CN117230212A - 一种金钱白花蛇特异性lamp检测引物组及lamp检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种金钱白花蛇特异性LAMP检测引物组及LAMP检测方法，属于中药材鉴定技术领域。本发明提供的引物组的上游外引物F3的序列如SEQ ID NO.1所示，下游外引物B3的序列如SEQ ID NO.2所示，上游内引物FIP的序列如SEQ ID NO.3所示，下游内引物BIP的序列如SEQ ID NO.4所示。本发明提供的金钱白花蛇特异性LAMP检测引物组及LAMP检测方法具有扩增速度快、操作简便、结果可视化、灵敏度高、特异性良好等特点。
Description
技术领域
本发明涉及中药材鉴定技术领域，尤其涉及一种金钱白花蛇特异性LAMP检测引物组及LAMP检测方法。
背景技术
金钱白花蛇，为眼镜蛇科动物银环蛇Bungarus multicinctus Blyth的幼蛇除去内脏后的干燥体，是中国特有的贵重中药材，为治疗风湿顽痹、麻木拘挛、中风口眼斜、半身不遂、抽搐痉挛、破伤风、麻风、疥癣的要药。
由于野生资源逐渐匮乏，临床用量较大，且人工繁殖技术不够成熟，近年来金钱白花蛇的市场价格不断上涨，其伪品、混淆品、掺杂品甚多，且仅凭外部形态特征难以准确辨认，严重影响了金钱白花蛇的功能和效用。金钱白花蛇常见的混淆品包括：游蛇科属蛇类(如：滑鼠蛇Ptyas mucosus(Linnaeus)、中国水蛇Enhydris chinensis(Gray))、眼镜蛇科蛇类(如：金环蛇Bungarus fasciatus(Schneider))等。常见的伪造或掺杂方法包括：使用褪色药水或油漆将其他蛇的幼蛇蛇体涂成白色环纹；成蛇去骨后，剖成若干小条，搓成圆带状，盘成圆盘，装上其他蛇的头，冒充金钱白花蛇；将其他蛇的幼体，间隔一定的距离刮去一圈鳞片，使黄白色的蛇肉裸露成环状。
2020年版《中国药典》中金钱白花蛇的鉴别方法包括了性状鉴别和聚合酶链式反应法。传统的性状鉴别方法需要专业的技术人员具备丰富的经验积累，聚合酶链式反应法鉴别步骤繁杂、耗时长，且需要大型仪器。因此，建立快速、特异、便捷的金钱白花蛇鉴别方法，对中药材市场的监管及中医中药的健康发展具有重要的现实意义。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的核酸等温扩增技术，该技术通过4个特异性引物(F3、B3、FIP和BIP)识别靶基因的6个区域，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在恒温条件(65℃左右)保温几十分钟，完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速扩增的特点。该技术可以在1h之内扩增出109靶序列拷贝，扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。但是，不同药材之间的基因差异较大，无法从上述检测技术中借鉴得到金钱白花蛇的特异性LAMP检测引物组。因此，有必要提供提供一种检测金钱白花蛇的特异性LAMP引物组。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金钱白花蛇特异性LAMP检测引物组及LAMP检测方法，能够实现对金钱白花蛇的特异性检测，且具有检测速度快、操作简便、可视化、灵敏度高、特异性好的优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种金钱白花蛇特异性LAMP检测引物组，上游外引物F3的序列如SEQ ID NO.1所示，下游外引物B3的序列如SEQ ID NO.2所示，上游内引物FIP的序列如SEQID NO.3所示，下游内引物BIP的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种金钱白花蛇特异性LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。
本发明提供了一种所述的引物组或所述的试剂盒在金钱白花蛇鉴定中的应用。
本发明还提供了一种特异性鉴定金钱白花蛇的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA，作为模板；
(2)用所述的引物组对所述模板进行LAMP扩增，获得扩增产物，同时加入显色剂；
(3)通过颜色反应鉴定样品是否为金钱白花蛇。
优选的，所述LAMP扩增体系中外引物F3、B3的浓度分别为8～12μmol/L，内引物FIP、BIP的浓度分别为16～24μmol/L。
优选的，所述上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP的体积比为0.45～0.55：0.45～0.55：1.8～2.2：1.8～2.2。
优选的，所述LAMP扩增的温度为60～65℃。
优选的，所述LAMP扩增的时间为50～70min。
优选的，所述显色剂的种类包括SYTO 9。
优选的，所述显色剂与引物总体积的比为0.9～1.1：5。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种金钱白花蛇特异性LAMP检测引物组及LAMP检测方法，该检测引物组和检测方法具有扩增速度快、操作简便、结果可视化、灵敏度高、特异性良好等特点，能够实现对市售金钱白花蛇的快速鉴定，鉴定结果与《中华人民共和国药典》规定的PCR琼脂糖凝胶电泳法的结果一致。本发明建立的LAMP鉴别方法可以应用于金钱白花蛇的快速筛查检测，具有良好的推广应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例2中空白对照(1号管)和金钱白花蛇对照药材(2号管)的LAMP反应结果；
图2为实施例3中空白对照(1号管)、金钱白花蛇对照药材(2号管)、乌梢蛇(3号管)、蕲蛇(4号管)、蝰蛇(5号管)、蝮蛇(6号管)、赤链蛇(7号管)、中国水蛇(8号管)、滑鼠蛇(9号管)、玉斑锦蛇(10号管)、眼镜蛇(11号管)的LAMP反应结果；
图3为实施例4中空白对照(1号管)、浓度100％的金钱白花蛇对照药材(2号管)、浓度10％的金钱白花蛇对照药材(3号管)、浓度1％的金钱白花蛇对照药材(4号管)、浓度0.1％的金钱白花蛇对照药材(5号管)、浓度0.01％的金钱白花蛇对照药材(6号管)的LAMP反应结果；
图4为实施例5中空白对照(1号管)、金钱白花蛇对照药材(2号管)、样品一(3号管)、样品二(4号管)、样品三(5号管)、样品四(6号管)、样品五(7号管)的LAMP反应结果；
图5为实施例5中空白对照(1号管)、金钱白花蛇对照药材(2号管)、样品一(3号管)、样品二(4号管)、样品三(5号管)、样品四(6号管)、样品五(7号管)的PCR反应结果，其中，M为marker。
具体实施方式
本发明提供了一种金钱白花蛇特异性LAMP检测引物组，上游外引物F3的序列如SEQ ID NO.1所示，下游外引物B3的序列如SEQ ID NO.2所示，上游内引物FIP的序列如SEQID NO.3所示，下游内引物BIP的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种金钱白花蛇特异性LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。
本发明提供了一种所述的引物组或所述的试剂盒在金钱白花蛇鉴定中的应用。
本发明还提供了一种特异性鉴定金钱白花蛇的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA，作为模板；
(2)用所述的引物组对所述模板进行LAMP扩增，获得扩增产物，同时加入显色剂；
(3)通过颜色反应鉴定样品是否为金钱白花蛇。
在本发明中，所述LAMP扩增体系中外引物F3、B3的浓度分别为8～12μmol/L，优选为9～11μmol/L，进一步优选为10μmol/L；内引物FIP、BIP的浓度分别为16～24μmol/L，优选为17～23μmol/L，进一步优选为18～22μmol/L，更优选为20μmol/L。
在本发明中，所述上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP的体积比为0.45～0.55：0.45～0.55：1.8～2.2：1.8～2.2，优选为0.47～0.53：0.47～0.53：1.9～2.1：1.9～2.1，进一步优选为0.5：0.5：2.0：2.0。
在本发明中，所述LAMP扩增体系还包括2×反应液和Bst DNA聚合酶；所述2×反应液与引物总体积的比为12～13：5，优选为12.5：5；所述Bst DNA聚合酶与引物总体积的比为0.8～1.2：5，优选为0.9～1.1：5，进一步优选为1：5。
在本发明中，所述LAMP扩增的温度为60～65℃，优选为61～64℃，进一步优选为62～63℃，更优选为63℃。
在本发明中，所述LAMP扩增的时间为50～70min，优选为55～65min，进一步优选为60min。
在本发明中，所述显色剂的种类包括SYTO 9。
在本发明中，所述显色剂与引物总体积的比为0.9～1.1：5，优选为1：5。
在本发明中，当显色剂为SYTO 9时，若颜色为橙色，说明样品不是金钱白花蛇，如颜色为绿色，说明样品是金钱白花蛇。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种特异性鉴定金钱白花蛇的方法，步骤如下：
(1)DNA提取：使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取待测样品DNA，作为模板。-20℃保存，备用。
(2)LAMP扩增
LAMP扩增体系：2×反应液(RM)12.5μL、10μmol/L上游外引物F30.5μL、10μmol/L下游外引物B30.5μL、20μmol/L上游内引物FIP 2μL、20μmol/L下游内引物BIP 2μL、Bst DNA聚合酶1μL、DNA模板2μL，加超纯水至体积25μL。
其中，上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP的序列如SEQID NO.1～SEQ ID NO.4和表1所示。
表1LAMP引物组序列
扩增反应在PCR管中进行，扩增前在PCR管盖间加入1μL显色剂SYTO9，扩增反应的条件为：63℃恒温水浴60min。
(3)样品鉴定：反应完成后将PCR管颠倒混匀，不开盖，通过观察颜色反应鉴定样品是否为金钱白花蛇。若颜色为橙色，说明样品不是金钱白花蛇；若颜色为绿色，说明样品是金钱白花蛇。
实施例2
按照实施例1的鉴定方法，以金钱白花蛇对照药材DNA为模板，进行LAMP反应，同时设置空白对照。反应结果如图1所示，其中，1号管为空白对照，2号管为金钱白花蛇对照药材。
由图1可以看出，1号管显橙色，为阴性；2号管显绿色，为阳性。说明本发明提供的金钱白花蛇LAMP检测引物组和LAMP金钱白花蛇鉴定方法具有特异性，可以用于下一步的特异性和灵敏度实验。
实施例3
按照实施例1的鉴定方法，分别以金钱白花蛇对照药材和9种金钱白花蛇混淆品样本(乌梢蛇、蕲蛇、蝰蛇、蝮蛇、赤链蛇、中国水蛇、滑鼠蛇、玉斑锦蛇、眼镜蛇)为检测对象，同时设置空白对照。检测结果如图2所示，其中，1号管为空白对照，2号管为金钱白花蛇对照药材，3号管为乌梢蛇，4号管为蕲蛇，5号管为蝰蛇，6号管为蝮蛇，7号管为赤链蛇，8号管为中国水蛇，9号管为滑鼠蛇，10号管为玉斑锦蛇，11号管为眼镜蛇。
从图2可以看出，金钱白花蛇对照药材为阳性，空白对照和9种金钱白花蛇混淆品样本反应结果为阴性。说明本发明提供的金钱白花蛇LAMP检测引物组和LAMP金钱白花蛇鉴定方法具有良好的特异性，可用于金钱白花蛇的特异检测。
实施例4
提取金钱白花蛇对照药材DNA，按10倍倍比稀释，按照实施例1的方法进行LAMP扩增，检验该方法的灵敏度。检测结果如图3所示，其中，1号管为空白对照，2号管为金钱白花蛇对照药材(100％)，3号管为金钱白花蛇对照药材(10％)，4号管为金钱白花蛇对照药材(1％)，5号管为金钱白花蛇对照药材(0.1％)，6号管为金钱白花蛇对照药材(0.01％)。
从图3可以看出，本发明鉴定方法的灵敏性高，可达0.01％。
实施例5
分别按照实施例1的鉴定方法和《中华人民共和国药典》收录的PCR法鉴定5份市售金钱白花蛇样品。同时设置空白对照和对照药材组。
PCR鉴定时使用的引物如SEQ ID NO.5(上游引物F)、SEQ ID NO.6(下游引物R)和表2所示。
表2 PCR引物组序列
| 引物名称 | 引物序列(5'to3') |
| 上游引物F | GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT |
| 下游引物R | GGAATCTTATCGATATCTGAATTAGTA |
25μLPCR反应体系为：2×San Taq PCR Mix 12.5μL，上游引物F和下游R各0.5μL，DNA模板2μL，用灭菌去离子水补至25μL。
将PCR反应体系充分混匀后，12000rpm离心30s，置于PCR仪中，参照《中华人民共和国药典》设置PCR反应程序：①95℃，5min；②95℃，30s；③55℃，45s；④72℃，5min。步骤②到③循环30次。电泳检测采用1.5％琼脂糖凝胶，加入核酸荧光剂Gold View 5μL，样品DNA模板、DNA分子量标记上样量均为8μL。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像系统上检视。金钱白花蛇样品凝胶电泳图谱中，在500～750bp应有单一DNA条带。
按照实施例1的鉴定方法得到的检测结果如图4所示，按照《中华人民共和国药典》收录的PCR法得到的检测结果如图5所示；其中，1号管为空白对照，2号管为金钱白花蛇对照药材，3号管为样品一，4号管为样品二，5号管为样品三，6号管为样品四，7号管为样品五，M为marker。
从图4和图5可以看出，本发明方法与《中华人民共和国药典》收录的PCR法的鉴定结果一致，说明本发明建立的LAMP具有较好的特异性，且比PCR法的检测时间大大缩短。
由以上实施例可知，本发明提供了一种金钱白花蛇特异性LAMP检测引物组及LAMP检测方法，本发明提供的金钱白花蛇特异性LAMP检测引物组及LAMP检测方法具有扩增速度快、操作简便、结果可视化、灵敏度高、特异性良好等特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种金钱白花蛇特异性LAMP检测引物组，其特征在于，上游外引物F3的序列如SEQID NO.1所示，下游外引物B3的序列如SEQ ID NO.2所示，上游内引物FIP的序列如SEQ IDNO.3所示，下游内引物BIP的序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种金钱白花蛇特异性LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
3.一种权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒在金钱白花蛇鉴定中的应用。
4.一种特异性鉴定金钱白花蛇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA，作为模板；
(2)用权利要求1所述的引物组对所述模板进行LAMP扩增，获得扩增产物，同时加入显色剂；
(3)通过颜色反应鉴定样品是否为金钱白花蛇。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述LAMP扩增体系中外引物F3、B3的浓度分别为8～12μmol/L，内引物FIP、BIP的浓度分别为16～24μmol/L；
所述上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP的体积比为0.45～0.55：0.45～0.55：1.8～2.2：1.8～2.2。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述LAMP扩增的温度为60～65℃。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述LAMP扩增的时间为50～70min。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述显色剂的种类包括SYTO 9。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述显色剂与引物总体积的比为0.9～1.1：5。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311438748.5A CN117230212A (zh) | 2023-11-01 | 2023-11-01 | 一种金钱白花蛇特异性lamp检测引物组及lamp检测方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117965758A (zh) * | 2024-03-25 | 2024-05-03 | 吉林医药学院 | 一种用于鉴定蛇的lamp引物组、试剂盒及其应用 |
-
2023
- 2023-11-01 CN CN202311438748.5A patent/CN117230212A/zh active Pending
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