CN117257954A - 促进aco1水平的物质在制备相关产品中的应用 - Google Patents

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BEIJING INSTITUTE OF HEART LUNG AND BLOOD VESSEL DISEASES
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Abstract

本发明公开了一种促进ACO1水平的物质在制备相关产品中的应用，其中，所述相关产品用于治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病。本公开首次揭示了ACO1与高胆固醇血症和脂肪肝的相关性，提高ACO1基因的表达或ACO1蛋白活性能够治疗高胆固醇血症和脂肪肝。本发明首次发现了一种ACO1过表达腺相关病毒8(ACO1‑AAV8)，ACO1‑AAV8可提高肝脏中ACO1基因表达进而降低改善高胆固醇血症模型小鼠的血浆总胆固醇水平、改善肝脂沉积，从而可以有效的治疗高胆固醇血症和脂肪肝。

Description

促进ACO1水平的物质在制备相关产品中的应用
技术领域
本发明涉及一种用于治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的相关产品，尤其是一种促进ACO1水平的物质在制备用于治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的产品中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化性心血管疾病是现代人类健康的头号杀手。世界卫生组织数据显示：全球每年有约2000万人死于动脉粥样硬化性心血管疾病，占据了约1/3的死亡人数；血脂稳态失衡则是动脉粥样硬化性心血管的首要诱因，约有一半的成年人存在血脂异常，导致动脉粥样硬化性心血管疾病等致命性疾病的患病风险升高。因此，血脂调控是防治动脉粥样硬化性心血管疾病最重要的手段。
高胆固醇血症是导致动脉粥样硬化性心血管疾病的重要且可控的危险因素。高胆固醇血症是指血液中总胆固醇(TC)和/或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)或非高密度脂蛋白胆固醇(非HDL-C)升高。当血液中的胆固醇水平过高时，胆固醇在血管壁内沉积逐渐形成斑块。随着斑块的进一步形成和增长，血管壁变硬、变薄，并最终导致动脉管腔狭窄或闭塞。当心脏或脑部供血不足时，就会引发心绞痛、心肌梗死、脑卒中等动脉粥样硬化性心血管疾病的症状和并发症。美国自上世纪通过Framingham研究确定了包括高胆固醇血症在内的动脉粥样硬化性心血管疾病危险因素后，开展了大规模的针对胆固醇的干预与管理，动脉粥样硬化性心血管疾病发病率和死亡率大幅下降；英国在1980年后的20年间，通过有效干预包括胆固醇在内的危险因素，冠心病的发病率下降了58％。而我国高胆固醇血症的患病率高达4.9％且呈现持续上升趋势，预计在2010年至2030年间将导致我国新增920万心血管事件。因此，高胆固醇血症已经成为阻碍健康中国建设的重大问题。
脂肪肝也被称为代谢相关脂肪性肝病，现有证据支持脂肪肝与心血管疾病之间存在密切联系，是一种新兴的心血管疾病危险因素。脂肪肝的特征是肝脏脂肪变性和代谢紊乱共存。脂肪肝与动脉粥样硬化性心血管疾病有着相似的发病机制，且这两种疾病都与血脂异常密切相关。研究发现，高胆固醇积累通过激活Kupffer细胞、星状细胞和肝细胞中的细胞内信号通路促进炎症和纤维化，导致肝损伤。同时高胆固醇水平损伤线粒体功能，减少脂肪酸氧化，有助于肝脂沉积的维持。进一步的，高胆固醇积累导致脂质在肝脏和胰岛等脏器中异位沉积，引发“脂毒性”，造成胰岛损伤、糖代谢异常和胰岛素抵抗，进一步加重脂肪肝的发生发展。
因此，寻找适合国人高胆固醇血症和脂肪肝的有效干预策略，对于预防和治疗动脉粥样硬化性心血管疾病，迎来我国心脑血管疾病发病率、死亡率的下降拐点有重大影响。近年来，治疗高胆固醇血症的靶点和药物陆续被发现，包括针对肝脏胆固醇合成主要限速酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂的他汀类药物，针对小肠黏膜刷状缘细胞膜上的NPC1L1蛋白以抑制胆固醇吸收的依折麦布，针对肝脏LDL受体调节蛋白PCSK9的单克隆抗体，以及新批准的针对肝脏ATP-柠檬酸裂解酶抑制剂贝派地酸。但是，已有药物全部为国外研发，且相当一部分患者胆固醇水平不能达标，还存在药物不耐受现象。仍需寻找新的干预靶点，为研发具有我国自主产权的降胆固醇药物奠定基础。
发明内容
本发明为了解决现有技术中存在的问题，提供了一种促进ACO1水平的物质在制备相关产品中的应用。
根据本发明的第一方面，提供了一种促进ACO1水平的物质在制备相关产品中的应用，其中，所述相关产品用于治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病。
在本发明一个实施方式中，其中，促进ACO1水平的物质与其它治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的药物在所述相关产品中联合使用。
在本发明一个实施方式中，其中，所述促进ACO1水平的物质为ACO1调节剂。
在本发明一个实施方式中，其中，所述ACO1调节剂包括ACO1表达促进剂或者ACO1活性激动剂。
在本发明一个实施方式中，其中，所述促进ACO1水平的物质为小分子化合物、抗体、多肽、核酸分子、碳水化合物、脂类、蛋白或病毒。
在本发明一个实施方式中，其中，所述相关疾病包括高血糖症、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗、胰岛损伤和动脉粥样硬化性心血管疾病。
在本发明一个实施方式中，其中，所述治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的产品还包括辅料。
在本发明一个实施方式中，其中，所述相关产品为注射制剂、口服片剂或者口服胶囊剂。
本发明提供的一种促进ACO1水平的物质在制备用于治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的产品中的应用，首次揭示了ACO1与高胆固醇血症和脂肪肝的相关性，提高ACO1基因的表达或ACO1蛋白活性能够治疗高胆固醇血症和脂肪肝。本发明首次发现了一种ACO1过表达腺相关病毒8(ACO1-AAV8)，ACO1-AAV8可提高肝脏中ACO1基因表达进而降低改善高胆固醇血症模型小鼠的血浆总胆固醇水平、改善肝脂沉积，从而可以有效的治疗高胆固醇血症和脂肪肝。本发明提供的ACO1过表达腺相关病毒8(ACO1-AAV8)，还可以改善高血糖症等其他相关疾病。
通过以下参照附图对本发明的示例性实施例的详细描述，本发明的其它特征及其优点将会变得清楚。
附图说明
被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。
图1是本公开实施例2中小鼠肝脏和其他脏器中ACO1表达水平的对比图。
图2是本公开实施例2中小鼠血浆中总胆固醇水平的对比图。
图3是本公开实施例3中小鼠血浆中血糖水平的对比图。
图4是本公开实施例4中小鼠肝脏重量和肝功能指标的对比图。
图5是本公开实施例5中小鼠肝脏切片的HE染色图。
图6是本公开实施例5中小鼠肝脏切片的油红O染色图。
图7是本公开实施例6中小鼠体重和摄入量的对比图。
图8是本公开实施例1中酶切电泳试验结果图。
图9是本公开实施例1中PCR电泳试验结果图。
图10是本公开实施例1中重组质粒构建电泳试验结果图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包括在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包括本数，“一种或几种”中“几种”的含义是两个及两个以上。
本发明的上述发明内容并不意欲描述本发明中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇发明中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、腺相关病毒技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
乌头酸酶1(ACO1)，又称为铁调节蛋白1(IRP1)，是一种对活性物质敏感的非氧化还原铁硫蛋白，含有一个[4Fe-4S]2+辅基，是存在于细胞质中的双功能蛋白质，在具有连接到其活性位点的铁–硫簇的活性细胞溶质中的乌头酸酶(ACO1)形式和结合铁反应元件的脱辅基蛋白(IRP1)两种形式之间交替，在柠檬酸循环中起着必不可少的作用。主要通过铁-硫开关机制来反映细胞溶质铁状态。当细胞铁水平高时，发挥乌头酸酶作用，会结合一个4Fe-4S簇，可逆的催化柠檬酸转化为异柠檬酸，在催化过程中产生的NADPH可维持谷胱甘肽还原状态；当细胞铁水平低或活性物质增加时，导致Fe-S簇的分解产生apoIRP-1，即活性RNA结合形式，其作为铁调节蛋白，结合到铁响应元件(IREs)上，与参与铁调节的多种物质的mRNA非翻译区(UTRs)中的5’或3’UTR结合，维持细胞内铁稳态。
研究发现ACO1/IRP1与癌症之间的关系密切：在多种肿瘤细胞中存在IRP1下调，进而抑制铁死亡使癌细胞免于死亡，包括肝癌、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌等；IRP1-HIF-2α轴参与多种血液学和肿瘤疾病，包括红细胞增多、神经胶质母细胞瘤、结肠直肠癌等。此外，相关研究表明ACO1/IRP1也可通过调控HIF-2α以及铁死亡等过程在神经退行性疾病的发生发展进程中发挥重要作用。
本公开提供了一种促进ACO1水平的物质在制备相关产品中的应用，其中，所述相关产品用于治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病。本发明通过研究发现，通过尾静脉注射靶向肝脏的ACO1(Gene ID:11428)过表达腺相关病毒8(ACO1-AAV8)，在小鼠肝脏中特异性过表达ACO1，提高ACO1在肝脏中的表达和活性，可以治疗高胆固醇血症模型小鼠的高胆固醇血症、高血糖和脂肪肝。表明靶向ACO1在调控胆固醇代谢、糖代谢和脂肪肝中具有重要作用。
本发明虽然没有给出通过促进ACO1水平达到预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的相关实验，但是对于本领域技术人员来说，降低高胆固醇水平可以预防动脉粥样硬化性心血管疾病，以及改善脂肪肝，降低高血糖可以预防糖尿病是已经确立的知识。通过在小鼠发生高胆固醇血症之前给予ACO1调节剂，或在高胆固醇血症和脂肪肝高危人群中使用ACO1调节剂进行预防性用药，即可达到本发明的预防目的。
在本发明一个实施方式中，其中，促进ACO1水平的物质与其它治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的药物在所述相关产品中联合使用。本发明虽然没有给出与其它治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的药物联合应用的相关实验，但是对于本领域技术人员来说，促进ACO1水平的物质只要能够促进患者体内的ACO1水平的表达，即可达到本发明的治疗/预防目的。
例如其它治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的药物可以是本发明背景技术中提到的各种药物。本发明的相关产品可以是药物化合物、药物组合物等，也可以为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、注射剂等各种剂型的药物。例如本发明的相关产品可以为注射制剂、口服片剂或者口服胶囊剂。
本发明的相关产品还可以包括辅料，在本发明公开的通过促进ACO1水平的物质在制备用于治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的相关产品中的应用基础上，合理选择适合的辅料对于本领域技术人员而言是常规的选择，在此不再具体说明。
在本发明一个实施方式中，其中，所述促进ACO1水平的物质为ACO1调节剂。所述ACO1调节剂包括ACO1表达促进剂或者ACO1活性激动剂。
虽然本发明只给出了ACO1过表达腺相关病毒8(ACO1-AAV8)的相关试验数据，但是对于本领域的技术人员而言，腺相关病毒8是一种载体，载体本身和治疗/预防没有直接的关系。在此基础上，本领域技术人员有理由相信，促进ACO1水平的物质也可以为小分子化合物、抗体、多肽、核酸分子、碳水化合物、脂类、蛋白或病毒等。例如抗体可以是对体内抑制ACO1表达的物质产生抗性的抗体。
在本公开一个实施方式中，其中，所述相关疾病包括高血糖症、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗、胰岛损伤和动脉粥样硬化性心血管疾病。通过尾静脉注射ACO1-AAV8，在小鼠肝脏中特异性过表达ACO1，提高ACO1在肝脏中的表达和活性，进而治疗高胆固醇血症、高血糖和脂肪肝。高胆固醇血症、高血糖、脂肪肝与高甘油三酯血症、胰岛素抵抗、胰岛损伤和动脉粥样硬化性心血管疾病都是相互关联的疾病过程，其间的联系和机理涉及到多个因素：高胆固醇水平损伤线粒体功能，减少脂肪酸氧化，导致脂肪肝；高胆固醇积累导致脂质在肝脏、胰岛和血管中异位沉积，造成高甘油三酯血症、胰岛损伤、糖代谢异常、胰岛素抵抗以及动脉粥样硬化性心血管疾病；脂肪肝将导致胰岛素抵抗、高血糖和高甘油三酯血症；高血糖、高胆固醇血症和高甘油三酯血症都增加脂肪肝、糖尿病、胰岛素抵抗和动脉粥样硬化的风险。
本公开相关产品的施用量为适当提高ACO1基因的转录或翻译，或者适当提高ACO1蛋白活性，或者可以改善ACO1稳态失衡相关的高胆固醇血症和脂肪肝的剂量，以使ACO1基因的表达或ACO1蛋白活性适当提高/恢复正常水平并调节ACO1稳态失衡相关信号通路。
实施例1
本实施例提供了一种ACO1过表达腺相关病毒的构建方法，该构建方法是一种成熟的商业化技术，例如可委托上海吉凯基因化学技术有限公司进行ACO1过表达腺相关病毒及相应对照病毒的构建。构建方法简述如下：
使用AgeI/HindIII限制性内切酶进行DNA片段的切割和连接，将ACO1基因的编码序列克隆到GV704(元件顺序：ApoE/hAATp-MCS-SV40 PolyA)表达质粒中。对重组DNA进行测序，以确保ACO1基因正确地插入到腺相关病毒基因组中。将重组DNA和包装质粒转染到AAV-293细胞(提供AAV复制和包装所需的反式作用因子)。转染2到3天后重组AAV在包装细胞中组装完成。为产生AAV前体颗粒，使用辅助腺相关病毒(helper virus)感染已转染的细胞系，以提供AAV复制和包装所需的蛋白。收集细胞培养上清液，其中含有产生的AAV颗粒。通过离心等步骤，富集AAV颗粒并进行纯化和浓缩，用定量PCR法测定所得到病毒的滴度。
1、基因信息：基因名称：Aco1(NM_007386)，物种：Mouse
2、实验材料描述
2.1主要试剂
1kp DNA ladder Marker(Fermentas公司，#SM0311)，250bp DNA ladder Marker(捷瑞生物，DL250+,100T)，琼脂糖(赛百盛公司，GA4-100)，In-FusionTMPCR Cloning Kit(Clontech，639626)，Taq polymerase(SinoBio，E001-02B)，dNTP(Takara，D4030A)，Primer(捷瑞生物)，限制性内切酶(NEB)，Plasmid抽提Kit(Promega，A1460)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化，DP209-03)
2.2主要仪器及器材
PCR仪(Applied Biosystems，2720thermal cycler)，positive clone测序仪(美季生物技术，ABI3730型)，稳压DNA电泳仪(BioRad)，凝胶成像仪(天能公司)，细菌摇床(华利达实验设备公司，HI-9211K)，细菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，Gilson移液器(吉尔森公司)，高速离心机(日立公司，TGL-16G-A)
3、载体信息：
载体名称：GV704(吉凯基因)
元件顺序：ApoE/hAATp-MCS-SV40 PolyA
克隆位点：AgeI/HindIII
4、酶切结果：
参考图8，电泳试验结果说明如下：
第一列、10kb Marker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)
第二列、载体酶切产物
第三列、未酶切载体(从细菌中提取的质粒因可能存在超螺旋、开环、线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，故此时质粒的电泳条带只能作为质粒分子量大小判断的参考，不可作为准确判断依据。质粒经单酶切消化后，会呈现均一的电泳条带，此时可与Marker对比判断其分子量大小)
5、目的基因片段的获取
5.1引物
引物说明：含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因
6、PCR结果
参考图9，电泳试验结果说明如下：Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp
由电泳结果可知，PCR产物大小为：2717
7、重组质粒构建
PCR鉴定引物
ID seq
KL94257-p3 CCCACGCGAGATGAGATCCA
KL94257-p4 CATTCTAGTTGTGGTTTGTCC
PCR鉴定结果
参考图10，由电泳结果可知，阳性转化子PCR产物大小为：980。
电泳试验结果说明如下：
1#：阴性对照(ddH2O)
2#：阴性对照(空载自连对照组)
3#：阳性对照(GAPDH)
4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp
5#-12#:1-8号转化子
8、阳性克隆测序结果及结果分析：
将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序。对测序结果和目的基因序列进行比对分析。比对结果如下：
CACCACTGACCTGGGACAGTGAATACCGGTCGCCACCATGAAGAACCCATTTGCACACCTTGCTGAGCCCTTGGACGCTGCCCAACCAGGAAAGAGGTTCTTCAACTTGAATAAATTGGAGGACTCAAGATACGGACGCTTACCATTTTCTATCAGAGTTCTCCTGGAGGCAGCCGTTCGGAACTGTGATGAGTTTCTGGTGAAGAAAAATGACATCGAGAATATCCTGAATTGGAATGTCATGCAACATAAGAACATAGAAGTGCCGTTTAAGCCAGCCCGAGTCATACTGCAAGACTTTACGGGTGTGCCTGCTGTGGTGGATTTTGCAGCAATGCGCGATGCTGTGAAGAAGTTGGGAGGGAATCCGGAGAAAATTAACCCTGTCTGCCCCGCTGACCTTGTAATTGATCATTCCATCCAGGTTGATTTCAACAGAAGGGCAGACAGTTTACAGAAGAATCAAGACCTGGAGTTTGAAAGAAATAAAGAACGATTTGAATTTCTAAAGTGGGGTTCCCAGGCCTTTTGCAACATGCGGATAATCCCTCCTGGCTCGGGAATCATTCACCAAGTGAACCTGGAGTATTTGGCAAGAGTAGTGTTTGATCAGGATGGATGCTACTACCCAGACAGCCTCGTGGGCACAGATTCACACACGACCATGATTGACGGCCTGGGAGTTCTTGGTTGGGGTGTGGGTGGTATTGAAGCAGAAGCTGTCATGCTGGGTCAGCCCATCAGCATGGTGCTTCCCCAGGTGATTGGCTACAAGCTGATGGGGAAGCCTCACCCTCTGGTGACATCCACGGACATCGTGCTCACCATTACCAAGCACCTCCGACAAGTGGGAGTTGTGGGCAAATTTGTGGAGTTTTTCGGGCCAGGAGTGGCTCAGCTGTCCATTGCTGACCGAGCTACGATTGCCAATATGTGCCCAGAGTATGGTGCGACAGCAGCCTTCTTCCCGGTTGATGAAGTTAGCATCGCGTACCTGCTGCAGACAGGCCGCGAGGAAGACAAAGTCAAGCACATTCAGAAGTATCTTCAGGCTGTAGGCATGTTTCGAGATTTCAACGACACCTCTCAAGACCCAGACTTCACTCAGGTTGTGGAGTTAGATCTGAAAACAGTTGTGCCTTGCTGCAGTGGACCCAAAAGACCTCAGGACAAAGTCGCGGTGTCTGAGATGAAAAAGGACTTTGAAAGCTGCCTTGGAGCCAAGCAAGGATTTAAAGGTTTCCAAGTTGCTCCAGACCGTCACAATGACCGCAAGACGTTCCTCTATAGTAACAGTGAATTCACTCTCGCTCATGGCTCTGTGGTAATCGCTGCCATCACTAGCTGCACAAACACCAGCAATCCATCCGTGATGTTAGGAGCAGGATTGTTAGCAAAGAAAGCTGTGGAGGCGGGGCTGAGTGTGAAGCCTTACATCAAAACCAGCCTGTCTCCTGGAAGTGGAGTGGTCACCTACTACCTTCGAGAGAGTGGAGTCATGCCTTACCTGTCCCAGTTAGGGTTTGATGTGGTGGGCTACGGCTGCATGACCTGCATCGGCAACAGTGGACCCCTTCCTGAACCTGTGGTCGAGGCAATCACCCAGGGAGACCTCGTAGCTGTTGGCGTTCTGTCTGGGAATAGGAATTTTGAAGGCCGAGTCCATCCTAACACACGAGCCAACTACTTAGCATCCCCCCCTCTGGTAATAGCATATGCGATTGCAGGCACCGTCAGGATTGACTTCGAGAAAGAGCCTTTGGGAGTGAACGCACAGGGCCGGCAAGTGTTTCTGAAGGACATCTGGCCCACGCGAGATGAGATCCAGGCGGTGGAAAGGCAGCATGTCATCCCCGGGATGTTTAAGGAGGTCTATCAGAAAATAGAGACTGTAAACAAAAGCTGGAATGCCTTAGCAGCCCCGTCAGAGAAGCTGTATGCGTGGAATCCCAAATCTACTTACATTAAGTCGCCACCATTCTTTGAAAGCTTGACTTTAGATCTCCAGCCACCCAAGTCCATAGTGGATGCCTATGTGCTACTGAATTTAGGAGATTCAGTAACAACGGACCATATCTCTCCCGCCGGCAATATTGCAAGAAACAGCCCTGCGGCTCGCTACTTGACGAACAGAGGCCTAACACCACGAGAGTTCAACTCCTATGGCTCCCGCCGGGGTAACGACGCCATCATGGCCCGGGGGACATTTGCCAACATTCGCTTGCTGAACAAGTTTCTGAACAAGCAGGCACCTCAGACTGTCCATCTCCCCTCAGGAGAAACCCTTGATGTATTCGACGCTGCTGAGCGGTACCAGCAGGCTGGACTTCCCCTGATTGTTCTGGCTGGGAAAGAATACGGTTCAGGCAGCTCCCGAGACTGGGCAGCCAAAGGCCCTTTCCTGCTGGGAATCAAAGCTGTCCTGGCAGAGAGCTATGAGCGCATTCACCGCAGCAACTTGGTTGGCATGGGGGTGATCCCCCTTGAGTATCTCCCTGGTGAAACTGCAGACTCTCTGGGACTCACAGGTCGGGAAAGATACACTATCAACATCCCTGAAGACCTCAAGCCTCGCATGACGGTGCAGATCAAGCTGGACACTGGGAAGACCTTCCAGGCCGTGATGAGGTTCGACACTGATGTGGAGCTCACGTACTTCCACAATGGAGGCATCCTGAACTACATGATCCGAAAGATGGCCCAGTAGAAGCTTTAAATAGCTGAGGCCGCTTCGAGC
比对结果说明：测序结果与目标序列完全一致。
对照AAV8(ConAAV8)为包含空载体(GV704)的AAV8。
实施例2
HCD+ConAAV8：小鼠3只，给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ConAAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
HCD+ACO1AAV8：小鼠3只，给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ACO1 AAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
注射六周后，小鼠禁食4小时，以戊巴比妥钠麻醉后安乐死，分离肝脏、骨骼肌、心脏、下丘脑和白色脂肪组织，利用Trizol法提取mRNA，应用实时荧光定量PCR检测试剂盒(PowerUp SYBR Green预混液，Applied Biosystems，A25742)对小鼠肝脏、下丘脑、脂肪、心脏和肌肉内ACO1的mRNA进行定量PCR，具体操作参见试剂盒说明书，GAPDH为内参。
所用引物如下：ACO1-F1:CCATCCGTGATGTTAGGAGCAG；
ACO1-R1:GACAGGTAAGGCATGACTCCAC
Gapdh-F1:GTCAAGGCCGAGAATGGGAA
Gapdh-R1:CTCGTGGTTCACACCCATCA
结果如图1所示，与对照组(ConAAV8)相比，通过尾静脉注射ACO1 AAV8(3×10^11vg/只)6周后小鼠肝脏中ACO1基因表达显著升高，而其他脏器中ACO1基因表达不变，可知通过尾静脉注射ACO1 AAV8可使ACO1在肝脏特异性表达升高。
实施例3肝脏特异性过表达ACO1显著降低高胆固醇饮食喂养小鼠血浆总胆固醇水平
建立小鼠模型如下：
Chow+ConAAV8：小鼠6只，给予小鼠正常饲料饮食喂养1周，再通过尾静脉注射ConAAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以正常饲料喂养。
HCD+ConAAV8：小鼠6只，给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ConAAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
HCD+ACO1AAV8：小鼠6只，给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ACO1 AAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
HCD+Ezetimibe：小鼠6只，给予正常小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再给予阳性药依折麦布(Ezetimibe，10mg/kg，灌胃)，测试前三天中每天给予一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
血浆胆固醇检测方法：小鼠禁食4小时后(早9点至下午1点)，从尾静脉取血并用中生北控的胆固醇试剂盒(#000180)检测血浆总胆固醇；需要注意的是，本次试验中2周、4周采用的是尾静脉取血，6周采用的是心脏血。
图2是实施例3中各实验组中血浆总胆固醇水平的对比图。其中，横轴表示组别，纵轴表示血浆总胆固醇(TC)的含量(m mol/L)。通过图2的数据可以发现与正常饮食组(Chow+ConAAV8)相比，HCD+ConAAV8组小鼠的血浆总胆固醇水平显著升高；与HCD+ConAAV8组相比，HCD+ACO1AAV8组中ACO1肝脏特异性过表达(ACO1-AAV8)2周、4周和6周均可显著降低HCD喂养小鼠血浆总胆固醇(TC)水平(P＜0.05；P＜0.01；p<0.001)。
实施例4肝脏特异性过表达ACO1显著降低高胆固醇饮食喂养小鼠血糖
建立小鼠模型如下：
Chow+ConAAV8：小鼠8只，给予小鼠正常饲料饮食喂养1周，再通过尾静脉注射ConAAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以正常饲料喂养。
HCD+ConAAV8：小鼠8只，给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ConAAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
HCD+ACO1AAV8：小鼠8只，给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ACO1 AAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
血糖检测方法：喂养6周，小鼠禁食4小时后(早9点-下午1点)，从尾静脉取血用中生北控的葡萄糖试剂盒(#060110)检测血糖。
图3是实施例4中各实验组中血糖水平的对比图。其中，横轴表示组别，纵轴表示血糖水平的含量(m mol/L)。通过图3的数据可以发现与正常饮食组(Chow+ConAAV8)相比，HCD+ConAAV8组小鼠的空腹血糖水平显著升高；与HCD+ConAAV8组相比，ACO1肝脏特异性过表达(ACO1-AAV8)6周可显著降低HCD喂养小鼠的空腹血糖水平(P＜0.001)。
实施例5肝脏特异性过表达ACO1显著降低高胆固醇饮食喂养小鼠的血浆ALT和AST水平
高胆固醇饮食可损伤人和小鼠的肝功能并导致脂肪肝，我们进一步观察肝脏特异性过表达ACO1对HCD喂养小鼠的肝脏重量和肝功能指标(ALT和AST)的影响。
建立小鼠模型如下：
Chow+ConAAV8：小鼠4只，给予小鼠正常饲料饮食喂养1周，再通过尾静脉注射ConAAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以正常饲料喂养。
HCD+ConAAV8：小鼠4只，给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ConAAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
HCD+ACO1AAV8：小鼠4只，给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ACO1 AAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
注射AAV8六周后，小鼠禁食4小时，以戊巴比妥钠麻醉后取心脏血，分离肝脏并称取肝脏重量，全血2000g在4摄氏度下离心15分钟分离上层血浆，以天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒(南京建成，C010-2-1)检测AST水平，以丙氨酸氨基转移酶试剂盒(南京建成，C009-2-1)检测ALT水平。
图4是实施例5中各实验组中肝脏重量和肝功能指标的对比图。其中，图4中A、B、C图中的横轴分别表示组别，纵轴分别表示肝脏重量(g)、ALT、AST水平(U/L)。通过图4的数据可以发现与正常饮食组(Chow+ConAAV8)相比，HCD+ConAAV8组小鼠的血浆ALT和AST水平显著升高，与HCD+ConAAV8组相比，ACO1肝脏特异性过表达(ACO1-AAV8)6周可显著降低HCD喂养小鼠血浆ALT和AST水平(P＜0.05)，对肝脏重量没有明显影响，以上结果表明ACO1肝脏特异性过表达显著改善高胆固醇饮食喂养小鼠的肝功能，且不影响肝脏重量。
实施例6肝脏特异性过表达ACO1显著改善高胆固醇饮食喂养小鼠的肝脂沉积
建立小鼠模型如下：
Chow+ConAAV8：给予小鼠正常饲料饮食喂养1周，再通过尾静脉注射ConAAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以正常饲料喂养。
HCD+ConAAV8：给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ConAAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
HCD+ACO1AAV8：给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ACO1 AAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
注射AAV六周后，小鼠禁食4小时，安乐死后分离肝脏固定于4％多聚甲醛，包埋切片5μM进行HE染色和油红O染色。HE结果如图5所示，箭头显示HCD+ConAAV8组小鼠肝脏显示明显的空泡变性，表明HCD喂养造成小鼠严重的脂肪肝。ACO1-AAV8干预组空泡变性明显减少(40×，标尺＝40μM)。油红O结果如图6所示，模型组(HCD+ConAAV8)小鼠肝脏中出现较多脂肪累积(深灰脂滴)，ACO1-AAV8干预组深灰脂滴明显减少。(40×，标尺＝40μM)，以上结果表明ACO1-AAV8可以显著改善HCD喂养小鼠的脂肪肝病变。
实施例7肝脏特异性过表达ACO1对高胆固醇饮食喂养小鼠体重和摄食无影响
建立小鼠模型如下：
Chow+ConAAV8：小鼠6只，给予小鼠正常饲料饮食喂养1周，再通过尾静脉注射ConAAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以正常饲料喂养。
HCD+ConAAV8：小鼠6只，给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ConAAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
HCD+ACO1AAV8：小鼠6只，给予小鼠高胆固醇饮食(Research Diets，D12108C)喂养1周，再通过尾静脉注射ACO1 AAV8(3×10^11vg/只)，每只小鼠仅注射一次；实验期间一直以高胆固醇饲料喂养。
图7中的A图为三组小鼠模型的体重对比图，B图为三组小鼠模型的摄入量对比图。从图7可以发现ACO1肝脏特异性过表达(ACO1-AAV8)6周对HCD喂养小鼠体重和摄食量无影响，表明ACO1肝脏特异性过表达对HCD喂养小鼠高胆固醇血症、高血糖和脂肪肝的改善作用不依赖于摄食量和体重的变化。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。本发明的范围由所附权利要求来限定。

Claims (8)

1.一种促进ACO1水平的物质在制备相关产品中的应用，其中，所述相关产品用于治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，促进ACO1水平的物质与其它治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的药物在所述相关产品中联合使用。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述促进ACO1水平的物质为ACO1调节剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述ACO1调节剂包括ACO1表达促进剂或者ACO1活性激动剂。
5.根据权利要求3所述的应用，其中，所述促进ACO1水平的物质为小分子化合物、抗体、多肽、核酸分子、碳水化合物、脂类、蛋白或病毒。
6.根据权利要求1所述的应用，其中，所述相关疾病包括高血糖症、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗、胰岛损伤和动脉粥样硬化性心血管疾病。
7.根据权利要求1所述的应用，其中，所述治疗/预防高胆固醇血症、脂肪肝及其相关疾病的产品还包括辅料。
8.根据权利要求1所述的应用，其中，所述相关产品为注射制剂、口服片剂或者口服胶囊剂。
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