CN117229972A - 一种假单胞菌菌株及其应用和微生物制剂 - Google Patents

Abstract

本申请提出一种假单胞菌菌株及其应用和微生物制剂，其名称为：Pseudomonas sp.ND022，所述假单胞菌菌株已于2023年04月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023616，所述假单胞菌菌株的ITS序列如SEQ ID No：1所示。本申请发现的一株新菌种，即假单胞菌菌株，其对于烟草普通花叶病毒的抑制作用显著，且不存在化学农药的一系列弊端，能够实现对烟草普通花叶病毒的可持续治理。

Description

一种假单胞菌菌株及其应用和微生物制剂

技术领域

本申请涉及微生物抗植物病毒技术领域，特别涉及一种假单胞菌菌株及其应用和微生物制剂。

背景技术

烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）作为一种危害严重的植物病原体，其宿主广泛，能够感染超过65科中的885种植物，TMV侵染烟草植株后，病毒RNA会在烟草细胞中大量繁殖，严重影响烟草的生长，全世界每年因植物病毒危害造成的农业经济损失高达亿美元，我国烟草业也受到了严重的威胁，不仅造成烟叶产量的下降，而且影响了烟叶的质量。

目前对于防治TMV的方法有农业防治、化学防治、生物防治等，然而由于农业防治的局限性和化学农药的滥用会对生态环境和人体健康造成危害，开发安全绿色且高效的生物农药成为未来的重点方向。生物农药（biogenic pesticides）也称为生物源农药或者生物源天然产物农药，是指直接利用生物获得或利用生物代谢过程中产生的具有生物活性的天然物质用作对抗病虫害的农药或者制剂，根据活性物质来源的生物划分，可分为微生物源农药，植物源农药，动物源农药。

长期以来，防治植物病毒病以化学防治和培育抗病毒品种为主，在化学药剂防治方面，目前令人满意的抗植物病毒剂实用化品种还不多，尤其特效的治疗性药剂更少，所报道的药剂在田间实际应用防效不理想，而且化学防治也存在着许多的问题，大量施用化学农药，造成农药残留、食品安全、生态环境污染等问题。所以培育抗病毒品种被认为是防治烟草花叶病毒病的经济而有效的途径。但是有限的具有商业价值的抗性材料大大限制了育种工作的进展，目前尚无优质高抗的品种可以大面积推广。随着植物病毒病的危害加重，化学农药的长期大量使用，环境污染、农药残留等问题，因此，开发新的、高效、安全的微生物制剂来控制植物病毒病，已经成为农业安全及可持续发展的需要。

发明内容

基于此，本申请的目的是提出一种假单胞菌菌株及其应用和微生物制剂，通过从烟草根系方向进行探索，筛选了防治效果好的假单胞菌菌株，扩充抗植物病毒资源，为深入揭示烟草根系微生物抗性机制和进一步研发微生物源抗病毒制剂提供保障。

一方面，本申请提出一种假单胞菌菌株，其名称为：Pseudomonassp. ND022，所述假单胞菌菌株已于2023年04月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2023616，所述假单胞菌菌株的ITS序列如SEQ ID No：1所示。

SEQ ID No：1：

5'-GTCGAGCGGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGCGGGGGATAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATCCGAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGGGGTTTAATTAGAAGCAACGAGAAGAACCTTCCCTGCCCTTCACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATAGGTGCCTTCGGGAACTATGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCATCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAACCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCATTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAACCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGGATACCAC-3'。

申请人发现假单胞菌菌株对于烟草普通花叶病毒的抑制作用显著，且不存在化学农药的一系列弊端。

此外，微生物本身含有丰富的资源并且分布广泛，从Mulvania在1926年发现使用细菌可以抑制植物病毒的生物活性后，便开始了从微生物及其次生代谢产物中寻找TMV活性物质的研究。目前成功应用的植物病害生防细菌有Agrobacterium、Bacillus、Pseudomonas、Erwinia、Xanthomonas等属的一些菌株。生防细菌防治植物病害发生发展的一个重要机制是产生拮抗物质，大致包括以下几类：细菌素 (bacteriocins)、荧光素(fluorescein)、土壤杆菌素 (agrocin)、酚类物质、多肽类抗生素(polypeptides)、蛋白质类等，在植物病害生物防治中起着关键的作用。其中细菌是一类丰富的生物资源且最早应用的生物防治菌，从中已获得多种抗烟草花叶病毒资源，假单胞菌属(Pseudomonas) 广泛分布于自然界，如土壤、水、食物和空气中，为直或稍弯的革兰氏阴性杆菌，是能够广泛定殖多种植物根际的益生微生物，有着促生长，诱导系统抗性和拮抗土壤真菌病害等功能。有研究发现，有的假单胞菌可以产生抗生素抑制病原菌，也可以促进土壤有益菌的生长；还有些荧光假单胞菌有着广谱抑菌作用，有效延缓菌核的形成。所以，假单胞菌可以作为较好的具有防治病害应用潜力的生防菌。

另一方面，本申请还提供一种如上述的假单胞菌菌株在制备抗烟草花叶病毒微生物制剂中的应用。

作为优选，所述假单胞菌菌株的分离包括以下步骤：待烟草长至6-7叶时，取根系土壤进行土壤微生物的分离与纯化，以通过在PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基以及高氏一号培养基上涂布分离单菌落，划线纯化后分离出假单胞菌菌株。

作为优选，假单胞菌菌株发酵液的制备包括以下步骤：

将分离出的假单胞菌菌株接种于LB液体培养基，在37℃、200 r/min 条件下恒温振荡培养1d，获得所述假单胞菌菌株发酵液，放 4℃保存；

所述LB液体培养基组成为10g胰蛋白陈、5g酵母膏、10g NaCl，pH自然，加水至1000mL。

作为优选，所述应用按如下步骤进行：

将制备得到的假单胞菌菌株发酵液喷洒或蘸涂到烟草花叶的叶片上。

又一方面，本申请还提供一种微生物制剂，该微生物制剂包括上述的假单胞菌菌株。

作为优选，该微生物制剂还包括与剂型相匹配的助剂。

再一方面，本申请还提供一种微生物制剂在防治烟草花叶病毒中的应用。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实施例了解到。

附图说明

图1为本申请第二实施例中假单胞菌菌株的培养形态特征及染色结果示意图。

图2为本申请第二实施例中假单胞菌菌株的系统发育树示意图。

图3为本申请第三实施例中的处理组和对照组关于烟草叶片枯斑症状的示意图。

图4为本申请第三实施例中处理组及清水对照组关于TMV表达量变化的示意图。

图5为本申请第三实施例中苯丙氨酸解氨酶的活性测定结果示意图。

图6为本申请第三实施例中超氧化物歧化酶的活性测定结果示意图。

图7为本申请实施例中过氧化物酶的活性测定结果示意图。

如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本申请。

具体实施方式

为了便于理解本申请，下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述。附图中给出了本申请的若干实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“及／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

假单胞菌菌株的分离和提纯：

从江西省抚州市黎川县潭溪乡烟草种植基地常年轮作烟草土壤中纯培养分离来菌株ND022，具体方法为将取自2020年7月及2021年6月烟草收割时期采自江西省抚州市黎川县潭溪乡烟草种植基地的土壤用于培养烟草，待烟草长至6-7叶时，取根系土壤进行土壤微生物的分离与纯化，主要通过在PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基以及高氏一号培养基上涂布分离单菌落，划线纯化后分离出菌株。将分离纯化出的菌株ND022接种在三种培养基上，将PDA培养基平板放置于30℃中培养，牛肉膏蛋白胨培养基平板放置于37℃中培养，高氏一号培养基平板放置于28℃中培养。培养时间为2-5天当能观察到明显菌落时，观察菌落形态。

实施例2

假单胞菌菌株的鉴定：

对菌株ND022进行形态特征以及16S rDNA 序列分析鉴定，具体如下：

2.1. 菌株的培养形态特征

形态学观察和培养特征：将菌株划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃培养24h后在显微镜下观察。

革兰氏染色：首先将涂片固定后，用结晶紫初染1 min，无菌水洗净后，用碘液媒染1 min，以无菌清水洗净，使用95%乙醇进行脱色，冲洗并用番红染液染色2 min。最后，用油镜检查染色结果。如染色结果呈现出蓝紫色则为革兰氏阳性菌，呈现出红色则为革兰氏阴性菌。

请参阅图1，显示了本申请实施例中假单胞菌菌株ND022的培养形态特征及染色观察结果，ND022菌株平板划线的菌落形态为白色、边缘不规则呈锯齿状、中间颜色较深。革兰氏染色结果为阴性，呈短杆状。

2.2. 16S rDNA序列分析鉴定

菌株DNA的提取利用DNA提取试剂盒进行，在提取菌株基因组总DNA后，设计16SrDNA基因通用引物，扩增引物的序列为：

正向27F：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，

反向1540R：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'；

扩增片段长度约为1450bp。用提取的总DNA作为PCR模板，用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析PCR产物，用凝胶成像仪观察对应结果。选用北京擎科生物科技股份有限公司SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒。将回收的PCR产物，送北京擎科生物科技股份有限公司进行测序。16S rDNA测序结果在NCBI数据库中进行BLAST搜索分析，进行同源性比较分析。

请参阅图2，显示了本申请实施例中假单胞菌菌株ND022的系统发育树，结果表明ND022菌株根据测序结果比对与假单胞菌属相似度达到了99.08%。

实施例3

ND022发酵液抗病毒活性检测：

3.1. 假单胞菌菌株ND022发酵液的制备

将假单胞菌菌株 ND022接种于LB液体培养基(配置方法：胰蛋白陈10g，酵母膏5g，NaCl 10g，pH7.0，加水至1000 mL)，在37℃，200 r/min 条件下恒温振荡培养1 d，获得ND022发酵液，放4℃保存备用。

3.2. 枯斑法检测假单胞菌菌株ND022发酵液在烟草上对TMV的防治效果

选健康的8叶期三生烟 (Nicotiana tabacum var samsunNN)，选取大小一致，中脉左右匀称的叶片。取感染TMV(Tobacco Mosaic Virus)引发烟草花叶病的发病症状严重的普通烟叶片，与接种PBS缓冲液(10mM磷酸缓冲液，pH7.4)以1：10（w/v）的比例研磨混匀，作为TMV病毒接种液；取上述得到的ND022发酵提取物与病毒接种液1∶1混匀，将混合液置于25℃，静置30 min后蘸取接种液摩擦接种选取的8叶期三生烟的左半边叶片；取接种上述缓冲液与病毒接种液1∶1混匀，半小时后摩擦接种右半边叶片作为对照；每个处理接种6个叶片，做3个重复处理；待出现明显枯斑后，记录枯斑数，取平均值，按以下公式计算抑制率：

抑制率(％)＝[1-(处理枯斑数/对照枯斑数)]×100。

请参阅图3，显示了本申请实施例中假单胞菌菌株ND022发酵液处理组及清水对照组烟草叶片枯斑症状，从图3可以看出喷施ND022菌株发酵液的叶片TMV感染症状明显低于清水对照组。

3.3. 假单胞菌菌株ND022发酵液在烟草上抗TMV机理

选择健康、长势一致的6-8叶期普通烟K326，实验设不同处理：

CK：喷施清水后24h接种TMV；

T：喷施假单胞菌菌株ND022发酵液后24h接种上述所得TMV病毒液。

分别于接种后1、3、5、7、9天取各组烟草相同部位的叶片，每个处理随机选取3株，重复3次。收集叶片液氮速冻后存放在-80℃冰箱中待测定相关防御酶活性及qRT-PCR测定病毒表达情况。

请参阅图4，显示了本申请实施例中假单胞菌菌株ND022发酵液处理组及清水对照组TMV表达量变化。发酵液处理组TMV含量很低几乎不变，在1至9天接种TMV和发酵液的实验组TMV含量一直低于对照组，在第9天对照组TMV含量达到最大值，而实验组明显低于对照组。

3.3.1. qRT-PCR测病毒表达量

采用Trizol法提取上述收集叶片的RNA，取50-100 mg新鲜植物组织尽量剪碎，之后加入1 mL Total RNA Extraction Reagent混匀。将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5分钟以使核蛋白体完全解离。4℃，12, 000 rpm离心10 min，取上清。向上述裂解液中加入0.2 mL氯仿。盖紧离心管盖，剧烈震荡15 sec，室温静置2-3 min。4℃，12, 000 rpm离心10-15 min。小心吸取上层水相至新离心管中，加入等体积异丙醇。颠倒混匀后室温放置10 min。4℃，12, 000 rpm离心10 min。小心弃去上清，加入1 mL 75%乙醇。涡旋充分洗涤，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。4℃，12,000 rpm离心5 min，弃上清。室温放置空气干燥5-10min。加入30-100 μL 无RNase水溶解RNA，待完全溶解后，取少量检测，其余溶液-70 ℃保存。

使用Nanodrop超微量分光光度计对提取的总RNA进行核酸浓度的测定，测定后进行烟草cDNA的合成及扩增，利用烟草cDNA进行实时荧光定量PCR以测定烟草体内TMV含量，以不同时间段各处理普通烟K326样品β-Actin为内参基因各菌种发酵液处理的烟草体内TMV-CP为目标基因含量以评估菌种发酵液对烟草抗性的影响，根据2^-ΔΔCt计算在不同时间段内各处理下的TMV-CP基因的相对表达水平。

3.3.2. 防御酶活性测定

采用愈创木酚法进行过氧化物酶(POD)活性测定，反应体系为2.9 mL 0.05 mol/LPBS缓冲液（pH 5.5）1.0 mL2% H₂O₂、1.0 mL 0.05 mol/L愈创木酚和0.1 mL酶液。37 ℃水浴锅内保温5 min， PBS替代酶液为空白对照。混匀后立刻计时，在470 nm下测定3 min内吸光度变化，每分钟变化0.01为一个酶活力单位U/（g·min）。

测定超氧化物歧化酶（SOD）活性采用超氧化物歧化酶活性检测试剂盒检测，取0.1g烟草叶片，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；8,000 g、4 ℃离心10 min，取上清，即为粗酶液，置于冰上待测。将粗酶液加入到试剂中混匀，不加入样本的预混液为空白对照组，37℃水浴30 min后，置于1 mL玻璃比色皿中测定560 nm下的吸光度。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性用苯丙氨酸解氨酶检测试剂盒测定，取0.1g烟草叶片，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；8,000 g、4℃离心10 min，取上清，即为粗酶液，置于冰上待测。将粗酶液加入到试剂中混匀，不加入样本的预混液为空白对照组，静置10 min 后，在290 nm处记录测定管吸光值。

请参阅图5至图7，显示了本申请实施例中防御酶活性的测定结果，假单胞菌菌株ND022发酵液处理的实验组SOD、PAL、POD活性都在第九天达到最大值。其中，第九天假单胞菌菌株ND022发酵液处理的烟草SOD活性相比于CK组提高了229.27%，PAL活性提高了17.95%，POD活性提高了364.29%。

综上，假单胞菌菌株ND022发酵液对烟草普通花叶病毒的抑制作用显著，首先是在三生烟枯斑实验中对TMV抑制率较高，ND022发酵液对TNMV钝化作用的抑制率可达63%。在ND022发酵液对TMV的抑制作用进一步探究中，从K326烟草内病毒表达量以及防御酶的变化情况中可以看出，ND022能够诱导烟草产生抗病性，在接种TMV后，因其体内产生的抗性而使得烟草感染的病毒无法在其体内大量繁殖，从而达到比较好的抗病毒效果。将菌株ND022应用于抗花叶病毒生物农药的开发，能够开出发新的、高效、安全的微生物制剂来控制植物病毒病。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种假单胞菌菌株（Pseudomonas sp. ND022），其特征在于，所述假单胞菌菌株已于2023年04月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2023616。

2.根据权利要求1所述的假单胞菌菌株在制备抗烟草花叶病毒微生物制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的假单胞菌菌株在制备抗烟草花叶病毒微生物制剂中的应用，其特征在于，所述假单胞菌菌株的分离包括以下步骤：待烟草长至6-7叶时，取根系土壤进行土壤微生物的分离与纯化，以通过在PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基以及高氏一号培养基上涂布分离单菌落，划线纯化后分离出假单胞菌菌株。

4.根据权利要求3所述的假单胞菌菌株在制备抗烟草花叶病毒微生物制剂中的应用，其特征在于，假单胞菌菌株发酵液的制备包括以下步骤：

将分离出的假单胞菌菌株接种于LB液体培养基，在37℃、200 r/min条件下恒温振荡培养1d，获得所述假单胞菌菌株发酵液，在4℃下保存；

所述LB液体培养基组成为10g胰蛋白陈、5g酵母膏、10g NaCl，pH自然，加水至1000 mL。

5.根据权利要求4所述的假单胞菌菌株在制备抗烟草花叶病毒微生物制剂中的应用，其特征在于，所述应用按如下步骤进行：

将制备得到的假单胞菌菌株发酵液喷洒或蘸涂到烟草花叶的叶片上。

6.一种微生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的假单胞菌菌株。

7.根据权利要求6所述的微生物制剂，其特征在于，还包括与剂型相匹配的助剂。

8.根据权利要求6-7任一项所述的微生物制剂在防治烟草花叶病毒中的应用。