CN117230002A - 一种软骨细胞培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种完全化学限定的软骨细胞培养基，以DMEM/F12为基础培养基，通过添加外源物质，得到培养基适合软骨细胞的培养。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种完全化学限定的软骨细胞培养基。
背景技术
软骨损伤是一种常见病和多发病，可由外伤、炎症以及退行性疾病等引起。由于成熟的关节软骨缺少神经组织与血液循环，一旦受到损伤，其再生能力十分有限，因此关节软骨损伤的修复是临床中的重大难题之一。
关节软骨移植为修复软骨损伤提供了一种新的医疗途径。关节软骨移植包括自体关节软骨移植和异体关节软骨移植。自体软骨移植对于修复软骨缺损区域具有很好的疗效，且不存在排斥反应的问题，但材料来源有限，很难得到广泛应用。人工软骨修复材料的诞生为软骨缺损的完全修复带来了契机。无论自体关节软骨移植还是异体关节软骨移植，技术路线包括种子细胞植入、生物工程材料和细胞生长刺激因子3大要素，其中种子细胞即软骨细胞的提取与培养是重中之重，是开发关节软骨移植技术的前提。
软骨细胞只占软骨总体积的1～2％，是一种高度分化的细胞，体外条件下，即使使用10％血清培养基培养，软骨细胞增殖能力依旧非常弱，并逐渐去分化。目前市场上能培养软骨细胞的培养基基本为血清和血清替代物培养基，而血清或其替代物的使用也会带来诸多风险：成分复杂且目前尚不明确，干扰分析细胞的分泌产物；血清或其替代物批次间稳定性差，直接导致培养基的稳定性差；血清或其替代物中存在抑制软骨细胞增殖并促软骨细胞去分化的物质；血清或其替代物为生物来源，存在高度致敏风险和动物病原体感染风险。
发明内容
本发明提供了一种完全化学限定的软骨细胞培养基，以DMEM/F12为基础培养基，通过添加外源物质，得到适合软骨细胞的培养基。
根据本发明的一个方面，本发明提供一种软骨细胞培养基，其在DMEM/F12基础培养基中添加外源添加物，所述外源添加物包括：
优选地，上述培养基的pH为7.1-7.4，需要时用HCl和/或NaOH水溶液，优选4M HCl和/或NaOH水溶液将pH调节至7.1-7.4。
优选地，所述外源添加物由以上物质组成。
优选地，所述外源添加物由以下物质组成：
用4M HCl和/或NaOH水溶液将pH调节至7.2。
本发明中，IGF-1为胰岛素样生长因子-1，PDGF-BB为血小板源性生长因子-BB，EGF为表皮细胞生长因子，TGF-β1为转化生长因子-β1，TGF-β2为转化生长因子-β2，TGF-β3为转化生长因子-β3，FGF-2为成纤维细胞生长因子-2，FGF-18为成纤维细胞生长因子-18，Ihh为印度刺猬因子，PTHrP为甲状旁腺素相关蛋白，Pluronic F-68为泊洛沙姆-188。
根据本发明的另一个方面，本发明提供上述软骨细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：取各外源添加物溶解于DMEM/F12基础培养基中，测定pH值，需要时用4M HCl和/或NaOH水溶液将pH值调节至7.1～7.4，0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
根据本发明的另一个方面，本发明提供上述软骨细胞培养基在培养软骨细胞中的应用。
本发明的上述应用并非以疾病的诊断和治疗为目的。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种软骨细胞的培养方法，使用上述软骨细胞培养基。
本发明的上述方法并非以疾病的诊断和治疗为目的。
本发明的完全化学限定的软骨细胞培养基，该培养基所含有的TGF-β2、TGF-β3、FGF-18共同促进软骨细胞扩增，并与PTHrP、Kartogenin共同促进Ⅱ型胶原蛋白(软骨细胞重要标志物，也是软骨细胞功能产物)表达。
本发明为化学限定培养基，不存在任何血清、水解物等不明确成分，不含有任何动物蛋白，培养基成分完全明确，具有填补化学限定软骨细胞培养基的市场空白的潜力。科研方面，本发明适合软骨细胞相关研究，尤其适合研究软骨细胞代谢及分泌物分析；医疗方面，本发明不存在任何动物源成分，无动物病原体感染风险，并对人体的致敏风险降到最低。由于本发明为完全化学限定培养基，批间差异极小，极大减轻软骨细胞培养的负担和成本。
附图说明
图1.本发明培养基培养P1软骨细胞96h；
图2.含血清培养基培养P1软骨细胞96h；
图3.本发明培养基培养P2软骨细胞96h；
图4.含血清培养基培养P2软骨细胞96h；
图5.本发明培养基培养P3软骨细胞96h；
图6.含血清培养基培养P3软骨细胞96h；
图7.本发明培养基培养软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白免疫组化；
图8.实施例5中不同培养基培养软骨细胞后Ⅱ型胶原蛋白的相对表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1
本实施例的软骨细胞培养基，是在DMEM/F12基础培养基中添加外源添加物，外源添加物由以下物质组成：
制备方法为：取各外源添加物溶解于DMEM/F12基础培养基中，用4M HCl和/或NaOH水溶液调节pH值至7.2，0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
实施例2
本实施例的软骨细胞培养基，是在DMEM/F12基础培养基中添加外源添加物，外源添加物由以下物质组成：
制备方法为：取各外源添加物溶解于DMEM/F12基础培养基中，用4M HCl和/或NaOH水溶液调节pH值至7.2，0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
实施例3
本实施例的软骨细胞培养基，是在DMEM/F12基础培养基中添加外源添加物，外源添加物由以下物质组成：
/>
制备方法为：取各外源添加物溶解于DMEM/F12基础培养基中，用4M HCl和/或NaOH水溶液调节pH值至7.2，0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
实施例4
利用本发明的完全化学限定的软骨细胞培养基(实施例2)，培养软骨细胞，以8000个细胞/cm2的接种密度接种于细胞培养瓶中，每代培养96h后，计细胞数和细胞活率。因市场上几乎没有在售的针对软骨细胞的完全化学限定培养基产品，故对比培养基为含10％胎牛血清的BI(货号05-060-1A)培养基，该培养基可培养包括软骨细胞在内的贴壁细胞。
平行实验三组，按照如下方法计算细胞平均扩增倍数和活率，如表1所示。
扩增倍数＝收获细胞数/接种细胞数；
活率＝活细胞数/有细胞结构的细胞数*100％。
表1
表1中可见，软骨细胞即使在含血清培养基中培养，其细胞扩增倍数依旧较低，最高只有2.64倍，说明血清培养基并不适合培养软骨细胞。另外，附图2、4和6表明细胞各代次显微镜下观察，含血清培养基培养的细胞界限模糊，细胞膨大，折光率低，细胞状态差，进而细胞扩增倍数和活率逐代降低，直到P3细胞基本丧失增殖能力。
附图1、3和5表明软骨细胞在本发明培养基中培养，细胞形态较好，界限清晰，各代次细胞活率都达到97％以上，各代次细胞扩增倍数远高于血清培养基，说明本发明的培养基非常适合软骨细胞的培养和增殖。对本发明培养基培养的软骨细胞进行软骨细胞标志物，即Ⅱ型胶原蛋白免疫组化，结果见图7，图7表明软骨细胞高表达Ⅱ型胶原蛋白，说明软骨细胞特性在本发明培养基中保持完好，本发明的培养基适合软骨细胞培养。
实施例5
分别使用与实施例2培养基相比仅不含有TGF-β2、TGF-β3、FGF-18、PTHrP、Kartogenin的基础培养基、基础培养基+TGF-β2、基础培养基+TGF-β3、基础培养基+TGF-β2+TGF-β3、基础培养基+TGF-β2+TGF-β3+FGF-18、实施例2(即基础培养基+TGF-β2+TGF-β3+FGF-18+PTHrP+Kartogenin)培养P3软骨细胞，以8000个细胞/cm2的接种密度接种于细胞培养瓶中，培养4.5天后，计细胞数和细胞活率，结果如下表2所示。
表2
分别使用上述基础培养基+TGF-β2+TGF-β3+FGF-18、基础培养基+TGF-β2+TGF-β3+FGF-18+PTHrP、实施例2(即基础培养基+TGF-β2+TGF-β3+FGF-18+PTHrP+Kartogenin)培养P3软骨细胞，以8000个细胞/cm2的接种密度接种于细胞培养瓶中，培养4天后收获细胞分别提取mRNA，使用提取的mRNA反转录模板DNA，设计Ⅱ型胶原蛋白引物(F-AGCAAGAGCAAGGACAAG，R-AGTGTTAGGAGCCAGGTT)使用PCR仪检测上述三种培养基Ⅱ型胶原蛋白Ct值，和β-actin内参蛋白Ct值，结果如下表3所示。内参蛋白在各细胞中表达量相对保守，所以作为校准蛋白使用。只加β-actin引物不加模板作为空白对照，目的是排除体系污染，空白对照不应有检出。以基础培养基+TGF-β2+TGF-β3+FGF-18为基准，通过如下公式计算其余两组培养基相对于基础培养基+TGF-β2+TGF-β3+FGF-18的相对表达量，结果如图8，Ⅱ型胶原蛋白表达量越高，说明软骨细胞维持分化状态越好。
ΔΔt＝(Ct待检-Ct待检β-actin)-(Ct基础-Ct基础β-actin)
相对表达量(待检/基础)＝2-ΔΔt
表3
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种软骨细胞培养基，其特征在于，在DMEM/F12基础培养基中添加外源添加物，所述外源添加物包括：
2.如权利要求1所述的软骨细胞培养基，其特征在于，所述培养基的pH为7.1-7.4，需要时用HCl和/或NaOH水溶液将pH调节至7.1-7.4。
3.如权利要求2所述的软骨细胞培养基，其特征在于，所述HCl和/或NaOH水溶液为4MHCl和/或NaOH水溶液。
4.如权利要求1-3中任一项所述的软骨细胞培养基，其特征在于，所述外源添加物由以上物质组成。
5.如权利要求4所述的软骨细胞培养基，其特征在于，所述外源添加物由以下物质组成：
用4M HCl和/或NaOH水溶液将pH调节至7.2。
6.如权利要求1-5中任一项所述的软骨细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取各外源添加物溶解于DMEM/F12基础培养基中，测定pH值，需要时用HCl和/或NaOH水溶液将pH值调节至7.1～7.4，0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述HCl和/或NaOH水溶液为4M HCl和/或NaOH水溶液。
8.如权利要求1-5中任一项所述的软骨细胞培养基在培养软骨细胞中的应用。
9.一种软骨细胞的培养方法，其特征在于，使用如权利要求1-5中任一项所述的软骨细胞培养基。
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