CN117247974A - 一种泡沫病毒包装载体系统及其构建方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物技术领域，尤其是涉及一种泡沫病毒包装载体系统及其构建方法和试剂盒。本申请采用五质粒法进行泡沫病毒包毒，获得感染能力明显增强、生产滴度明显增加的泡沫病毒包装载体系统。其中，本申请在优化的辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C的基础上(所述辅助质粒A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述辅助质粒B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述辅助质粒C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)，在泡沫病毒包装过程中额外加入外源糖蛋白质粒能够有效提高泡沫病毒侵染细胞效率，从而达到滴度的提升，并且还能降低生产成本的同时提高泡沫病毒的应用价值。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其是涉及一种泡沫病毒包装载体系统及其构建方法和试剂盒。
背景技术
泡沫病毒(FVs)是一种有包膜、二聚线型单链RNA或双链DNA病毒，基因组大小约为11～12kb，其包装容量超过9kb。虽然与乙型肝炎等病毒具有同源性，但因其独特的复制方式在许多方面又与这类病毒不同，因此被分为逆转录病毒科中单独的一个亚科，即泡沫逆转录病毒亚科(Spumaretrovirinae)。泡沫病毒在自然界中广泛存在，可从多种哺乳动物中分离出来，并对组织具有亲和性，但泡沫病毒野生型缺乏致病性，因此对比其他逆转录病毒更为安全，且泡沫病毒大部分偏向于整合到cpg岛，少量整合到转录起始位点，相对于慢病毒及MMLV对转录活性单元的整合倾向，泡沫病毒无疑大大降低了致癌的风险。
包膜病毒生命周期的一个重要步骤是由病毒糖蛋白介导的病毒和细胞脂质膜融合，将病毒衣壳释放到宿主细胞的细胞质中。包膜是由病毒核酸编码的一种病毒糖蛋白，在病毒成熟的过程中以出芽的方式从寄主细胞中释放并附着在病毒衣壳表面。不同的糖蛋白在感染过程中，能够特异性的结合到细胞表面上的受体，介导病毒进入细胞，引起感染。
随着近年来病毒载体在基因与细胞治疗的应用中愈发流行，制备假病毒已成为病毒载体生产中不可或缺的一环。假病毒是指在病毒包装重组过程中使用异源病毒的外层蛋白组分来完成病毒颗粒的组装。如最初的慢病毒是从逆转录病毒家族的HIV-1改造而成，病毒进入细胞过度依赖于细胞表面特殊受体CD4，这种机制导致慢病毒只能侵染细胞表面能够表达CD4的受体的细胞。为了扩大慢病毒可侵染的细胞类型，将VSV-G(Vesicularstomatitis virus envelope protein)替换掉慢病毒本身包膜糖蛋白，使得慢病毒能够与LDL受体结合，并因LDL广泛存在于多类细胞表面，从而达到慢病毒可侵染多种细胞类型的目的。泡沫病毒的gag衣壳蛋白缺少膜靶向信号，但由于可以跟自身的Env相互作用，使得病毒颗粒成功出壳，这在逆转录病毒中是独特的。
目前常用的泡沫病毒包装方法主要有两种，1、将泡沫病毒自身包装相关的蛋白拆分成几个不同的包装载体，该包装体系获得的病毒颗粒包膜蛋白为自身的Env，感染范围较窄，无法适用于多种类型细胞感染；2、通过小分子控制的异二聚化(HD)系统，将异源包膜蛋白的C端连接上一个二聚化功能域，另一个二聚化功能域则连接在Gag蛋白上。通过加入小分子化合物，将异源蛋白和gag连接到一起，从而使gag能与异源包膜蛋白相互作用是病毒颗粒成功出壳，但该方法获得的假包膜病毒滴度往往会低5-100倍，无法被有效应用。
发明内容
本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种泡沫病毒包装载体系统及其构建方法和试剂盒。本申请采用五质粒法进行泡沫病毒包毒，获得感染能力明显增强、生产滴度明显增加的泡沫病毒包装载体系统。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
第一方面，本申请提供了一种泡沫病毒包装辅助质粒，所述泡沫病毒包装辅助质粒包括辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C中的至少一种；
所述辅助质粒A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述辅助质粒B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述辅助质粒C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在本申请的技术方案中，本申请优化后的辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C包毒情况优于要常规辅助质粒(例如Gag、Pol、Env和pCiGSΔΨ、pCiPS、pCiES)的包毒情况，可以应用于泡沫病毒包装过程中，提高泡沫病毒的包装效率，进而提高泡沫病毒滴度。
第二方面，本申请提供了一种泡沫病毒包装载体系统，所述泡沫病毒包装载体系统包括上述辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C、外源糖蛋白质粒和泡沫病毒目的质粒。
本申请在优化的辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C的基础上，在泡沫病毒包装过程中额外加入外源糖蛋白质粒(含有VSVG)能够有效提高泡沫病毒侵染细胞效率，从而达到滴度的提升。
由于VSVG蛋白会被锚定在细胞膜上，泡沫病毒在能够被正常包装并成功出壳的前提下，病毒颗粒形成成熟粒子出芽的同时会携带上细胞膜上的VSVG蛋白，从而使得泡沫病毒颗粒的包膜既含有自身的Env，也含有具有更广泛细胞靶向性的VSVG，从而提高了泡沫病毒感染细胞类型。通过本申请的装体系进行假型泡沫病毒包装，能大大提高病毒产量和功能滴度，降低生产成本的同时提高泡沫病毒的应用价值。
作为本申请所述泡沫病毒包装载体系统的优选实施方式，所述泡沫病毒目的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本申请的泡沫病毒目的质粒pFV-EGFP-T2A-Puro-EF1A-mCherry(CMV extended)可根据需求替换其中的Maker为实验要研究的目的基因。
作为本申请所述泡沫病毒包装载体系统的优选实施方式，所述外源糖蛋白质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本申请在泡沫病毒包装过程中加入外源糖蛋白质粒，可以显著提高泡沫病毒滴度。
经过转导(转导HEK293T细胞)滴度测定实验可知，在病毒包装过程中没有自身糖蛋白ENV也没有外源糖蛋白质粒时病毒滴度为1.44E+5IU/mL，说明病毒被包装出来但缺乏进入细胞所必要的糖蛋白导致荧光几乎不表达。
在病毒包装过程中加入自身糖蛋白ENV但不加入外源糖蛋白质粒时滴度为5.85E+5IU/mL，可观察到滴度相较于组A明显提升4倍左右，说明病毒被包装出来且能够有效的进入细胞。
在病毒包装过程中没有自身糖蛋白ENV但加入外源糖蛋白质粒时滴度为2.30E+5IU/mL，荧光几乎不表达，由此可以看出，泡沫病毒自身糖蛋白ENV是病毒能进入细胞的关键因素。
在病毒包装过程中加入自身糖蛋白ENV并再加入外源糖蛋白质粒时滴度达到了4.55E+6IU/mL，相较于没有泡沫病毒自身糖蛋白ENV且没有外源糖蛋白质粒提升了30倍左右，相较于有泡沫病毒自身糖蛋白ENV且没有外源糖蛋白质粒提升了8倍左右。因此在泡沫病毒包装过程中额外加入外源糖蛋白质粒能够显著提高泡沫病毒滴度。
作为本申请所述泡沫病毒包装载体系统的优选实施方式，所述辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C、泡沫病毒目的质粒和外源糖蛋白质粒的质量比为2:0.25:0.125:2:1。具体质粒的用量与使用的包装病毒规格存在关系，本领域技术人员可根据实际应用进行调整。
第三方面，本申请提供了一种泡沫病毒的构建方法，使用上述泡沫病毒包装载体系统转染宿主细胞，制备泡沫病毒。
作为本申请所述泡沫病毒的构建方法的优选实施方式，所述转染包括磷酸钙法。在其他一些具体实施例中，可根据需求替换成其他转染方式。
第四方面，本申请提供了检测上述构建方法获得的泡沫病毒滴度的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:7～8所示。
第五方面，本申请提供了上述泡沫病毒包装载体系统在试剂盒、疫苗、基因治疗试剂盒和/或肿瘤治疗药物制备的应用。
第六方面，本申请提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述泡沫病毒包装载体系统。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
一种泡沫病毒包装载体系统及其构建方法和试剂盒。本申请采用五质粒法进行泡沫病毒包毒，获得感染能力明显增强、生产滴度明显增加的泡沫病毒包装载体系统。其中，本申请在优化的辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C的基础上，在泡沫病毒包装过程中额外加入外源糖蛋白质粒能够有效提高泡沫病毒侵染细胞效率，从而达到滴度的提升，并且还能降低生产成本的同时提高泡沫病毒的应用价值。
附图说明
图1为辅助质粒pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron-gag(f)-UTR图谱；
图2为辅助质粒pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron-pol(f)-UTR图谱；
图3为辅助质粒pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron-env(f)-UTR图谱；
图4为qPCR测定泡沫病毒标准品图谱(BMP2为内参基因片段；Cis acting为泡沫病毒信号区域片段)；
图5为泡沫病毒测定滴度qPCR反应程序；
图6为不同泡沫病毒包装组合转导72h的荧光图；
图7为实施例2中泡沫病毒转导HEK293T细胞荧光图(72h)；
图8为实施例2中各组别(HEK293T细胞)滴度测定结果图；
图9为实施例2中泡沫病毒转导HT1080细胞荧光图(72h)；
图10为实施例2中各组别(HEK293T细胞)滴度测定结果图。
具体实施方式
为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本申请作进一步说明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一种可用于提高泡沫病毒滴度的试剂盒
本申请提供了一种可用于提高泡沫病毒滴度的试剂盒，该试剂盒包含辅助载体pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron-gag(f)-UTR、pRP[Exp]-CMV-human betaglobin intron-pol(f)-UTR和pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron-env(f)-UTR，辅助质粒经过商品辅助质粒优化所得到，与其他辅助质粒相比，对病毒滴度有明显提升。
具体优化过程如下：
1、取商品辅助质粒pCiGSΔΨ、pCiPS和pCiES(分别来源于https://www.addgene.org/108312/，https://www.addgene.org/60011/，https://www.addgene.org/60010/)。
2、与商品辅助质粒相比，把SV40内含子和终止子替换成了beta-globin的内含子和终止子。
分别构建获得新型辅助质粒Gag，Pol，Env，同时在Gag，Pol，Env质粒的基础上，增加了相应基因的5’UTR和3’UTR序列，构建获得泡沫病毒包装辅助质粒A，Gag-UTR(pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron-gag(f)-UTR)、辅助质粒B，Pol-UTR(pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron-pol(f)-UTR)、辅助质粒C，Env-UTR(pRP[Exp]-CMV-humanbeta globin intron-env(f)-UTR)。具体图谱见图1、图2和图3，包装辅助质粒A、包装辅助质粒B和辅助质粒C的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～3所示。
本申请构建获得3个测试用的泡沫病毒目的质粒pFV-EF1A-mCherry(来源于https://www.vectorbuilder.cn/vector/VB220217-1424erz.html)，简称PFV-EX、pFV-EF1A-mCherry-WPRE(来源于https://www.vectorbuilder.cn/vector/VB220217-1429jyr.html)，简称PFV-EX-WPRE以及PFV-EGFP-T2A-Puro-EF1A-mCherry(来源于https://www.vectorbuilder.cn/vector/VB220518-1358qvv.html)。
PFV-EX、PFV-EX-WPRE不同点在于是否使用WPRE转录调控元件，PFV-EGFP-T2A-Puro-EF1A-mCherry的不同之处在于含有两个荧光基因表达框。通过表1确定泡沫病毒辅助包装质粒的最优组合。通过表2确定加入VSVG表达载体是否提高泡沫病毒滴度。
本测试使用的VSVG包膜蛋白序列参考商业化载体(来源于https://www.addgene.org/12259/)，可根据需要，更换不同启动子介导的VSVG表达载体。
其中，泡沫病毒目的质粒pFV-EGFP-T2A-Puro-EF1A-mCherry(CMV extended)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。外源糖蛋白质粒pRP[Exp]-CMV>VSVG的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。空白对照质粒pUC19的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
表1
表2
实施例2、VSVG假型泡沫病毒包装方法
具体实验流程
1、包装：
第一天在10cm皿中接种HEK293T细胞，使其能在第二天处理时生长密度达到80％-90％。第二天，在包毒前30min将完全培养基替换为包装培养基(DMEM+5％血清)。将表1中各质粒按照不同的组合方式加入至1.5mL CaCl2溶液中混匀，边涡旋质粒—CaCl2混合物，边向其中滴加1.5mL HBS，转染体系配制完成后静置10min，然后将转染混合物逐滴加入细胞培养皿中，5h后将培养皿中的包装培养基更换培养基(DMEM+10％血清)，完成病毒包装。
2、收毒：
包毒72小时后拍照记录，随后收集泡沫病毒上清液，4℃、4000rpm，离心10min，然后利用0.45μm过滤器过滤，按病毒原液体积的二分之一加入PEG 6000，混匀后放入4℃冰箱过夜。次日，4℃、4000rpm，离心30min，弃上清，加入1mL HBSS重悬泡沫病毒沉淀。
3、转导过程拍照记录：
在加入泡沫病毒72h后拍摄转导白光和荧光图片。细胞悬液加入终浓度为12.5U/mL的Benzonase在37℃中消化30min后提取各组别细胞基因组。
4、qPCR测定泡沫病毒滴度
将内参基因BMP2片段与泡沫病毒的信号区域cis-acting片段插入到同一个骨架上(具体操作如https://www.vectorbuilder.cn/vector/VB230525-1115fya.html所示)，图谱见下图4，并利用SalI与BamHI切下相连的两个片段构建出病毒滴度测定的标准品。
取108个拷贝标准品用无菌水逐级稀释至107、106、105、104、103。按照表3配置qPCR反应体系：
表3
其中，内参引物为：
BMP2-F:TAGGGTAGACAGAGCCAAGG；
BMP2-R:AGCACAGGACAAGAAAGTCATTG；
泡沫病毒qPCR检测引物为：
FV-F：ACCTCGTTGGCATAAACCGT(SEQ ID NO:7)；
FV-R：TGGTGGTGCCATTCTGATGA(SEQ ID NO:8)。
体系配置完成后，上机，设置反应程序如下图5。
计算滴度：同一样品的FV-Quantity Mean除以BMP2-Quantity Mean则得到该样品转导时的MOI。滴度计算公式为Titer(TU/mL)＝1000×MOI×M(细胞计数值)×稀释倍数/转导体积。
6、结果分析
1)泡沫病毒包装最优组合
从转导72h照片(如图6)可以看出以Gag-UTR、Pol-UTR、Env-UTR为辅助质粒的包毒情况要略优于以Gag、Pol、Env和pCiGSΔΨ、pCiPS、pCiES为辅助质粒的包毒情况。并发现pFV-EF1A-mCherry(CMV extended)为目的质粒的包毒情况与pFV-EF1A-mCherry-WPRE(CMVextended)为目的质粒的包毒情况二者没有明显的差异。因此确认泡沫病毒最优辅助质粒为本申请改造后的pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron-gag(f)-UTR、pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron-pol(f)-UTR和pRP[Exp]-CMV-human beta globinintron-env(f)-UTR。
2)加入VSVG提高泡沫病毒滴度
从组别A、B、C和D转导72h照片(如图7)来看，不加入泡沫病毒自身ENV(组A和组C)是无法正常转导。在有泡沫病毒自身ENV的前提下加入外源糖蛋白质粒pRP[Exp]-CMV>VSVG(简称外源糖蛋白VSV-G)(组B和组D)能大幅提升泡沫病毒滴度，从而荧光强度有明显提升。
3)转导滴度测定结果如下图8，组别293T-NC为空白对照组，组别A在病毒包装过程中没有自身糖蛋白ENV也没有外源糖蛋白VSV-G时滴度为1.44E+5IU/mL，说明病毒被包装出来但缺乏进入细胞所必要的糖蛋白导致荧光几乎不表达。
组别B在病毒包装过程中加入自身糖蛋白ENV但不加入外源糖蛋白VSV-G时滴度为5.85E+5IU/mL，可观察到滴度相较于组A明显提升4倍左右，说明病毒被包装出来且能够有效的进入细胞。
组别C在病毒包装过程中没有自身糖蛋白ENV但加入外源糖蛋白VSV-G时滴度为2.30E+5IU/mL，荧光几乎不表达，由此可以看出，泡沫病毒自身糖蛋白ENV是病毒能进入细胞的关键因素。
而最后一组，组别D在病毒包装过程中加入自身糖蛋白ENV并再加入外源糖蛋白VSV-G时滴度达到了4.55E+6IU/mL，相较于没有泡沫病毒自身糖蛋白ENV且没有外源糖蛋白VSV-G组A提升了30倍左右，相较于有泡沫病毒自身糖蛋白ENV且没有外源糖蛋白VSV-G组B提升了8倍左右。因此在泡沫病毒包装过程中额外加入外源糖蛋白VSV-G能够显著提高泡沫病毒滴度。
同理，本申请加入VSVG提高泡沫病毒滴度，转导HT1080细胞同样适用。具体实验流程如上述步骤1)-5)所示。
结果分析：
取实验流程步骤2)中包装72h的泡沫病毒原液，按照转导293T细胞时用量加入到HT1080细胞中，观察记录转导72h后的HT1080细胞，荧光图如图9。得到的结果与此前转导293T细胞结果一致，不加入泡沫病毒自身ENV(组A和组C)是无法正常转导。在有泡沫病毒自身ENV的前提下加入VSVG质粒(组B和组D)能大幅提升泡沫病毒滴度，从而荧光强度有明显提升。
转导滴度测定结果如图10，组别HT1080-NC为空白对照组，组别A在病毒包装过程中没有自身糖蛋白ENV也没有外源糖蛋白VSV-G时滴度为9.98E+4IU/mL，说明病毒被包装出来但缺乏进入细胞所必要的糖蛋白导致荧光几乎不表达。
组别B在病毒包装过程中加入自身糖蛋白ENV但不加入外源糖蛋白VSV-G时滴度为5.59E+5IU/mL，可观察到滴度相较于组A明显提升5倍左右，说明病毒被包装出来且能够有效的进入细胞。
组别C在病毒包装过程中没有自身糖蛋白ENV但加入外源糖蛋白VSV-G时滴度为1.56E+5IU/mL，荧光几乎不表达，由此可以看出，泡沫病毒自身糖蛋白ENV是病毒能进入细胞的关键因素。
而最后一组，组别D在病毒包装过程中加入自身糖蛋白ENV并再加入外源糖蛋白VSV-G时滴度达到了7.25E+6IU/mL，相较于没有泡沫病毒自身糖蛋白ENV且没有外源糖蛋白VSV-G组A提升了70倍左右，相较于有泡沫病毒自身糖蛋白ENV且没有外源糖蛋白VSV-G组B提升了13倍左右。得到的结果与转导293T细胞一致。因此在泡沫病毒包装过程中额外加入外源糖蛋白VSV-G能够显著提高泡沫病毒滴度。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种泡沫病毒包装辅助质粒，其特征在于，所述泡沫病毒包装辅助质粒包括辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C中的至少一种；
所述辅助质粒A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述辅助质粒B的核苷酸序列如SEQID NO:2所示；所述辅助质粒C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种泡沫病毒包装载体系统，其特征在于，所述泡沫病毒包装载体系统包括如权利要求1所述的辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C、外源糖蛋白质粒和泡沫病毒目的质粒。
3.如权利要求2所述的泡沫病毒包装载体系统，其特征在于，所述泡沫病毒目的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.如权利要求2所述的泡沫病毒包装载体系统，其特征在于，所述外源糖蛋白质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
5.如权利要求2所述的泡沫病毒包装载体系统，其特征在于，所述辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C、泡沫病毒目的质粒和外源糖蛋白质粒的质量比为2:0.25:0.125:2:1。
6.一种泡沫病毒的构建方法，其特征在于，使用如权利要求1～5任一项所述的泡沫病毒包装载体系统转染宿主细胞，制备泡沫病毒。
7.如权利要求6所述的泡沫病毒的构建方法，其特征在于，所述转染包括磷酸钙法。
8.检测如权利要求6或7所述构建方法获得的泡沫病毒滴度的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO:7～8所示。
9.如权利要求2～5任一项所述的泡沫病毒包装载体系统在试剂盒、疫苗、细胞基因治疗试剂盒和/或肿瘤治疗药物制备的应用。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2～5任一项所述的泡沫病毒包装载体系统。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010111608A1 (en) * | 2009-03-26 | 2010-09-30 | Indiana University Research And Technology Corporation | Foamyvirus vectors and methods of use |
| CN101979606A (zh) * | 2010-11-01 | 2011-02-23 | 陕西师范大学 | 一种以腺病毒表达系统产生的人逆转录泡沫病毒载体 |
| US20120141440A1 (en) * | 2009-03-19 | 2012-06-07 | Axel Rethwilm | Foamyvirus vectors and methods of use |
| CN108396027A (zh) * | 2018-02-27 | 2018-08-14 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞DEAF1基因及其特异性的sgRNA |
| CN110029129A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-07-19 | 华南农业大学 | 一种表达鸡st3gal 1基因的mdck稳转细胞株的构建方法 |
| CN110684804A (zh) * | 2019-10-15 | 2020-01-14 | 上海交通大学 | 递送外源rnp的慢病毒载体及其制备方法 |
| CN112168958A (zh) * | 2020-09-21 | 2021-01-05 | 上海交通大学 | 基于慢病毒外壳修饰和mRNA递送的SARS-CoV-2疫苗及其制备方法 |
| WO2021212279A1 (zh) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | 广东东阳光药业有限公司 | 慢病毒的滴度提高型转移质粒 |
| WO2023080363A1 (ko) * | 2021-11-05 | 2023-05-11 | 중앙대학교 산학협력단 | 2-플라스미드 시스템으로 제조된 가짜 포미 바이러스 및 이의 용도 |
-
2023
- 2023-09-21 CN CN202311220866.9A patent/CN117247974B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120141440A1 (en) * | 2009-03-19 | 2012-06-07 | Axel Rethwilm | Foamyvirus vectors and methods of use |
| WO2010111608A1 (en) * | 2009-03-26 | 2010-09-30 | Indiana University Research And Technology Corporation | Foamyvirus vectors and methods of use |
| CN101979606A (zh) * | 2010-11-01 | 2011-02-23 | 陕西师范大学 | 一种以腺病毒表达系统产生的人逆转录泡沫病毒载体 |
| CN108396027A (zh) * | 2018-02-27 | 2018-08-14 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞DEAF1基因及其特异性的sgRNA |
| CN110029129A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-07-19 | 华南农业大学 | 一种表达鸡st3gal 1基因的mdck稳转细胞株的构建方法 |
| CN110684804A (zh) * | 2019-10-15 | 2020-01-14 | 上海交通大学 | 递送外源rnp的慢病毒载体及其制备方法 |
| WO2021212279A1 (zh) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | 广东东阳光药业有限公司 | 慢病毒的滴度提高型转移质粒 |
| CN112168958A (zh) * | 2020-09-21 | 2021-01-05 | 上海交通大学 | 基于慢病毒外壳修饰和mRNA递送的SARS-CoV-2疫苗及其制备方法 |
| WO2023080363A1 (ko) * | 2021-11-05 | 2023-05-11 | 중앙대학교 산학협력단 | 2-플라스미드 시스템으로 제조된 가짜 포미 바이러스 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| FRANKE, K.E.等: "登录号：DL232435", GENBANK数据库, 20 November 2008 (2008-11-20) * |
| MAURER, B等: "登录号：M54978", GENBANK数据库, 1 April 2002 (2002-04-01) * |
| SATO, C.等: "登录号：MC003544", GENBANK数据库, 29 May 2020 (2020-05-29) * |
| 余荭等: "牛泡沫病毒BFV3026细胞感染性的确立及包装细胞系的建立", 病毒学报, no. 4, 31 December 2003 (2003-12-31) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117247974B (zh) | 2024-04-05 |
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