本申请的一些实施例中的治疗猫脂肪肝的靶向复合物,花胶低聚肽的氨基酸序列包括Tyr-Cys-Tyr-Cys-Pro-Arg。
在第二方面上,在本申请的一些实施例中的制备治疗猫脂肪肝的靶向复合物的方法,包括
S41.将虾青素溶于乙醇溶液,将复合载体溶于水;
S42.将溶有虾青素油的乙醇溶液加入复合载体的溶液中,加热进行反应,蒸发去除乙醇,得治疗猫脂肪肝的靶向复合物。
在本申请的一些实施例中的制备治疗猫脂肪肝的靶向复合物的方法,步骤S41中,将虾青素含量10%的虾青素油溶于乙醇溶液,搅拌均匀,复合载体溶于超纯水中,虾青素油与乙醇溶液的质量体积比为1~10%,虾青素油与复合载体的质量比为1:(1~10);
步骤S42中,将溶有虾青素油的乙醇溶液,缓慢滴入复合载体溶液中,滴入过程中加热搅拌进行反应,蒸发去除乙醇,冷冻干燥,得组合物粉末,搅拌速度为500~1500r/min,反应温度为40~60℃,反应时间为2~4h。
在本申请的一些实施例中的制备治疗猫脂肪肝的靶向复合物的方法,包括
将海参低聚肽、花胶低聚肽与半乳糖基化细菌纤维素载体溶于超纯水,80~100℃搅拌反应2~6小时,冷冻干燥,得复合载体,其中,半乳糖基化细菌纤维素载体,基于如下方式制备:
在本申请的一些实施例中的制备治疗猫脂肪肝的靶向复合物的方法,S21.将细菌纤维素溶于含四丁基醋酸铵的二甲基亚砜溶液中,搅拌至无胶状物凝聚,得质量体积比为1~5%的均一的细菌纤维素溶液;
S22中.将乳糖酸溶于含有1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)及1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(NHS)的二甲基亚砜(DMSO)溶液中,搅拌进行羧基活化,活化时间为1~3h,得质量体积比为1~10%的乳糖酸溶液;其中,乳糖酸:1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC):1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(NHS)=1~5:1:1;
S23,将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液中,加热搅拌,去除杂质,冷冻干燥,得半乳糖基化细菌纤维素载体粉,其中,加热搅拌温度为40~50℃,加热搅拌时间为10~24h。
在本申请的一些实施例中的制备治疗猫脂肪肝的靶向复合物的方法,优选地,步骤S22中,活化时间为2h,
优选地,步骤S22中,乳糖酸:1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC):1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(NHS)=1:1:1;
优选地,步骤S23中,去除杂质包括在透析管中蒸馏水透析去除未反应的乳糖酸、细菌纤维素及含有含四丁基醋酸铵的二甲基亚砜(DMSO)溶液;
优选地,步骤S23中,透析时间为24~72h,更优选地为72h。
在第二方面上,本申请的一些实施例提供上述复合物中的海参低聚活性肽的制备方法,包括
S11.将海参加入其2~3倍质量体积的水中制成匀浆液置于酶解罐中;
S12.向酶解罐中加入海参质量的2~5‰的复合蛋白酶,酶解后升温灭酶,得到海参蛋白酶解液,复合蛋白酶包括碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及风味蛋白酶,碱性蛋白酶:木瓜蛋白酶:风味蛋白酶=3~5:1~2:1~3;
S13.将海参蛋白酶解液离心,得清液;
S14.对清液进行膜分离,截留分子量为3000Da,获得膜分离样品;
S15.将膜分离样品浓缩,冷冻干燥,得海参低聚肽粉;
S16.将海参低聚肽粉加水溶解,浓度为20~30mg/mL;
S17.采用凝胶色谱柱对溶解物分离纯化,洗脱溶剂为去离子水,洗脱流速为0.3~0.5mL/min,在220nm下检测吸光度,收集保留时间10min的洗脱峰;
S18.采用反相柱进一步纯化,色谱条件如下:流动相:5~80%(v/v)的甲醇,包含0.1%(v/v)的三氟乙酸,流速:0.8mL/min,线性洗脱时间35min,在220nm下检测吸光度,收集保留时间16分钟的色谱峰,得海参低聚活性肽。
本申请的一些实施例的上述复合物中的海参低聚活性肽的制备方法:
优选地,步骤S17中,采用20mm×100mm的SephadexG10凝胶色谱柱进行分离纯化;
优选地,步骤S18中,采用300SSB-C18RP-HPLC反相柱进一步纯化;
优选地,步骤S12中,酶解反应温度为50℃~60℃,酶解ph为8.0~9.0,酶解时间为3~6h;
优选地,步骤S12中,酶解后升温至90℃灭酶10分钟,得到海参蛋白酶解液;
优选地,海参蛋白酶解液在8000转/分钟离心10分钟;
优选地,步骤S15中,膜分离样品在60℃温度下真空减压浓缩,冷冻干燥,得海参低聚肽粉;
优选地,步骤S16中,将海参低聚肽粉加水溶解,浓度为25mg/mL;
优选地,步骤S18中,将海参低聚活性肽浓缩,冷冻干燥,得海参低聚活性肽粉;
优选地,步骤S11中,海参包括仿刺参、梅花参、米刺参、球参、玉足海参中的任一种或者组合。
在第三方面上,本申请的一些实施例提供上述复合物中的花胶低聚肽的制备方法,包括
S11.将花胶加入其10~20倍质量体积的水制成匀浆液置于酶解罐中;
S12.向酶解罐中加入花胶质量的2~5%的复合蛋白酶,酶解后升温灭酶,得到花胶蛋白酶解液,其中,复合蛋白酶包括中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶以及风味蛋白酶,中性蛋白酶:胰蛋白酶:菠萝蛋白酶:风味蛋白酶=1~3:2~4:3~5:2~5;
S13.将花胶蛋白酶解液离心,得清液;
S14.将清液进行膜分离,截留分子量为3000Da;
S15.过膜液通过凝胶色谱柱进行分离纯化,洗脱溶剂为去离子水,洗脱流速为0.5~0.8mL/min,在220nm下检测吸光度,收集保留时间14~15min的洗脱峰;
S16.采用色谱柱进一步纯化,色谱条件如下:流动相A为含体积百分数0.05~0.1%三氟乙酸水,流动相B为乙腈,梯度洗脱条件为:0~5min,10%B,5~15min,10%~15%B,15~25min,15%B~25%B,25~40min,25%B~35%B,流速为0.8mL/min,收集保留时间12~13min的洗脱峰,得花胶低聚肽。
根据本申请的一些实施例的上述复合物中的花胶低聚肽的制备方法:
优选地,步骤S12中,酶解温度为50~60℃,酶反应pH为8.0~9.0,酶解时间为4h;
优选地,步骤S12中,酶解后升温至80~90℃灭酶10分钟,得到花胶蛋白酶解液;
优选地,步骤S13中,花胶蛋白酶解液在8000转/分钟离心10分钟;
优选地,步骤S15中,采用20mm×100mm的SephadexG10凝胶色谱柱进行分离纯化;
优选地,步骤S16中,采用C18色谱柱进一步纯化;
优选地,步骤S16中,花胶低聚肽浓缩、冷冻干燥,得花胶低聚肽粉。
有益效果:
本发明采用半乳糖修饰细菌纤维素作为海参低聚肽、花胶低聚肽及虾青素的肝靶向递送载体,一方面活性肽与接枝在细菌纤维素上的半乳糖通过美拉德反应连接,另一方面活性肽与虾青素通过乳化作用进行包裹,并且活性肽与虾青素同时被细菌纤维素独特的三维网状结构包被,延长了海参肽、花胶肽与虾青素的释放时间,具有极高的生物相容性、生物可降解性,大量羟基团的存在也很好地对抗极端pH值环境的变化对于芯材的结构影响。同时与半乳糖修饰壳聚糖载运体系相比,细菌纤维素的三维网状结构,具有极大的孔隙度,对芯材的包被效果更有利于保护活性肽不受胃肠道内各类蛋白酶的水解消化作用,以及提高虾青素在肠胃道的稳定性。由此,海参低聚肽-花胶低聚肽-虾青素-半乳糖基化细菌纤维素微胶囊具有很强的柔韧性以及高附着力,不仅能够应对胃肠道肌肉的蠕动以及腔内胃液流速引起的剪切应力,以减少对活性肽以及虾青素的机械降解,还可以增强在牢固粘附层的粘附作用,有效地延长在胃肠道中的停留时间来增强吸收,这种柔韧性也降低了芯材进入体循环后被网状内皮系统中的巨噬细胞吞噬的概率,从而提高递送至靶细胞的效率。
综上所述,本发明提供的方法制备的海参低聚肽-花胶低聚肽-虾青素-半乳糖基化细菌纤维素在胃肠消化道中保护活性肽与虾青素的分子结构,并增强其吸收,延缓释放,最终精准靶向递送至猫的肝实质细胞。而海参低聚肽缓解脂肪堆积带来的肝细胞肿胀与炎症浸润,花胶低聚肽降低肝脏脂肪的堆积,虾青素减轻蛋白质、脂肪等的过氧化,三者者协同调节肝细胞的氧化应激系统及改善脂肪变性,对比单独使用具有更好的猫脂肪肝治疗效果。该方法简单易于操作,适用于工业化制备场景,在宠物猫的脂肪肝预防与治疗中具有良好的应用前景。
附图说明
图1肝脏脂质堆积变化。
图2细菌纤维素的三维网状结构。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本发明作进一步说明,需要说明的是,实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。
本发明提供一种能够在猫的胃肠道内保护作为芯材的海参低聚肽、花胶低聚肽及虾青素降低其受pH值、蛋白酶等消化水解酶的失活作用的影响,同时增强在黏膜的粘附以延长在胃肠道中的时间来提高吸收,并且在吸收后直接靶向递送至脂质堆积的肝细胞进行修复改善的海参低聚肽-花胶低聚肽-虾青素微胶囊及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种具有猫脂肪肝改善作用的肝靶向微胶囊,其经过下列工艺步骤:
步骤1.海参低聚肽的制备:将新鲜海参加入2~3倍质量体积的水制成匀浆液置于酶解罐中,然后加入刺参质量的2~5‰的复合蛋白酶,酶解后升温至90℃灭酶10分钟,得到海参蛋白酶解液;海参蛋白酶解液在8000转/分钟离心10分钟,除去颗粒状物质,然后采用截留分子量为3000Da的超滤膜进行分子量分离,获得膜分离样品,该样品在60℃温度下真空减压浓缩至一定体积,冷冻干燥得海参低聚肽粉;将海参低聚肽粉加水溶解,浓度为25mg/mL,采用SephadexG 10(20mm×100mm)凝胶色谱柱进行分离纯化,洗脱溶剂为去离子水,洗脱流速为0.3-0.5mL/min,在220nm下检测其吸光度,收集保留时间10min的洗脱峰;采用300SSB-C18 RP-HPLC反相柱进一步纯化,色谱条件如下:流动相:5-80%(v/v)的甲醇,包含0.1%(v/v)的三氟乙酸(TFA),流速:0.8mL/min,线性洗脱时间35min,在220nm下检测其吸光度,收集保留时间16分钟的色谱峰,浓缩后冷冻干燥得海参低聚活性肽粉。
进一步的,步骤1所述海参为仿刺参、梅花参、米刺参、球参、玉足海参,优选的为仿刺参、米刺参。
进一步的,步骤1的酶解采用碱性蛋白酶:木瓜蛋白酶:风味蛋白酶=3~5:1~2:1~3的复合蛋白酶,复合蛋白酶与投入海参原料的质量比为1:10~15。酶解反应温度为50℃~60℃,酶解ph为8.0~9.0,酶解时间为3~6h。
进一步的,步骤1所述海参低聚活性肽的氨基酸序列为:Tyr-Pro-Asp-Cys-Pro-Gly-Pro。
步骤2.花胶低聚肽制备:花胶样品处理后,加入10~20倍质量体积的水制成匀浆液置于酶解罐中,然后加入花胶质量的2~5%的复合蛋白酶酶解4小时,酶解结束后升温至80~90℃灭酶10分钟,得到花胶蛋白酶解液,将蛋白酶解液8000转/分钟离心10分钟,去除颗粒状物质,然后采用膜分离技术进行分离,截留分子量为3000Da,过膜液采用SephadexG10(20mm×100mm)凝胶色谱柱进行分离纯化,洗脱溶剂为去离子水,洗脱流速为0.5-0.8mL/min,在220nm下检测其吸光度,收集保留时间14-15min的洗脱峰;C18色谱柱,流动相A为含体积百分数0.05~0.1%三氟乙酸水,流动相B为乙腈,梯度洗脱条件为:0~5min,10%B,5~15min,10%~15%B,15~25min,15%B~25%B,25~40min,25%B~35%B,流速为0.8mL/min,收集保留时间12-13min的洗脱峰,浓缩后冷冻干燥得花胶低聚肽。
进一步的,步骤1所述花胶来源为黄花鱼。
进一步的,步骤2的酶解采用中性蛋白酶:胰蛋白酶:菠萝蛋白酶:风味蛋白酶=1~3:2~4:3~5:2~5的复合蛋白酶,酶解温度为50~60℃,酶反应pH值控制在8.0~9.0。
进一步的,步骤1所述花胶低聚肽的氨基酸序列为:Tyr-Cys-Tyr-Cys-Pro-Arg。
步骤3.半乳糖基化细菌纤维素载体的制备:取细菌纤维素溶于含四丁基醋酸铵的二甲基亚砜(DMSO)溶液中搅拌至无胶状物凝聚后,制备成均一的细菌纤维素溶液;取乳糖酸溶于含有1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺EDC及1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺NHS(1:1)的DMSO溶液中搅拌进行羧基活化;将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液加热搅拌,然后在透析管中蒸馏水透析去除未反应的乳糖酸、细菌纤维素及含有四丁基醋酸铵的DMSO溶剂等杂质,冷冻干燥制得半乳糖基化细菌纤维素粉末。
进一步的,步骤3中的细菌纤维素溶液质量体积比为1~5%。
进一步的,步骤3中的乳糖酸溶液的质量体积比为1~10%。
进一步的,步骤3中的乳糖酸、EDC与NHS的质量比为1~5:1:1,优选的为1:1:1。
进一步的,步骤3中的活化时间为1~3小时,优选的为2小时。
进一步的,步骤3中的加热搅拌温度为40~50℃,搅拌时间为10~24小时。
进一步的,步骤3中的透析时间为24~72小时,优选的为72小时。
步骤4.海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化细菌纤维素复合物载体的制备:取步骤1,2制备的海参低聚肽粉、花胶低聚肽粉与半乳糖基化细菌纤维素粉复溶于10倍体积的超纯水,80~100℃搅拌反应2~6小时,冷冻干燥获得海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化细菌纤维素复合物载体粉末。
进一步的,步骤4中海参低聚肽粉,花胶低聚肽与半乳糖基化细菌纤维粉的质量比为1~3:1~3:1,优选的为2:2:1。
步骤5.海参低聚肽-花胶低聚肽-虾青素-半乳糖基化细菌纤维素复合物载体的制备:取虾青素含量10%的虾青素油溶于乙醇溶液搅拌均匀,取海参低聚肽-花胶低聚肽虾青素-半乳糖基化细菌纤维素粉末复溶于10倍体积的超纯水,随后将虾青素油乙醇溶液缓慢滴入搅拌中的海参低聚肽-花胶低聚肽虾青素-半乳糖基化细菌纤维素溶液并加热进行反应,蒸发去除乙醇后冷冻干燥获得海参低聚肽-花胶低聚肽虾青素-虾青素-半乳糖基化细菌纤维素微胶囊(SCP-FMP-AST-GBC)粉末;
进一步的,步骤5中的虾青素油与乙醇溶液的质量体积比为1~10%,优选的为5%。
进一步的,步骤5中的虾青素油与海参低聚肽-花胶低聚肽虾青素-半乳糖基化细菌纤维素的质量比为1:1~10,优选的为1:1。
进一步的,步骤5中搅拌速度为500~1500r/min,反应温度为40~60℃,反应时间为2~4小时。
半乳糖介导的肝实质细胞细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体靶向递送系统虽然已有许多研究先例,但多集中于对药物直接进行半乳糖修饰,或是构建半乳糖修饰的脂质体、聚合物胶束载体,来实现良好的靶向递送性能。然而患有脂肪肝的猫是否能够接受这些运载体系没有明确报道,而乳液运载体系存在操作过程中涉及的高压均质、超声等可能会影响到虾青素的结构,进而影响包埋率、稳定性、生物利用度等性能。
本发明采用半乳糖修饰细菌纤维素作为海参低聚肽、花胶低聚肽及虾青素的肝靶向递送载体,一方面活性肽与接枝在细菌纤维素上的半乳糖通过美拉德反应连接,另一方面活性肽与虾青素通过乳化作用进行包裹,并且活性肽与虾青素同时被细菌纤维素独特的三维网状结构包被,延长了海参肽、花胶肽与虾青素的释放时间,具有极高的生物相容性、生物可降解性,大量羟基团的存在也很好地对抗极端pH值环境的变化对于芯材的结构影响。同时与半乳糖修饰壳聚糖载运体系相比,细菌纤维素的三维网状结构,具有极大的孔隙度,对芯材的包被效果更有利于保护活性肽不受胃肠道内各类蛋白酶的水解消化作用,以及提高虾青素在肠胃道的稳定性。由此,海参低聚肽-花胶低聚肽-虾青素-半乳糖基化细菌纤维素微胶囊具有很强的柔韧性以及高附着力,不仅能够应对胃肠道肌肉的蠕动以及腔内胃液流速引起的剪切应力,以减少对活性肽以及虾青素的机械降解,还可以增强在牢固粘附层的粘附作用,有效地延长在胃肠道中的停留时间来增强吸收,这种柔韧性也降低了芯材进入体循环后被网状内皮系统中的巨噬细胞吞噬的概率,从而提高递送至靶细胞的效率。
综上所述,本发明提供的方法制备的海参低聚肽-花胶低聚肽-虾青素-半乳糖基化细菌纤维素在胃肠消化道中保护活性肽与虾青素的分子结构,并增强其吸收,延缓释放,最终精准靶向递送至猫的肝实质细胞。而海参低聚肽缓解脂肪堆积带来的肝细胞肿胀与炎症浸润,花胶低聚肽降低肝脏脂肪的堆积,虾青素减轻蛋白质、脂肪等的过氧化,三者者协同调节肝细胞的氧化应激系统及改善脂肪变性,对比单独使用具有更好的猫脂肪肝治疗效果。该方法简单易于操作,适用于工业化制备场景,在宠物猫的脂肪肝预防与治疗中具有良好的应用前景。
实施例1:
步骤1.将新鲜刺参体壁1000g加入3倍质量体积的水制成匀浆液置于酶解罐中,然后加入20g的复合蛋白酶,蛋白酶组成为碱性蛋白酶:木瓜蛋白酶:风味蛋白酶=5:2:3,调节pH至9.0,50℃酶解4小时后升温至90℃灭酶10分钟,得到海参蛋白酶解液;海参蛋白酶解液在8000转/分钟离心10分钟,,然后经过3000Da超滤分离后,在60℃温度下真空减压浓缩至总质量的25%,冷冻干燥得海参低聚肽粉58g;将海参低聚肽粉加水溶解为浓度为25mg/mL的溶液,采用SephadexG 10(20mm×100mm)凝胶色谱柱进行分离纯化,洗脱溶剂为去离子水,洗脱流速为0.5mL/min,在220nm下检测其吸光度,收集保留时间10.11min的洗脱峰;采用300SSB-C18 RP-HPLC反相柱进一步纯化,色谱条件如下:流动相:40%(v/v)的甲醇,包含0.1%(v/v)的三氟乙酸(TFA),流速:0.8mL/min,线性洗脱时间35min,收集保留时间16.25min的色谱峰,浓缩后冷冻干燥得海参低聚活性肽粉7.8g。
步骤2.将花胶1000g加入20倍质量体积的水制成匀浆液置于酶解罐中,然后加入25g的复合蛋白酶,蛋白酶组成为中性蛋白酶:胰蛋白酶:菠萝蛋白酶:风味蛋白酶=3:4:5:3,调节pH至8.5,50℃酶解4小时后升温至90℃灭酶10分钟,得到花胶蛋白酶解液;8000转/分钟离心10分钟,,然后经过3000Da超滤分离后,过膜液采用SephadexG 10(20mm×100mm)凝胶色谱柱进行分离纯化,洗脱溶剂为去离子水,洗脱流速为0.6mL/min,在220nm下检测其吸光度,收集保留时间14.61min的洗脱峰;C18色谱柱,流动相A为含体积百分数0.05%三氟乙酸水,流动相B为乙腈,梯度洗脱条件为:0~5min,10%B,5~15min,10%~15%B,15~25min,15%B~25%B,25~40min,25%B~35%B,流速为0.8mL/min,收集保留时间12.41min的洗脱峰,浓缩后冷冻干燥得花胶低聚肽7.5g;
步骤3.取细菌纤维素20g溶于1000ml含四丁基醋酸铵的DMSO溶液中搅拌至无胶状物凝聚后,制备成均一的细菌纤维素溶液;取乳糖酸10g溶于1000ml含有5gEDC及5gNHS的DMSO溶液中搅拌进行羧基活化2小时;将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液加热至40℃搅拌12小时,然后透析24小时候冷冻干燥制得半乳糖基化细菌纤维素粉末30g。
步骤4.取海参低聚肽粉6g,花胶低聚肽6g与半乳糖基化细菌纤维素粉3g复溶于10倍体积的超纯水,90℃搅拌反应4小时,冷冻干燥获得海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化细菌纤维素复合物载体粉末15g。
步骤5.取虾青素油10g溶于100ml乙醇溶液搅拌均匀,取海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化细菌纤维素粉末10g复溶于10倍体积的超纯水,随后将虾青素油乙醇溶液缓慢滴入搅拌中的海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化细菌纤维素溶液并加热至50℃在1500r/min搅拌速度下进行反应2小时,蒸发去除乙醇后冷冻干燥获得海参低聚肽-花胶低聚肽-虾青素-半乳糖基化细菌纤维素微粒粉末20g。
实施例2:
步骤1.将新鲜球参体壁1000g加入2倍质量体积的水制成匀浆液置于酶解罐中,然后加入5g的复合蛋白酶,蛋白酶组成为碱性蛋白酶:木瓜蛋白酶:风味蛋白酶=3:1:3,调节pH至8.5,55℃酶解4小时后升温至90℃灭酶10分钟,得到海参蛋白酶解液;海参蛋白酶解液在8000转/分钟离心10分钟,,然后经过3000Da超滤分离后,在60℃温度下真空减压浓缩至总质量的20%,冷冻干燥得海参低聚肽粉63g;将海参低聚肽粉加水溶解为浓度为25mg/mL的溶液,采用SephadexG 10(20mm×100mm)凝胶色谱柱进行分离纯化,洗脱溶剂为去离子水,洗脱流速为0.3mL/min,在220nm下检测其吸光度,收集保留时间10.15min的洗脱峰;采用300SSB-C18 RP-HPLC反相柱进一步纯化,色谱条件如下:流动相:40%(v/v)的甲醇,包含0.1%(v/v)的三氟乙酸(TFA),流速:0.8mL/min,线性洗脱时间35min,收集保留时间16.29min的色谱峰,浓缩后冷冻干燥得海参低聚活性肽粉8.1g。
步骤2.将花胶1000g加入20倍质量体积的水制成匀浆液置于酶解罐中,然后加入30g的复合蛋白酶,蛋白酶组成为中性蛋白酶:胰蛋白酶:菠萝蛋白酶:风味蛋白酶=3:2:5:5,调节pH至8.0,55℃酶解4小时后升温至90℃灭酶10分钟,得到花胶蛋白酶解液;8000转/分钟离心10分钟,,然后经过3000Da超滤分离后,过膜液采用SephadexG 10(20mm×100mm)凝胶色谱柱进行分离纯化,洗脱溶剂为去离子水,洗脱流速为0.8mL/min,在220nm下检测其吸光度,收集保留时间14.31min的洗脱峰;C18色谱柱,流动相A为含体积百分数0.1%三氟乙酸水,流动相B为乙腈,梯度洗脱条件为:0~5min,10%B,5~15min,10%~15%B,15~25min,15%B~25%B,25~40min,25%B~35%B,流速为0.8mL/min,收集保留时间12.50min的洗脱峰,浓缩后冷冻干燥得花胶低聚肽7.2g;
步骤3.取细菌纤维素10g溶于1000ml含四丁基醋酸铵的DMSO溶液中搅拌至无胶状物凝聚后,制备成均一的细菌纤维素溶液;取乳糖酸4g溶于1000ml含有5gEDC及5gNHS的DMSO溶液中搅拌进行羧基活化2小时;将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液加热至50℃搅拌24小时,然后透析72小时候冷冻干燥制得半乳糖基化细菌纤维素粉末13g。
步骤4.取海参低聚肽粉6g、花胶低聚肽粉6g与半乳糖基化细菌纤维素粉2g复溶于10倍体积的超纯水,100℃搅拌反应3小时,冷冻干燥获得海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化细菌纤维素复合物载体粉末14g。
步骤5.取虾青素油5g溶于100ml乙醇溶液搅拌均匀,取海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化细菌纤维素粉末10g复溶于10倍体积的超纯水,随后将虾青素油乙醇溶液缓慢滴入搅拌中的海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化细菌纤维素溶液并加热至60℃在1000r/min搅拌速度下进行反应4小时,蒸发去除乙醇后冷冻干燥获得海参低聚肽-花胶低聚肽-虾青素-半乳糖基化细菌纤维素(SCP-FMP-AST-GBC)粉末15g。
对比例1:
按照实施例1步骤1~步骤4实施,获得海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化细菌纤维素复合物载体(SCP-FMP-GBC)粉末92g。
对比例2:
步骤1.取细菌纤维素20g溶于1000ml含四丁基醋酸铵的DMSO溶液中搅拌至无胶状物凝聚后,制备成均一的细菌纤维素溶液;取乳糖酸10g溶于1000ml含有5gEDC及5gNHS的DMSO溶液中搅拌进行羧基活化2小时;将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液加热至40℃搅拌24小时,然后透析48小时候冷冻干燥制得半乳糖基化细菌纤维素粉末56g。
步骤2.取虾青素油10g溶于100ml乙醇溶液搅拌均匀,取半乳糖基化细菌纤维素粉末10g复溶于10倍体积的超纯水,随后将虾青素油乙醇溶液缓慢滴入搅拌中的半乳糖基化细菌纤维素溶液并加热至50℃在1000r/min搅拌速度下进行反应3小时,蒸发去除乙醇后冷冻干燥获得虾青素-半乳糖基化细菌纤维素(AST-GBC)微粒粉末20g。
对比例3:
步骤1:按照实施例1步骤1实施获得海参低聚肽:8.0g。
步骤2:按照实施例1步骤2实施获得花胶低聚肽:7.6g。
步骤3:取20g壳聚糖溶于1000mL 0.1mol/L MES buffer中,待其完全溶解后调节pH值至5.7,再同时加入8g乳糖酸、10gNHS、10g EDC,搅拌反应30min,完全溶解后置于4℃放置12h,然后转移至室温放置12h,最后用透析袋透析3d,取出透析液冷冻干燥得到半乳糖基化壳聚糖粉末30g。
步骤4.取海参低聚肽粉6g,花胶低聚肽6g与半乳糖基化壳聚糖粉3g复溶于10倍体积的超纯水,90℃搅拌反应4小时,冷冻干燥获得海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化壳聚糖粉15g。
步骤5.取虾青素油10g溶于100ml乙醇溶液搅拌均匀,取海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化壳聚糖粉末10g复溶于10倍体积的超纯水,随后将虾青素油乙醇溶液缓慢滴入搅拌中的海参低聚肽-花胶低聚肽-半乳糖基化壳聚糖溶液并加热至50℃在1000r/min搅拌速度下进行反应3小时,蒸发去除乙醇后冷冻干燥获得海参低聚肽-花胶低聚肽-虾青素-半乳糖基化壳聚糖(SCP-FMP-AST-GC)粉末20g。
实验1:肝靶向效率
雄性SD大鼠适应性饲养3-5d,随机分SCP-FMP-AST-GBC组(5mg/kg),AST-GBC组(3mg/kg)以及SCP-FMP-AST-GC组(5mg/kg),每组12只。给药前12h禁食,按剂量分别给大鼠灌胃,给药后0.5,1,4,12,24h(每个时间点12只大鼠,每组各3只)断头处死大鼠,放尽血液后,得肝、肺、肾样品,然后加入2倍量生理盐水,使用组织匀浆器把上述样品制成匀浆。精密吸取组织匀浆液200μL于1.5mL离心管中,加入600μL甲醇,涡旋震荡2min,于10000r/min离心5min,精密吸取上清液500μL,氮气吹干,200μL甲醇复溶,涡旋混合1min,取20μL进样,HPLC测定虾青素含量。根据Gupta的方法用靶向效率(Targeting efficiency,Te),来评价SCP-FMP-AST-GBC的肝靶向性。结果如下表所示:
表1不同组织的AUC和靶向效率
从表1可以看到,相比AST-GBC组及SCP-FMP-AST-GC组,SCP-FMP-AST-GBC组表现出了最强的肝脏趋向性。
实验2:NAFLD小鼠脂肪堆积改善效果
小鼠适应性喂养一周后,随机挑选10只小鼠喂养普通饲料(空白对照组),其余小鼠均给予高脂饲料进行自由进食8周。然后将喂养高脂饲料的小鼠随机分为3组(每组12只)进行灌胃,每日一次,连续6周:(1)普通饲料+生理盐水(模型组);(2)普通饲料
+SCP-FMP-AST-GBC;(3)普通饲料+FMP;(4)普通饲料+FMP;(5)普通饲料+AST;(6)普通饲料+SCP-FMP-AST-GC。第14周结束时小鼠禁食4小时后全部处死。肝脏取出后经常规方法进行冰冻切片,按试剂盒说明进行油红O染色,用异丙醇萃取细胞内脂滴的油红,570nm下测定吸光度数值。由图1所示,模型组与空白组相比,模型组的脂滴油红吸光度较空白组具有极显著性升高,说明NAFLD模型建立成功。SCP-FMP-AST-GBC干预处理显著降低了NAFLD小鼠肝脏中脂质的堆积,趋近于空白组水平,效果也优于单独投喂海参低聚肽、花胶低聚肽或虾青素,以及海参低聚肽-花胶低聚肽-虾青素-半乳糖基化壳聚糖载运体系。
实验3:脂肪肝患猫的治疗效果
通过当地宠物医院收集患有脂肪肝病症的宠物猫30例,雌性与雄性比例1:1。将患猫分为3组,分别为SCP-FMP-AST-GBC组(5mg/kg)、水飞蓟宾组(10mg/kg)、及对照组,每日按照剂量投喂2次,持续4周。第5周检测患猫血液丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量,并观察呕吐、厌食、活动量减少等病症情况。结果如表2所示,与对照组相比,SCP-FMP-AST-GBC组与水飞蓟宾组都表现出了良好的治疗效果,在SCP-FMP-AST-GBC组中,体现肝功能的重要指标ALT及AST的改善效果最为显著。同时从呕吐、厌食等病症的治愈率上来看,SCP-FMP-AST-GBC组(90%)也大于水飞蓟宾组(50%)。
表2给药前后肝功能变化及治愈情况
上述实验结果表明,海参低聚肽-花胶低聚肽-虾青素-半乳糖基化细菌纤维素微胶囊对脂肪肝患猫投喂后具有很强的肝脏靶向特性,同时对胃肠液等具有很高的稳定性,提高了芯材的生物利用度,仅需要较低的剂量就能起到良好的效果。海参低聚肽、花胶低聚肽及虾青素共同起到减轻肝细胞炎症,减少脂肪的堆积,缓解生命分子的过氧化等作用,有效治疗猫脂肪肝综合征。
实验4:海参低聚活性肽的肝损伤治疗效果
将HepG2细胞与脂多糖LPS(1μg/mL)共同培养24小时,与海参低聚活性肽的水溶液(2μg/mL)培养24小时,并检测TNF-α炎症因子的分泌水平,结果显示未经过海参低聚活性肽溶液处理的HepG2细胞LPS炎症模型的TNF-α含量达到59.18±3.72pg/ml,远高于空白组的普通HepG2细胞(4.45±0.83pg/ml),而经过海参低聚活性肽溶液处理处理后TNF-α水平得到大幅改善(10.3±1.27pg/ml),表现出海参低聚活性肽(Tyr-Pro-Asp-Cys-Pro-Gly-Pro)显著的肝细胞炎症缓解效果。
实验5:花胶低聚肽的脂肪型肝细胞改善效果
将HepG2细胞培养在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中,置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中。当6孔板内的细胞密度达到60%~70%时,分成3组,对照组:普通培养基培养(含等浓度溶解介质);模型组:0.25mmol/L棕榈酸培养24h后换普通培养基;花胶低聚肽组:0.25mmol/L棕榈酸培养24h,以16μg/mL花胶低聚肽溶液干预12h。加入油红O染色液(油红储存液:去离子水=3:2)染色15min,蒸馏水冲洗数次后置于显微镜下观察并拍照。异丙醇溶解染料后,置于酶标仪下,在570nm波长下测定各组吸光度数值D570。结果显示花胶低聚肽组的D570(0.28±0.08)远低于模型组的D570(0.49±0.06),接近于空白组的D570(0.21±0.08),表明花胶低聚肽溶液干预有效减少了脂肪型肝细胞的脂肪堆积。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有衍生,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种治疗猫脂肪肝的靶向复合物,其特征在于,包括虾青素以及复合载体,其中,复合载体包括海参低聚肽、花胶低聚肽以及半乳糖基化细菌纤维素载体;
虾青素与复合载体的质量比为1:(10~100),复合载体中的海参低聚肽、花胶低聚肽以及半乳糖基化细菌纤维素载体的质量比为(1~3):(1~3):1。
2.根据权利要求1所述的治疗猫脂肪肝的靶向复合物,其特征在于,虾青素与复合载体的质量比为1:10。
3.根据权利要求1所述的治疗猫脂肪肝的靶向复合物,其特征在于,其中,海参低聚肽、花胶低聚肽以及半乳糖基化细菌纤维素载体的质量比为2:2:1。
4.根据权利要求1所述的治疗猫脂肪肝的靶向复合物,其特征在于,海参低聚活性肽的氨基酸序列包括Tyr-Pro-Asp-Cys-Pro-Gly-Pro。
5.根据权利要求1所述的治疗猫脂肪肝的靶向复合物,其特征在于,花胶低聚肽的氨基酸序列包括Tyr-Cys-Tyr-Cys-Pro-Arg。
6.一种制备权利要求1所述的治疗猫脂肪肝的靶向复合物的方法,其特征在于,包括
S41.将虾青素溶于乙醇溶液,将复合载体溶于水;
S42.将溶有虾青素油的乙醇溶液加入复合载体的溶液中,加热进行反应,蒸发去除乙醇,得治疗猫脂肪肝的靶向复合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,
步骤S41中,将虾青素含量10%的虾青素油溶于乙醇溶液,搅拌均匀,复合载体溶于超纯水中,虾青素油与乙醇溶液的质量体积比为1~10%,虾青素油与复合载体的质量比为1:(1~10);
步骤S42中,将溶有虾青素油的乙醇溶液,缓慢滴入复合载体溶液中,滴入过程中加热搅拌进行反应,蒸发去除乙醇,冷冻干燥,得组合物粉末,搅拌速度为500~1500 r/min,反应温度为40~60℃,反应时间为2~4h。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,复合载体的制备方法,包括
将海参低聚肽、花胶低聚肽与半乳糖基化细菌纤维素载体溶于超纯水,80~100℃搅拌反应2~6小时,冷冻干燥,得复合载体。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,其中,半乳糖基化细菌纤维素载体,基于如下方式制备:
S21.将细菌纤维素溶于含四丁基醋酸铵的二甲基亚砜溶液中,搅拌至无胶状物凝聚,得质量体积比为1~5%的均一的细菌纤维素溶液;
S22中.将乳糖酸溶于含有1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)及1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(NHS)的二甲基亚砜(DMSO)溶液中,搅拌进行羧基活化,活化时间为1~3h,得质量体积比为1~10%的乳糖酸溶液;其中,乳糖酸:1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC):1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(NHS)=1~5:1:1;
S23,将细菌纤维素溶液加入乳糖酸溶液中,加热搅拌,去除杂质,冷冻干燥,得半乳糖基化细菌纤维素载体粉,其中,加热搅拌温度为40~50℃,加热搅拌时间为10~24h。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,
优选地,步骤S22中,活化时间为2h,
优选地,步骤S22中,乳糖酸:1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC):1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(NHS)=1:1:1;
优选地,步骤S23中,去除杂质包括在透析管中蒸馏水透析去除未反应的乳糖酸、细菌纤维素及含有含四丁基醋酸铵的二甲基亚砜(DMSO)溶液;
优选地,步骤S23中,透析时间为24~72h,更优选地为72h。
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