CN117244081A - 一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液 - Google Patents

一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液。所述mRNA制剂洗液的成分及重量比例为：0.002%‑0.01%mRNA，0.2%‑1%硫酸肝素，0.1%‑1%肌醇磷脂，0.045%‑10%聚乙二醇，0%‑1%聚乙烯醇，0%‑1%聚丙烯醚，0.045%‑0.9%氯化钠，0%‑0.31%乳酸，0%‑0.31%乳酸钠，0%‑0.02%氯化钾，0%‑0.027%钙氯化物，其余为注射用水。研究结果表明，本发明所提供的mRNA制剂洗液能够通过改变肿瘤种植的免疫微环境，抑制术后游离瘤栓及肿瘤细胞的种植和生长，从而降低术后癌症复发和转移的风险，以达到控制肿瘤进化或治愈癌症的目的。

Description

一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液
技术领域
本发明涉及医学领域中肿瘤手术的辅助用品，尤其涉及到一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液。
背景技术
采用洗液对肿瘤手术创口或体内手术区清扫是一种常见的外科操作，主要目的之一是预防创口感染、减少创口感染和促进创口愈合。目前肿瘤手术创口的的洗液通常生理盐水、无菌水、碘酒、氯己定或添加了非离子表面活性剂（如聚山梨醇酯）的制剂洗液等。但是，这些用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的常规洗液不能完全消除术后癌症复发和转移的风险。原因如下：（1）术后残留肿瘤细胞：即使在进行彻底的手术切除后，仍有可能存在微小的残留肿瘤细胞。这些细胞可能位于创口周围的邻近组织中或通过血液和淋巴系统转移到其他部位。因此，采用常规的洗液对肿瘤手术创口或体内手术区进行清扫，无法完全消除术后复发和转移的风险；（2）微转移和单个肿瘤细胞：肿瘤的复发和转移往往不仅仅依赖于手术创口周围的局部情况，还受到体内微转移和单个肿瘤细胞的影响。这些微转移和单个肿瘤细胞可能已经存在于手术前，并隐匿在远离手术创口的其他部位。它们具有潜在的复发和转移能力，不受常规的洗液对肿瘤手术创口或体内手术区进行清扫的影响；（3）肿瘤特性和分子机制：肿瘤的复发和转移是一个复杂的过程，涉及多个分子机制和肿瘤特性的影响。这些因素包括肿瘤的侵袭性、血管生成、免疫逃逸等。尽管常规的洗液对肿瘤手术创口或体内手术区进行清扫可以控制局部情况，但对于这些与肿瘤特性和分子机制相关的因素，常规的洗液对肿瘤手术创口或体内手术区进行清扫的影响有限。尽管如此，肿瘤手术创口或体内手术区清扫仍然是恶性肿瘤治疗中重要的一环。因此，非常需要开发一种能够辅助提高癌症术后复发和转移控制效果的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的洗液，以最大程度地降低术后癌症复发和转移的风险。
有鉴于此，本发明提供了一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，用于辅助降低术后癌症复发和转移的风险。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于肿瘤手术创口清扫或体内手术区清扫现有现有技术的不足，提供了一种可以克服上述问题或者部分地解决上述问题的一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，通过改变肿瘤种植的免疫微环境，抑制术后肿瘤残留（游离瘤栓及肿瘤细胞）的种植和生长，以最大程度地降低术后癌症复发和转移的风险，达到控制肿瘤进化或治愈癌症的目的。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是：
一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，其成分中含有mRNA。
进一步地，所述mRNA制剂洗液的成分及重量比例为：0.002%-0.01% mRNA，0.2%-1%硫酸肝素，0.1%-1%肌醇磷脂，0.045%-10% 聚乙二醇，0%-1% 聚乙烯醇，0%-1% 聚丙烯醚，0.045%-0.9% 氯化钠，0%-0.31%乳酸，0%-0.31%乳酸钠，0%-0.02% 氯化钾，0%-0.027%钙氯化物，其余为注射用水。
进一步地，所述mRNA制剂洗液中的mRNA为能够在人体或小鼠体内表达IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS的线性mRNA或环状mRNA。
进一步地，所述mRNA制剂洗液中的mRNA为能够在人体或小鼠体内表达所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS的线性mRNA或环状mRNA中的两种或两种以上的混合mRNA。
进一步地，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例范围为0:100到100:0。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为0:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为1:100。在一些实施例中，在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例比例为2:100。在一些实施例中，在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为3:100。在一些实施例中，在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为4:100。在一些实施例中，在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为5:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为6-10:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为11-15:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为16-20:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为21-30:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为31-40:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为51-60:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为61-70:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为71-80:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为81-90:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为91-99:100。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:1。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:2。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:3。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:4。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:5。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:6-10。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:11-15。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:16-20。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:21-30。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:31-40。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:41-50。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:51-60。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:61-70。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:71-80。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:81-90。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为100:91-99。在一些实施例中，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例为0:100。
进一步地，所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA或环状mRNA含有IRES元件。
优选地，所述的线性mRNA或环状mRNA所含的IRES元件具有SEQ ID 1- SEQ ID 10所示的任一序列所组成的组中的一种或或两种或多种序列的核苷酸序列。
优选地，所述的线性mRNA或环状mRNA所含的IRES元件具有SEQ ID 1-SEQ ID 10任一序列所示的序列的反向互补序列的核苷酸序列。
优选地，所述的线性mRNA或环状mRNA所含的IRES元件具有在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与SEQ ID 1-SEQ ID 10任一序列所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列。
进一步地，一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，所述mRNA制剂洗液的制备方法是通过搅拌或超声振荡的方式把前面所述配方量的硫酸肝素、肌醇磷脂与mRNA、聚乙二醇、聚乙烯醇，聚丙烯醚，氯化钠，乳酸，乳酸钠，氯化钾，钙氯化物和注射水混合，制成膜状物或液体。
进一步地，一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，所述mRNA制剂洗液的制备方法中，包括以下具体步骤：
第一步，将前面所述配方量的肌醇磷脂溶于注射用水中，搅拌或超声振荡，制成重量0.1%-1%溶液，放置一段时间；再用过滤膜过滤备用，制成A溶液；
第二步，将前面所述配方量的硫酸肝素、mRNA、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯醚溶于少量注射用水中，搅拌或超声振荡, 制成B溶液；
第三步，往第二步制成的B溶液中加入部分氯化钠、乳酸、乳酸钠、氯化钾、钙氯化物，搅拌或超声振荡, 制成C溶液；
第四步，将第三步制成的C溶液中加入部分氯化钠、乳酸、乳酸钠、氯化钾、钙氯化物，搅拌或超声振荡一段时间，再用过滤膜过滤备用，制成D溶液；
第五步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水调节乳酸、乳酸钠、氯化钾、钙氯化物含量在配方范围，并用氯化钠调节等渗；
第六步，第五步中调节好的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液按规格灌装到塑料瓶中密封;
第七步，将第六步中生产合格的塑料瓶在灭菌柜中灭菌后包装。
优选地，所述搅拌或超声振荡的时间为5-25分钟。
优选地，所述过滤膜的孔径为0.2-0.4微米。
进一步地，一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液的应用，是将其用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫区域的冲洗。
进一步地，一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液的应用，是将其涂抹在肿瘤手术创口或体内手术区的清扫区域。
进一步地，一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液的应用，是将其附着在无菌敷料上，用于肿瘤手术创口的包扎。
优选地，所述mRNA制剂洗液的渗透压为281mmol/L-327mmol/L。本发明中mRNA制剂洗液的渗透压按《中华人民共和国药典》(2015年版四部)中渗透压摩尔浓度测定。
更优选地，所述mRNA制剂洗液的渗透压为303mmol/L。
优选地，所述mRNA制剂洗液在20摄氏度下的动力粘度为1.2-14.8mPa·s。本发明中mRNA制剂洗液的动力粘度的检测方法参考《GB/T 10247-2008粘度测量方法》中的规定进行。
更优选地，所述mRNA制剂洗液在20℃下的动力粘度为7.2 mPa·s。
进一步地，一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液的使用对象可以为动物，较佳的，可以为哺乳动物，具体地，可以是灵长类动物，如人、猴等。
与现有技术相比，本发明的一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液具有以下有益效果：
1）本发明mRNA制剂洗液含有mRNA制剂，可以改变肿瘤种植的免疫微环境，抑制术后肿瘤残留（游离瘤栓及肿瘤细胞）的种植和生长，以最大程度地降低术后癌症复发和转移的风险；
2）本发明mRNA制剂洗液含有硫酸肝素和肌醇磷脂，且具有281mmol/L-327mmol/L的适中渗透压，在肿瘤手术创口或体内手术区进行机械性清创清扫和自溶清创清扫的同时起到保护创口、防粘促愈和渗液管理甚至快速止血的作用，不同于临床中常用的伤口灌洗或压力性冲洗的单一机械性清创作用的冲洗液；
3）本发明mRNA制剂洗液在20摄氏度下具有 (1.2-14.8)mPa·s的动力粘度，不仅可用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫区域的冲洗、涂抹，而且可以将其附着在无菌敷料上，用于肿瘤手术创口的包扎；
4）本发明mRNA制剂洗液不仅成本低、工艺周期短、生态友好，而且洗液中的mRNA可进行编程，利于不同肿瘤患者在手术进行前进行个性化定制。
附图说明
图1是本发明的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液瓶装产品图片。
实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。本发明的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限制本发明，且本发明的实施例并不局限于说明书中给出的实施例。实施例中未注明具体实验条件或操作条件的按常规条件制作，或按材料供应商推荐的条件制作。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的组合关系并不排斥在所述组合还可以存在其他组合或在这些明确提到的组合之间还可以插入其他组合，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。在下述实施例中，所使用到的试剂、材料、仪器如没有特殊的说明，均可通过商业途径获得。在下述实施例中，本技术人员均可通过技术手册得知或获知所使用到的检测原理、方法步骤及质控标准。图1是用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液瓶装产品图片。
实施例1 mRNA制剂洗液的mRNA构建和验证流程
第一步，通过中国授权专利202211194884X或国际专利PCT/CN2023/072236能够在人体或小鼠体内表达本发明所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS的mRNA的IRES元件进行预测；
第二步，通过环状mRNA可编程药物的数字化平台（中国专利2022101147883、2022104221991、2023104818780）筛选能编码能够在人体或小鼠体内表达本发明所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS的mRNA的IRES序列；
第三步，构建FLuc-IRES-RLuc双荧光素酶标记的质粒，并在质粒内分别克隆空载、野生型IRES序列和突变型IRES序列。通过双荧光素酶报告实验，证明了所预测并筛选的具有SEQ ID 1- SEQ ID 10所示氨基酸序列的IRES序列表达本发明所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS的活性强；
第四步，同时从环状mRNA可编程药物的数字化平台（中国专利2022101147883、2022104221991、2023104818780）的RNA结构元件库根据翻译效率或和环化效率的大小匹配。其中，线性mRNA匹配：第二外显子的核苷酸序列，如SEQ ID 11-13所示；5’间隔区的核苷酸序列，如SEQ ID 14-16所示；3’间隔区的核苷酸序列，如SEQ ID 17-19；第一外显子的核苷酸序列，如SEQ ID 20-22所示。此外，环状mRNA匹配：第二外显子的核苷酸序列，如SEQ ID23-25所示；5’间隔区的核苷酸序列，如SEQ ID 26-28所示；3’间隔区的核苷酸序列，如SEQID 29-31；第一外显子的核苷酸序列，如SEQ ID 32-34所示；
第五步，制备Flag标记的第四步所设计优化的线性mRNA或环状mRNA的质粒及空载质粒，并将质粒通过Lipo 3000转染至HEK293T细胞内，48小时后提取细胞中的总蛋白，通过Western Blot实 验，验证Flag所标记的本发明所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS；
第六步，转染同样的质粒后，通过Western Bolt实验得到电泳胶，通过考马斯亮蓝染色后，将相应位置的胶条进行质谱检测。通过分析质谱检测的结果，验证了第二步所设计优化的线性mRNA或环状mRNA的确能够编码本发明所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS。
实施例2 CMC工艺库中环形mRNA的克级规模合成工艺优化流程
第一步，从环状mRNA可编程药物的数字化平台（中国专利2022101147883、2022104221991、2023104818780）的CMC工艺库根据成本核算、制备、分离纯化的难易匹配设计线性mRNA或环状mRNA的克级规模合成工艺路线；
第二步，从环状mRNA可编程药物的数字化平台（中国专利2022101147883、2022104221991、2023104818780）的RNA结构元件库根据环化效率的大小设计mRNA的前驱物。包括：本发明所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS的编码区，具有SEQ ID 1- SEQ ID 10所示核苷酸序列的IRES，线性mRNA的如SEQ ID 11-13所示核苷酸序列的第二外显子，线性mRNA的如SEQ ID 14-16核苷酸序列所示的5’间隔区的，线性mRNA的SEQ ID 17-19核苷酸序列所示的3’间隔区的，线性mRNA的如SEQ ID 20-22核苷酸序列所示的第一外显子；环状mRNA的如SEQ ID 23-25核苷酸序列所示的第二外显子，环状mRNA的如SEQ ID 26-28核苷酸序列所示的5’间隔区的，环状mRNA的如SEQ ID 29-31核苷酸序列所示的3’间隔区的，环状mRNA的如SEQ ID 32-34核苷酸序列所示的第一外显子；具有SEQ ID 35-36核苷酸序列所示的启动子，具有SEQ ID 37-39核苷酸序列所示的5’同源臂，具有SEQ ID 40-42核苷酸序列的3’内含子，具有SEQ ID 43-45所示核苷酸序列的5’内含子，具有SEQ ID 46-48所示核苷酸序列的3’同源臂，以及可用于具有SEQ ID 49-51所示核苷酸序列的质粒线性化的酶切位点；
第三步，合成第二步所设计mRNA前驱物的基因片段，同时将合成的穿刺菌在37摄氏度，适当转速下活化一定时间，取活化菌液在37摄氏度，适当转速下培养过夜。然后，抽提质粒，测定OD值和质粒提取浓度；
第四步，将一定量质粒，酶（1000units）, 10×cutsmart buffer和若干体积无酶水混合，并将混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行OD值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后DNA浓度;
第五步，线性mRNA制备：将一定量质粒模板，10×reaction buffer，浓度为20毫摩尔每升的ATP，浓度为20毫摩尔每升的CTP，浓度为20毫摩尔每升的UTP，浓度为20毫摩尔每升的GTP，T7 RNA Polymerase Mix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在37摄氏度孵育一定时间，然后加入DNase I在37摄氏度消化一定时间。将所获得的混合物进行纯化。对纯化产物进行OD值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对线性mRNA大小进行识别；测定所合成的线性mRNA的纯度;
第六步，环状mRNA制备：将第五步骤中制备的适量线性mRNA，20毫摩尔每升GTP溶液和若干体积由50毫摩尔每升的Tris-HCl，10毫摩尔每升的氯化镁及1毫摩尔每升的DTT混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的混合溶液在55摄氏度加热一定时间。将所获得的混合物进行纯化。对纯化产物进行OD值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环状mRNA大小进行鉴定；测定mRNA环化效率和纯度;
第七步，验证：将第五步骤或第六步骤中所获得的mRNA与RT prmier,Primerscript RT Enzye Mix I和若干体积无核酸酶水混合合成的混合液在37摄氏度加热一定时间，随后在85摄氏度加热一定时间，最后在4摄氏度保存；将所获得的一定体积逆转录溶液与适量10×buffer，dNTP，10微摩尔每升primer-F，10微摩尔每升primer-R，Taq酶，无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置一定时间，60摄氏度放置一定时间，72摄氏度放置一定时间（循环次数为40次），4摄氏度放置保存的PCR程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列，证明已成功制备所设计的目的mRNA。
实施例3 实施例2中所制备的mRNA表达功能的验证流程
取小鼠脾细胞1×106个按10:1的比例与骨髓来源的树突状细胞共培养并电转10微克实施例2中所制备的mRNA，加入Brefeldin A处理。5小时后，收集处理过的细胞进行细胞活性抗体染色，固定后，破膜剂进行破膜，然后分别进行所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS的染色。进行流式细胞仪检测，分析脾细胞中所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS产生情况。电转所制备的mRNA在脾细胞中所产生的的所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS表达量是未加入任何mRNA的4.2-7.7倍。说明本发明实施例2中所制备的mRNA都能够高水平表达本发明所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS。
实施例4一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液制备
第一步，称取符合监管要求的肌醇磷脂1克, 缓慢加入装有注射用水0.5升的灭菌不锈钢反应釜中，搅拌溶解，制成重量0.2%溶液，放置30分钟；再用0.4微米过滤膜过滤备用，制成A溶液；
第二步，将按表1配方量的2克硫酸肝素、0.02克实施例2中所制备的mRNA（0.005克序列为SEQ ID 52的表达GM-CSF的线性mRNA、0.005克序列为SEQ ID 53的表达CCL13的环状mRNA、0.005克序列为SEQ ID 54的表达CD70的线性mRNA、0.005克序列为SEQ ID 55的表达CD27的环状mRNA）、0.45克聚乙二醇溶于0.25升注射用水中，超声振荡5分钟, 制成B溶液；
；
第三步，往第二步制成的B溶液中加入2克氯化钠，超声振荡10分钟, 制成C溶液；
第四步，将第三步制成的C溶液中加入4克氯化钠，搅拌或超声振荡5分钟，再用0.2微米过滤膜过滤备用，制成D溶液；
第五步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水和3克氯化钠调节，渗透压为 327mmol/L和动力粘度为1.2 mPa·s；
第六步，第五步中调节好的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液进行按100毫升每瓶的规格灌装到瓶中密封；
第七步，将第六步中生产合格的瓶装产品在灭菌柜中灭菌后包装。
实施例5一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液制备
第一步，称取符合监管要求的肌醇磷脂5克, 缓慢加入装有注射用水0.5升的灭菌不锈钢反应釜中，搅拌溶解，制成重量1%溶液，放置30分钟；再用0.4微米过滤膜过滤备用，制成A溶液；
第二步，将按表2配方量的3克硫酸肝素、0.05克实施例2中所制备的mRNA（0.03克序列为SEQ ID 56的表达IL-12sc的线性mRNA、0.01克序列为SEQ ID 57的表达CXCL10的线性mRNA、0.005克序列为SEQ ID 58的表达ICOSL的线性mRNA、0.005克序列为SEQ ID 59的表达CD28的线性mRNA）、9克聚乙二醇溶于0.25升注射用水中，超声振荡10分钟, 制成B溶液；
；
第三步，往第二步制成的B溶液中加入2克氯化钠，超声振荡10分钟, 制成C溶液；
第四步，将第三步制成的C溶液中加入4克氯化钠，搅拌或超声振荡5分钟，再用0.2微米过滤膜过滤备用，制成D溶液；
第五步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水和3克氯化钠调节，渗透压为 327mmol/L和动力粘度为1.2 mPa·s；
第六步，第五步中调节好的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液进行按100毫升每瓶的规格灌装到塑料瓶中密封；
第七步，将第六步中生产合格的塑料瓶在灭菌柜中灭菌后包装。
实施例6 一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液制备
第一步，称取符合监管要求的肌醇磷脂5克, 缓慢加入装有注射用水0.5升的灭菌不锈钢反应釜中，搅拌溶解，制成重量1%溶液，放置30分钟；再用0.4微米过滤膜过滤备用，制成A溶液；
第二步，将按表3配方量的3克硫酸肝素、实施例2中所制备的mRNA（0.04克序列为SEQ ID 60的表达IFNa的环状mRNA、0.02克序列为SEQ ID 61的表达CXCL9的环状mRNA、0.01克序列为SEQ ID 62的表达GITRL的环状mRNA、0.01克序列为SEQ ID 63的表达ICOS的环状mRNA）0.08克、9克聚乙二醇溶于0.25升注射用水中，超声振荡10分钟, 制成B溶液；
；
第三步，往第二步制成的B溶液中加入2克氯化钠，超声振荡5分钟, 制成C溶液；
第四步，将第三步制成的C溶液中加入2克氯化钠，搅拌或超声振荡7分钟，再用0.2微米过滤膜过滤备用，制成D溶液；
第五步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水和1克氯化钠调节，渗透压为 306mmol/L和动力粘度为2.3 mPa·s；
第六步，第五步中调节好的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液进行按100毫升每瓶的规格灌装到瓶中密封；
第七步，将第六步中生产合格的瓶装产品在灭菌柜中灭菌后包装。
实施例7一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液制备
第一步，称取符合监管要求的肌醇磷脂9克, 缓慢加入装有注射用水0.5升的灭菌不锈钢反应釜中，搅拌溶解，制成重量1%溶液，放置30分钟；再用0.4微米过滤膜过滤备用，制成A溶液；
第二步，将按表4配方量的6克硫酸肝素、实施例2中所制备的mRNA（序列为SEQ ID64的表达IL-2的环状mRNA）0.1克 mRNA、10克聚乙二醇溶于0.35升注射用水中，超声振荡25分钟, 制成B溶液；
；
第三步，往第二步制成的B溶液中加入0.5克氯化钠，超声振荡5分钟, 制成C溶液；
第四步，将第三步制成的C溶液中加入0.2克氯化钠，搅拌或超声振荡3分钟，再用0.2微米过滤膜过滤备用，制成D溶液；
第五步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水和0.3克氯化钠调节，渗透压为 299mmol/L和动力粘度为2.1 mPa·s；
第六步，第五步中调节好的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液进行按100毫升每瓶的规格灌装到塑料瓶中密封；
第七步，将第六步中生产合格的塑料瓶在灭菌柜中灭菌后包装。
实施例8一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液制备
第一步，称取符合监管要求的肌醇磷脂9克, 缓慢加入装有注射用水0.5升的灭菌不锈钢反应釜中，搅拌溶解，制成重量1%溶液，放置30分钟；再用0.4微米过滤膜过滤备用，制成A溶液；
第二步，将按表5配方量的6克硫酸肝素、实施例2中所制备的mRNA（0.02克序列为SEQ ID 64的表达IL-2的环状mRNA、0.01克序列为SEQ ID 65的表达CXCL11的线性mRNA）0.03克 mRNA、10克聚乙二醇溶于0.35升注射用水中，超声振荡25分钟, 制成B溶液；
；
第三步，往第二步制成的B溶液中加入0.15克氯化钠，超声振荡5分钟, 制成C溶液；
第四步，将第三步制成的C溶液中加入0.1克氯化钠，搅拌或超声振荡3分钟，再用0.2微米过滤膜过滤备用，制成D溶液；
第五步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水和0.1克氯化钠调节，渗透压为 281mmol/L和动力粘度为8.9 mPa·s；
第六步，第五步中调节好的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液进行按100毫升每瓶的规格灌装到瓶中密封；
第七步，将第六步中生产合格的瓶装产品在灭菌柜中灭菌后包装。
实施例9一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液制备
第一步，称取符合监管要求的肌醇磷脂10克, 缓慢加入装有注射用水0.2升的灭菌不锈钢反应釜中，搅拌溶解，制成重量5%溶液，放置30分钟；再用0.4微米过滤膜过滤备用，制成A溶液；
第二步，将按表6配方量的10克硫酸肝素、实施例2中所制备的mRNA（序列为SEQ ID66的表达GITR的线性mRNA）0.1克、100克聚乙二醇、1克聚丙烯醚溶于0.65升注射用水中，超声振荡30分钟, 制成B溶液；
；
第三步，往第二步制成的B溶液中加入0.15克氯化钠、0.5克乳酸、0.5克乳酸钠、0.05克氯化钾、0.05克钙氯化物，超声振荡30分钟, 制成C溶液；
第四步，将第三步制成的C溶液中加入0.15克氯化钠、0.3克乳酸、0.3克乳酸钠、0.03克氯化钾、0.03克钙氯化物，超声振荡30分钟,再用0.2微米过滤膜过滤备用，制成D溶液；
第五步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水调节乳酸、乳酸钠、氯化钾、钙氯化物含量在配方范围，并用氯化钠调节等渗；
第六步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水和0.1克氯化钠、0.2克乳酸、0.2克乳酸钠、0.02克氯化钾、0.02克钙氯化物调节，渗透压为 285mmol/L和动力粘度为14.8 mPa·s；
第七步，第五步中调节好的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液进行按100毫升每瓶的规格灌装到瓶中密封；
第八步，将第六步中生产合格的瓶装产品在灭菌柜中灭菌后包装。
实施例10 一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液制备
第一步，称取符合监管要求的肌醇磷脂10克, 缓慢加入装有注射用水0.2升的灭菌不锈钢反应釜中，搅拌溶解，制成重量5%溶液，放置30分钟；再用0.4微米过滤膜过滤备用，制成A溶液；
第二步，将按表7配方量的8克硫酸肝素、实施例2中所制备的mRNA（序列为SEQ ID67的表达CD40的环状mRNA）0.085克、70克聚乙二醇、0.1克聚丙烯醚溶于0.65升注射用水中，超声振荡30分钟, 制成B溶液；
；
第三步，往第二步制成的B溶液中加入0.5克氯化钠，超声振荡5分钟, 制成C溶液；
第四步，将第三步制成的C溶液中加入0.3克氯化钠、1克乳酸、1克乳酸钠、0.1克氯化钾、0.1克钙氯化物，搅拌或超声振荡23分钟，再用0.2微米过滤膜过滤备用，制成D溶液；
第五步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水和0.1克氯化钠、1克乳酸、0.5克乳酸钠、0.05克氯化钾、0.1克钙氯化物调节，渗透压为 308mmol/L和动力粘度为11.5 mPa·s；
第六步，第五步中调节好的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液进行按100毫升每瓶的规格灌装到瓶中密封；
第七步，将第六步中生产合格的瓶装产品在灭菌柜中灭菌后包装。
实施例11一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液制备
第一步，称取符合监管要求的肌醇磷脂5克, 缓慢加入装有注射用水0.2升的灭菌不锈钢反应釜中，搅拌溶解，制成重量25%溶液，放置30分钟；再用0.4微米过滤膜过滤备用，制成A溶液；
第二步，将按表8配方量的10克硫酸肝素、实施例2中所制备的mRNA（0.03克序列为SEQ ID 68的表达OX40L的环状mRNA、0.03克序列为SEQ ID 69的表达4-1BB的线性mRNA）0.06克 mRNA、40克聚乙二醇、2克聚丙烯醚溶于0.65升注射用水中，超声振荡30分钟, 制成B溶液；
；
第三步，往第二步制成的B溶液中加入2克氯化钠，超声振荡5分钟, 制成C溶液；
第四步，将第三步制成的C溶液中加入1克氯化钠、1克乳酸、1克乳酸钠、0.1克氯化钾、0.1克钙氯化物，搅拌或超声振荡23分钟，再用0.2微米过滤膜过滤备用，制成D溶液；
第五步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水和1克氯化钠、1克乳酸、0.5克乳酸钠、0.05克氯化钾、0.1克钙氯化物调节，渗透压为 313mmol/L和动力粘度为9.2 mPa·s；
第六步，第五步中调节好的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液进行按100毫升每瓶的规格灌装到瓶中密封；
第七步，将第六步中生产合格的瓶装产品在灭菌柜中灭菌后包装。
实施例12一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液制备
第一步，称取符合监管要求的肌醇磷脂3克, 缓慢加入装有注射用水0.2升的灭菌不锈钢反应釜中，搅拌溶解，制成重量15%溶液，放置30分钟；再用0.4微米过滤膜过滤备用，制成A溶液；
第二步，将按表9配方量的5克硫酸肝素、实施例2中所制备的0.04克序列为SEQ ID70的表达IL-23的环状mRNA、70克聚乙二醇、0.5克聚丙烯醚溶于0.65升注射用水中，超声振荡30分钟, 制成B溶液；
；
第三步，往第二步制成的B溶液中加入3克氯化钠，超声振荡5分钟, 制成C溶液；
第四步，将第三步制成的C溶液中加入3克氯化钠、1克乳酸、0.5克乳酸钠、0.1克氯化钾、0.15克钙氯化物，搅拌或超声振荡23分钟，再用0.2微米过滤膜过滤备用，制成D溶液；
第五步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水和1克氯化钠、1克乳酸、0.5克乳酸钠、0.1克氯化钾、0.1克钙氯化物调节，渗透压为 315mmol/L和动力粘度为13.3 mPa·s；
第六步，第五步中调节好的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液进行按100毫升每瓶的规格灌装到瓶中密封；
第七步，将第六步中生产合格的瓶装产品在灭菌柜中灭菌后包装。
实施例13一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液制备
第一步，称取符合监管要求的肌醇磷脂5克, 缓慢加入装有注射用水0.2升的灭菌不锈钢反应釜中，搅拌溶解，制成重量15%溶液，放置30分钟；再用0.4微米过滤膜过滤备用，制成A溶液；
第二步，将按表10配方量的5克硫酸肝素、实施例2中所制备的序列为SEQ ID 71的表达CX3CL1的线性mRNA0.05克、20克聚乙二醇、8克聚丙烯醚溶于0.65升注射用水中，超声振荡30分钟, 制成B溶液；
；
第三步，往第二步制成的B溶液中加入3克氯化钠，超声振荡5分钟, 制成C溶液；
第四步，将第三步制成的C溶液中加入1克氯化钠、1克乳酸、1克乳酸钠、0.1克氯化钾、0.15克钙氯化物，搅拌或超声振荡23分钟，再用0.2微米过滤膜过滤备用，制成D溶液；
第五步，将第一步得到的A溶液与第四步的D溶液进行混合，加注射用水和1克氯化钠、1克乳酸、0.5克乳酸钠、0.05克氯化钾、0.05克钙氯化物调节，渗透压为 312mmol/L和动力粘度为8.7 mPa·s；
第六步，第五步中调节好的用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液进行按100毫升每瓶的规格灌装到瓶中密封；
第七步，将第六步中生产合格的瓶装产品在灭菌柜中灭菌后包装。
实施例14一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液的抑菌功能验证
抑菌功能验证按照中国药典2020版附录1201抗生素微生物检定法中的管碟法进行测定。第一步，菌株准备：选择枯草芽孢杆菌（表11中简称为“枯草”）、藤黄微球菌（表11中简称为“藤黄”）、金黄色葡萄球菌（表11中简称为“金黄”）、大肠杆菌（表11中简称为“大肠”）、啤酒酵母（表11中简称为“啤酒”）、曲霉和青霉为目标菌株进行实验，以琼脂培养基培养并扩增目标菌株，确保其在实验中的纯度和活性；第二步，筛选浓度：根据洗液的预期抑菌效果，进行一系列浓度的稀释试验，以确定最佳的抑菌浓度范围；第三步，本发明实施例4-实施例13的产品，生理盐水，抑菌对照标准品1和无抑菌对照标准品2为对照，按照中国药典2020版附录1201抗生素微生物检定法中的管碟法进行抑菌功能验证；第四步，经24h或72h 培养后，观察样品对不同菌种的抑制效果，用游标卡尺测量抑菌圈大小，抑菌圈直径大于7.8mm 者，判为有抑菌作用（表11中简称为“+”）；抑菌圈直径小于或等于7.8mm 者，判为无抑菌作用（表11中简称为“-”）。3次重复试验均有抑菌作用者，取平均值作为最终结果，有一次以上无抑菌作用者，无抑菌性（表11中简称为“-”）。 由表 11 可知，本发明实施例4-实施例13中mRNA制剂洗液产品对枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、啤酒酵母、曲霉和青霉的生长均有抑制作用。总而言之，无论是革兰氏阴性还是阳性菌，本发明实施例4-实施例13中mRNA制剂洗液产品作为抑菌剂都能有效抑制其生长，表现出广谱抗菌活性。表12为本发明实施例4-实施例13中mRNA制剂洗液产品的最低抑菌浓度范围；
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实施例15一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液的创面冲洗功能验证
创面冲洗功能验证步骤为：第一步，制备含50 - 100cfu/mL金黄色葡萄球菌的菌悬液，准备48个琼脂培养基平皿，平均分成16组，每个平皿用2mL制备好的菌悬液均匀涂抹，将平皿向下倾斜45度角放置；第二步，分别采用100mL实施例4-13、生理盐水、冲洗功能对照标准品1和无冲洗功能对照标准品2均匀冲洗平皿表面，每种冲洗液冲洗3个平皿，剩余3个平皿不冲洗作为对照；第三步，冲洗后自每个平皿上取相同面积残留物至另一营养琼脂培养基平皿中培养18 - 24小时后观察菌落数，同一冲洗液冲洗的3个平皿的菌落数计算平均值。结果见表13。结果表明，本发明实施例4-13的mRNA制剂洗液产品对比0.9% 的生理盐水、冲洗功能对照标准品1、无冲洗功能对照标准品2及空白对照的冲洗效果，表明本发明本发明实施例4-13的mRNA制剂洗液产品具有良好的冲洗功效，冲洗功效非常明显。因此，本发明实施例4-13的mRNA制剂洗液产品可以作为目前临床上诸如生理盐水、碘伏液、甲硝唑溶液、聚烯吡酮碘、双氧水、等渗盐水以及壳聚糖类传统常规无功能性冲洗制品的重要补充或新型替代性产品。此外，本发明产品可单独使用，同时也可以与生理盐水配比使用；
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实施例16一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液的迅速控制渗血功能验证
迅速控制渗血功能验证步骤为：第一步，按照动物伦理实验所批准的要求，委托某医院动物实验中心建立迅速控制渗血功能验证的动物模型，选择：健康新西兰白兔(普通级)，182-212天，体重2.1-3.1公斤，雌雄各半；动物来源：家兔由某医院动物实验中心采购提供；动物数量和分组：新西兰兔91只，随机分为13组，每组7只；适应时间：适应5天以上；动物管理：动物试验在某医院动物实验中心动物实验室进行，动物管理某医院动物实验中心委托按动物伦理实验所批准的的福利要求规范进行；家兔饲养于普通级环境，室温20-25摄氏度，湿度39％-71％，日温差小于等于4摄氏度，换气频率为每小时9次，昼夜明暗交替时间分别为12小时，动物用金属兔笼单笼饲养，自由饮水，每日上下午各给予一次颗粒兔饲料；第二步，将实施例4-13制得的10组mRNA制剂洗液为实验组，以0.9％生理盐水、迅速控制渗血对功能照标准品1、无迅速控制渗血功能对照标准品2为对照组，将它们用于家兔体表创面出血模型的止血冲洗实验中；第三步，以脱毛剂对家兔背部脱毛，24小时后以1％戊巴比妥钠30毫克每公斤耳缘静脉注射麻醉，无菌条件下使用7号注射器针头在脱毛区皮肤“#”型划伤(以轻微渗血而无明显出血为度)。划伤后的家兔用第二步所述的冲洗液进行创口冲洗，每组家兔分别使用不同的冲洗液每次冲洗持续30秒；第四步，每次冲洗后观察伤口的流血情况，如果还有渗血则继续进行冲洗，直至不再渗血为止。考察各样品止血以及促进伤口愈合功效。其中，用滤纸条轻轻蘸吸观察渗血情况，滤纸条上不再沾有血液为不再渗血。5次冲洗后仍未止血的，进行按压止血，出血时间以5分钟计。记录各组家兔的止血所需时间，止血后使用纱布绷带缠绕固定，12小时后去掉纱布，记录创面情况，然后用冲洗液清洗创口，每日1次，每次持续冲洗30 秒，连续7天，每天观察记录动物整体情况及受损区的红肿、结痂、脱痂等情况。本发明实施例4-13制得的mRNA制剂洗液迅速控制渗血功能验证结果如表14所示。结果表明，本发明实施例4-13制得的mRNA制剂洗液与其他对照组比较，止血速度与迅速控制渗血对功能照标准品1一致且动物无炎症发生。此外，本发明实施例4-13制得的mRNA制剂洗液的体表创面伤口恢复最快，能提高创面愈合速度。由此可以看出，本发明实施例4-13制得的mRNA制剂洗液具有清创、止血、促愈多重功效，明显优于生理盐水；
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实施例17一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液的预防粘连功能验证
预防粘连功能验证步骤为：第一步，按照动物伦理实验所批准的要求，委托某医院动物实验中心建立预防粘连功能验证的动物模型，选择：SD大鼠(SPF级)，205-225g，雌雄各半；动物来源：大鼠由某医院动物实验中心采购提供；动物数量和分组： SD大鼠78只，随机分为13组，每组6只；检疫与驯化：检疫5天，按照《大鼠的检疫》SOP-AM035(2)执行；动物管理：动物试验在某医院动物实验中心动物实验室进行，动物管理某医院动物实验中心委托按动物伦理实验所批准的的福利要求规范进行；大鼠饲养于普通级环境，室温20-25摄氏度，湿度39％-71％，日温差小于等于4摄氏度，换气频率为每小时9次，昼夜明暗交替时间分别为12小时，动物用不锈钢鼠笼饲养，6只/笼，自由饮水，每日上下午各给予一次饲料；第二步，将实施例4-13制得的10组mRNA制剂洗液为实验组，以0.9％生理盐水、预防粘连功能照标准品1、无预防粘连功能对照标准品2为对照组，将它们用于大鼠预防粘连模型的冲洗实验；第三步，动物造模前禁食(不禁水)12h，3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30毫克每公斤)。大鼠麻醉后将其仰卧固定于手术板上，腹部电剃脱毛，消毒皮肤。取下腹部正中长约2cm切口，提出盲肠。用解剖刀刮盲肠浆膜面10遍至整个盲肠浆膜面点状出血再滴1滴无水乙醇于创面，分别采用第二步所述的冲洗液冲洗创面，回纳盲肠，然后用血管钳钳夹与盲肠相对应的壁层腹膜，用4号丝线结扎后关腹；第四步，各组动物手术后第7天，根据Phillips五类分级法观察肠粘连程度，对肠粘连程度进行分级，即：完全无黏连为0级；1-2处局部轻度黏连，用手指可分离为I级；有2处以上1级黏连为II级；有广泛的黏连，部分分离困难为III级；盲肠与腔壁紧密黏连，分离困难为IV级。本发明实施例4-13制得的mRNA制剂洗液预防粘连功能验证结果如表15所示。结果表明，本发明实施例4-13制得的mRNA制剂洗液有优异的预防粘连功能，术后第7d均为0级大鼠。优于其他对照组；
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实施例18 一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液
改变肿瘤种植的免疫微环境，抑制术后肿瘤残留（游离瘤栓及肿瘤细胞）的种植和生长的功能验证
改变肿瘤种植的免疫微环境，抑制术后肿瘤残留（游离瘤栓及肿瘤细胞）的种植和生长的功能验证步骤为：第一步，按照动物伦理实验所批准的要求，委托某医院动物实验中心建立改变肿瘤种植的免疫微环境，抑制术后肿瘤残留（游离瘤栓及肿瘤细胞）的种植和生长的功能验证的动物模型，选择：SD大鼠(SPF级)，205-225g，雌雄各半；动物来源：大鼠由某医院动物实验中心采购提供；动物数量和分组： SD大鼠66只，随机分为11组，每组6只；检疫与驯化：检疫5天，按照《大鼠的检疫》SOP-AM035(2)执行；动物管理：动物试验在某医院动物实验中心动物实验室进行，动物管理某医院动物实验中心委托按动物伦理实验所批准的的福利要求规范进行；大鼠饲养于普通级环境，室温20-25摄氏度，湿度39％-71％，日温差小于等于4摄氏度，换气频率为每小时9次，昼夜明暗交替时间分别为12小时，动物用不锈钢鼠笼饲养，6只/笼，自由饮水，每日上下午各给予一次饲料；第二步，将实施例4-13制得的10组mRNA制剂洗液为实验组，以0.9％生理盐水、无mRNA的洗液、或无本发明所述的特定mRNA的洗液为对照组，将它们用于改变肿瘤种植的免疫微环境，抑制术后肿瘤残留（游离瘤栓及肿瘤细胞）的种植和生长的功能验证的冲洗实验；第三步，并使用相应的肿瘤细胞系（膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、食管癌、子宫内膜癌、胆囊癌、胃癌或甲状腺癌）在大鼠体内种植肿瘤（膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、食管癌、子宫内膜癌、胆囊癌、胃癌或甲状腺癌），通过手术模拟术后肿瘤残留情况，如：原发肿瘤后，引入肿瘤细胞悬浮液或瘤栓等；第四步，分别采用实施例4-13制得的10组mRNA制剂洗液，及0.9％生理盐水、无mRNA的洗液、或非本发明所述的特定mRNA的洗液引入第三步中所述手术模拟术后肿瘤残留的手术创口或体内手术区，使其与残留的肿瘤细胞接触；第五步，采集术后7天的切口组织或其他相关组织，使用免疫组化染色、PCR、流式细胞术等方法，检测肿瘤残留情况和肿瘤细胞数量，对收集到的数据进行统计学分析，比较实验组和对照组之间的差异，评估mRNA制剂洗液对对肿瘤免疫微环境的影响。结果分别列于表16、表17和表18；
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实施例19一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液临床应用
本发明实施例4-13制得的10组mRNA制剂洗液经细胞毒性(GB/T16886.5,不大于1级)、皮内刺激(GB/T16886.10,皮肤计分不大于1)、致敏(GB/T16886.10,无致敏反应)、急性全身毒性(GB/T16886.11,无急性全身毒性) 、亚慢性全身毒性(GB/T16886.11,无亚慢性全身毒性) 、植入反应(GB/T16886.6,无异常病理现象) 、溶血实验(GB/T16886.4,无溶血)等系统生物学评价试验，证明本发明无细胞毒性、无皮内刺激反应，无致敏反应、无急性全身毒性反应、无遗传毒性反应，是安全可靠的；
本发明的实施例4-13制得的10组mRNA制剂洗液可以临床应用于：1）肿瘤手术创口或体内手术区清扫，用本发明的mRNA制剂洗液直接冲洗，或用生理盐水配合进行冲洗，操作时运用各种手术常规冲洗方法或用专用冲洗设备进行冲洗；2）常规冲洗洁净后，可直接使用本发明的mRNA制剂洗液适量置留体内，约为 30-60毫升, 更能有效地预防粘连、预防术后感染、修复伤口及抑制术后肿瘤残留（游离瘤栓及肿瘤细胞）的种植和生长；3）本发明的mRNA制剂洗液对残留异物组织、积血、积液有很好的冲洗功能，冲洗后通过吸引导出体外，使冲洗创面更干净、彻底，术野清晰，因其广谱杀菌，能预防术后感染，有效制止手术创面渗血，缓和刺激，减少创面渗出，促进伤口愈合；4）必要时可用无菌纱布浸润，本发明对伤口进行包扎，外敷等处理。本发明的实施例4-13制得的10组mRNA制剂洗液的临床应用结果分别列于表19和表20。结果表明，本发明的mRNA制剂洗液具有潜在的降低癌症复发和转移风险的巨大的临床辅助应用价值；
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实施例20一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液的稳定性试验
将本发明的实施例4-13制得的10组mRNA制剂洗液无菌灌装放置于温度20±5℃下，比较0、 6、12月测定的前面所述各项功能指标。 结果显示，将本发明的实施例4-13制得的10组mRNA制剂洗液均放置稳定，前面所述各项功能指标无降低。
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本发明的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本发明进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本发明中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本发明示范实施例的精神和范围。
同时，本发明使用了特定词语来描述本发明的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本发明至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本发明的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
此外，本领域技术人员可以理解，本发明的各方面可以通过若干具有可专利性的种类或情况进行说明和描述，包括任何新的和有用的工序、机器、产品或物质的组合，或对他们的任何新的和有用的改进。
此外，除非权利要求中明确说明，本发明处理元素和序列的顺序、数字字母的使用、或其他名称的使用，并非用于限定本发明流程和方法的顺序。尽管上述披露中通过各种示例讨论了一些目前认为有用的发明实施例，但应当理解的是，该类细节仅起到说明的目的，附加的权利要求并不仅限于披露的实施例，相反，权利要求旨在覆盖所有符合本发明实施例实质和范围的修正和等价组合。
同理，应当注意的是，为了简化本发明披露的表述，从而帮助对一个或多个发明实施例的理解，前文对本发明实施例的描述中，有时会将多种特征归并至一个实施例、附图或对其的描述中。但是，这种披露方法并不意味着本发明对象所需要的特征比权利要求中提及的特征多。实际上，实施例的特征要少于上述披露的单个实施例的全部特征。
针对本发明引用的每个专利、专利发明、专利发明公开物和其他材料，如文章、书籍、说明书、出版物、文档等，特此将其全部内容并入本发明作为参考。与本发明内容不一致或产生冲突的发明历史文件除外，对本发明权利要求最广范围有限制的文件（当前或之后附加于本发明中的）也除外。需要说明的是，如果本发明附属材料中的描述、定义、和/或术语的使用与本发明内容有不一致或冲突的地方，以本发明的描述、定义和/或术语的使用为准。
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本实施例的各种等价形式的修改均落入本发明所附权利要求所限定的范围。

Claims (9)

1. 一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，其特征在于：所述mRNA制剂洗液的成分及重量比例为：0.002%-0.01% mRNA，0.2%-1%硫酸肝素，0.1%-1%肌醇磷脂，0.045%-10% 聚乙二醇，0%-1% 聚乙烯醇，0%-1% 聚丙烯醚，0.045%-0.9% 氯化钠，0%-0.31%乳酸，0%-0.31%乳酸钠，0%-0.02% 氯化钾，0%-0.027%钙氯化物，其余为注射用水；所述mRNA制剂洗液中的mRNA为能够在人体或小鼠体内表达IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS的线性mRNA或环状mRNA。
2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，其特征在于：所述mRNA制剂洗液中的mRNA为能够在人体或小鼠体内表达所述IL-2、IL-7、IL-12sc、IL-15sushi、IL21、IL-23、IL-36γ、GM-CSF、IFNa、IFN-γ、CCL3、CCL5、CCL13、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、XCL1、CX3CL1、CD40、CD70、CD80、CD86、OX40L、GITRL、4-1BBL、ICOSL、CD40L、CD27、CD28、OX40、GITR、4-1BB、ICOS的线性mRNA或环状mRNA中的两种或两种以上的混合mRNA。
3.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，其特征在于：所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA/环状mRNA的质量比例范围为0:100到100:0。
4. 根据权利要求1所述的一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，其特征在于：所述mRNA制剂洗液中的线性mRNA或环状mRNA含有SEQ ID 1- SEQ ID 10所示的任一序列所组成的组中的一种或两种或多种序列的核苷酸序列IRES元件。
5.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，其特征在于：所述mRNA制剂洗液的制备方法是通过搅拌或超声振荡的方式把权利要求1所述配方量的硫酸肝素、肌醇磷脂与mRNA、聚乙二醇、聚乙烯醇，聚丙烯醚，氯化钠，乳酸，乳酸钠，氯化钾，钙氯化物和注射水混合，制成膜状物或液体。。
6.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，其特征在于：所述mRNA制剂洗液的渗透压为281mmol/L-327mmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，其特征在于：所述mRNA制剂洗液在20摄氏度下的动力粘度为1.2-14.8mPa·s。
8.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，其特征在于：所述mRNA制剂洗液的使用方式为将其用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫区域的冲洗，将其将其涂抹在肿瘤手术创口或体内手术区的清扫区域，或将其附着在无菌敷料上，用于肿瘤手术创口的包扎。
9.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤手术创口或体内手术区清扫的mRNA制剂洗液，其特征在于：所述mRNA制剂洗液的使用对象为人、猴及其他动物。
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