CN117248036A - 一种与鸡脂肪沉积相关的miRNA家族及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于分子标记应用领域，提出了一种与鸡脂肪沉积相关的miRNA家族及其应用，miRNA家族为gga‑miR‑30家族，其核苷酸序列为：gga‑miR‑30a：TGTTAAACATCCTCGACTGGAA；gga‑miR‑30b：TGTAAACATCCTACACTCAGC；gga‑miR‑30c：TGTAAACATCCTACACTCTCAGCT；gga‑miR‑30d:TGTAAACATCCCCGACTGGAAG；gga‑miR‑30e：TGTAAACATCCTTGACTGG；gga‑miR‑30家族通过调控MGLL基因的表达，调控鸡的腹部脂肪沉积，同时，gga‑miR‑30家族对肌内脂肪沉积的调控并不是通过MGLL来实现。综上，本发明通过调控靶基因MGLL的表达，调控鸡脂肪沉积，因此可作为分子标记，使高肌内脂肪和低腹脂沉积专门化品系的育成速度加快。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种与鸡脂肪沉积相关的miRNA家族及其应用。
背景技术
在畜牧业生产中，脂肪性状一直受到广泛关注，其不仅与动物的饲料报酬、抗病力、繁殖性能及肉用性能密切相关，最主要关系到肉品质的质量和风味。腹部脂肪沉积是一种负的经济特征，过度脂肪沉积会导致饲料效率下降，从而增加育种成本，被丢弃的腹部脂肪还会造成环境污染。与腹部脂肪不同，肌内脂肪却是有益的特征，其作为动物肌肉的重要组成部分，存在于肌纤维内部与肌束之间，作为能量储存的一种形式，与肌肉嫩度、香味、多汁性呈显著的正相关。因此，高肌内脂肪和低腹脂沉积是现代优质肉鸡育种的目标。
miRNA是一类非编码单链RNA，在人类肥胖、脂肪生成、脂肪细胞增值与分化及胰岛素耐受性中起到重要作用，因此获得与主选性状及其关键基因相关的miRNA作为分子标记，对实现重要经济性状的早期选择具有重要意义。研究证明，鸡的miR-30家族包括gga-miR-30a、gga-miR-30b、gga-miR-30c、gga-miR-30d和gga-miR-30e 5个成员。
授权公告号为CN 112375759 B的专利，公开了一种与鸡肝脏脂质沉积相关的miRNA及其应用，发现了miR-146a在调控鸡肝脏脂质沉积中的应用，并提供了其前体pri-miR-146a，但是该研究也只是证明了miR-146a能够调控鸡肝脏脂质沉积。并没有研究肌内脂肪和腹部脂肪。
论文：circADGRF5/miR-200b-3p/SESN1调控固始鸡腹部前脂肪细胞增殖与分化的作用机制研究。河南农业大学硕士学位论文。论文中公开miR-200b-3p可以直接靶向SESN1来调控固始鸡腹部前脂肪细胞的增殖和分化。
授权公告号为CN 105087584 B的专利，为发明人在2015年之前作出的研究，该研究筛选到的miRNA为gga-miR-19b-3p，对于该miRNA，只是研究并证明了其能够调控鸡腹脂沉积。
由于鸡脂肪沉积是受很多的miRNA共同作用调控，一个miRNA不能起到决定性作用，但是，上述论文和授权公告号为CN 105087584 B的专利(发明人自己的专利)，均是只研究了一个核苷酸序列，并不能更好的分析鸡脂肪沉积的作用机理。
另外，上述论文和授权公告号为CN 105087584 B的专利(发明人自己的专利)，只对鸡腹部脂肪进行研究，为单一的分子标记，并没有研究肌内脂肪，无法获得腹部脂肪和肌内脂肪的差异性分子机制；但是由于腹部脂肪沉积是一种负的经济特征，肌内脂肪却是有益的经济特征，因此，单一的分子标记无法实现优良经济性状的早期选择。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种与鸡脂肪沉积相关的miRNA家族及其应用。其可通过调控靶基因MGLL的表达，调控鸡脂肪沉积，因此可作为分子标记，使高肌内脂肪和低腹脂沉积专门化品系的育成速度加快。
本发明的技术方案是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种与鸡脂肪沉积相关的miRNA家族，其中，miRNA家族为gga-miR-30家族，其核苷酸序列为：
gga-miR-30a：TGTTAAACATCCTCGACTGGAA；
gga-miR-30b：TGTAAACATCCTACACTCAGC；
gga-miR-30c：TGTAAACATCCTACACTCTCAGCT；
gga-miR-30d：TGTAAACATCCCCGACTGGAAG；
gga-miR-30e：TGTAAACATCCTTGACTGG；
gga-miR-30家族可以促进鸡腹部脂肪和肌内脂肪的沉积。
另外，gga-miR-30家族通过调控MGLL基因的表达，调控鸡的腹部脂肪沉积；但是gga-miR-30家族对肌内脂肪沉积的调控并不是通过MGLL来实现。因此，如果需要对肉鸡的腹部脂肪(负经济特征)和肌内脂肪(有益经济特征)这两类性状进行早期选择，可以通过对MGLL基因的控制，实现高肌内脂肪和低腹脂沉积的选育。
进一步地，本发明中，gga-miR-30家族通过抑制MGLL基因的表达，促进鸡腹部脂肪的沉积。
进一步地，本发明通过QPCR检测腹部脂肪细胞和肌内脂肪细胞中gga-miR-30家族的5个成员的表达量。
进一步地，本发明进行QPCR检测时，针对5个成员采用的特异性扩增引物序列分别如下：
gga-miR-30a：TGTAAACATCCTCGACTGGAAG；
gga-miR-30b：TGTAAACATCCTACACTCAGC；
gga-miR-30c：TGTAAACATCCTACACTCTCAGCT；
gga-miR-30d：TGTAAACATCCCCGACTGGAAG；
gga-miR-30e：TGTAAACATCCTTGACTGG。
另一方面，本发明还提供了gga-miR-30家族作为分子标记，在加快高肌内脂肪和低腹脂沉积专门化品系的育成速度中的应用。
可将gga-miR-30家族mimics或基于gga-miR-30构建的过表达载体，作为添加剂，用于调控鸡腹部脂肪沉积和肌内脂肪沉积，加快高肌内脂肪和低腹脂沉积专门化品系的育成速度，并且对gga-miR-30家族mimics进行的保护碱基修饰以及针对gga-miR-30家族前体设计的过表达载体均包含在本发明的保护范围内。
本发明与鸡脂肪沉积相关的miRNA家族及其应用，相对于现有技术具有以下有益效果：
1、提供了gga-miR-30家族中五个特殊的核苷酸序列，并针对五个特殊的核苷酸序列分别设计了特殊的引物。
2、通过五个特殊的核苷酸序列，深入研究鸡脂肪沉积的作用机理，获得高肌内脂肪和低腹脂沉积双重性状的、可控的分子标记，并通过构建gga-miR-30家族的模拟物，外源过表达gga-miR-30家族，发现gga-miR-30家族通过调控MGLL基因的表达进而调控鸡脂肪沉积。
3、通过改善鸡的脂肪沉积的gga-miR-30家族标记，运用这些标记对优质肉鸡腹脂和肌内脂肪沉积这两类复杂性状进行早期选择，缩短世代间隔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中构建体外研究模型过程中提纯得到的腹部脂肪细胞；
图2为本发明实施例中构建体外研究模型过程中提纯得到的肌内脂肪细胞；
图3为本发明实施例的gga-miR-30家族中的gga-miR-30a、gga-miR-30c和gga-miR-30e在腹部脂肪细胞中增殖期和分化期的表达情况(不同字母表示差异显著(p<0.01))；
图4为本发明实施例的gga-miR-30家族gga-miR-30b、gga-miR-30d在腹部脂肪细胞中增殖期和分化期的表达情况(不同字母表示差异显著(p<0.01))；
图5为本发明实施例的gga-miR-30家族在肌内脂肪细胞中增殖期和分化期的表达情况(不同字母表示差异显著(p<0.01))；
图6为本发明实施例中在腹部脂肪细胞中转染gga-miR-30家族模拟物后5个成员的表达变化情况(***表示p<0.001)；
图7为本发明实施例中在转染了gga-miR-30家族mimics后腹部脂肪细胞的增殖显著升高情况(*表示p<0.05，**表示p<0.01)；
图8为本发明实施例中外源转染了gga-miR-30家族mimics后腹部脂肪细胞的脂滴沉积显著升高情况(***表示p<0.001)；
图9为本发明实施例中在胸肌肌内脂肪细胞中转染gga-miR-30家族模拟物后5个成员的表达显著升高的情况(***表示p<0.001)；
图10为本发明实施例中外源转染了gga-miR-30家族mimics后胸肌肌内脂肪细胞的脂滴沉积显著升高情况(***表示p<0.001)；
图11为gga-miR-30家族转染mimics后MGLL基因在腹部脂肪细胞和肌内脂肪细胞中的表达变化情况(**表示p<0.01)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。实施例1：利用腹部脂肪细胞和肌内脂肪细胞对miR-30家族的表达进行验证1.腹部脂肪细胞和肌内脂肪细胞体外研究模型的构建
以7～10日龄3～4只优质肉鸡的腹部脂肪组织和胸肌组织为试验材料，胶原酶I分别消化1小时和1.5小时后，2倍体积的全培养基终止消化。腹部脂肪细胞用400目过滤网过滤、离心，弃上清，加全培养基混悬沉淀，培养皿中培养，如图1为提纯得到的腹部脂肪细胞得到腹部脂肪组织的前脂肪细胞；胸肌组织消化后直接离心，取上清，T25瓶中培养，如图2为肌内脂肪细胞。
2.鸡gga-miR-30家族模拟物的制备及稀释
gga-miR-30家族五个成员模拟物(mimics)由苏州吉玛基因股份有限公司合成；合成后的每1OD模拟物加125ul的DEPC水稀释，终浓度为20uM/ul，-20℃保存待用。
3.gga-miR-30家族在脂肪细胞增殖期和分期的表达
待上述提纯得到的腹部脂肪细胞长至50％和100％时，收集增殖期的细胞。另一批脂肪细胞在油酸诱导分化后的3d、5d、10d收集细胞；提取收集的各时间点细胞的总RNA，QPCR检测gga-miR-30家族在增殖期和分化期的表达。
利用北京天根公司总RNA提取试剂盒法提取脂肪细胞中总RNA。总RNA反转录成miRNA，试剂盒miScript II RT Kit(Qiagen,Germany)进行反转录；试剂盒QuantifastSYBR Green PCR Kit(Qiagen,Germany)进行qRT-PCR。gga-miR-30家族特异性扩增引物分别为：
(1)gga-miR-30a：TGTAAACATCCTCGACTGGAAG；
(2)gga-miR-30b：TGTAAACATCCTACACTCAGC；
(3)gga-miR-30c：TGTAAACATCCTACACTCTCAGCT；
(4)gga-miR-30d：TGTAAACATCCCCGACTGGAAG；
(5)gga-miR-30e：TGTAAACATCCTTGACTGG。
引物的终浓度为10umol/uL，检测每次设置3个平行管反应，miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以U6基因作为内参；gga-miR-30家族Q-PCR反应程序：95℃15min；40个循环(94℃15s，55℃30s，70℃30s)。
QPCR结果表明：如图3和图4，在腹部脂肪细胞中，5个成员在诱导分化期的表达显著高于增殖期；如图5，在肌内脂肪细胞中，gga-miR-30家族5个成员的表达量随着分化期的延长而升高，分化期的表达显著高于增殖期。
4.gga-miR-30家族作为分子标记对脂肪细胞增殖分化的影响
基于上述的样本内容，腹部脂肪细胞长至60％左右，转染miR-30家族的模拟物，使得gga-miR-30a、gga-miR-30b、gga-miR-30c、gga-miR-30d和gga-miR-30e的表达极显著升高，结果如图6所示；在转染的72h，CCK8检测细胞增殖，结果表明转染gga-miR-30家族模拟物，腹部脂肪细胞的的增殖显著升高(P＜0.01)，结果如图7；如图8所示，在转染gga-miR-30家族3d，与对照组相比，腹部脂肪细胞脂滴沉积显著高于对照组(P＜0.01)；试验证明gga-miR-30家族可促进腹部前脂肪细胞增殖和脂肪沉积。
肌内脂肪细胞长至60％左右，转染gga-miR-30家族的模拟物，使得gga-miR-30a、gga-miR-30b、gga-miR-30c、gga-miR-30d和gga-miR-30e的表达极显著升高，如图9所示；转染3d油红O染色，与对照组相比，脂肪细胞脂滴沉积显著高于对照组(P＜0.01)，如图10；试验证明gga-miR-30家族可促进肌内脂肪的细胞的增殖和脂肪的沉积。
其中，具体转染体系如下：试验组：100ul opti-MEM培养基+8ul终浓度为20uMmimics+8ul Hiperfect transfection；对照组：100ulopti-MEM培养基+8ul终浓度为20uMNegative+8ul Hiperfect transfection，共孵育8分钟，形成一个转染复合物，转染至培养基中。
实施例2：gga-miR-30家族对MGLL基因表达的调控
MGLLmRNA表达分析：分别将gga-miR-30a、gga-miR-30b、gga-miR-30c、gga-miR-30d和gga-miR-30e模拟物转染至腹部脂肪细胞和肌内脂肪细胞中，转染24h收集细胞，提取细胞中总RNA。利用Q-PCR检测MGLLmRNA的表达变化。
结果表明(如图11)：
在腹部脂肪细胞中，转染5个miRNA的模拟物24h后，MGLL mRNA表达显著下降。
在肌内脂肪的细胞中，转染5个miRNA的模拟物24h后，MGLLmRNA表达无显著变化。
MGLL蛋白含量的测定：分别将gga-miR-30a、gga-miR-30b、gga-miR-30c、gga-miR-30d和gga-miR-30e模拟物转染至腹部脂肪细胞和肌内脂肪细胞中，转染24h和72h收集细胞，用MGLL Elisa试剂盒测定MGLL的蛋白含量变化。
结果表明：
有腹部脂肪细胞中，转染5个miRNA的模拟物24h后，MGLL的蛋白含量显著下降(表1)，而在肌内脂肪细胞中，转染5个miRNA的模拟物后，MGLL的蛋白含量并没有显著变化。
因此，miR-30家族通过下调MGLL的表达促进鸡腹部脂肪的沉积，miR-30家族对肌内脂肪沉积的调控并不是通过MGLL来实现。
表1外源转染miR30 mimics对MGLL蛋白含量的影响
不同字母表示与对照组相比，差异显著(p<0.05)。
根据核苷酸或氨基酸序列表WIPO标准ST.26(RECOMMENDED STANDARD FOR THEPRESENTATION OF NUCLEOTIDE AND AMINO ACID SEQUENCE LISTINGS STANDARD ST.26)中的规定：T代表RNA中的尿嘧啶和DNA中的胸腺嘧啶(The symbol“t”will be construed asthymine in DNA and uracil in RNA.)。因此，本发明中，gga-miR-30家族的核苷酸序列中，使用“T”代表“U(尿嘧啶)”。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种与鸡脂肪沉积相关的miRNA家族，其特征在于：所述miRNA家族为gga-miR-30家族，其核苷酸序列为：
gga-miR-30a：TGTTAAACATCCTCGACTGGAA；
gga-miR-30b：TGTAAACATCCTACACTCAGC；
gga-miR-30c：TGTAAACATCCTACACTCTCAGCT；
gga-miR-30d：TGTAAACATCCCCGACTGGAAG；
gga-miR-30e：TGTAAACATCCTTGACTGG；
所述gga-miR-30家族通过调控MGLL基因的表达，调控鸡的腹部脂肪沉积；同时，gga-miR-30家族对肌内脂肪沉积的调控并不是通过MGLL来实现。
2.根据权利要求1所述的miRNA家族，其特征在于，所述gga-miR-30家族通过抑制MGLL基因的表达，调控鸡的腹部脂肪沉积。
3.根据权利要求1所述的miRNA家族，其特征在于，腹部脂肪细胞和肌内脂肪细胞中，gga-miR-30家族的5个成员的表达量通过QPCR检测。
4.根据权利要求3所述的miRNA家族，其特征在于，在进行QPCR检测时，针对5个成员采用的特异性扩增引物序列分别如下：
gga-miR-30a：TGTAAACATCCTCGACTGGAAG；
gga-miR-30b：TGTAAACATCCTACACTCAGC；
gga-miR-30c：TGTAAACATCCTACACTCTCAGCT；
gga-miR-30d：TGTAAACATCCCCGACTGGAAG；
gga-miR-30e：TGTAAACATCCTTGACTGG。
5.一种如权利要求1所述的miRNA家族的应用，其特征在于：所述gga-miR-30家族作为分子标记，在加快高肌内脂肪和低腹脂沉积专门化品系育成速度中的应用。
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