CN117257848A - 黑芝麻色素在制备用于治疗和/或改善脂肪肝的药物和/或食品中的应用 - Google Patents
黑芝麻色素在制备用于治疗和/或改善脂肪肝的药物和/或食品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了黑芝麻色素在制备用于治疗和/或改善脂肪肝的药物和/或食品中的应用。本发明经研究发现利用黑芝麻色素能够显著改善动物模型的非酒精性脂肪肝，使非酒精性脂肪肝类器官中ATP活性水平显著上升，同时还能够显著降低非酒精性脂肪肝类器官的脂肪酸代谢关键基因和炎症因子表达水平，进而改善非酒精性脂肪肝症状；并且黑芝麻色素还能通过调控HIF‑1信号通路，显著上调HIF1A表达水平，显著下调上游基因STAT3、MAPK3、AKT1和下游基因NOS2的表达水平，从而抑制非酒精性脂肪肝发展过程中的氧化应激、脂质积累和炎症因子的分泌。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地，涉及黑芝麻色素在制备用于治疗和/或改善非酒精性脂肪肝的药物和/或食品中的应用。
背景技术
非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明确的干涉因素所致，以肝细胞内脂肪堆积为主要特征的临床病理综合征。按中医观点，NFALD归属于“癥积”、“胁痛”、“痰症”和“肥气病”等范畴。随着肥胖以及相关代谢综合征全球化的趋势，NAFLD已成为慢性肝病的重要病因，普通成人的患病率约为10％～30％，但目前仍然缺乏有效的防治方法和特效药物。
弘扬药食同源的中国传统中医药文化，从传统的药食同源植物中发现有价值的生物活性物质并用于防治以NAFLD为代表的慢性综合性代谢疾病，已成为食品、医药和健康领域关注的热点，传统中医理论认为黑色食品具有补益肝肾等功能，但是目前的研究有待深入。
黑芝麻为脂麻科(胡麻科)脂麻属植物脂麻(Sesamumindicum L.)的干燥成熟种子。黑芝麻原产我国云贵高原，主要分布于江西、福建、广东、关系及云南等省区，全国各地均有栽培。黑芝麻(Black sesame，BS)作为一种传统的药食同源的植物，被多部要点所收录；2015版《中国药典》记载，黑芝麻“性肝、平，归肝、肾、大肠经；补肝肾、益精血，润肠燥；用于头晕眼花，耳鸣耳聋，须发早白，病后脱发，肠燥便秘”。黑芝麻中含有多糖、色素、木脂素等多种生物活性物质，具有抗氧化、抗增殖和抗肿瘤生物活性。
黑芝麻色素(Black sesame pigment，BSP)属于黑芝麻中的生物活性物质，属于儿茶酚新生物大分子，为高分子聚合物异质结构，存在苯酚、儿茶酚、愈创木酚、香草醛和松柏醇等单体结构；木脂素(lignan)是一类存在于植物中的天然有机化合物，其结构由两个苯丙基醚单元通过较强的化学键连接而成。它们在植物细胞壁中与木素一起存在，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗炎和激素调节等作用，已有研究表明黑芝麻中的芝麻木脂素能够减轻细胞氧化应激，降低肝细胞中的脂质累积，进而起到治疗非酒精性脂肪肝的作用；但是芝麻木脂素在黑芝麻中的含量低(<1‰)，且其对于非酒精性脂肪肝的治疗效果仍未证实。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供黑芝麻色素在制备用于治疗和/或改善脂肪肝的药物和/或食品中的应用。
本发明的第一目的是提供黑芝麻色素在制备用于治疗和/或改善脂肪肝的药物和/或食品中的应用。
本发明的第二目的是提供黑芝麻色素在制备用于辅助降低血脂的药物和/或食品中的应用。
本发明的第三目的是提供一种治疗和/或改善脂肪肝的药物。
本发明的第四目的是提供一种适用于脂肪肝患者的食品。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明请求保护黑芝麻色素在制备用于治疗和/或改善脂肪肝的药物和/或食品中的应用。
优选地，所述食品为特殊医学用途配方食品和/或保健食品。
优选地，所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝。
优选地，所述黑芝麻色素以黑芝麻粉末为原料，采用碱溶酸沉法提取得到。
更优选地，具体包括以下步骤：
S1.将黑芝麻粉末以质量体积比为1：10～30与浓度为8～12g/L的氢氧化钠溶液充分混合，充分搅拌后抽滤并收集滤液进行离心，固液分离收集黑色上清液；
S2.将步骤S1得到的黑色上清液静置，待出现分层后去除上层液体，收集下层液并利用调节pH值为1.0～3.0，充分搅拌后，离心收集沉淀即为黑芝麻色素。
优选地，步骤S1中所述黑芝麻粉末的制备方法具体为：将成熟黑芝麻加热至散发出香味后，置于烘箱中在110～130℃加热2h后，充分粉碎。
优选地，步骤S1中所述黑芝麻粉末和浓度为8～12g/L的氢氧化钠溶液的质量体积比为1：15。
优选地，步骤S2中为利用盐酸调节pH值至2.0。
本发明还请求保护黑芝麻色素在制备用于辅助降低血脂的药物和/或食品中的应用。
优选地，所述食品为特殊医学用途配方食品和/或保健食品。
发明人经研究发现采用碱溶酸沉法处理黑芝麻提取得到的黑芝麻色素，能够显著改善非酒精性脂肪肝损伤，使非酒精性脂肪肝类器官的ATP活性水平显著上升，同时还能够显著降低非酒精性脂肪肝类器官模型中脂肪酸代谢关键基因和炎症因子表达水平，改善非酒精性脂肪肝症状，防止其恶化形成非酒精性脂肪肝炎。
本发明还请求保护一种用于治疗和/或改善脂肪肝的药物，所述药物含有黑芝麻色素。
优选地，所述黑芝麻色素在药物中的质量浓度为0.4％～0.6％。
更优选地，所述黑芝麻色素在药物中的质量浓度为0.5％。
更优选地，所述药物还含有药学上可接受的载体。
进一步优选地，所述药物为口服制剂，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂和/或溶液剂。
本发明还请求保护一种适用于脂肪肝患者的食品，所述食品的主要活性物质为黑芝麻色素。
优选地，所述食品为特殊医学用途配方食品和/或保健食品。
优选地，所述食品是日常饮食品。
优选地，所述脂肪肝患者为非酒精脂肪肝患者。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了黑芝麻色素在制备用于治疗和/或改善脂肪肝的药物和/或食品中的应用。本发明经研究发现利用黑芝麻色素能够显著改善动物模型的非酒精性脂肪肝，使非酒精性脂肪肝类器官中ATP活性水平显著上升，同时还能够显著降低非酒精性脂肪肝类器官的脂肪酸代谢关键基因和炎症因子表达水平，进而改善非酒精性脂肪肝症状，防止其恶化形成非酒精性脂肪肝炎；并且黑芝麻色素还能通过调控HIF-1信号通路，显著上调HIF1A表达水平，显著下调上游基因STAT3、MAPK3、AKT1和下游基因NOS2的表达水平，从而抑制非酒精性脂肪肝发展过程中的氧化应激、脂质积累和炎症因子的分泌。
附图说明
图1为实施例2中各组样品的ATP活性测试结果图；
图2为实施例2中的甘油三酯和总胆固醇测定结果图；(a)为甘油三酯测定结果；(b)为总胆固醇测定结果；
图3为脂肪酸代谢相关基因APOC2、CPT2和HADH的表达水平结果图；(a)为APOC2的表达水平结果；(b)为CPT2的表达水平结果；(c)为HADH的表达水平结果；
图4为炎症相关基因IL-8、IL-17和TNFα的表达水平结果图；(a)为TNFα的表达水平结果；(b)为IL-17的表达水平结果；(c)为IL-8的表达水平结果；
图5为HIF-1信号通路相关基因的表达水平结果图；(a)为HIF1A的表达水平结果；(b)为AKT1的表达水平结果；(c)为MAPK3的表达水平结果；(d)为STAT3的表达水平结果；(e)为NOS2的表达水平结果；
图6为实施例3中的小鼠肝脏观察图；A为正常组对应的切片观察图；B为模型对照组对应的切片观察图；C为黑芝麻色素低剂量组对应的切片观察图；D为黑芝麻色素高剂量组对应的切片观察图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1黑芝麻色素的提取
挑取成熟黑芝麻置于加热炒制机中，在220℃下炒制30min，待炒制至出现爆裂声，且黑芝麻为鼓起或表面有裂痕，并伴随有香味逸出时完成炒制。将炒制完成的黑芝麻置于120℃烘箱加热2h，接着粉碎30s，重复粉碎3次，得到黑芝麻粉末。
以黑芝麻粉末作为原料，采用碱溶酸沉法提取黑芝麻色素，具体为：
称取200g黑芝麻粉末置于锥形瓶中，向锥形瓶中加入3000mL现配的10g/L的NaOH溶液，置于30℃摇床中，在140rpm下震荡搅拌40min，震荡结束后，使用四层纱布抽滤一次，收集滤液并在6000rpm的条件下离心25min，收集黑色上清液，将黑色上清液置于分液漏斗中，静置30min，收集下层液至新的锥形瓶中，在150rpm的条件下向下层液中加入1.5mol/L的盐酸调节pH值至2.0，接着静置2h，在6000rpm的条件下离心25min，收集沉淀，在60℃烘箱中烘干至恒重，即得黑芝麻色素。
实施例2黑芝麻色素对非酒精性脂肪肝的作用测定
1、实验方法
(1)实验样品准备
将32.5mg的α-淀粉酶溶解到25mL氯化钙(1mmol/L)中，并调整pH为7，得到α-淀粉酶/氯化钙溶液；
将23.4mL的浓盐酸(12mol/L)与100mL水混合得到稀盐酸，将1.64mL稀盐酸、80mL水和1g胃蛋白酶混合，并用水稀释至100mL，得到人工胃液(pH＝2)；
将0.68g磷酸二氢钾溶解于50mL水中，用浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液调制pH＝6.8，得到溶液1,；将1g胰蛋白酶充分溶解于水中得到溶液2，将溶液1和溶液2混合均匀后，加水稀释至100mL，得到人工小肠液(pH＝6.8)；
将5.59g磷酸氢二钾和0.41g磷酸二氢钾加水溶液，并稀释至1000mL，得到人工大肠液(pH＝7.8)。
将2g实施例1制备得到的黑芝麻色素、20mL蒸馏水和500μL的α-淀粉酶/氯化钙溶液混合，在37℃的恒温振荡器中以120rpm的速度孵育10min，得到BSP口腔上清样品；利用6mol/L的HCl将20mL的BSP口腔上清样品的pH值调至2.0，并加入10mL含有0.1g胃蛋白酶的人工胃液，混合均匀后置于37℃的恒温振荡器中以120rpm的速度孵育1h，得到BSP胃部上清样品；利用0.9mol/L的NaHCO3溶液将20mL的BSP胃部上清样品的pH值调至6.0，并加入10mL含有0.1g胰酶的人工小肠溶液，混合均匀后将pH值调节至7.4，在37℃的恒温振荡器中以120rpm的速度孵育2h，得到BSP小肠上清样品；利用6mol/L的HCl将20mL的BSP小肠上清样品的pH值调节至4.0，并加入10mL的人工大肠液，混合均匀后在27℃的恒温振荡器中以120rpm的速度孵育14h，孵育结束后将pH值调节至7.0，得到BSP大肠上清样品。
将20mL的BSP口腔上清样品、30mL的BSP胃部上清样品、40mL的BSP小肠上清样品和50mL的BSP大肠上清样品分别在烧瓶中45℃真空以60rpm的速度旋转蒸发至干，收集烧瓶瓶壁上的膏状样物质，并利用超纯水进行溶解定容至20mL，得到BSP口腔消化样品、BSP胃部消化样品、BSP小肠消化样品和BSP大肠消化样品。
将2g实施例1制备得到的黑芝麻色素替换成2g黑芝麻，按照相同处理方法进行处理，得到BS口腔消化样品、BS胃部消化样品、BS小肠消化样品和BS大肠消化样品。
(2)非酒精性脂肪肝类器官造模
挑选正常肝类器官在37℃，5％CO2(v/v)的培养箱中进行传代培养，每隔2天更换新鲜培养基，培养7天后，利用FFAs诱导培养后的肝类器官，得到非酒精性脂肪肝类器官模型。
将非酒精性脂肪肝类器官模型随机分为10组，得到10组非酒精性脂肪肝类器官并分别置于96孔培养板中进行培养，其中一组作为模型组(DC，不添加样品，游离脂肪酸浓度为600μmol/L)；一组采用150μg/mL的多西磷酸胆碱进行处理，作为阳性药物组(PC)；四组分别使用5mg/mL步骤(1)制备得到的BSP口腔消化样品、BSP胃部消化样品、BSP小肠消化样品和BSP大肠消化样品进行处理，作为BSP口腔组、BSP胃部组、BSP小肠组和BSP大肠组；剩余四组分别使用5mg/mL步骤(1)制备得到的BS口腔消化样品、BS胃部消化样品、BS小肠消化样品和BS大肠消化样品进行处理，作为BS口腔组、BS胃部组、BS小肠组和BS大肠组；各组别样品添加量均为：每100μL培养基加入5μL样品。
将肝类器官同时造模给药培养5天后，收集健康肝类细胞作为正常组(NC)，正常组每两天更换培养基，不进行其他处理；11个不同组别均为每两天处理一次，处理5天后，备用。
类器官培养基成分：采用DEME/F-12P培养基，含有2mM谷氨酰胺、10mM的Hepes缓冲液、1×N2、1×B27、50ng/mL的EGF、25ng/mL的HGF、100ng/mL的FGF10、10nM的Gastrinl、10μM的Forskolin、5μM的A83-01、10mM的Nicotinamide、1.25mM的N-Acetylcysteine、10μM的Y-27632、100ng/mL的R-SPondinl和100ng/mL的Noggin；物质浓度均为培养基中的终浓度。
(3)ATP水平测试
将步骤(2)得到的11个不同组别的样品温度平衡至25℃，分别加入与组别内样品等体积(80μL)的CellCounting-Lite3D，使用移液枪吹打均匀后，置于200rpm的摇床上震荡5min混匀，接着转移至酶标板中，在25℃放置25min后，使用化学发光法测定各个组别的ATP活性。
(4)甘油三酯和总胆固醇的测定
以步骤(2)建立的正常组(NC)为例，测定甘油三酯和总胆固醇，具体如下：
向培养孔中加入200μL的PBS清洗2次后，再加入200μL的康宁细胞回收液，充分混合后使用移液枪吹散基质胶，并将液体吸取到1.5mL离心管中，加入基质胶至体积为1mL，颠倒离心管充分混匀，置于冰上1h，接着在4℃，300×g的条件下离心5min，收集沉淀用PBS重悬，接着在4℃，300×g的条件下离心5min，收集沉淀并用PBS重悬，接着在4℃，300×g的条件下离心5min，收集得到细胞沉淀，并使用100μL的1％(v/v)的TritonX-100裂解液重悬沉淀，在冰上裂解30min，分别使用甘油三酯试剂盒(A110-1-1)和总胆固醇试剂盒(A111-1-1)按照说明书测定甘油三酯和总胆固醇含量。
对剩余10个组别进行相同处理，测定甘油三酯和总胆固醇含量。
(5)炎症因子、脂肪酸代谢因子以及HIF-1信号通路的相关基因的表达测试
以步骤(2)建立的正常组(NC)为例，测定其脂肪酸代谢因子相关基因APOC2、CPT2和HADH、炎症因子相关基因IL-8、IL-17和TNFα、HIF-1信号通路相关基因MAPK3、NOS2、STAT3、AKT1和HIF1A的表达水平，其中以测定CPT2表达水平为例，具体如下：
向正常组(NC)的培养孔中加入200μL的PBS清洗2次后，再加入200μL的康宁细胞回收液，充分混合后使用移液枪吹散基质胶，并将液体吸取到1.5mL离心管中，加入基质胶至体积为1mL，颠倒离心管充分混匀，置于冰上1h，接着在4℃，300×g的条件下离心5min，收集沉淀用PBS重悬，接着在4℃，300×g的条件下离心5min，收集沉淀并用PBS重悬，接着在4℃，300×g的条件下离心5min，收集得到细胞沉淀。
向细胞沉淀中加入1mL的TriQuick Reagent重悬细胞沉淀，吹打混合均匀后置于冰上裂解15min，接着加入200μL的氯仿，颠倒混匀30s，在涡旋仪涡旋1min，涡旋结束后4℃放置3min，接着在12000×g的条件下离心15min，移取500μL上清液在新的1.5mL离心管中与500μL的异丙醇混合均匀，在4℃静置10min后，接着以4℃，12000×g的条件离心10min，弃上清后加入1mL的预冷(4℃)75％乙醇，混匀后在12000×g的离心条件下离心10min，弃上清后，置于通风处放置20min直至管壁和管底乙醇完全挥发，加入10μL的DEPC水溶解沉淀，在59℃金属浴加热10min即得RNA样本。
配制如表1所示逆转录体系。
表1逆转录体系
| 组分 | 体积/质量 |
| 5×SuperMix | 4μL |
| RNA样本 | 1μg |
| Rnase Free ddH2O | Up to 20μL |
配制好如表1所示逆转录体系之后，瞬时离心混匀，进行逆转录反应，得到cDNA逆转录产物；逆转录反应程序为：25℃，2min；42℃，15min；95℃，1min。
以cDNA逆转录产物作为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的GAPDH-F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的GAPDH-R进行RT-qPCR反应，得到GAPDH的基因表达量；RT-qPCR反应体系如表2所示，反应程序如表3所示。
表2RT-qPCR反应体系
表3RT-qPCR反应程序
将表2所示RT-qPCR反应体系中的GAPHD-F替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的CPT2-F，将GAPHD-R替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的CPT2-R，按照表3所示RT-qPCR反应程序进行反应，反应结束后根据RT-qPCR仪器测定得到的实验结果利用2-△△CT法分析基因相对表达量计算出CPT2的基因相对表达量(相对与GAPDH基因的表达量)，并利用2-△△CT分析基因表达相对变化；平行测定3组，取平均值作为CPT2的基因相对表达量结果。
GAPDH-F(SEQ ID NO：1)：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；
GAPDH-R(SEQ ID NO：2)：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’；
CPT2-F(SEQ ID NO：3)：5’-CACCATGCACTACCAGGACA-3’；
CPT2-R(SEQ ID NO：4)：5’-GTTTGTCCAGAGCAACCAGC-3’
将核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的CPT2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的CPT2-R分别替换成表4所示组别1～10中对应的F序列和R序列，分别计算APOC2、HADH、IL-8、IL-17、TNFα、MAPK3、NOS2、STAT3、AKT1和HIF1A的基因相对表达量。
表4引物序列信息
2、实验结果
(1)ATP水平测试结果
各组样品的ATP活性测试结果如图1所示，结果显示：相较于模型组(DC)，所有BSP组的ATP活性水平均显著提高(p＜0.05)，并且其中BSP大肠组的ATP水平最高，其次为BSP胃部组、BSP小肠组和BSP口腔组；而BS组中除BS口腔组外，其他各组的ATP活性水平与模型组(DC)均没有显著差异。
(2)甘油三酯和总胆固醇测定结果
甘油三酯和总胆固醇的测定结果如图2所示，其中(a)为甘油三酯测定结果，(b)为总胆固醇测定结果；结果显示：与模型组(DC)相比，所有BSP组均可显著性降低甘油三酯和总胆固醇的含量(p＜0.05)，其中BSP胃部组和BSP大肠组的甘油三酯和总胆固醇含量下降最显著。
(3)基因表达测试结果
脂肪酸代谢相关基因APOC2、CPT2和HADH的表达水平结果如图3所示，其中(a)为APOC2的表达水平结果，(b)为CPT2的表达水平结果，(c)为HADH的表达水平结果。
炎症相关因子相关基因IL-8、IL-17和TNFα的表达水平结果如图4所示，其中(a)为TNFα的表达水平结果，(b)为IL-17的表达水平结果，(c)为IL-8的表达水平结果。
结果显示：与模型组(DC)相比，除BSP胃部组的HADH基因表达水平升高之外，其余所有BSP组的脂肪酸代谢因子表达水平、炎症因子表达水平均为下降，其中除BSP胃部组的HADH基因、BS大肠组及BSP口腔、胃部组的TNFα基因表达水平无显著性差异外，其余组均具有显著性差异(p＜0.05)，并且BSP小肠组的基因表达水平下降最为显著；结果说明：黑芝麻色素(BSP)能够改善非酒精性脂肪肝。
HIF-1信号通路相关基因的表达水平结果如图5所示，其中(a)为HIF1A的表达水平结果，(b)为AKT1的表达水平结果，(c)为MAPK3的表达水平结果，(d)为STAT3的表达水平结果，(e)为NOS2的表达水平结果。
结果显示：模型组(DC)相较于正常组(NC)，其HIF1A基因表达水平显著下调，而STAT3、MAPK3、AKT1和NOS2基因表达水平均显著上调；与模型组(DC)相比，BSP小肠组的HIF1A(低氧诱导因子)表达水平显著上调(p＜0.05)，而STAT3(信号传导和转录因子3)、MAPK3(丝裂原活化蛋白激酶)、AKT1(蛋白激酶)和NOS2(一氧化氮合酶)基因表达水平均显著下调(p＜0.05)。
结果说明：黑芝麻色素(BSP)能够通过调控HIF-1信号通路，从而抑制非酒精性脂肪肝发展过程中的氧化应激、脂质积累和炎症因子的分泌，进而抑制非酒精性脂肪肝，起到治疗和改善非酒精性脂肪肝的效果。
实施例3黑芝麻色素对非酒精性脂肪肝小鼠的影响
1、实验方法
随机选取100只健康无疾病的小鼠，其中80只作为建模小鼠，建模小鼠饲喂高脂饲料(配方：20％蛋白、35％碳水化合物和45％脂肪，w/w)，剩余20只小鼠饲喂普通饲料(由广东药科大学动物实验中心提供，饲料成分包含玉米粉、大豆粉、麦麸、鱼粉、骨粉、脱脂奶粉、维生素和矿物质)作为健康组。
饲喂饲料4周之后，建模组小鼠禁食不禁水12h，并且以150mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液(将STZ利用0.1mmol/L，pH＝4.4的无菌柠檬酸缓冲液配制得到STZ浓度为1.33％(w/w))；健康组小鼠以150mg/kg的剂量腹腔注射无菌柠檬酸缓冲液(pH＝4.4)。接着将46只建模组小鼠随机分为正常组(NC)、模型对照组(DC)、黑芝麻色素低剂量组(BSP-H1)和黑芝麻色素高剂量组(BSP-H2)；其中模型对照组每组10只建模组小鼠，其余组别每组12只建模组小鼠。
正常组(NC)和模型对照组(DC)小鼠以300mg/kg的剂量每天灌胃双蒸水；黑芝麻色素低剂量组(BSP-H1)以200mg/kg的剂量每天灌胃实施例1制备得到的黑芝麻色素；黑芝麻色素高剂量组(BSP-H2)以800mg/kg的剂量灌胃实施例1制备得到的黑芝麻色素；灌胃期间正常组(NC)小鼠饲喂普通饲料，其余各组小组饲喂高脂饲料。
各组小鼠连续灌胃对应物质四周之后，处死小鼠并将小鼠肝脏制备石蜡切片，HE染色观察形态，以模型对照组(DC)小鼠为例，具体步骤如下：
将小鼠肝脏制备成石蜡切片后，将温箱温度调至60℃，待温度控制在60℃时，将石蜡切片和切片架放入干燥的温箱中静置直至石蜡熔化，接着利用苏木精染色2min，水洗，利用1％(v/v)的盐酸乙醇液分化5s，接着用返蓝液返蓝，再利用伊红染色1min，水洗，水洗后依次过70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇和100％乙醇(每个梯度2min)，接着2次二甲苯，每次5min，树胶封片后即可用于镜检。
对正常组(NC)、模型对照组、黑芝麻色素低剂量组和黑芝麻色素高剂量组的小鼠肝脏石蜡切片进行同等处理，并观察。
2、实验结果
小鼠肝脏石蜡切片的观察图如图6所示，A为正常组对应的切片观察图；B为模型对照组对应的切片观察图；C为黑芝麻色素低剂量组对应的切片观察图；D为黑芝麻色素高剂量组对应的切片观察图。
结果显示：正常组(NC)小鼠的肝细胞形态清洗可见，肝小叶结构完整无病变；与正常组小鼠肝脏切片相比，模型对照组(DC)的小鼠肝脏肝小叶结构存在，但肝窦索结构明显紊乱，肝细胞部分浊肿，肝小叶内见肝细胞水肿及点状坏死，且局部有一定的炎性细胞浸润，说明肝脏发生严重损伤。
与模型对照组的肝脏切片相比，黑芝麻色素低剂量组(BSP-H1)和黑芝麻色素高剂量组(BSP-H2)的小鼠肝脏均有不同程度的好转，虽然仍能够见到少量细胞水肿，但未见细胞坏死；其中黑芝麻色素高剂量组的小鼠肝脏切片细胞形态与正常组(NC)的小鼠切片细胞形态接近，没有显著差异，且肝小叶结构和肝窦索结构较为清晰，肝细胞损伤程度明显减轻。
结果说明：黑芝麻色素对于非酒精性脂肪肝造成的肝脏损伤具有一定的修复效果，能够在一定程度上治疗和改善非酒精性脂肪肝。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.黑芝麻色素在制备用于治疗和/或改善脂肪肝的药物和/或食品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黑芝麻色素以黑芝麻粉末为原料，采用碱溶酸沉法提取得到。
4.黑芝麻色素在制备用于辅助降低血脂的药物和/或食品中的应用。
5.一种用于治疗和/或改善脂肪肝的药物，其特征在于，所述药物含有黑芝麻色素。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述黑芝麻色素在药物中的质量浓度为0.4％～0.6％。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物为口服制剂，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂和/或溶液剂。
9.一种适用于脂肪肝患者的食品，其特征在于，所述食品的主要活性物质为黑芝麻色素。
10.根据权利要求9所述的食品，其特征在于，所述食品是日常饮食品。
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