CN117255694A - 用磷酸二酯酶3b(pde3b)抑制剂治疗肝病的方法 - Google Patents

用磷酸二酯酶3b(pde3b)抑制剂治疗肝病的方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供治疗患有肝病或2型糖尿病的受试者的方法，以及鉴定患肝病或2型糖尿病的风险提高的受试者的方法。

Description

用磷酸二酯酶3B(PDE3B)抑制剂治疗肝病的方法
对序列表的引用
本申请包括以电子方式提交的序列表，其为2022年5月9日创建的名为18923806902SEQ的文本文件，大小为1,057千字节。所述序列表以引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开一般涉及用磷酸二酯酶3B(PDE3B)抑制剂治疗患有肝病的受试者，以及鉴定患肝病的风险提高的受试者的方法。
背景技术
慢性肝病和肝硬化是美国发病率和死亡率的主要原因，并且2014年导致38,170人死亡(占总死亡人数的1.5％)(Kochanek等人,Nat'l.Vital Stat.Rep.,2016,65,1-122)。在美国，最常见的肝硬化病因是酒精性肝病、慢性丙型肝炎和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，在2004年至2013年期间，所述疾病共占等待肝移植的受试者的80％(Wong等人,Gastroenterology,2015,148,547-555)。NAFLD在美国的估计患病率在19％与46％之间(Browning等人,Hepatology,2004,40,1387-1395；Lazo等人,Am.J.Epidemiol.,2013,178,38-45；和Williams等人,Gastroenterology,2011,140,124-131)，并且随着时间的推移而上升(Younossi等人,Clin.Gastroenterol.Hepatol.,2011,9,524-530)，可能与肥胖率增加有关，这是其主要风险因素(Cohen等人,Science,2011,332,1519-1523)。虽然丙型肝炎的治疗取得了重大进展，但目前还没有针对酒精性或非酒精性肝病和肝硬化的循证治疗方法。
2型糖尿病(T2D)的全球流行是一个重大的公共卫生问题，因为此疾病是全球第五大死亡原因，也是导致早发冠心病、中风、周围血管疾病、肾功能衰竭和截肢的主要原因。预计全球糖尿病患者人数将从2011年的3.66亿增加至2030年的5.52亿。
T2D的特征是由于靶组织胰岛素分泌受损和胰岛素抵抗而导致高血糖。T2D典型地在40岁后被诊断出来，并且是由遗传易感性和环境因素共同作用引起的。T2D与肥胖有关，并且也是一种多基因疾病。
磷酸二酯酶3B(PDE3B)是磷酸水解酶家族的成员，可催化腺苷和/或鸟嘌呤3',5'环状单磷酸(cAMP和/或cGMP)中的3'环状磷酸键水解，从而形成各自的核苷5'单磷酸。环核苷酸cAMP和cGMP在许多细胞信号传导途径中充当第二信使。PDE以及合成环核苷酸的鸟苷酸环化酶和腺苷酸环化酶是调节环核苷酸浓度，并因此调节信号转导途径的细胞组分。特别地，PDE通过控制第二信使的降解来调节所述第二信使。
发明内容
本公开提供了治疗患有肝病，或有患肝病的风险，或有患肝病的风险因素，或有患肝病并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有脂肪肝病，或有患脂肪肝病的风险，或有患脂肪肝病的风险因素，或有患脂肪肝病并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有肝细胞癌，或有患肝细胞癌的风险，或有患肝细胞癌的风险因素，或有患肝细胞癌并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有肝硬化，或有患肝硬化的风险，或有患肝硬化的风险因素，或有患肝硬化并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B。
本公开还提供了治疗患有肝纤维化，或有患肝纤维化的风险，或有患肝纤维化的风险因素，或有患肝纤维化并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，或有患单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH的风险，或有患单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH的风险因素，或有患单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有肝损伤，或有患肝损伤的风险，或有患肝损伤的风险因素，或有患肝损伤并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有2型糖尿病，或有患2型糖尿病的风险，或有患2型糖尿病的风险因素，或有患2型糖尿病并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂治疗受试者的方法，其中受试者罹患肝病或2型糖尿病，所述方法包括以下步骤：通过以下方式确定受试者是否具有编码人PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子：获得或已经获得来自受试者的生物样品；并且对生物样品进行或已经进行序列分析以确定受试者是否具有包含PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的基因型；当受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈杂合时，则以等于或小于标准剂量的量向受试者施用或继续施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，并且向受试者施用PDE3B抑制剂；并且当受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈纯合时，则以等于或小于标准剂量的量向受试者施用或继续施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂；并且当受试者是PDE3B参考时，则以大于标准剂量的量向受试者施用或继续施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，并且向受试者施用PDE3B抑制剂；其中具有编码人PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的基因型的存在指示受试者患肝病或2型糖尿病的风险降低。
本公开还提供了鉴定患肝病或2型糖尿病的风险提高的受试者的方法，其中所述方法包括：确定或已经确定从受试者获得的生物样品中编码人PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的存在或不存在；其中：当受试者是PDE3B参考时，则受试者患肝病或2型糖尿病的风险提高；并且当受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合或纯合时，则受试者患肝病或2型糖尿病的风险降低。
本公开还提供了治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，用于治疗作为PDE3B参考(以大于标准剂量的量)或具有以下各者的受试者的肝病或2型糖尿病：编码PDE3B多肽的磷酸二酯酶3B(PDE3B)预测功能丧失或错义变体基因组核酸分子；编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体mRNA分子；或编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体cDNA分子(以小于或等于标准剂量的量)。
本公开还提供了治疗或抑制肝病或2型糖尿病的PDE3B抑制剂，用于治疗作为PDE3B参考或对以下各者呈杂合的受试者的肝病或2型糖尿病：编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体基因组核酸分子；编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体mRNA分子；或编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体cDNA分子。
具体实施方式
在整个说明书和权利要求书中使用与本公开的多个方面相关的各种术语。除非另有说明，否则此类术语将被赋予其在本领域中的普通含义。其它特定定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式来解释。
除非另外明确说明，否则决不意图将本文陈述的任何方法或方面解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，在权利要求书或说明书中，当方法权利要求没有确切地说明步骤是限于特定顺序时，在任何方面决非意图推断顺序。这适用于任何可能的非表达解释基础，包括相对于步骤排列或操作流程的逻辑事项、从语法组织或标点中得到的普通含义或者在说明书中描述的方面的编号或类型。
除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。
如本文所用，术语“约”表示所列举的数值是近似值，并且小的变化不会显著影响公开的实施方案的实践。在使用数值的情况下，除非上下文另外指明，否则术语“约”意指数值可变化±10％并且仍在所公开的实施方案的范围内。
如本文所用，根据需要，在特定实施方案中，术语“包含”可替换为“由……组成”或“基本上由……组成”。
如本文所用，关于核酸分子或多肽的术语“分离的”意指核酸分子或多肽处于不同于其天然环境的条件下，例如远离血液和/或动物组织。在一些实施方案中，分离的核酸分子或多肽基本上不含其它核酸分子或其它多肽，特别是动物来源的其它核酸分子或多肽。在一些实施方案中，核酸分子或多肽可呈高度纯化的形式，即大于95％纯或大于99％纯。当在此上下文中使用时，术语“分离的”不排除存在呈替代物理形式，例如二聚体或可替代地磷酸化或衍生化形式的相同核酸分子或多肽。
如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”可包括任何长度的核苷酸的聚合物形式，可包括DNA和/或RNA，并且可以是单链的、双链的或多链的。核酸的一条链还指其互补物。
如本文所用，术语“受试者”包括任何动物，包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物(例如马、牛、猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室动物(例如小鼠、大鼠、兔)和非人灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，人是在医生护理下的患者。
根据本公开已经观察到PDE3B中的功能丧失变体(无论这些变体在特定受试者中是纯合的还是杂合的)与患肝病或2型糖尿病的风险降低相关。据信，在全基因组或全外显子组关联研究中，PDE3B基因或蛋白质的功能丧失变提与肝病或2型糖尿病无关。因此，可用PDE3B抑制剂治疗作为PDE3B参考或对PDE3B变体核酸分子呈杂合的受试者，从而抑制肝病或2型糖尿病、减轻其症状和/或抑制症状的发展。还据信，患有肝病或2型糖尿病的此类受试者可进一步用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂进行治疗。
出于本公开的目的，任何特定受试者，例如人类可被分类为具有三种PDE3B基因型之一：i)PDE3B参考；ii)对预测功能丧失或错义变体PDE3B核酸分子呈杂合；或iii)对预测功能丧失或错义变体PDE3B核酸分子呈纯合。当受试者不具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的拷贝时，受试者是PDE3B参考。当受试者具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的单拷贝时，受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合。PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子是编码具有部分功能丧失、完全功能丧失、预测部分功能丧失或预测完全功能丧失的变体PDE3B多肽的任何核酸分子(例如基因组核酸分子、mRNA分子或cDNA分子)。具有有部分功能丧失(或预测部分功能丧失)的PDE3B多肽的受试者是PDE3B亚等位基因的。当受试者具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的两个拷贝(相同或不同)时，受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈纯合。
对于基因分型或确定为PDE3B参考的受试者，此类受试者患2型糖尿病或肝病(例如肝损伤、肝硬化、肝纤维化、脂肪变性、脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝脏炎症和/或脂肪肝病)的风险提高。对于基因分型或确定为PDE3B参考或对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合的受试者，可用PDE3B抑制剂治疗此类受试者或受试者。
在本文所述的任何实施方案中，PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子可以是编码具有部分功能丧失、完全功能丧失、预测部分功能丧失或预测完全功能丧失的PDE3B变体多肽的任何核酸分子(例如基因组核酸分子、mRNA分子或cDNA分子)。在一些实施方案中，PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子与相比于参考PDE3B，对PDE3B配体的体外反应降低相关。在一些实施方案中，PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子是导致或预计导致与人参考基因组序列相比PDE3B多肽过早截短的PDE3B变体。在一些实施方案中，PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子是通过体外预测算法例如Polyphen、SIFT或类似算法预测为具有破坏性的变体。在一些实施方案中，PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子是引起或预计引起PDE3B中的非同义氨基酸取代的变体，并且其等位基因频率小于从中选择受试者的群体中的等位基因的1/100。在一些实施方案中，PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子是任何罕见错义变体(等位基因频率<0.1％；或1,000个等位基因中有1个)，或任何剪接位点、终止获得、起始丧失、中止丧失、移码或框内插入缺失，或其它移码PDE3B变体。
在本文所述的任何实施方案中，PDE3B预测功能丧失多肽可以是具有部分功能丧失、完全功能丧失、预测部分功能丧失或预测完全功能丧失的任何PDE3B多肽。
在本文所述的任何实施方案中，编码蛋白质序列变异的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子可包括使用PDE3B参考基因组核酸分子的核苷酸序列(SEQ ID NO:1；GRCh38/hg38人类基因组组装中的ENSG00000152270.9chr11：14,643,804-14,872,044)作为参考序列的11号染色体位置处的变异。
PDE3B中存在许多遗传变体，所述变体引起PDE3B多肽序列的后续变化，包括但不限于表1中列出的那些。
表1：PDE3B遗传变体(GRCh38/hg38人类基因组组装)
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PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子中的任何一者或多者(即，任何组合)可用于本文所述的任何方法中以确定受试者患肝病或2型糖尿病的风险是否提高。特定变体的组合可形成掩模或负荷基因型，用于对PDE3B与患肝病或2型糖尿病的风险的特定相关性进行统计分析。
在本文所述的任何实施方案中，肝病是实质性肝病、肝损伤、肝细胞癌、肝硬化、肝纤维化、单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝脏炎症和/或脂肪肝病(例如酒精性脂肪肝病(AFLD)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD))。在一些实施方案中，肝病是实质性肝病。在一些实施方案中，肝病是肝损伤。在一些实施方案中，肝病是肝细胞癌。在一些实施方案中，肝病是肝硬化。在一些实施方案中，肝病是肝纤维化。在一些实施方案中，肝病是单纯性脂肪变性。在一些实施方案中，肝病是脂肪性肝炎。在一些实施方案中，肝病是NASH。在一些实施方案中，肝病是肝脏炎症。在一些实施方案中，肝病是脂肪肝病。在一些实施方案中，肝病是AFLD。在一些实施方案中，肝病是NAFLD。
肝病的症状包括但不限于肝脏肿大、疲劳、右上腹部疼痛、腹部肿胀(腹水)、皮肤表面下的血管增大、男性乳房增大、脾脏肿大、手掌发红、皮肤和眼睛发黄(黄疸)、瘙痒、尿色深、粪便颜色苍白、恶心或呕吐、食欲不振以及容易瘀伤。肝病检测可包括血液检测、肝脏成像和肝脏活组织检查。如果受试者具有至少一个已知的风险因素(例如遗传因素，如致病突变)，使得具有所述风险因素的个体患肝病的风险相比于没有所述风险因素的个体统计显著更高，则所述个体患肝病的风险提高。肝病的风险因素也是众所周知的，并且包括例如过量饮酒、肥胖、高胆固醇、血液中甘油三酯水平高、多囊卵巢综合征、睡眠呼吸暂停、2型糖尿病、甲状腺功能低下(甲状腺功能减退症)、垂体功能低下(垂体功能减退症)和代谢综合征，包括血脂升高。
糖尿病的症状包括但不限于排尿增多、持续口渴、体重减轻、持续饥饿、视力模糊、手脚麻木、慢性疲劳、皮肤干燥、溃疡愈合缓慢、对感染的易感性增加、恶心、呕吐或胃痛。如果受试者具有至少一种已知的风险因素，则受试者患糖尿病的风险提高，使得具有所述风险因素的个体患糖尿病的风险在统计学上显著高于不具有所述风险因素的个体。糖尿病的风险因素包括例如家族史、年龄、前驱糖尿病的存在、体重过重和久坐的生活方式。
本公开提供了治疗患有肝病，或有患肝病的风险，或有患肝病的风险因素，或有患肝病并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有脂肪肝病，或有患脂肪肝病的风险，或有患脂肪肝病的风险因素，或有患脂肪肝病并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有肝细胞癌，或有患肝细胞癌的风险，或有患肝细胞癌的风险因素，或有患肝细胞癌并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有肝硬化，或有患肝硬化的风险，或有患肝硬化的风险因素，或有患肝硬化并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B。
本公开还提供了治疗患有肝纤维化，或有患肝纤维化的风险，或有患肝纤维化的风险因素，或有患肝纤维化并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH，或有患单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH的风险，或有患单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH的风险因素，或有患单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有肝损伤，或有患肝损伤的风险，或有患肝损伤的风险因素，或有患肝损伤并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本公开还提供了治疗患有2型糖尿病，或有患2型糖尿病的风险，或有患2型糖尿病的风险因素，或有患2型糖尿病并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用PDE3B抑制剂。
本文描述的实施方案可应用于患有本文描述的任何适应症，或有患本文描述的任何适应症的风险，或有患本文描述的任何适应症的风险因素，或有患本文描述的任何适应症的并发症的风险的任何受试者。
在一些实施方案中，PDE3B抑制剂包含抑制性核酸分子。抑制性核酸分子的实例包括但不限于反义核酸分子、小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。此类抑制性核酸分子可设计成靶向PDE3B mRNA的任何区域。在一些实施方案中，反义RNA、siRNA或shRNA与PDE3B基因组核酸分子或mRNA分子内的序列杂交并降低受试者细胞中PDE3B多肽的表达。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂包含与PDE3B基因组核酸分子或mRNA分子杂交并降低受试者细胞中PDE3B多肽的表达的反义RNA。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂包含与PDE3B基因组核酸分子或mRNA分子杂交并降低受试者细胞中PDE3B多肽的表达的siRNA。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂包含与PDE3B基因组核酸分子或mRNA分子杂交并降低受试者细胞中PDE3B多肽表达的shRNA。
在一些实施方案中，反义核酸分子包含由SEQ ID NO:35-864表示的任何核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，siRNA分子包含由SEQ ID NO:865-3210表示的任何核苷酸序列(有义链和反义链)或由其组成(例如，有义链是例如SEQ ID NO:865并且对应的反义链是SEQ ID NO:866；有义链是例如SEQ ID NO:867并且对应的反义链是SEQ ID NO:868；有义链是例如SEQ ID NO:3209并且对应的反义链是SEQ ID NO:3210；等等)。
本文公开的抑制性核酸分子可包含RNA、DNA或RNA和DNA两者。抑制性核酸分子还可连接或融合至异源核酸序列，例如在载体中，或异源标记。例如，本文公开的抑制性核酸分子可位于载体内或作为包含抑制性核酸分子和异源核酸序列的外源供体序列。抑制性核酸分子还可连接或融合至异源标记。标记可以是直接可检测的(例如荧光团)或间接可检测的(例如半抗原、酶或荧光团猝灭剂)。此类标记可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段来检测。此类标记包括例如放射性标记、颜料、染料、色原、自旋标记和荧光标记。标记还可以是例如化学发光物质；含金属物质；或酶，其中发生酶依赖性二次信号产生。术语“标记”还可指可选择性地结合至缀合分子的“标签”或半抗原，使得当随后与底物一起添加时，缀合分子用于产生可检测信号。例如，生物素可与辣根过氧化物(HRP)的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合物一起用作标签以结合至标签上，并使用量热底物(例如四甲基联苯胺(TMB))或荧光底物进行检查以检测HRP的存在。可用作标签以促进纯化的示例性标记包括但不限于myc、HA、FLAG或3XFLAG、6XHis或多组氨酸、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白、表位标签或免疫球蛋白的Fc部分。许多标记包括例如颗粒、荧光团、半抗原、酶和其量热、荧光和化学发光底物以及其它标记。
所公开的抑制性核酸分子可包含例如核苷酸或非天然或修饰的核苷酸，例如核苷酸类似物或核苷酸替代物。此类核苷酸包括含有修饰的碱基、糖或磷酸基团的核苷酸，或在其结构中掺入非天然部分的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于双脱氧核苷酸、生物素化、胺化、脱氨基、烷基化、苄化和荧光团标记的核苷酸。
本文公开的抑制性核酸分子还可包含一种或多种核苷酸类似物或取代。核苷酸类似物是含有对碱基、糖或磷酸部分的修饰的核苷酸。对碱基部分的修饰包括但不限于以下各者的天然和合成修饰：A、C、G和T/U，以及不同的嘌呤或嘧啶碱基，例如假尿苷、尿嘧啶-5-基、次黄质-9-基(I)和2-氨基腺嘌呤-9-基。修饰的碱基包括但不限于：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基和腺嘌呤和鸟嘌呤的其它烷基衍生物、2-丙基和腺嘌呤和鸟嘌呤的其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(例如5-溴)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、7-去氮杂腺嘌呤、3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。
核苷酸类似物还可包括糖部分的修饰。对糖部分的修饰包括但不限于核糖和脱氧核糖的天然修饰以及合成修饰。糖修饰包括但不限于2'位的以下修饰：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-10烷基或C2-10烯基和C2-10炔基。示例性2’糖修饰还包括但不限于-O[(CH2)nO]mCH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)n-ONH2和-O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m独立地为1至约10。2’位置处的其它修饰包括但不限于不限于C1-10烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药物动力学特性的基团、或用于改善寡核苷酸的药效学特性的基团、以及其它具有相似特性的取代基。类似的修饰也可在糖上的其它位置进行，特别是3’末端核苷酸或2’-5’连接的寡核苷酸上的糖的3’位置以及5’末端核苷酸的5'位置。修饰的糖还可包括在桥接环氧处含有修饰的那些，例如CH2和S。核苷酸糖类似物还可具有糖模拟物，例如环丁基部分代替呋喃戊糖。
核苷酸类似物还可在磷酸部分处进行修饰。修饰的磷酸部分包括但不限于可经修饰以使得两个核苷酸之间的键含有以下的修饰的磷酸部分：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。两个核苷酸之间的这些磷酸酯或修饰的磷酸酯键联可通过3'-5'键联或2'-5'键联，并且所述键联可含有反转的极性诸如3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'。还包括各种盐、混合盐以及游离酸形式。核苷酸替代物还包括肽核酸(PNA)。
在一些实施方案中，反义核酸分子是间隔体(gapmer)，其中5’和3’端的前1至7个核苷酸各自具有2’-甲氧基乙基(2’-MOE)修饰。在一些实施方案中，5’和3’端的前五个核苷酸各自具有2’-MOE修饰。在一些实施方案中，5’和3’端的前1至7个核苷酸是RNA核苷酸。在一些实施方案中，5’和3’端的前五个核苷酸是RNA核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸之间的每个主链键联是硫代磷酸酯键联。
在一些实施方案中，siRNA分子具有末端修饰。在一些实施方案中，反义链的5’端被磷酸化。在一些实施方案中，使用不能水解的5’-磷酸类似物，例如5’-(E)-乙烯基-膦酸酯。
在一些实施方案中，siRNA分子具有主链修饰。在一些实施方案中，连接连续核糖核苷的修饰的磷酸二酯基团已显示增强siRNA的稳定性和体内生物可用性。磷酸二酯键联的非酯基团(-OH、＝O)可被硫、硼或乙酸酯取代，得到硫代磷酸酯、硼磷酸酯和膦酰乙酸酯键联。此外，用磷酸三酯取代磷酸二酯基团可促进siRNA的细胞摄取并通过消除其负电荷而保留在血清成分上。在一些实施方案中，siRNA分子具有糖修饰。在一些实施方案中，糖被去质子化(由核酸外切酶和核酸内切酶催化的反应)，由此2’-羟基可充当亲核体并攻击磷酸二酯键中的相邻磷。此类替代物包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-氟修饰。
在一些实施方案中，siRNA分子具有碱基修饰。在一些实施方案中，碱基可被修饰的碱基例如假尿苷、5′-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、肌苷和N7-甲基鸟苷取代。
在一些实施方案中，siRNA分子缀合至脂质。脂质可与siRNA的5’或3’末端缀合，通过允许其与血清脂蛋白结合来提高其体内生物可用性。代表性脂质包括但不限于胆固醇和维生素E，以及脂肪酸，例如棕榈酸酯和生育酚。
在一些实施方案中，代表性siRNA具有下式：
有义：mN*mN*/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/*mN*/32FN/
反义：/52FN/*/i2FN/*mN/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/mN/i2FN/mN*N*N
其中：“N”是碱基；“2F”是2’-F修饰；“m”是2’-O-甲基修饰，“I”是内部碱基；并且“*”是硫代磷酸酯主链键联。
本公开还提供包含本文公开的任何一种或多种抑制性核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体包含本文公开的任何一种或多种抑制性核酸分子和异源核酸。载体可以是能够转运核酸分子的病毒或非病毒载体。在一些实施方案中，载体是质粒或粘粒(例如，其中可连接区段DNA区段的环状双链DNA)。在一些实施方案中，载体是病毒载体，其中额外DNA区段可连接至病毒基因组中。表达载体包括但不限于质粒、粘粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒例如花椰菜花叶病毒和烟草花叶病毒、酵母人工染色体(YAC)、Epstein-Barr(EBV)衍生的附加体以及本领域已知的其它表达载体。
本公开还提供包含本文公开的任何一种或多种抑制性核酸分子的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。在一些实施方案中，组合物包含载剂和/或赋形剂。载剂的实例包括但不限于聚(乳酸)(PLA)微球、聚(D,L-乳酸-共乙醇酸)(PLGA)微球、脂质体、胶束、反胶束、脂质螺旋物和脂质微管。载剂可包括缓冲盐溶液，例如PBS、HBSS等。
在一些实施方案中，PDE3B抑制剂描述于例如PCT公开案第WO 2002/070469号、美国专利申请公开案第2020/0247783号中。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂选自OPC3911、IBMX、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、二氢哒嗪酮、氨力农(amrinone)、依诺昔酮(enoximone)、西洛酰胺(cilostamide)、米力农(milrinone)、西洛他唑(cilostazol)和左西孟旦(levosimendan)。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂是OPC3911。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂是IBMX。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂是3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂是二氢哒嗪酮。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂是氨力农。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂是依诺昔酮。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂是西洛酰胺。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂是米力农。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂是西洛他唑。在一些实施方案中，PDE3B抑制剂是左西孟旦。
在一些实施方案中，PDE3B抑制剂包含核酸酶剂或DNA结合蛋白，所述核酸酶剂在识别序列处诱导一个或多个切口或双链断裂，所述DNA结合蛋白与PDE3B基因组核酸分子内的识别序列结合。识别序列可位于PDE3B基因的编码区内，或位于影响基因表达的调控区内。DNA结合蛋白或核酸酶剂的识别序列可位于内含子、外显子、启动子、增强子、调控区或任何非蛋白质编码区中。识别序列可包括或接近PDE3B基因的起始密码子。例如，识别序列可位于距起始密码子约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约400、约500或约1,000个核苷酸处。作为另一实例，可使用两种或更多种核酸酶剂，每种核酸酶剂均靶向包括或接近起始密码子的核酸酶识别序列。作为另一实例，可使用两种核酸酶剂，一种靶向包括或接近起始密码子的核酸酶识别序列，并且一种靶向包括或接近终止密码子的核酸酶识别序列，其中核酸酶剂的切割可导致两个核酸酶识别序列之间的编码区的缺失。可在所需识别序列中诱导切口或双链断裂的任何核酸酶剂均可用于本文公开的方法和组合物中。结合所需识别序列的任何DNA结合蛋白均可用于本文公开的方法和组合物中。
用于本文的合适的核酸酶剂和DNA结合蛋白包括但不限于锌指蛋白或锌指核酸酶(ZFN)对、转录激活因子样效应物(TALE)蛋白或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，或成簇规则散布的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统。识别序列的长度可变化，并且包括例如对于锌指蛋白或ZFN对为约30-36bp、对于每个ZFN为约15-18bp、对于TALE蛋白或TALEN为约36bp并且对于CRISPR/Cas指导RNA为约20bp的识别序列。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统可用于修饰细胞内的PDE3B基因组核酸分子。本文公开的方法和组合物可通过利用CRISPR复合物(包含与Cas蛋白复合的指导RNA(gRNA))采用CRISPR-Cas系统用于PDE3B核酸分子的定点裂解。
Cas蛋白通常包含至少一个可与gRNA相互作用的RNA识别或结合域。Cas蛋白还可包含核酸酶域(例如DNA酶或RNA酶域)、DNA结合域、解旋酶域、蛋白质-蛋白质相互作用域、二聚化域和其它域。合适的Cas蛋白包括例如野生型Cas9蛋白和野生型Cpf1蛋白(例如FnCpf1)。Cas蛋白可具有完全切割活性以在PDE3B基因组核酸分子中产生双链断裂，或者它可以是在PDE3B基因组核酸分子中产生单链断裂的切口酶。Cas蛋白的另外的实例包括但不限于Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csn1或Csx12)、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966，以及它们的同源物或修饰型式。Cas蛋白也可以可操作地连接至异源多肽为融合蛋白。例如，Cas蛋白可与切割域、表观遗传修饰域、转录激活域或转录抑制域融合。Cas蛋白可以任何形式提供。例如，Cas蛋白可以蛋白质，例如与gRNA复合的Cas蛋白的形式提供。替代地，Cas蛋白可以编码Cas蛋白的核酸分子，例如RNA或DNA的形式提供。
在一些实施方案中，可通过使细胞与Cas蛋白和一种或多种gRNA接触来产生PDE3B基因组核酸分子的靶向遗传修饰，所述gRNA与在PDE3B基因组核酸分子中的靶基因组基因座内的一种或多种gRNA识别序列杂交。例如，gRNA识别序列可位于SEQ ID NO:1的区域内。所述gRNA识别序列可包括或接近PDE3B基因组核酸分子的起始密码子或PDE3B基因组核酸分子的终止密码子。例如，gRNA识别序列可位于距起始密码子或终止密码子约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约400、约500或约1,000个核苷酸处。
PDE3B基因组核酸分子中靶基因组基因座内的gRNA识别序列位于原型间隔区邻近基序(PAM)序列附近，PAM序列是紧随Cas9核酸酶靶向的DNA序列之后的2-6个碱基对的DNA序列。规范的PAM是序列5'-NGG-3'，其中“N”是任何核碱基，接着是两个鸟嘌呤(“G”)核碱基。gRNA可将Cas9转运至基因组中的任何位置用于基因编辑，但在除了Cas9识别PAM的位点之外的任何位点都不会发生编辑。另外，5'-NGA-3'可作为人体细胞的高效非经典PAM。一般地，PAM在gRNA靶向的DNA序列下游约2-6个核苷酸处。PAM可侧接gRNA识别序列。在一些实施方案中，gRNA识别序列可在3’端被PAM侧接。在一些实施方案中，gRNA识别序列可在5’端被PAM侧接。例如，Cas蛋白的切割位点可在PAM序列上游或下游约1个至约10个、约2个至约5个碱基对，或3个碱基对处。在一些实施方案中(例如当使用来自酿脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9或密切相关的Cas9时)，非互补链的PAM序列可以是5’-NGG-3’，其中N是任何DNA核苷酸并且紧邻靶DNA的非互补链的gRNA识别序列的3’。因而，互补链的PAM序列将是5’-CCN-3’，其中N是任何DNA核苷酸并紧邻靶DNA的互补链的gRNA识别序列的5’。
gRNA是与Cas蛋白结合并将Cas蛋白靶向PDE3B基因组核酸分子内的特定位置的RNA分子。示例性gRNA是有效指导Cas酶结合于或切割PDE3B基因组核酸分子的gRNA，其中所述gRNA包含DNA靶向区段，其与PDE3B基因组核酸分子内的gRNA识别序列杂交。示例性gRNA包含DNA靶向区段，其与PDE3B基因组核酸分子内存在的gRNA识别序列杂交，所述gRNA识别序列包含或接近起始密码子或终止密码子。例如，可选择gRNA以使其与位于距起始密码子约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约100、约200、约300、约400、约500或约1,000个核苷酸处或位于距终止密码子约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约100、约200、约300、约400、约500或约1,000个核苷酸处的gRNA识别序列杂交。合适的gRNA可包含约17至约25个核苷酸、约17至约23个核苷酸、约18至约22个核苷酸或约19至约21个核苷酸。在一些实施方案中，gRNA可包含20个核苷酸。
位于人PDE3B参考基因内的合适的gRNA识别序列的示例在表2中作为SEQ ID NO:26-34列出。
表2：PDE3B变异附近的指导RNA识别序列
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Cas蛋白和gRNA形成复合物，并且Cas蛋白切割靶PDE3B基因组核酸分子。Cas蛋白可在gRNA的DNA靶向区段将与之结合的靶PDE3B基因组核酸分子中存在的核酸序列内或外的位点处切割核酸分子。例如，CRISPR复合物(包含与gRNA识别序列杂交并与Cas蛋白复合的gRNA)的形成可导致在gRNA的DNA靶向区段将结合的PDE3B基因组核酸分子中存在的核酸序列中或附近(例如来自所述核酸序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、50个或更多个碱基对内)的一条或两条链的切割。
此类方法可产生例如其中SEQ ID NO:1的区域被破坏、起始密码子被破坏、终止密码子被破坏或编码序列被破坏或缺失的PDE3B基因组核酸分子。任选地，细胞可进一步与一种或多种另外的gRNA接触，所述另外的gRNA与PDE3B基因组核酸分子中靶基因组基因座内另外的gRNA识别序列杂交。通过使所述细胞与一种或多种另外的gRNA(例如与第二gRNA识别序列杂交的第二gRNA)接触，由Cas蛋白切割可产生两个或更多个双链断裂或者两个或更多个单链断裂。
在一些实施方案中，治疗方法还包括检测来自受试者的生物样品中存在或不存在编码人PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子。如本公开通篇所用，“PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子”是编码具有部分功能丧失、完全功能丧失、预测部分功能丧失或预测完全功能丧失的PDE3B多肽的任何PDE3B核酸分子(例如基因组核酸分子、mRNA分子或cDNA分子)。
本公开还提供了用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂治疗受试者的方法，其中所述受试者罹患肝病或2型糖尿病。在一些实施方案中，方法包括通过以下确定受试者是否具有编码人PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子：获得或已经获得来自受试者的生物样品，并且对生物样品进行或已经进行序列分析以确定受试者是否具有包含PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的基因型。当受试者是PDE3B参考时，以大于标准剂量的量向受试者施用或继续施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，并且向受试者施用PDE3B抑制剂。当受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合时，以等于或小于标准剂量的量向受试者施用或继续施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，并且向受试者施用PDE3B抑制剂。具有编码人PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的基因型的存在表明受试者患肝病或2型糖尿病的风险降低。在一些实施方案中，受试者是PDE3B参考。在一些实施方案中，受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈杂合。
对于被基因分型或确定为PDE3B参考或对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合的受试者，可用如本文所述的PDE3B抑制剂治疗此类受试者。
检测来自受试者的生物样品中存在或不存在PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子和/或确定受试者是否具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子可通过本文所述的任何方法进行。在一些实施方案中，这些方法可在体外进行。在一些实施方案中，这些方法可原位进行。在一些实施方案中，这些方法可在体内进行。在这些实施方案中的任一者中，核酸分子可存在于从受试者获得的细胞内。
在一些实施方案中，当受试者是PDE3B参考时，还以大于标准剂量的量向受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。在一些实施方案中，当受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合时，还以等于或小于标准剂量的剂量向受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。
在一些实施方案中，治疗方法还包括检测来自受试者的生物样品中PDE3B预测功能丧失多肽的存在或不存在。在一些实施方案中，当受试者不具有PDE3B预测功能丧失多肽时，还以大于标准剂量的量向受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。在一些实施方案中，当受试者具有PDE3B预测功能丧失多肽时，还以等于或小于标准剂量的剂量向受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。
本公开还提供了用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂治疗受试者的方法，其中所述受试者罹患肝病或2型糖尿病。在一些实施方案中，方法包括通过以下方式确定受试者是否具有PDE3B预测功能丧失多肽：从所述受试者获得或已经获得生物样品，并且对所述生物样品进行或已经进行测定以确定所述受试者是否具有PDE3B预测功能丧失多肽。当受试者不具有PDE3B预测功能丧失多肽时，以大于标准剂量的量向受试者施用或继续施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，并且向受试者施用PDE3B抑制剂。当受试者具有PDE3B预测功能丧失多肽时，以等于或小于标准剂量的量向受试者施用或继续施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，并且向受试者施用PDE3B抑制剂。PDE3B预测功能丧失多肽的存在指示受试者患肝病或2型糖尿病的风险降低。在一些实施方案中，受试者具有PDE3B预测功能丧失多肽。在一些实施方案中，受试者不具有PDE3B预测功能丧失多肽。
检测来自受试者的生物样品中存在或不存在PDE3B预测功能丧失多肽和/或确定受试者是否具有PDE3B预测功能丧失多肽可通过本文所述的任何方法进行。在一些实施方案中，这些方法可在体外进行。在一些实施方案中，这些方法可原位进行。在一些实施方案中，这些方法可在体内进行。在这些实施方案中的任一者中，多肽可存在于从受试者获得的细胞内。
治疗或抑制肝病的治疗剂的实例包括但不限于：双硫仑、纳曲酮、阿坎酸、泼尼松、硫唑嘌呤、青霉胺、曲恩汀、去铁胺、环丙沙星、诺氟沙星、头孢曲松、氧氟沙星、阿莫西林-克拉维酸、植物甲萘醌、布美他尼(bumetanide)、呋塞米、氢氯噻嗪、氯噻嗪、阿米洛利(amiloride)、氨苯蝶啶、螺内酯、奥曲肽、阿替洛尔(atenolol)、美托洛尔(metoprolol)、纳多洛尔(nadolol)、普萘洛尔(propranolol)、噻吗洛尔(timolol)和卡维地洛(carvedilol)，或其任何组合。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是双硫仑。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是纳曲酮。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是阿坎酸。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是泼尼松。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是硫唑嘌呤。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是青霉胺。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是曲恩汀。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是去铁胺。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是环丙沙星。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是诺氟沙星。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是头孢曲松。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是氧氟沙星。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是阿莫西林-克拉维酸。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是植物甲萘醌。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是布美他尼。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是呋塞米。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是氢氯噻嗪。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是氯噻嗪。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是阿米洛利。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是氨苯蝶啶。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是螺内酯。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是奥曲肽。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是阿替洛尔。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是美托洛尔。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是纳多洛尔。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是普萘洛尔。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是噻吗洛尔。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病的治疗剂是卡维地洛。
治疗或抑制2型糖尿病的治疗剂的实例包括但不限于：二甲双胍、胰岛素、磺酰脲类(例如格列本脲(glyburide)、格列吡嗪(glipizide)和格列美脲(glimepiride))、格列奈类(例如瑞格列奈(repaglinide)和那格列奈(nateglinide))、噻唑烷二酮类(例如罗格列酮(rosiglitazone)和吡格列酮(pioglitazone))、DPP-4抑制剂(例如西格列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)和利格列汀(linagliptin))、GLP-1受体激动剂(例如艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)和索马鲁肽(semaglutide))以及SGLT2抑制剂(例如卡格列净(canagliflozin)、达格列净(dapagliflozin)和恩格列净(empagliflozin))。在一些实施方案中，治疗剂是二甲双胍、胰岛素、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、瑞格列奈、那格列奈、罗格列酮、吡格列酮、西他列汀、沙格列汀、利格列汀、艾塞那肽、利拉鲁肽、索马鲁肽、卡格列净、达格列净或恩格列净。在一些实施方案中，治疗剂是二甲双胍。在一些实施方案中，治疗剂是胰岛素。在一些实施方案中，治疗剂是格列本脲。在一些实施方案中，治疗剂是格列吡嗪。在一些实施方案中，治疗剂是格列美脲。在一些实施方案中，治疗剂是瑞格列奈。在一些实施方案中，治疗剂是那格列奈。在一些实施方案中，治疗剂是罗格列酮。在一些实施方案中，治疗剂是吡格列酮。在一些实施方案中，治疗剂是西他列汀。在一些实施方案中，治疗剂是沙格列汀。在一些实施方案中，治疗剂是利格列汀。在一些实施方案中，治疗剂是艾塞那肽。在一些实施方案中，治疗剂是利拉鲁肽。在一些实施方案中，治疗剂是索马鲁肽。在一些实施方案中，治疗剂是卡格列净。在一些实施方案中，治疗剂是达格列净。在一些实施方案中，治疗剂是恩格列净。
治疗或抑制肝硬化的治疗剂的实例包括但不限于：双硫仑、纳曲酮、阿坎酸、皮质类固醇(例如泼尼松和硫唑嘌呤)、抗病毒剂(例如干扰素、蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂)、螯合剂(例如青霉胺、曲恩汀和去铁胺)、利尿剂(例如布美他尼、呋塞米、氢氯噻嗪、氯噻嗪、阿米洛利、氨苯蝶啶和螺内酯)以及β-阻断剂(例如阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、噻吗洛尔和卡维地洛)。在一些实施方案中，治疗或抑制肝硬化的治疗剂是双硫仑。在一些实施方案中，治疗或抑制肝硬化的治疗剂是纳曲酮。在一些实施方案中，治疗或抑制肝硬化的治疗剂是阿坎酸。在一些实施方案中，治疗或抑制肝硬化的治疗剂是皮质类固醇(例如泼尼松和硫唑嘌呤)。在一些实施方案中，治疗或抑制肝硬化的治疗剂是抗病毒剂(例如干扰素、蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂)。在一些实施方案中，治疗或抑制肝硬化的治疗剂是螯合剂(例如青霉胺、曲恩汀和去铁胺)。在一些实施方案中，治疗或抑制肝硬化的治疗剂是利尿剂(例如布美他尼、呋塞米、氢氯噻嗪、氯噻嗪、阿米洛利、氨苯蝶啶和螺内酯)。在一些实施方案中，治疗或抑制肝硬化的治疗剂是β-阻断剂(例如阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、噻吗洛尔和卡维地洛)。
肝病治疗剂(例如用于非酒精性脂肪肝)的其它实例包括但不限于体重减轻诱导剂，例如奥利司他(orlistat)或西布曲明(sibutramine)；胰岛素增敏剂，例如噻唑烷二酮(TZD)、二甲双胍和格列奈类；降脂剂，例如他汀类药物、贝特类药物和ω-3脂肪酸；抗氧化剂，例如维生素E、甜菜碱、N-乙酰半胱氨酸、卵磷脂、水飞蓟素和β-胡萝卜素；抗TNF剂，例如己酮可可碱；益生菌，例如VSL#3；和细胞保护剂，例如熊去氧胆酸(UDCA)；ACE抑制剂/ARB、低聚果糖和肠促胰岛素类似物。在一些实施方案中，用于治疗非酒精性脂肪肝病的治疗剂是体重减轻诱导剂(例如奥利司他或西布曲明)。在一些实施方案中，用于治疗非酒精性脂肪肝病的治疗剂是胰岛素增敏剂(例如噻唑烷二酮类(TZD)、二甲双胍和格列奈类)。在一些实施方案中，用于治疗非酒精性脂肪肝病的治疗剂是降脂剂(例如他汀类药物、贝特类药物和ω-3脂肪酸)。在一些实施方案中，用于治疗非酒精性脂肪肝病的治疗剂是抗氧化剂，例如维生素E、甜菜碱、N-乙酰半胱氨酸、卵磷脂、水飞蓟素和β-胡萝卜素。在一些实施方案中，用于治疗非酒精性脂肪肝病的治疗剂是抗TNF剂(例如己酮可可碱)。在一些实施方案中，用于治疗非酒精性脂肪肝病的治疗剂是益生菌(例如VSL#3)。在一些实施方案中，用于治疗非酒精性脂肪肝病的治疗剂是细胞保护剂(例如熊去氧胆酸(UDCA))。在一些实施方案中，用于治疗非酒精性脂肪肝病的治疗剂是ACE抑制剂/ARB。在一些实施方案中，用于治疗非酒精性脂肪肝病的治疗剂是低聚果糖。在一些实施方案中，用于治疗非酒精性脂肪肝病的治疗剂是肠促胰岛素类似物。
肝病治疗剂(例如用于NASH)的其它实例包括但不限于(奥贝胆酸)、司隆色替(Selonsertib)、艾拉菲诺(Elafibranor)、塞尼维罗(Cenicriviroc)、GR_MD_02、MGL_3196、IMM124E、花生酰氨基胆酸(ARAMCHOLTM)、GS0976、恩利卡生(Emricasan)、伏昔巴特(Volixibat)、NGM282、GS9674、托匹非索(Tropifexor)、MN_001、LMB763、BI_1467335、MSDC_0602、PF_05221304、DF102、沙罗格列扎(Saroglitazar)、BMS986036、拉尼兰诺(Lanifibranor)、索马鲁肽(Semaglutide)、硝唑尼特(Nitazoxanide)、GRI_0621、EYP001、VK2809、纳美芬(Nalmefene)、LIK066、MT_3995、依洛西巴特(Elobixibat)、纳莫德森(Namodenoson)、福雷芦单抗(Foralumab)、SAR425899、索格列净(Sotagliflozin)、EDP_305、艾萨布特(Isosabutate)、吉卡宾(Gemcabene)、TERN_101、KBP_042、PF_06865571、DUR928、PF_06835919、NGM313、BMS_986171、那马珠单抗(Namacizumab)、CER_209、ND_L02_s0201、RTU_1096、DRX_065、IONIS_DGAT2Rx、INT_767、NC_001、Seladepar、PXL770、TERN_201、NV556、AZD2693、SP_1373、VK0214、Hepastem、TGFTX4、RLBN1127、GKT_137831、RYI_018、CB4209-CB4211和JH_0920。
另外，可用减肥手术和/或饮食干预来治疗受试者。
肝病治疗剂(例如，用于慢性丙型肝炎治疗中使用)的另外实例包括但不限于利巴韦林(ribavirin)、帕利普韦(paritaprevir)、OLYSIOTM(西米普韦(simeprevir))、格拉瑞韦(grazoprevir)、雷迪帕韦(ledipasvir)、奥比他韦(ombitasvir)、依巴司韦(elbasvir)、(达卡他韦(daclatasvir))、达拉他韦(dasabuvir)、利托那韦(ritonavir)、索非布韦(sofosbuvir)、维帕他韦(velpatasvir)、伏西瑞韦(voxilaprevir)、格卡瑞韦(glecaprevir)、哌仑他韦(pibrentasvir)、聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b和干扰素α-2b。
在一些实施方案中，与作为PDE3B参考的人类受试者(其可接受大于标准剂量的量)相比，对于对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合的受试者，治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂的剂量可减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％(即，小于标准剂量)。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂的剂量可减少约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。另外，与作为PDE3B参考的受试者相比，对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合的受试者可以较低频率施用。
在一些实施方案中，与对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈杂合的受试者相比，对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈纯合的受试者的治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂的剂量可减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％。在一些实施方案中，治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂的剂量可减少约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。另外，与对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈杂合的受试者相比，对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈纯合的受试者的治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂的剂量可以较低频率施用。
治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂和/或PDE3B抑制剂的施用可在一天、两天、三天、五天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、八周、两个月或三个月后重复。重复施用可为相同剂量或不同剂量。施用可重复一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。例如，根据某些剂量方案，受试者可接受长时间段的疗法，例如6个月、1年或更长时间。
治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂和/或PDE3B抑制剂的施用可通过任何合适的途径进行，包括但不限于肠胃外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌内。用于施用的药物组合物理想地是无菌且基本上等渗的，并且在GMP条件下制造。药物组合物可以单位剂型(即单次施用的剂量)提供。药物组合物可使用一种或多种生理上和药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或助剂来配制。配制物取决于所选的施用途径。术语“药学上可接受的”意指载剂、稀释剂、赋形剂或助剂与配制物的其它成分相容，并且对其接受者基本上无害。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”以及“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”分别是指引发所需生物反应，例如治疗效果和预防效果。在一些实施方案中，在施用所述药剂或包含所述药剂的组合物后，治疗效果包括以下中的一者或多者：肝病的降低/减轻、肝病或2型糖尿病的严重程度的降低/减轻(例如降轻或抑制肝病或2型糖尿病的发展)、症状和肝病相关效应或2型糖尿病相关效应的降低/减轻、延迟症状和肝病相关效应或2型糖尿病相关效应的发作、减轻肝病相关效应或2型糖尿病相关效应的症状的严重程度、减少症状和肝病相关效应或2型糖尿病相关效应的数目、减少症状和肝病相关效应或2型糖尿病相关效应的潜伏期、症状和肝病相关效应或2型糖尿病相关效应的改善、减少继发性症状、减少继发性感染、预防肝病或2型糖尿病复发、降低复发发作的次数或频率、增加症状发作间隔的潜伏期、增加持续进展的时间、加速恢复、或增加替代治疗剂的功效或降低对替代治疗剂的抗性、和/或增加受影响宿主动物的存活时间。预防效果可包括在治疗方案的施用后完全或部分避免/抑制或延迟肝病或2型糖尿病发展/进展(例如完全或部分避免/抑制或延迟)，以及增加受影响宿主动物的存活时间。肝病或2型糖尿病的治疗涵盖治疗已经被诊断为患有处于任何临床阶段或表现的任何形式的肝病或2型糖尿病的受试者，延迟肝病或2型糖尿病的症状或体征的发作或演变或加重或恶化，和/或预防和/或减轻肝病或2型糖尿病的严重程度。
本公开还提供鉴定患肝病或2型糖尿病的风险提高的受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括确定或已经确定在从受试者获得的生物样品中存在或不存在编码人PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子(例如基因组核酸分子、mRNA分子和/或cDNA分子)。当受试者缺少PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子(即，受试者基因型分类为PDE3B参考)时，则受试者患肝病或2型糖尿病的风险提高。当受试者具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子(即，受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合或对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈纯合)时，则受试者患肝病或2型糖尿病的风险降低。在一些实施方案中，可分析肝脏表达数量性状基因座(eQTL)。
与不具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的拷贝相比，具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的单个拷贝更能保护受试者免于患肝病或2型糖尿病。无意受限于任何特定理论或作用机制，认为PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的单个拷贝(即对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合)能够保护受试者免于患肝病或2型糖尿病，并且还认为相对于具有单个拷贝的受试者，具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的两个拷贝(即对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈纯合)更能够保护受试者免于患肝病或2型糖尿病。因此，在一些实施方案中，PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的单个拷贝可能不具完全保护性，而是可能部分或不完全地保护受试者免于患肝病或2型糖尿病。虽然不希望受任何特定理论束缚，但可能存在涉及患肝病或2型糖尿病的其它因子或分子，其仍存在于具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的单个拷贝的受试者中，因此导致对患肝病或2型糖尿病的保护不太完全。
确定受试者在来自受试者的生物样品中是否具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子和/或确定受试者是否具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子可通过本文所述的任何方法进行。在一些实施方案中，这些方法可在体外进行。在一些实施方案中，这些方法可原位进行。在一些实施方案中，这些方法可在体内进行。在这些实施方案中的任一者中，核酸分子可存在于从受试者获得的细胞内。
在一些实施方案中，当受试者被鉴定为患肝病或2型糖尿病的风险提高时，进一步用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂和/或PDE3B抑制剂治疗受试者，如本文所述。例如，当受试者是PDE3B参考并因此患肝病或2型糖尿病的风险提高时，向受试者施用PDE3B抑制剂。在一些实施方案中，还向此类受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。在一些实施方案中，当受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈杂合时，以等于或小于标准剂量的剂量向受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，并且还施用PDE3B抑制剂。在一些实施方案中，还向此类受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。在一些实施方案中，当受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈纯合时，以等于或小于标准剂量的剂量向受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。在一些实施方案中，受试者是PDE3B参考。在一些实施方案中，受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈杂合。在一些实施方案中，受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈纯合。
在一些实施方案中，本文所述的任何方法还可包括确定受试者具有PDE3B预测功能丧失或错义变体基因组核酸分子、mRNA分子或由mRNA分子产生的cDNA分子、和/或与患肝病或2型糖尿病的风险降低相关的PDE3B预测功能丧失变体多肽的总负荷。总负荷是PDE3B基因中所有变体的总和(包括PDE3B基因附近(基因周围最多10Mb)的任何遗传变体，无论其基因组注释如何)，其可在与肝病或2型糖尿病的关联分析中进行。在一些实施方案中，受试者对与患肝病或2型糖尿病的风险降低相关的一种或多种PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈纯合。在一些实施方案中，受试者对与患肝病或2型糖尿病的风险降低相关的一种或多种PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈杂合。关联分析的结果表明，PDE3B预测功能丧失和错义变体与患肝病或2型糖尿病的风险降低相关。当受试者的总负荷较小时，受试者患肝病或2型糖尿病的风险较高，并且以大于标准剂量的量向受试者施用或继续施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。当受试者的总负荷较大时，受试者患肝病或2型糖尿病的风险较低，并且以等于或小于标准剂量的量向受试者施用或继续施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。总负荷越大，患肝病或2型糖尿病的风险就越低。
在一些实施方案中，受试者具有任何一个或多个PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的总负荷代表多个任何PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的加权和。在一些实施方案中，使用至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约100、至少约120、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300，至少约400、至少约500、至少约1,000、至少约10,000、至少约100,000或至少约或超过至少约1,000,000种存在于PDE3B中或周围(至多10Mb)的遗传变体计算总负荷，其中遗传负荷是等位基因的数量乘以每个等位基因与肝病或相关结果的关联估计(例如，加权多基因负荷评分)。这可以包括接近PDE3B基因(所述基因周围至多10Mb)的任何遗传变异，无论其基因组注释如何，所述变异在遗传关联分析中显示出与肝脏相关性状的非零关联。在一些实施方案中，当受试者具有高于所需阈值分数的总负荷时，受试者患肝病或2型糖尿病的风险降低。在一些实施方案中，当受试者具有低于所需阈值分数的总负荷时，受试者患肝病或2型糖尿病的风险提高。
在一些实施方案中，总负荷可分为五分位数，例如最高五分位数、中间五分位数和最低五分位数，其中总负荷的最高五分位数对应于最低风险组，并且总负荷的最低五分位数对应于最高风险组。在一些实施方案中，具有较大总负荷的受试者包括最高加权总负荷，包括但不限于受试者群体的总负荷的前10％、前20％、前30％、前40％或前50％。在一些实施方案中，遗传变体包括在相关性p值范围的前10％、前20％、前30％、前40％或前50％中的与肝病或2型糖尿病相关的遗传变体。在一些实施方案中，每个鉴定的遗传变体包括与肝病或2型糖尿病相关的遗传变体，其p值不大于约10-2、约10-3、约10-4、约10-5、约10-6、约10-7、约10-8、约10-9、约10-10、约10-11、约10-12、约10-13、约10-14或约10-15。在一些实施方案中，鉴定的遗传变体包括p值小于5×10-8的与肝病或2型糖尿病相关的遗传变体。在一些实施方案中，鉴定的遗传变体包括与高风险受试者的肝病相关的遗传变体，与参考群体的剩余部分相比具有以下比值比(OR)：对于分布的前20％为约1.001或更大、约1.01或更大、约1.1或更大、约1.5或更大、约1.75或更大、约2.0或更大、或约2.25或更大；或约1.5或更大、约1.75或更大、约2.0或更大、约2.25或更大、约2.5或更大、或约2.75或更大。在一些实施方案中，比值比(OR)的范围可为约1.001至约1.01、约1.01至约1.1、约1.0至约1.5、约1.5至约2.0、约2.0至约2.5、约2.5至约3.0、约3.0至约3.5、约3.5至约4.0、约4.0至约4.5、约4.5至约5.0、约5.0至约5.5、约5.5至约6.0、约6.0至约6.5、约6.5至约7.0或大于7.0。在一些实施方案中，高风险受试者包括具有参考群体中的最低十分位数、五分位数或三分位数的总负荷的受试者。总负荷的阈值是根据预期实际应用的性质以及将被视为对所述实际应用有意义的风险差异来确定的。
在一些实施方案中，当受试者被鉴定为患肝病或2型糖尿病的风险提高时，受试者进一步如本文所述用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂和/或PDE3B抑制剂治疗。例如，当受试者是PDE3B参考，并因此患肝病的风险提高时，向受试者施用PDE3B抑制剂。在一些实施方案中，还向此类受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。在一些实施方案中，当受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合时，以等于或小于标准剂量的剂量向受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，并且还向其施用PDE3B抑制剂。在一些实施方案中，受试者是PDE3B参考。在一些实施方案中，受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈杂合。此外，当受试者因具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的总负荷较低并因此具有提高的患肝病或2型糖尿病的风险时，以大于标准剂量的量向受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。在一些实施方案中，当受试者因具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的总负荷较低时，以等于或小于向具有PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的总负荷较高的受试者施用的标准剂量的剂量向受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。
本公开还提供了检测来自受试者的生物样品中存在或不存在PDE3B预测功能丧失或错义变体基因组核酸分子，和/或来自受试者的生物样品中存在或不存在PDE3B预测功能丧失或错义变体mRNA分子，和/或来自受试者的生物样品中存在或不存在由mRNA分子产生的PDE3B预测功能丧失或错义变体cDNA分子的方法。应理解，群体内的基因序列和由此类基因编码的mRNA分子可因多态性(例如单核苷酸多态性)而变化。本文提供的PDE3B变体基因组核酸分子、PDE3B变体mRNA分子和PDE3B变体cDNA分子的序列仅是示例性序列。PDE3B变体基因组核酸分子、变体mRNA分子和变体cDNA分子的其它序列也是可能的。
生物样品可来源于来自受试者的任何细胞、组织或生物流体。生物样品可包括任何临床相关组织，诸如骨髓样品、肿瘤活检、细针抽吸物或体液样品，诸如血液、龈沟液、血浆、血清、淋巴液、腹水、囊液或尿液。在一些情况下，样品包括口腔拭子。本文所公开的方法中使用的生物样品可基于测定形式、检测方法的性质以及用作样品的组织、细胞或提取物而变化。生物样品可根据所采用的测定进行不同处理。例如，当检测任何PDE3B变体核酸分子时，可采用被设计为针对基因组DNA来分离或富集生物样品的初步处理。多种技术可用于此目的。当检测任何PDE3B变体mRNA分子的水平时，可采用不同的技术使生物样品富集mRNA分子。可使用检测mRNA分子的存在或水平或特定变体基因组DNA基因座的存在的各种方法。
在一些实施方案中，检测受试者中的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子包括对从受试者获得的生物样品进行序列分析，以确定生物样品中的PDE3B基因组核酸分子和/或生物样品中的PDE3B mRNA分子和/或生物样品中由mRNA分子产生的PDE3B cDNA分子是否包含一种或多种导致功能丧失(部分或完全)或预测会导致功能丧失(部分或完全)的变异。
在一些实施方案中，检测受试者中存在或不存在PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子(例如基因组核酸分子、mRNA分子和/或由mRNA分子产生的cDNA分子)的方法包括对从受试者获得的生物样品进行测定。所述测定确定生物样品中的核酸分子是否包含特定核苷酸序列。
在一些实施方案中，生物样品包含细胞或细胞裂解物。此类方法还可包括例如从受试者获得包含PDE3B基因组核酸分子或mRNA分子的生物样品，并且如果包含mRNA，则任选地将mRNA逆转录成cDNA。此类测定可包括例如确定特定PDE3B核酸分子的这些位置的同一性。在一些实施方案中，所述方法是体外方法。
在一些实施方案中，确定步骤、检测步骤或序列分析包括对生物样品中PDE3B基因组核酸分子、PDE3B mRNA分子或PDE3B cDNA分子的核苷酸序列的至少一部分进行测序，其中测序部分包含导致功能丧失(部分或完全)或预测会导致功能丧失(部分或完全)的一种或多种变异。
在一些实施方案中，测定包括对整个核酸分子进行测序。在一些实施方案中，仅分析PDE3B基因组核酸分子。在一些实施方案中，仅分析PDE3B mRNA。在一些实施方案中，仅分析从PDE3B mRNA获得的PDE3B cDNA。
改变特异性聚合酶链反应技术可用于检测核酸序列中的突变，例如SNP。因为当与模板存在失配时，DNA聚合酶将不延伸，所以可使用改变特异性引物。
在一些实施方案中，样品中的核酸分子是mRNA，并且在扩增步骤之前将所述mRNA逆转录成cDNA。在一些实施方案中，核酸分子存在于从受试者获得的细胞内。
在一些实施方案中，测定包括使生物样品与引物或探针，例如改变特异性引物或改变特异性探针接触，所述引物或探针在严格条件下与PDE3B变体基因组序列、变体mRNA序列或变体cDNA序列特异性杂交，而不与相应的PDE3B参考序列特异性杂交，并且确定是否已经发生杂交。
在一些实施方案中，确定步骤、检测步骤或序列分析包括：a)对编码PDE3B多肽的核酸分子的至少一部分进行扩增；b)用可检测标记来标记扩增的核酸分子；c)使标记的核酸分子与包含改变特异性探针的支持物接触；以及d)检测可检测标记。
在一些实施方案中，测定包括RNA测序(RNA-Seq)。在一些实施方案中，测定还包括例如通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)将mRNA逆转录成cDNA。
在一些实施方案中，所述方法利用足够核苷酸长度的探针和引物与靶核苷酸序列结合，并特异性检测和/或鉴定包含PDE3B变体基因组核酸分子、变体mRNA分子或变体cDNA分子的多核苷酸。杂交条件或反应条件可由操作人员确定以实现此结果。核苷酸长度可为足以用于所选择的检测方法(包括本文描述或例示的任何测定)的任何长度。此类探针和引物可在高严格杂交条件下与靶核苷酸序列特异性杂交。探针和引物可具有与靶核苷酸序列内连续核苷酸的完全核苷酸序列同一性，但可通过常规方法设计不同于靶核苷酸序列并保留特异性检测和/或鉴定靶核苷酸序列的能力的探针。探针和引物可与靶核酸分子的核苷酸序列具有约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性或互补性。
核酸测序技术的说明性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。其它方法涉及除了测序以外的核酸杂交方法，其包括使用针对纯化的DNA、扩增的DNA和固定细胞制品的标记的引物或探针(荧光原位杂交(FISH))。在一些方法中，可在检测之前或在检测的同时对靶核酸分子进行扩增。核酸扩增技术的例示性示例包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增反应(SDA)以及基于核酸序列的扩增反应(NASBA)。其它方法包括但不限于连接酶链反应、链置换扩增反应和嗜热SDA(tSDA)。
在杂交技术中，可采用严格条件，使得探针或引物特异性地与其靶标杂交。在一些实施方案中，在严格条件下的多核苷酸引物或探针将与其靶序列杂交，其程度可检测地比与其它非靶序列的杂交大例如至少2倍、至少3倍、至少4倍或更多倍(相对于背景)，包括大超过10倍(相对于背景)。在一些实施方案中，在严格条件下的多核苷酸引物或探针将与其靶核苷酸序列杂交，其程度可检测地比与其它核苷酸序列的杂交大至少2倍。在一些实施方案中，在严格条件下的多核苷酸引物或探针将与其靶核苷酸序列杂交，其程度可检测地比与其它核苷酸序列的杂交大至少3倍。在一些实施方案中，在严格条件下的多核苷酸引物或探针将与其靶核苷酸序列杂交，其程度可检测地比与其它核苷酸序列的杂交大至少4倍。在一些实施方案中，在严格条件下的多核苷酸引物或探针将与其靶核苷酸序列杂交，其程度可检测地比与其它核苷酸序列的杂交大超过10倍(相对于背景)。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。
促进DNA杂交的适当严格性条件(例如6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，在约45℃下，接着在50℃下进行2X SSC的洗涤)是已知的并且可见于Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。通常，用于杂交和检测的严格条件将是其中如下所述的那些：在pH 7.0至8.3时的盐浓度低于约1.5M Na+离子、通常约0.01至1.0M Na+离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(例如10至50个核苷酸)是至少约30℃，并且对于较长探针(例如大于50个核苷酸)是至少约60℃。还可通过添加例如甲酰胺等去稳定剂来实现严格条件。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％ SDS。杂交的持续时间通常少于约24小时，通常约4至约12小时。洗涤时间将持续至少足以达到平衡的时间长度。
在一些实施方案中，此类分离的核酸分子包含至少约5个、至少约8个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约800个、至少约900个、至少约1000个、至少约2000个、至少约3000个、至少约4000个或至少约5000个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，此类分离的核酸分子包含至少约5个、至少约8个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个或至少约25个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含至少约18个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含至少约15个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含约10个至约35个、约10个至约30个、约10个至约25个、约12个至约30个、约12个至约28个、约12个至约24个、约15个至约30个、约15个至约25个、约18个至约30个、约18个至约25个、约18个至约24个或约18个至约22个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含约18个至约30个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含至少约15个核苷酸至至少约35个核苷酸或由其组成。
在一些实施方案中，此类分离的核酸分子在严格条件下与PDE3B变体核酸分子(例如基因组核酸分子、mRNA分子和/或cDNA分子)杂交。此类核酸分子例如可用作本文所描述或例示的探针、引物、改变特异性探针或改变特异性引物，并且包括但不限于引物、探针、反义RNA、shRNA和siRNA，其中每一者都在本文他处被更详细地描述，并且可在本文所述的任何方法中使用。
在一些实施方案中，分离的核酸分子与核酸分子的至少约15个连续核苷酸杂交，所述核酸分子与PDE3B变体基因组核酸分子、PDE3B变体mRNA分子和/或PDE3B变体cDNA分子至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含约15个至约100个核苷酸或约15个至约35个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含约15个至约100个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含约15个至约35个核苷酸或由其组成。
在一些实施方案中，改变特异性探针和改变特异性引物包含DNA。在一些实施方案中，改变特异性探针和改变特异性引物包含RNA。
在一些实施方案中，本文所述的探针和引物(包括改变特异性探针和改变特异性引物)具有与本文公开的任何核酸分子特异性杂交的核苷酸序列，或其互补序列。在一些实施方案中，所述探针和引物在严格条件下与本文公开的核酸分子中的任一者特异性杂交。
在一些实施方案中，引物(包括改变特异性引物)可用于第二代测序或高通量测序中。在一些情况下，可修饰引物，包括改变特异性引物。特别地，引物可包含在例如大规模平行签名测序(MPSS)、聚合酶克隆测序(Polony sequencing)和454焦磷酸测序的不同步骤中使用的各种修饰。在所述过程的几个步骤中可使用修饰的引物，包括在克隆步骤中使用生物素酰化的引物，并且在珠粒装载步骤和检测步骤中使用荧光标记的引物。通常使用双端测序标签文库进行聚合酶克隆测序，其中每个DNA模板分子的长度约为135bp。在珠粒装载步骤和乳液PCR中使用生物素酰化的引物。在检测步骤中使用荧光标记的简并九聚物寡核苷酸。衔接子可含有用于将DNA文库固定至链酶亲和素包被的珠粒上的5’-生物素标签。
本文所述的探针和引物可用于检测本文公开的PDE3B变体基因组核酸分子、PDE3B变体mRNA分子和/或PDE3B变体cDNA分子中的任一者内的核苷酸变异。本文所述的引物可用于扩增PDE3B变体基因组核酸分子、PDE3B变体mRNA分子或PDE3B变体cDNA分子或其片段。
在本公开的上下文中，“特异性杂交”意指探针或引物(例如改变特异性探针或改变特异性引物)不与编码PDE3B参考基因组核酸分子、PDE3B参考mRNA分子和/或PDE3B参考cDNA分子的核酸序列杂交。
在一些实施方案中，探针(例如改变特异性探针)包含标记。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记、放射性标记或生物素。
本公开还提供包含本文所公开的探针中的任一者或多者所附接的底物的支持物。固体支持物是固态基底或支持物，例如本文公开的任何探针的分子可与之结合。固体支持物的一种形式是阵列。固体支持物的另一种形式是阵列检测物。阵列检测物是多种不同的探针以阵列、网格或其它组织化模式与其偶联的固体支持物。固态基底的一种形式是微量滴定皿，例如标准96孔类型。在一些实施方案中，可采用通常每孔含有一个阵列的多孔玻璃载片。
PDE3B参考基因组核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(ENSG00000152270.9，包含GRCh38/hg38人类基因组装配中的chr11:14,643,804-14,872,044)。
PDE3B参考mRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。另一种PDE3B参考mRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。另一种PDE3B参考mRNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。PDE3B参考mRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。另一种PDE3B参考mRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。另一种PDE3B参考mRNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示。PDE3B参考mRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。另一种PDE3B参考mRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。另一种PDE3B参考mRNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示。另一种PDE3B参考mRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
PDE3B参考cDNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。另一种PDE3B参考cDNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。另一种PDE3B参考cDNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:14所示。PDE3B参考cDNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。另一种PDE3B参考cDNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。另一种PDE3B参考cDNA分子的核苷酸序列如SEQID NO:17所示。另一种PDE3B参考cDNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。另一种PDE3B参考cDNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。PDE3B参考cDNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。另一种PDE3B参考cDNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
PDE3B参考多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。参考SEQ ID NO:22，PDE3B参考多肽的长度为1,112个氨基酸。PDE3B参考多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。参考SEQ ID NO:23，PDE3B参考多肽的长度为1,061个氨基酸。PDE3B参考多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。参考SEQ ID NO:24，PDE3B参考多肽的长度为1,190个氨基酸。PDE3B参考多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。参考SEQ ID NO:25，PDE3B参考多肽的长度为298个氨基酸。
基因组核酸分子、mRNA分子和cDNA分子可来自任何生物体。例如，所述基因组核酸分子、mRNA分子和cDNA分子可以是人的或来自另一生物体(例如非人哺乳动物、啮齿动物、小鼠或大鼠)的直向同源物。应理解，群体内的基因序列可因多态性(例如单核苷酸多态性)而变化。本文提供的实例仅为示例性序列。其它序列也是可能的。
本文还提供了可与所公开的核酸分子相互作用的功能性多核苷酸。功能性多核苷酸的实例包括但不限于反义分子、适体、核酶、三链体形成分子以及外部指导序列。功能性多核苷酸可以充当靶分子所具有的特定活性的影响剂、抑制剂、调节剂和刺激剂，或者功能性多核苷酸可具有独立于任何其它分子的全新活性。
本文公开的分离的核酸分子可包括RNA、DNA或RNA和DNA两者。所述分离的核酸分子还可连接或融合至异源核酸序列(例如在载体中)或异源标记。例如，本文所公开的分离的核酸分子可在载体中或作为包含分离的核酸分子和异源核酸序列的外源供体序列。分离的核酸分子还可与异源标记连接或融合。标记可以是直接可检测的(例如荧光团)或间接可检测的(例如半抗原、酶或荧光团淬灭剂)。此类标记可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测。此类标记包括例如放射性标记、颜料、染料、色原、自旋标记和荧光标记。标记也可以是例如化学发光物质；含金属物质；或酶，其中发生依赖于酶的二次信号产生。术语“标记”还可指“标签”或半抗原，其可选择性地结合缀合分子，使得缀合分子在随后与底物一起添加时用于产生可检测信号。例如，生物素可与辣根过氧化物酶(HRP)的亲和素或链霉亲和素缀合物一起用作标签以结合标签，并使用量热底物(例如四甲基联苯胺(TMB))或荧光底物进行检查以检测HRP的存在。可用作标签来促进纯化的示例性标记包括但不限于myc、HA、FLAG或3XFLAG、6Xhis或聚组氨酸、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白、表位标签或免疫球蛋白的Fc部分。多种标记包括例如颗粒、荧光团、半抗原、酶以及其量热、荧光和化学发光底物和其它标记。
核酸分子内的核苷酸序列或多肽内的氨基酸序列的特定伸长段之间的同一性百分比(或互补性百分比)可使用BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序(Altschul等人，J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)或通过使用Gap程序(Wisconsin序列分析包，用于Unix的版本8，GeneticsComputer Group,University Research Park,Madison Wis.)，使用默认设置(其使用Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489))来确定。在本文中，如果对序列同一性百分比进行参考，则较高的序列同一性百分比相对于较低的序列同一性百分比是优选的。
如本文所用，当在对特定核苷酸或核苷酸序列或位置的编号的语境中使用时，短语“对应于”或其语法变型是指当将特定核苷酸或核苷酸序列与参考序列进行比较时对指定参考序列的编号(例如SEQ ID NO:1)。换句话说，特定聚合物的残基(例如核苷酸或氨基酸)编号或残基(例如核苷酸或氨基酸)位置相对于参考序列来指定，而不是通过残基在特定核苷酸或核苷酸序列内的实际数值位置来指定。例如，特定核苷酸序列可通过引入缺口以优化两个序列之间的残基匹配来与参考序列比对。在这些情况下，虽然存在缺口，但是对特定核苷酸或核苷酸序列中的残基的编号是相对于其所比对的参考序列来进行的。
所附序列表中列出的核苷酸序列和氨基酸序列是使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码示出的。所述核苷酸序列遵循从序列的5’端开始并且前进(即在每一行中从左到右)至3’端的标准惯例。仅示出了每一个核苷酸序列的一条链，但应理解的是，互补链是通过对所展示链的任何参考而被包括在内的。氨基酸序列遵循从序列的氨基末端开始并且前进(即在每一行中从左到右)至羧基末端的标准惯例。
本公开还提供了治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，用于治疗作为PDE3B参考或具有以下各者的受试者的肝病或2型糖尿病：编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体基因组核酸分子；编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体mRNA分子；或编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体cDNA分子。本文所述的治疗或抑制肝病或2型糖尿病的任何治疗剂均可用于这些方法中。为了治疗PDE3B参考受试者，治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂的施用量大于标准剂量。为了治疗如上所述的杂合或纯合的受试者，治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂的施用量小于或等于标准剂量。
本公开还提供了治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，用于制备供治疗作为PDE3B参考或具有以下各者的受试者的肝病或2型糖尿病用的药物：编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体基因组核酸分子；编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体mRNA分子；或编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体cDNA分子。本文所述的治疗或抑制肝病或2型糖尿病的任何治疗剂均可用于这些方法中。为了治疗PDE3B参考受试者，治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂的施用量大于标准剂量。为了治疗如上所述的杂合或纯合的受试者，治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂的施用量小于或等于标准剂量。
本公开还提供了治疗或抑制肝病或2型糖尿病的PDE3B抑制剂，用于治疗作为PDE3B参考或对以下各者呈杂合的受试者的肝病或2型糖尿病：编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体基因组核酸分子；编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体mRNA分子；或编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体cDNA分子。本文所述的任何PDE3B抑制剂均可用于这些方法中。
本公开还提供了治疗或抑制肝病或2型糖尿病的PDE3B抑制剂，用于制备供治疗作为PDE3B参考或对以下各者呈杂合的受试者的肝病或2型糖尿病用的药物：编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体基因组核酸分子；编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体mRNA分子；或编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体cDNA分子。本文所述的任何PDE3B抑制剂均可用于这些方法中。
以上或以下所引用的所有专利文献、网站、其它出版物、登录号等均出于所有目的以引用的方式整体并入，其程度犹如每个单独项目均具体地且单独地被指示为以引用的方式如此并入一样。如果序列的不同版本与不同时间的登录号相关，则意指与本申请的有效提交日期的登录号相关的版本。有效提交日期意指实际提交日期或优先权申请的提交日期中较早的日期，如果适用，则参考登录号。同样，如果出版物、网站等的不同版本在不同时间公布，除非另有说明，否则意指在申请的有效提交日期最近公布的版本。除非另有明确说明，否则本公开的任何特征、步骤、要素、实施方案或方面可与任何其它特征、步骤、要素、实施方案或方面组合使用。尽管出于清楚和理解的目的已通过说明和实例详细描述本公开，但将显而易见的是，可在所附权利要求的范围内实施某些变化和修改。
提供以下实施例来更详细地描述实施方案。它们意图说明但不限制所要求保护的实施方案。以下实施例为本领域普通技术人员提供本文所述的化合物、组合物、制品、装置和/或方法如何制备和评价的公开和描述，并且意图仅仅是示例性的并且不意图限制任何权利要求的范围。已经努力确保关于数字(例如量、温度等)的准确性，但可考虑一些误差和偏差。除非另外指示，否则份数是重量份，温度是以℃计或处于环境温度，并且压力处于或接近大气压。
实施例
实施例1：编码PDE3B的基因的功能丧失与降低肝脏脂肪以及降低肝损伤、肝病和2型糖尿病的风险相关
PDE3B中的罕见非同义变体与身体脂肪分布有关(Emdin等人,Nat.Commun.,2018,9,1613)。由于身体脂肪的分布是非酒精性脂肪肝的风险因素，因此推测此基因中的罕见非同义变体可能与肝脏中的脂肪沉积和其相关疾病结果有关，特别是2型糖尿病和非酒精性脂肪肝病。为了检验这一假设，我们对来自多个队列的超过500,000名接受全外显子组测序的人估计了这些健康特征与PDE3B中的预测功能丧失(pLOF)或预测有害错义变体之间的关联。
表3显示了PDE3B中的罕见(交替等位基因频率(AAF)<1％)pLOF变体(单独或与预测有害错义变体组合)的负荷与身体质量指数调整腰臀比(BMI调整WHR)的关联，BMI调整WHR是一种独立于整体肥胖的脂肪分布度量。
表3：UKB和MCPS中PDE3B功能丧失或预测有害错义变体的负荷与较低的BMI调整WHR相关
注释：RR表示群体研究中不携带替代等位基因的个体数量；RA表示携带一个或多个杂合替代等位基因的个体数量；AA表示携带一个或多个纯合替代等位基因的个体数量；基因暴露(或效应等位基因)是造成替代等位基因频率小于1％(AAF<1％)的功能丧失(pLOF)或预测有害错义变体的罕见等位基因的负荷。
PDE3B中的罕见pLOF变体或pLOF加上有害错义变体与较低BMI调整腰臀比密切相关，即与更有利的身体脂肪分布密切相关。结果表明，与单独的pLOF变体相比，组合的pLOF变体和预测有害错义变体与脂肪分布的相关性更强，并且具有类似的效应量，表明分析中包含的预测有害错义变体可能会导致功能丧失。因此，罕见预测功能丧失变体和罕见有害错义变体的组合提高了研究PDE3B遗传功能丧失后果的统计能力。
接下来估计了与肝脏脂肪含量(通过成像测量)和肝损伤(通过丙氨酸氨基转移酶(ALT)测量)的关联，ALT是一种在临床实践中用作肝损伤生物标志物的肝酶。通过磁共振成像(MRI)衍生的肝脏质子密度脂肪分数(PDFF)测量肝脏脂肪含量。PDFF被定义为来自脂肪(甘油三酯)的移动质子密度与来自移动甘油三酯和移动水的质子总密度的比率，并且反映组织内脂肪的浓度。循环ALT水平表明由于炎症或细胞死亡而从受损细胞的泄漏。发现PDE3B中的罕见pLOF变体或pLOF和预测有害错义变体的负荷与较低的PDFF和较低的循环ALT水平相关(表4)。
表4：分别通过磁共振成像(MRI)衍生的肝脏质子密度脂肪分数(PDFF)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)所测量，PDE3B中的功能丧失或预测有害错义变体的负荷与较低的肝脏脂肪和较低的肝脏损伤相关
注释：RR表示群体研究中不携带替代等位基因的个体数量；RA表示携带一个或多个杂合替代等位基因的个体数量；AA表示携带一个或多个纯合替代等位基因的个体数量；基因暴露(或效应等位基因)是造成替代等位基因频率小于1％(AAF<1％)的功能丧失(pLOF)或预测有害错义变体的罕见等位基因的负荷。
这些结果构成了将PDE3B功能丧失与人类肝脏脂肪沉积和肝脏损伤保护联系起来的第一个证据。
此外，在多项队列研究的荟萃分析中发现，携带PDE3B功能丧失变体和预测有害错义变体的个体患慢性肝病的风险较低(表5)。
表5：在UKB、GHS、SINAI、MDCS和UPENN-PMBB的荟萃分析中，PDE3B的功能丧失或预测有害错义变体的负荷与肝病临床诊断的几率较低相关。在GHS队列的减肥手术参与者中评估了肝活检时与非酒精性脂肪性肝炎或肝纤维化的关联
注释：RR表示群体研究中不携带替代等位基因的个体数量；RA表示携带一个或多个杂合替代等位基因的个体数量；AA表示携带一个或多个纯合替代等位基因的个体数量；基因暴露(或效应等位基因)是造成替代等位基因频率小于1％(AAF<1％)的功能丧失(pLOF)或预测有害错义变体的罕见等位基因的负荷；OR表示效应等位基因的比值比。
另外，结果显示，与GHS研究的减肥手术患者中的非酒精性脂肪性肝炎或肝纤维化风险较低的关联(表7)。这些结果构成了将PDE3B功能丧失与预防人类慢性肝病联系起来的第一个证据。
此外，分析表明，PDE3B功能丧失变体和预测有害错义变体的携带者患2型糖尿病的风险较低，如表6所示。
表6：在UKB和GHS的荟萃分析中，PDE3B功能丧失或预测有害错义变体的负荷与2型糖尿病风险较低相关
注释：RR表示群体研究中不携带替代等位基因的个体数量；RA表示携带一个或多个杂合替代等位基因的个体数量；AA表示携带一个或多个纯合替代等位基因的个体数量；基因暴露(或效应等位基因)是造成替代等位基因频率小于1％(AAF<1％)的功能丧失(pLOF)或预测有害错义变体的罕见等位基因的负荷；OR表示效应等位基因的比值比。
这些结果构成了将PDE3B功能丧失与预防人类2型糖尿病联系起来的第一个证据。
参与队列
在United Kingdom Biobank(UKB)队列(Sudlow等人,PLoS Med,2015,12,e1001779)和来自Geisinger Health System(GHS)MyCode Community Health Initiative的DiscoverEHR队列(Carey等人,Genet.Med.,2016,18,906-13)中进行了遗传关联研究。UKB是2006-2010年间通过英国22家检测中心招募的40至69岁人群的基于群体的队列研究。包括超过430,000名来自UKB的具有可用的全基因组测序和临床表型数据的欧洲血统参与者。GHS MyCode研究Community Health Initiative是2007-2019年从美国宾夕法尼亚州中部和东部(Central and Eastern Pennsylvania(USA))招募的患者的基于健康系统的队列。包括超过130,000名来自GHS的具有可用的全基因组测序和临床表型数据的欧洲血统参与者。在UKB和墨西哥城前瞻性研究(MCPS；Int.J.Epidemiol.,2006,35,243-9)中估计了PDE3B与腰臀比之间的关联。与肝脏结果的关联还包括Mount Sinai BioMe Biobank队列(SINAI,Cell,2019,177,58-69)、The University of Pennsylvania Penn MedicineBioBank(UPENN-PMBB；Park等人,2020,doi:10.1038/s41436-019-0625-8))以及MalmoDiet and Cancer Study(MDCS)，一个在1991年至1996年间招募的基于瑞典人群的前瞻性观察队列(Berglund等人,1993,doi:10.1111/j.1365-2796.1993.tb00647.x)。
表型定义
ALT的临床实验室测量值是从GHS参与者的电子健康记录(EHR)中提取的。计算所有参与者的两次或多次测量的中值。在UKB中，在研究基线访视时由IFCC(国际临床化学联合会)在Beckman Coulter AU5800上进行分析来测量ALT；Hb1Ac由HPLC使用Bio-RadVARIANT II Turbo来测量。BMI是通过体重(千克)除以身高(米)的平方来计算。腰臀比是通过腰围除以臀围来计算。在遗传关联分析之前，连续表型值通过逆标准正态函数进行转换，应用于每个血统组内并单独应用于男性和女性中。
疾病结果是根据国际疾病分类(International Classification of Diseases)第九版和第十版(ICD-9和ICD-10)使用EHR和自我报告(如果可用)定义的，并且合并为单个变量。使用先前描述的算法鉴定患有2型糖尿病的个体(Lotta等人,JAMA,2018,doi:10.1001/jama.2018.19329)，根据表7中列出的定义来定义慢性肝病。在UKB、GHS、SINAI、UPENN-PMBB和MALMO中鉴定了患有非酒精性肝病和实质性肝病的个体；在UKB和GHS中鉴定了患有2型糖尿病的个体。
表7：肝病结果的定义
注释：ICD10表示国际疾病和相关健康问题统计分类(InternationalStatistical Classification of Diseases and Related Health Problems)第10次修订；UKB.OPCS4表示UK Biobank(UKB)使用的人口普查和调查办公室(Office ofPopulation Censuses and Surveys，OPCS)干预措施和程序分类第4版；UKB.f.20002表示UKB中使用的自我报告的非癌症疾病代码。UKB.f.20004表示UKB中使用的自我报告医疗程序。
GHS减肥手术队列中的肝脏组织病理学表型定义
3,779名个体在减肥手术期间获得了术中肝脏楔形活检。在进行任何肝脏回缩或胃部手术之前，始终在镰状韧带左侧10cm处获得活检。活检分为多个切片，主要切片提交给临床病理学家进行肝脏组织学检查(固定在10％中性缓冲福尔马林中，并用苏木精和伊红染色以进行常规组织学检查，并用马松三色(Masson’s trichrome)染色以评估纤维化)，并且其余切片保存在研究生物库内(冷冻在RNAlater和/或液氮中)。肝脏组织学由一位经验丰富的病理学家进行，并随后由另一位经验丰富的病理学家使用NASH临床研究网络评分系统重新审查，如下：脂肪变性0级(67％)；小叶炎症0级(无病灶)，1级(轻度，每200X视野4个病灶)；纤维化0期(无)、1期(窦周或门静脉周围纤维化)、2期(窦周和门静脉周围纤维化)、3期(桥接纤维化)和4期(肝硬化)。这些组织学诊断用于定义以下表型：1)正常：没有脂肪变性、NASH或纤维化的证据；2)单纯性脂肪变性：没有NASH或纤维化证据的脂肪变性(无论级别如何)；3)NASH：任何小叶炎症或肝细胞气球样变(无论级别)的存在，或任何纤维化(无论阶段)的存在；4)纤维化：任何纤维化(无论阶段)的存在。
基因型数据
如先所描述进行高覆盖率全外显子组测序(Science,2016,354:aaf6814；和Nature,2020,586,749-756)并总结如下。将NimbleGen探针(VCRome；对于GHS队列的一部分)或可从Integrated DNA Technologies获得的xGen设计的经修饰型式(IDT；对于GHS的其余部分和其它队列)用于外显子组的靶序列捕获。在文库制备期间向每个DNA片段添加独特的6碱基对(bp)条形码(VCRome)或10bp条形码(IDT)以促进多重外显子组捕获和测序。在进行外显子组捕获之前合并等量样品。使用Illumina v4 HiSeq 2500(对于GHS队列的一部分)或NovaSeq(对于GHS的其余部分和其它队列)仪器上的75bp配对末端读段进行测序。测序的覆盖深度(即，覆盖基因组靶区中的每个核苷酸的序列读段的数目)足以在96％的VCRome样品中提供对85％的靶碱基的大于20x覆盖，并且在99％的IDT样品中提供对90％的靶碱基的20x覆盖。数据处理步骤包括使用Illumina软件进行样品分用(de-multiplexing)，与GRCh38人类基因组参考序列进行比对，包括生成二进制比对和作图文件(BAM)，处理BAM文件(例如标记重复读段和其它读段作图评价)。使用GLNexus系统(DOI：10.1101/343970)执行变体调用。变体作图和注释是基于GRCh38人类基因组参考序列和使用snpEff软件的Ensembl v85基因定义的。然后通过选择对于每个基因最有害的功能效应类别，将涉及具有注释的起始和终止的蛋白编码转录本的snpEff预测组合成单个功能影响预测。这些注释的等级(从最有害到最不有害)是移码、终止获得、终止丧失、剪接受体、剪接供体、终止丧失、框内插入缺失、错义、其它注释。预测的LOF遗传变体包括：a)导致移码的插入或缺失，b)导致引入提前终止密码子或转录起始位点或终止位点损失的插入、缺失或单核苷酸变体，和c)供体或受体剪接位点的变体。针对可能的功能影响根据使用SIFT(Adzhubei等人,Nat.Methods,2010,7,248-9)和Polyphen2_HVAR(Adzhubei等人,Nat.Methods,2010,7,248-9)、LRT(Chun等人,Genome Res.,2009,19,1553-61)以及MutationTaster(Schwarz等人,Nat.Methods,2010,7,575-6)预测有害性的计算机预测算法对错义变体进行分类。对于每个基因，每个变体的替代等位基因频率(AAF)和功能注释确定包含在这7次基因负荷暴露中：1)AAF<1％的pLOF变体；2)通过5/5算法预测为有害的，AAF<1％的pLOF或错义变体。
罕见功能丧失变异的基因负荷关联分析
通过使用REGENIE v1.0(doi：doi.org/10.1101/2020.06.19.162354)拟合针对近似基因组亲属关系矩阵的多基因评分调整的线性(对于数量性状)或firth偏差校正逻辑(对于二元性状)回归模型，测试了给定基因中的罕见预测功能丧失或错义变体的负荷与表型之间的关联。分析按血统进行分层，并根据年龄、年龄2、性别、年龄与性别和年龄2与性别交互项、实验批次相关协变量、10个常见变体衍生主成分和20个罕见变体衍生主成分进行调整。使用固定效应逆方差加权荟萃分析来组合每个变体-表型关联的跨队列结果。在基因负荷测试中，如果所有个体携带一种或多种合格的罕见变体(如上所述，基于频率和功能注释)，则所有个体被标记为杂合子，并且如果他们携带纯合状态的任何合格变体，则被标记为纯合子。接着使用这种“复合基因型”来测试关联性。
根据前面的描述，除了本文描述的修改以外，对所描述的主题的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。此类修改也意图落在随附权利要求书的范围内。本申请中引用的每篇参考文献(包括但不限于期刊文章、美国和非美国专利、专利申请公布、国际专利申请公布、基因库登录号等)均通过引用以其整体并且出于所有目的并入本文中。

Claims (91)

1.一种治疗患有肝病，或有患肝病的风险，或有患肝病的风险因素，或有患肝病并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用磷酸二酯酶3B(PDE3B)抑制剂。
2.一种治疗患有脂肪肝病，或有患脂肪肝病的风险，或有患脂肪肝病的风险因素，或有患脂肪肝病并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用磷酸二酯酶3B(PDE3B)抑制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述脂肪肝病是酒精性脂肪肝病(AFLD)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
4.一种治疗患有肝细胞癌，或有患肝细胞癌的风险，或有患肝细胞癌的风险因素，或有患肝细胞癌并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用磷酸二酯酶3B(PDE3B)抑制剂。
5.一种治疗患有肝硬化，或有患肝硬化的风险，或有患肝硬化的风险因素，或有患肝硬化并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用磷酸二酯酶3B(PDE3B)。
6.一种治疗患有肝纤维化，或有患肝纤维化的风险，或有患肝纤维化的风险因素，或有患肝纤维化并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用磷酸二酯酶3B(PDE3B)抑制剂。
7.一种治疗患有单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，或有患单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH的风险，或有患单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH的风险因素，或有患单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用磷酸二酯酶3B(PDE3B)抑制剂。
8.一种治疗患有肝损伤，或有患肝损伤的风险，或有患肝损伤的风险因素，或有患肝损伤并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用磷酸二酯酶3B(PDE3B)抑制剂。
9.一种治疗患有2型糖尿病，或有患2型糖尿病的风险，或有患2型糖尿病的风险因素，或有患2型糖尿病并发症的风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用磷酸二酯酶3B(PDE3B)抑制剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述PDE3B抑制剂包含与PDE3B mRNA杂交的反义核酸分子、小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述PDE3B抑制剂包含Cas蛋白和与PDE3B基因组核酸分子内的指导RNA(gRNA)识别序列杂交的gRNA。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9或Cpf1。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述gRNA识别序列位于SEQ IDNO:1内。
14.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中原型间隔区邻近基序(PAM)序列位于所述gRNA识别序列下游约2至约6个核苷酸处。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含约17至约23个核苷酸。
16.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述gRNA识别序列包含根据SEQID NO:26-34中的任一者的核苷酸序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，所述方法还包括检测来自所述受试者的生物样品中编码人PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的存在或不存在。
18.根据权利要求17所述的方法，其中当所述受试者是PDE3B参考时，还以大于标准剂量的量向所述受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。
19.根据权利要求17所述的方法，其中当所述受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合时，还以等于或小于标准剂量的剂量向所述受试者施用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子是剪接位点变体、终止获得变体、起始丧失变体、终止丧失变体、移码变体、或框内插入缺失变体、或编码截短的PDE3B多肽的变体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子编码截短的PDE3B多肽。
22.一种用治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂治疗受试者的方法，其中所述受试者罹患肝病或2型糖尿病，所述方法包括以下步骤：
通过以下方式确定所述受试者是否具有编码人磷酸二酯酶3B(PDE3B)多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子：
获得或已经获得来自所述受试者的生物样品；和
对所述生物样品进行或已经进行序列分析以确定所述受试者是否具有包含所述PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的基因型；和
当所述受试者是PDE3B参考时，则以大于标准剂量的量向所述受试者施用或继续施用治疗或抑制所述肝病或2型糖尿病的所述治疗剂，并且向所述受试者施用PDE3B抑制剂；以及
当所述受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈杂合时，则以等于或小于标准剂量的量向所述受试者施用或继续施用治疗或抑制所述肝病或2型糖尿病的所述治疗剂，并且向所述受试者施用PDE3B抑制剂；
当所述受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子呈纯合时，则以等于或小于标准剂量的量向所述受试者施用或继续施用治疗或抑制所述肝病或2型糖尿病的所述治疗剂；
其中具有编码所述人PDE3B多肽的所述PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的基因型的存在表明所述受试者患所述肝病或2型糖尿病的风险降低。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述受试者是PDE3B参考，并且以大于标准剂量的量向所述受试者施用或继续施用治疗或抑制所述肝病或2型糖尿病的所述治疗剂，并且施用PDE3B抑制剂。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合，并且以等于或小于标准剂量的量向所述受试者施用或继续施用治疗或抑制所述肝病或2型糖尿病的所述治疗剂，并且施用PDE3B抑制剂。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述预测功能丧失或错义变体PDE3B核酸分子是剪接位点变体、终止获得变体、起始丧失变体、终止丧失变体、移码变体、或框内插入缺失变体、或编码截短的PDE3B多肽的变体。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述预测功能丧失或错义变体PDE3B核酸分子编码截短的PDE3B多肽。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述PDE3B抑制剂包含与PDE3BmRNA杂交的反义核酸分子、小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。
28.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述PDE3B抑制剂包含Cas蛋白和与PDE3B基因组核酸分子内的指导RNA(gRNA)识别序列杂交的gRNA。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9或Cpf1。
30.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述gRNA识别序列位于SEQ IDNO:1内。
31.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中原型间隔区邻近基序(PAM)序列位于所述gRNA识别序列下游约2至6个核苷酸处。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含约17至约23个核苷酸。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述gRNA识别序列包含根据SEQID NO:26-34中的任一者的核苷酸序列。
34.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述肝病是脂肪肝病。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述脂肪肝病是酒精性脂肪肝病(AFLD)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
36.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述肝病是肝细胞癌。
37.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述肝病是肝硬化。
38.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述肝病是肝纤维化。
39.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述肝病是单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
40.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肝损伤。
41.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述用于治疗2型糖尿病的治疗剂选自二甲双胍、胰岛素、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、瑞格列奈、那格列奈、罗格列酮、吡格列酮、西他列汀、沙格列汀、利格列汀、艾塞那肽、利拉鲁肽、索马鲁肽、卡格列净、达格列净和恩格列净，或其任何组合。
42.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述用于治疗肝病的治疗剂选自双硫仑、纳曲酮、阿坎酸、泼尼松、硫唑嘌呤、干扰素、蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、青霉胺、曲恩汀、去铁胺、布美他尼、呋塞米、氢氯噻嗪、氯噻嗪、阿米洛利、氨苯蝶啶、螺内酯、阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、噻吗洛尔和卡维地洛，或其任何组合。
43.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述肝病是脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH，并且所述治疗剂选自奥贝胆酸、司隆色替、艾拉菲诺、塞尼维罗、GR_MD_02、MGL_3196、IMM124E、花生酰氨基胆酸、GS0976、恩利卡生、伏昔巴特、NGM282、GS9674、托匹非索、MN_001、LMB763、BI_1467335、MSDC_0602、PF_05221304、DF102、沙罗格列扎、BMS986036、拉尼兰诺、索马鲁肽、硝唑尼特、GRI_0621、EYP001、VK2809、纳美芬、LIK066、MT_3995、依洛西巴特、纳莫德森、福雷芦单抗、SAR425899、索格列净、EDP_305、艾萨布特、吉卡宾、TERN_101、KBP_042、PF_06865571、DUR928、PF_06835919、NGM313、BMS_986171、那马珠单抗、CER_209、ND_L02_s0201、RTU_1096、DRX_065、IONIS_DGAT2Rx、INT_767、NC_001、seladepar、PXL770、TERN_201、NV556、AZD2693、SP_1373、VK0214、hepastem、TGFTX4、RLBN1127、GKT_137831、RYI_018、CB4209-CB4211和JH_0920，或其任何组合。
44.一种鉴定患肝病或2型糖尿病的风险提高的受试者的方法，其中所述方法包括：
确定或已经确定从所述受试者获得的生物样品中编码人磷酸二酯酶3B(PDE3B)多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子的存在或不存在；
其中：
当所述受试者是PDE3B参考时，则所述受试者患所述肝病或2型糖尿病的风险提高；并且
当所述受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合或纯合时，则所述受试者患所述肝病或2型糖尿病的风险降低。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子是剪接位点变体、终止获得变体、起始丧失变体、终止丧失变体、移码变体、或框内插入缺失变体、或编码截短的PDE3B多肽的变体。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述PDE3B预测功能丧失或错义变体核酸分子编码截短的PDE3B多肽。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述受试者是PDE3B参考，并且以大于标准剂量的量向所述受试者施用或继续施用治疗或抑制所述肝病或2型糖尿病的所述治疗剂，并且施用PDE3B抑制剂。
48.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述受试者对PDE3B预测功能丧失或错义变体呈杂合，并且以等于或小于标准剂量的量向所述受试者施用或继续施用治疗或抑制所述肝病或2型糖尿病的所述治疗剂，并且施用PDE3B抑制剂。
49.根据权利要求48或权利要求49所述的方法，其中所述PDE3B抑制剂包含与PDE3BmRNA杂交的反义核酸分子、小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的方法，其中所述PDE3B抑制剂包含Cas蛋白和与PDE3B基因组核酸分子内的指导RNA(gRNA)识别序列杂交的gRNA。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9或Cpf1。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的方法，其中所述gRNA识别序列位于SEQ IDNO:1内。
53.根据权利要求50或权利要求51所述的方法，其中原型间隔区邻近基序(PAM)序列位于所述gRNA识别序列下游约2至6个核苷酸处。
54.根据权利要求50至53中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含约17至约23个核苷酸。
55.根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其中所述gRNA识别序列包含根据SEQID NO:26-34中的任一者的核苷酸序列。
56.根据权利要求44至55中任一项所述的方法，其中所述肝病是脂肪肝病。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述脂肪肝病是酒精性脂肪肝病(AFLD)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
58.根据权利要求44至55中任一项所述的方法，其中所述肝病是肝细胞癌。
59.根据权利要求44至55中任一项所述的方法，其中所述肝病是肝硬化。
60.根据权利要求44至55中任一项所述的方法，其中所述肝病是肝纤维化。
61.根据权利要求44至55中任一项所述的方法，其中所述肝病是单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
62.根据权利要求44至55中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肝损伤。
63.根据权利要求44至55中任一项所述的方法，其中所述用于治疗2型糖尿病的治疗剂选自二甲双胍、胰岛素、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、瑞格列奈、那格列奈、罗格列酮、吡格列酮、西他列汀、沙格列汀、利格列汀、艾塞那肽、利拉鲁肽、索马鲁肽、卡格列净、达格列净和恩格列净，或其任何组合。
64.根据权利要求44至55中任一项所述的方法，其中所述用于治疗肝病的治疗剂选自双硫仑、纳曲酮、阿坎酸、泼尼松、硫唑嘌呤、干扰素、蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、青霉胺、曲恩汀、去铁胺、布美他尼、呋塞米、氢氯噻嗪、氯噻嗪、阿米洛利、氨苯蝶啶、螺内酯、阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、噻吗洛尔和卡维地洛，或其任何组合。
65.根据权利要求44至55中任一项所述的方法，其中所述肝病是脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH，并且所述治疗剂选自奥贝胆酸、司隆色替、艾拉菲诺、塞尼维罗、GR_MD_02、MGL_3196、IMM124E、花生酰氨基胆酸、GS0976、恩利卡生、伏昔巴特、NGM282、GS9674、托匹非索、MN_001、LMB763、BI_1467335、MSDC_0602、PF_05221304、DF102、沙罗格列扎、BMS986036、拉尼兰诺、索马鲁肽、硝唑尼特、GRI_0621、EYP001、VK2809、纳美芬、LIK066、MT_3995、依洛西巴特、纳莫德森、福雷芦单抗、SAR425899、索格列净、EDP_305、艾萨布特、吉卡宾、TERN_101、KBP_042、PF_06865571、DUR928、PF_06835919、NGM313、BMS_986171、那马珠单抗、CER_209、ND_L02_s0201、RTU_1096、DRX_065、IONIS_DGAT2Rx、INT_767、NC_001、seladepar、PXL770、TERN_201、NV556、AZD2693、SP_1373、VK0214、hepastem、TGFTX4、RLBN1127、GKT_137831、RYI_018、CB4209-CB4211和JH_0920，或其任何组合。
66.一种治疗或抑制肝病或2型糖尿病的治疗剂，所述治疗剂用于治疗作为PDE3B参考的受试者或具有以下各者的受试者的所述肝病或2型糖尿病：
编码磷酸二酯酶3B(PDE3B)多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体基因组核酸分子；
编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体mRNA分子；或
编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体cDNA分子。
67.根据权利要求66所述的治疗剂，其中所述肝病是脂肪肝病。
68.根据权利要求67所述的治疗剂，其中所述脂肪肝病是酒精性脂肪肝病(AFLD)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
69.根据权利要求66所述的治疗剂，其中所述肝病是肝细胞癌。
70.根据权利要求66所述的治疗剂，其中所述肝病是肝硬化。
71.根据权利要求66所述的治疗剂，其中所述肝病是肝纤维化。
72.根据权利要求66所述的治疗剂，其中所述肝病是单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
73.根据权利要求66所述的治疗剂，其中所述受试者患有肝损伤。
74.根据权利要求66所述的治疗剂，其中所述用于治疗2型糖尿病的治疗剂选自二甲双胍、胰岛素、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、瑞格列奈、那格列奈、罗格列酮、吡格列酮、西他列汀、沙格列汀、利格列汀、艾塞那肽、利拉鲁肽、索马鲁肽、卡格列净、达格列净和恩格列净，或其任何组合。
75.根据权利要求66所述的治疗剂，其中所述用于治疗肝病的治疗剂选自双硫仑、纳曲酮、阿坎酸、泼尼松、硫唑嘌呤、干扰素、蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、青霉胺、曲恩汀、去铁胺、布美他尼、呋塞米、氢氯噻嗪、氯噻嗪、阿米洛利、氨苯蝶啶、螺内酯、阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、噻吗洛尔和卡维地洛，或其任何组合。
76.根据权利要求66所述的治疗剂，其中所述肝病是脂肪变性、脂肪性肝炎或NASH，并且所述治疗剂选自奥贝胆酸、司隆色替、艾拉菲诺、塞尼维罗、GR_MD_02、MGL_3196、IMM124E、花生酰氨基胆酸、GS0976、恩利卡生、伏昔巴特、NGM282、GS9674、托匹非索、MN_001、LMB763、BI_1467335、MSDC_0602、PF_05221304、DF102、沙罗格列扎、BMS986036、拉尼兰诺、索马鲁肽、硝唑尼特、GRI_0621、EYP001、VK2809、纳美芬、LIK066、MT_3995、依洛西巴特、纳莫德森、福雷芦单抗、SAR425899、索格列净、EDP_305、艾萨布特、吉卡宾、TERN_101、KBP_042、PF_06865571、DUR928、PF_06835919、NGM313、BMS_986171、那马珠单抗、CER_209、ND_L02_s0201、R TU_1096、DRX_065、IONIS_DGAT2Rx、INT_767、NC_001、seladepar、PXL770、TERN_201、NV556、AZD2693、SP_1373、VK0214、hepastem、TGFTX4、RLBN1127、GKT_137831、RYI_018、CB4209-CB4211和JH_0920，或其任何组合。
77.一种治疗或抑制肝病或2型糖尿病的磷酸二酯酶3B(PDE3B)抑制剂，所述抑制剂用于治疗作为PDE3B参考或对以下各者呈杂合的受试者的所述肝病或2型糖尿病：
编码磷酸二酯酶3B(PDE3B)多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体基因组核酸分子；
编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体mRNA分子；或
编码PDE3B多肽的PDE3B预测功能丧失或错义变体cDNA分子。
78.根据权利要求77所述的PDE3B抑制剂，其中所述肝病是脂肪肝病。
79.根据权利要求78所述的PDE3B抑制剂，其中所述脂肪肝病是酒精性脂肪肝病(AFLD)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
80.根据权利要求77所述的PDE3B抑制剂，其中所述肝病是肝细胞癌。
81.根据权利要求77所述的PDE3B抑制剂，其中所述肝病是肝硬化。
82.根据权利要求77所述的PDE3B抑制剂，其中所述肝病是肝纤维化。
83.根据权利要求77所述的PDE3B抑制剂，其中所述肝病是单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
84.根据权利要求77所述的PDE3B抑制剂，其中所述受试者患有肝损伤。
85.根据权利要求77至84中任一项所述的PDE3B抑制剂，其中所述PDE3B抑制剂包含与PDE3B mRNA杂交的反义核酸分子、小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。
86.根据权利要求77至84中任一项所述的PDE3B抑制剂，其中所述PDE3B抑制剂包含Cas蛋白和与PDE3B基因组核酸分子内的指导RNA(gRNA)识别序列杂交的gRNA。
87.根据权利要求86所述的PDE3B抑制剂，其中所述Cas蛋白是Cas9或Cpf1。
88.根据权利要求86或权利要求87所述的PDE3B抑制剂，其中所述gRNA识别序列位于SEQ ID NO:1内。
89.根据权利要求86或权利要求87所述的PDE3B抑制剂，其中原型间隔区邻近基序(PAM)序列位于所述gRNA识别序列下游约2至6个核苷酸处。
90.根据权利要求86至89中任一项所述的PDE3B抑制剂，其中所述gRNA包含约17至约23个核苷酸。
91.根据权利要求86至90中任一项所述的PDE3B抑制剂，其中所述gRNA识别序列包含根据SEQ ID NO:26-34中的任一者的核苷酸序列。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002070469A2 (en) 2001-03-05 2002-09-12 Icos Corporation Selective pde3b inhibitors and use of the same in therapy
CA2539752A1 (en) * 2003-09-29 2005-04-07 Topigen Pharmaceutique Inc. Oligonucleotide compositions and methods for treating disease including inflammatory conditions
US8084221B2 (en) * 2006-04-01 2011-12-27 Saint Louis University Method of screening for a drug candidate that increases ATP release from RBCs stimulated via the Gs or Gi pathway
AR067446A1 (es) * 2007-07-11 2009-10-14 Otsuka Pharma Co Ltd Un medicamento para tratar higado graso que comprende cilostazol
JP5467259B2 (ja) * 2008-03-13 2014-04-09 国立大学法人 千葉大学 シスプラチン効果増強剤及び抗癌剤キット
WO2011111066A2 (en) * 2010-03-12 2011-09-15 Connexios Life Sciences Pvt. Ltd. Composition and uses thereof
DK3220911T3 (en) * 2014-11-17 2019-02-18 Univ Degli Studi Di Salerno LEVOSIMENDAN FOR USE AS A LIVING PROTECTOR
US11897867B2 (en) 2017-08-04 2024-02-13 Bayer Aktiengesellschaft 6-phenyl-4,5-dihydropyridazin-3(2H)-one derivatives as PDE3A and PDE3B inhibitors for treating cancer
US20210285050A1 (en) * 2018-07-06 2021-09-16 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Pde3b variants
CN113244395A (zh) * 2020-02-10 2021-08-13 广州市妇女儿童医疗中心 纤维化疾病机制及其治疗药物

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