CN117223859A

CN117223859A - 功能性组合物及其用途

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Publication number: CN117223859A
Application number: CN202311317564.3A
Authority: CN
Inventors: 李菊芳; 解庆刚; 任琦琦; 刘洋; 张永久; 陆思宇; 冷友斌; 蔡方良
Original assignee: Feihe Baiquan Dairy Products Co ltd; Feihe Jilin Dairy Co ltd; Feihe Tailai Dairy Products Co ltd; Heilongjiang Feihe Dairy Co Ltd
Current assignee: Feihe Baiquan Dairy Products Co ltd; Feihe Jilin Dairy Co ltd; Feihe Tailai Dairy Products Co ltd; Heilongjiang Feihe Dairy Co Ltd
Priority date: 2023-10-11
Filing date: 2023-10-11
Publication date: 2023-12-15

Abstract

本发明涉及功能性组合物及其用途，所述组合物包含如下(i)所示的第一组分和(ii)所示的第二组分两个必要组分：所述第一组分(i)，选自N‑乙酰神经氨酸、唾液酸化寡糖、唾液酸化蛋白以及唾液酸化脂类中的一种或多种；所述第二组分(ii)，选自双歧杆菌属益生菌中的一种或多种；并且，在所述组合物中，所述第一组分(i)所示的物质的质量与所述第二组分(ii)所示的益生菌的数量的比值为1mg：(0.16×10⁷～0.4×10¹⁰)CFU。相比单独的唾液酸、唾液酸化物质或双歧杆菌属益生菌，本发明提供的组合物可以更加有效的增强免疫力，及预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病，也可以更加有效抑制炎症反应。

Description

功能性组合物及其用途

技术领域

本发明属于功能性营养物质研究技术领域，具体涉及功能性组合物及其用途，更具体涉及功能性组合物及其在有助于增强免疫力、抗流感病毒抗炎症反应及方面的用途。

背景技术

流行性感冒(简称流感)，是一种随季节规律发作的急性呼吸道传染病，主要由流感病毒引起，具有传播速度快速、传染性强和致病性重的特点。流感的病原体为正黏病毒科RNA病毒，根据基质蛋白抗原以及病毒核蛋白差异，分为甲、乙、丙型(或A、B、C型)3种。血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)是甲型流感病毒囊膜上的主要纤突蛋白。HA的变异没有新亚型的出现，多引起阶段性或季节性的小型流感；NA的变异则会有新亚型的产生，往往会导致爆发传染迅速、波及范围极广的大型流感。甲型H1N1病毒是目前流行范围最广的一类病毒，这种病毒是一个三重排甲型流感病毒复合体，其中基因片段PB2和PA的母体为禽流感病毒，MP，NP，HA，NA和NS来源于猪流感病毒，参与重排的PB1是人流感病毒基因片段，由于甲型H1N1流感病毒集聚了禽流感、猪流感和人流感病毒的相关基因片段，在遗传物质上发生了质变，使其入侵宿主细胞的毒力和能力明显高于猪流感病毒亲本，容易引发传播迅速、致死率高的全球性大流感。

人类感染H1N1病毒后，病毒主要在呼吸道和肺中复制，流感病毒能够特异性地结合人类上呼吸道中的α-2,6-半乳糖唾液酸受体(SAα2和6Gal)和禽类细胞中的α-2,3-半乳糖唾液酸受体(SAα2和3Gal)，引发病毒不断的转录、复制，造成流感在人类或禽类之间的传播。婴幼儿/儿童/孕产妇/老年人等易感人群在病毒感染后可引起严重的并发症和后遗症，对生命健康造成严重的威胁。

接种流感疫苗是目前预防流感的重要手段之一，但是流感疫苗尚有其不足之处，其一为物质限制，制备流感疫苗须能在鸡胚中高效复制方可，且用鸡胚生产流感疫苗的过程耗时长，操作复杂，无法满足流感爆发需求。其二是疫苗抗同亚型病毒感染效果较为显著，但对不同亚型病毒抗感染效果较差。

在机体感染病毒后的治疗方面，目前主要策略为抑制病毒本身复制、提高机体免疫力或抑制机体炎症反应等。抑制病毒复制的药物有奥司他韦、扎那米韦和金刚烷胺等；中药复方在提高机体免疫力，以增强自身对病毒的免疫应答能力方面有一定疗效。虽然药物制剂在临床上表现出不同程度的治疗效果，但几种药物仍然存在药物安全问题和不良反应。特别是针对婴幼儿、儿童的有效抗病毒药物较少，且存在诸多不规范使用问题。医生在用药时对用药剂量、给药途径等进行严格把控，患儿家属也对药物使用保持谨慎态度。其中，IFN-a目前尚无雾化吸入用制剂，仅将注射用IFN-a作为雾化吸入制剂使用，该药品目前属于“超说明书用药”；奥司他韦不良反应较轻，但也会对胃肠道、肝脏、中枢神经系统、呼吸系统、血液、皮肤等产生不良副作用；阿比多尔的主要不良反应包括恶心、腹泻、头晕和血清转氨酶增高等；利巴韦林具有严重的不良反应，由于其在红细胞内发生反应，主观严重不良反应是溶血性贫血，口服1-2周内幼儿/儿童可能会出现血红蛋白下降、红细胞下降、白细胞下降，严重影响孩子自身免疫力。

抗病毒研究的另一方向是抑制机体炎症风暴的产生。炎症反应的产生本身是由机体对病原体入侵的一种保护性的反应，但其作用太强可引起与感染相关的各种有害影响，所以机体内的炎症反应必须得到适当的调节，使机体免受炎症造成的严重损伤。

使用益生菌是当前预防或治疗病毒时考虑的一种方案，且其在肠道病毒感染，如轮状病毒感染的预防或治疗中具有一定的疗效，得到临床验证。其在临床治疗肠道炎性疾病的分子和细胞机制主要涉及3个方面：1)益生菌可产生抗菌物质并竞争性与病原微生物粘附于肠上皮来阻止病原体在肠道的粘附和定植；2)益生菌可提高肠上皮细胞的存活率和肠上皮的屏障功能并刺激保护性反应来调节肠上皮细胞的动态平衡；3)益生菌可提高天然免疫并通过TLR信号途径调节病原体引起的炎性反应。而关于益生菌在呼吸道疾病的预防和治疗也有一些报道，例如引用文献1公开了动物双歧杆菌及其制备的复合菌制剂在制备治疗或预防禽流感病毒感染的药物中的应用，但作用机制尚不明确。

此外，N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)又称为唾液酸，广泛存在于哺乳动物组织中，是黏蛋白、糖蛋白和糖脂的低聚糖链的组成部分，占据复杂碳水化合物低聚糖链的末端非还原端位置，以各种方式连接在细胞膜内外表面，具有重要的生理功能。Neu5Ac在大脑中的浓度较高，其在神经细胞膜上的含量是其他细胞的20倍。Neu5Ac参与细胞间的识别、调节神经发生、细胞增殖和迁移、突触发生、细胞粘附和轴突引导，对大脑信息传递、神经冲动传导及突触形成过程中起关键作用，行为上有助于促进婴幼儿学习能力和记忆功能。目前，已有现有技术报道唾液酸及其寡糖在流感病毒防治中的应用，例如引用文献2公开了一种抑制有需要的婴儿中的呼吸道病毒生长的方法，所述方法包括：鉴别具有呼吸道合胞病毒、人3型副流感病毒和甲型流感病毒中的至少一种的婴儿；以及向所述婴儿施用由营养物递送系统制备的婴儿配方食品，所述营养物递送系统包括(a)荚式容器；以及(b)营养粉末，其包含人乳寡糖或其前体，此外，所述营养粉末还可以包含益生菌。

引用文献：

引用文献1：CN 111110703 B；

引用文献2：CN 106659218 A。

发明内容

发明要解决的问题

基于以上现有技术中对于唾液酸或唾液酸化寡糖及益生菌已经展开的探索，本发明在通过大量的进一步研究后，意外发现唾液酸或唾液酸化物质与双歧杆菌属益生菌以特定配比组合，具有协同增效的有助于增强免疫力、抗流感病毒或抑制炎症反应的作用。

需要说明的是，尽管现有技术，例如引用文献2中的研究，提到了人乳寡糖单独或与益生菌组合可以用于控制和减轻与肠-脑-免疫系统相关的许多疾病、病症和病状。但是，这些研究的主要目的在于提供一种更加方便使用的营养物递送系统，以提供具有一致配方的婴儿配方食品，从而为婴儿提供在合适温度下的最佳量的适当营养物，而其对于具体的营养组合物在控制和减轻与肠-脑-免疫系统相关的许多疾病、病症和病状等功效方面并未给出任何实证，且其明确说明营养粉末包含益生菌是为了向最终使用者提供在促进婴儿胃肠道中的微生物群生长方面的协同益处。

因此，本发明的目的在于提供一种组合物及其用途，以适当的配比组合唾液酸或唾液酸化物质和双歧杆菌属益生菌，以起到协同增效的有助于增强免疫力、抗流感病毒或抑制炎症反应的作用，这样的作用可以为治疗目的或者非治疗目的。

用于解决问题的方案

为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

[1].一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如下两个必要组分，并且，在优选的实施方案中，作为组合物的活性组分，必要的包括或者由这两个组分构成，所述的活性为抑制炎症反应的能力和/或有助于增强免疫力的活性，

(i)所示的第一组分和(ii)所示的第二组分：

所述第一组分(i)，选自N-乙酰神经氨酸、唾液酸化寡糖、唾液酸化蛋白以及唾液酸化脂类中的一种或多种；

所述第二组分(ii)，选自双歧杆菌属益生菌中的一种或多种；

并且，在所述组合物中，所述第一组分(i)所示的物质的质量与所述第二组分(ii)所示的益生菌的数量的比值为1mg：(0.16×10⁷～0.4×10¹⁰)CFU。

[2].根据[1]所述的组合物，其特征在于，所述第一组分(i)中，所述唾液酸化寡糖包括3’-唾液酸化乳糖、6’-唾液酸化乳糖、唾液酸化-乳糖-N-四糖a、唾液酸化-乳糖-N-四糖b、唾液酸化-乳糖-N-四糖c和二唾液酸-乳糖-N-四糖中的任意一种或多种。

[3].根据[1]或[2]所述的组合物，其特征在于，所述第二组分(ii)中，所述双歧杆菌属益生菌包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌动物亚种、动物双歧杆菌乳亚种、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种和长双歧杆菌婴儿亚种中的任意一种或多种。

[4].根据[1]～[3]任一项所述的组合物在制备具有抑制炎症反应的能力和/或有助于增强免疫力的产品中的用途。

[5].根据[4]所述的用途，其特征在于，所述炎症反应包括炎症因子表达的升高。

[6].根据[4]或[5]所述的用途，其特征在于，所述产品包括食品、保健食品或药物。

[7].根据[1]～[3]任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病的药物中的用途。

[8].根据[7]所述的用途，其特征在于，所述病毒包括流感病毒。

[9].根据[7]或[8]所述的用途，其特征在于，所述病毒感染性呼吸道疾病具有引起炎症反应的症状。

[10].一种产品，其特征在于，所述产品包括根据[1]～[3]任一项所述的组合物和如下成分中的任意一种或多种：植物制品成分、动物肉制品成分、动物乳制品成分、功能性添加成分和任意的可接受的辅料。

发明的效果

通过上述技术方案的实施，本发明获得了以下技术效果：

本发明通过大量筛选研究，开发了一种组合物，其包含特定比例的唾液酸或唾液酸化物质与双歧杆菌属益生菌。相比单独的唾液酸、唾液酸化物质或双歧杆菌属益生菌，本发明提供的组合物可以更加有效的增强免疫力，进一步更加有效的预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病，也可以更加有效抑制炎症反应。同时，该组合物可以长期服用，有助于增强免疫力，也可以在病毒感染后使用，以抑制流感病毒侵袭导致的症状对人体的侵害。

此外，本发明意外发现，在一些优选方案中，N-乙酰神经氨酸联合双歧杆菌属益生菌比唾液酸化寡糖等具有更有效的抑制流感病毒对细胞的侵害作用，以及可以起到更优良的抑制炎症反应的作用，并且该效果在N-乙酰神经氨酸含量较高且双歧杆菌属益生菌含量较低的情况下尤为显著。

附图说明

图1：不同浓度功能活性物质组分对HEP-2细胞毒性检测结果。

图2：实施例9个功能性物质组合与BB536低中高三个剂量影响免疫因子生成浓度的比较结果。

图3：实施例9个功能性物质组合与SA低中高三个剂量影响免疫因子生成浓度的比较结果。

图4：3个功能性物质组合影响炎症因子mRNA表达量的比较结果。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，所使用“婴幼儿”表示年龄3岁以下的人类群组。

本说明书中，所使用的“儿童”表示年龄大于3岁，且小于12岁，处于生长发育期的人类生活群体。

本说明书中，所使用的“青少年”表示年龄大于12岁，且小于18岁，处于生长发育期的人类生活群体。

本说明书中，所使用的“中老年”表示年龄在45岁以上的人类群体。

本说明书中，使用“动物乳”表示从处于泌乳期间的哺乳动物的乳腺获得的液体。术语“动物乳”应被广义地解释，并且涵盖生乳(即，直接从乳腺获得的液体)和标准化乳制品(例如像脱脂乳或全脂乳)两者。

本说明书中，使用“任选”或“任选的”表示某些物质、组分、执行步骤、施加条件等因素使用或者不使用。

本说明书中，所使用的单位名称均为国际标准单位名称，并且如果没有特别声明，所使用的“％”均表示重量或质量百分含量。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

另外，除非另有定义，本发明所用的其他的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。

以下对本发明技术方案进行进一步具体说明：

组合物

本发明提供了一种组合物，其包含如下第一组分(i)和第二组分(ii)所示的组分，并且，二者作为所述组合物的必要组分：

所述第二组分(ii)，选自双歧杆菌属益生菌中的一种或多种；

相比单独的唾液酸、唾液酸化物质或双歧杆菌属益生菌，本发明提供的组合物可以更加有效的增强免疫力，以及预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病，也可以更加有效抑制炎症反应。

在一些优选的实施方案中，所述组合物的活性成分由如下第一组分(i)和第二组分(ii)所示的组分组成：

所述第二组分(ii)，选自双歧杆菌属益生菌中的一种或多种；

(N-乙酰神经氨酸及唾液酸化物质)

N-乙酰神经氨酸又称为唾液酸(N-Acetylneuraminic Acid，NANA)，是大脑神经节苷脂的重要组成部分。研究表明，N-乙酰神经氨酸广泛存在于各种生物组织中，是糖蛋白、低聚糖和糖脂的重要成分，通常在糖蛋白和糖脂的末端以糖甙的形式存在，特别在哺乳动物的脑、神经组织、血液、颌下腺、黏蛋白、初乳中存在较多。N-乙酰神经氨酸具有促进智力发育，提高肠道吸收能力，提高免疫力等多方面的有益功效。

目前，N-乙酰神经氨酸生产方法主要有天然原料提取法、化学合成法、多聚物分解法、酶及固定化酶法和微生物发酵法等。本发明对于N-乙酰神经氨酸的来源和提取工艺不做特别限定，典型的，可以通过微生物发酵法、酶法制备而来，或者从富含唾液酸的物质，如鸡蛋、燕窝中提取而来，也可以通过商购获得成品N-乙酰神经氨酸。

唾液酸化(Sialylation)是一种糖基化，涉及唾液酸共价添加到糖蛋白和糖脂的末端聚糖上。这一酶促过程受到唾液酸转移酶(STs)和唾液酸酶/神经氨酸酶(NEUs)的严格调控。根据糖苷键的种类，唾液酸化可分为三种类型：α2-3-、α2-6-和α2-8-唾液酸化。本发明所述的唾液酸化物质主要包括唾液酸化寡糖、唾液酸化蛋白及唾液酸化脂类。

在一些实施方案中，本发明所述的唾液酸化寡糖包括3’-唾液酸化乳糖、6’-唾液酸化乳糖、唾液酸化-乳糖-N-四糖a、唾液酸化-乳糖-N-四糖b、唾液酸化-乳糖-N-四糖c和二唾液酸-乳糖-N-四糖中的任意一种或多种。在一些优选的实施方案中，本发明所述的唾液酸化寡糖为3’-唾液酸化乳糖。

为了获得更加有效的抗流感病毒或抑制炎症反应的效果，在一些具体的实施方案中，本发明所述的组合物包含如下(i)所示的第一组分和(ii)所示的第二组分，并且，二者作为所述组合物的必要组分：(i)N-乙酰神经氨酸或3’-唾液酸化乳糖；(ii)双歧杆菌属益生菌中的一种或多种。在一些优选的实施方案中，所述组合物的活性成分由如下第一组分(i)和第二组分(ii)所示的组分组成：(i)N-乙酰神经氨酸或3’-唾液酸化乳糖；(ii)双歧杆菌属益生菌中的一种或多种。

(双歧杆菌属益生菌)

本发明对于双歧杆菌属益生菌的来源不做特别限定，典型的，可以通过微生物发酵得到，或直接购买市售成品。

本发明对于双歧杆菌属的具体菌种不做特别限定，在一些实施方案中，本发明所述的双歧杆菌属益生菌包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌动物亚种、动物双歧杆菌乳亚种、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种和长双歧杆菌婴儿亚种中的任意一种或多种。在一些优选的实施方案中，本发明所述的双歧杆菌属益生菌为长双歧杆菌长亚种。

本发明对于上述各菌种的具体菌株也不做特别限定，示例性的，所述动物双歧杆菌乳亚种包括Bb-12菌株、HN109菌株和Bi-07等等，两歧双歧杆菌包括R0071菌株等，所述长双歧杆菌婴儿亚种包括R0033菌株等，长双歧杆菌长亚种包括BB536菌株等。

为了获得更加有效的增强免疫力，以及抗流感病毒或抑制炎症反应的效果，在一些具体的实施方案中，本发明所述的组合物包含如下(i)和(ii)所示的组分：(i)N-乙酰神经氨酸，或唾液酸化寡糖，或唾液酸化蛋白，或唾液酸化脂类；(ii)长双歧杆菌长亚种。

在一些更具体的实施方案中，本发明所述的组合物包含如下(i)所示的第一组分和(ii)所示的第二组分，并且，二者作为所述组合物的必要组分：(i)N-乙酰神经氨酸或3’-唾液酸化乳糖；(ii)长双歧杆菌长亚种。在一些优选的实施方案中，所述组合物的活性成分由如下第一组分(i)和第二组分(ii)所示的组分组成：(i)N-乙酰神经氨酸或3’-唾液酸化乳糖；(ii)长双歧杆菌长亚种。

本发明通过大量实验，意外发现在一些优选的实施方案中，当本发明所述的组合物包含如下(i)所示的第一组分和(ii)所示的第二组分作为所述组合物的必要组分时，增强免疫力以及抗流感病毒和抑制炎症反应的功效尤为突出，(i)N-乙酰神经氨酸；(ii)长双歧杆菌长亚种。在一些更优选的实施方案中，所述组合物的活性成分由如下第一组分(i)和第二组分(ii)所示的组分组成：(i)N-乙酰神经氨酸；(ii)长双歧杆菌长亚种。

进一步，为了获得更优的协同增加的增强免疫力，抑制炎症反应，或预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病的效果，在一些具体的实施方案中，在本发明所述的组合物中，(i)所示的物质的质量与(ii)所示的益生菌的数量的比值为1mg：(0.16×10⁷～0.4×10¹⁰)CFU，例如可以为1mg：0.16×10⁷CFU、1mg：0.5×10⁷CFU、1mg：0.2×10⁸CFU、1mg：0.3×10⁸CFU、1mg：0.1×10⁹CFU、1mg：0.3×10⁹CFU、1mg：0.4×10⁹CFU、1mg：0.1×10¹⁰CFU或1mg：0.4×10¹⁰CFU等。

本发明对于所述组合物的形态不做特别限定，典型的，可以为液体或固体等。

出于对所述组合物的使用方法的考虑，并为了满足相关法律法规的要求。在一些实施方案中，所述组合物是非食品组合物。在一些实施方案中，所述组合物是非食品和非保健食品组合物。在另一些实施方案中，所述组合物是食品组合物。在另一些实施方案中，所述组合物是保健食品组合物。在一些实施方案中，所述组合物为药物组合物。

产品

本发明提供了一种产品，所述产品包含上述组合物。

对于本发明所述的产品除了上述必要组分以外，还可以根据最终产品的需要，包括其他成分，可以例举的包括：

植物制品成分，包括无花果、石榴、猕猴桃、橘子、橙子、菠萝、草莓、苹果、橡胶、葡萄、梨、樱桃、蓝莓、黑莓、黑加仑、蔓越莓、覆盆莓、甜瓜、余甘子和山桑子等水果或它们的提取物；洋蔥、黄瓜、番茄、花椰菜、红萝卜、菠菜、芥蓝、球芽甘蓝、大蒜、罗勒、奧勒冈草等果蔬类物质或它们的提取物；稻类(籼稻、粳稻、糯稻)、麦类(小麦、大麦、燕麦、黑麦)、玉米、高粱、粟、黍、黄米、荞麦、大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、红小豆、芸豆等谷物或它们的提取物；核桃、开心果、腰果、榛子、扁桃、杏仁、松子、花生、瓜子、板栗、夏威夷果、白果等坚果类物质或它们的提取物；咖啡或其提取物；以及一些药食同源的植物性中药材或其提取物。

动物肉制品成分，包括猪、牛、羊、水产类或禽类的肉制品成分。

动物乳制品成分，包括来源于牛、羊等的鲜乳，以及乳粉、乳清蛋白或奶酪等再加工乳制品。

功能性添加成分，包括维生素(维生素A、β-胡萝卜素、维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、泛酸、叶酸、烟酸、胆碱、肌醇、生物素、左旋肉碱、叶黄素中的一种或多种)；淀粉；改性淀粉；氨基酸(L-赖氨酸-L-谷氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酰胺、牛磺酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、酪蛋白磷酸肽等)；膳食纤维(菊粉、魔芋粉、低聚半乳糖、低聚果糖、棉子糖、聚葡萄糖、低聚异麦芽糖、大豆多糖、环糊精、抗性糊精或大豆纤维等)；微量元素补充剂(可以包括有机酸类的金属离子盐，例如柠檬酸钙、L-乳酸钙、磷酸氢钙、葡萄糖酸钾、柠檬酸钠、葡萄糖酸亚铁、碘化钾、葡萄糖酸锌、亚硒酸钠、葡萄糖酸铜、硫酸铬、葡萄糖酸锰和葡萄糖酸镁等)，脂肪类补充剂(例如饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、OPO结构脂、OPL结构脂、LPL结构脂、DHA、EPA、ARA、磷脂等)；核苷酸补充剂；母乳寡糖(例如2’-FL、3-FL、DFL、LNFPI、LNFPII、LNT、LNnT、3’-SL、6’-SL、DSLNT等)等。

任意的可接受的辅料，包括但不限于溶剂、抗氧剂、抗菌剂、增稠剂、稀释剂、助溶剂、稳定剂、乳化剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣材料、抗结块剂、矫味剂、甜味剂、食用香精、食用色素等。

对上述产品的具体类型，本发明不做特别限定。在一些实施方案中，所述产品是食品。在一些实施方案中，所述产品是保健食品。在一些实施方案中，所述产品是药物。在另一些实施方案中，所述产品是非食品。在另一些实施方案中，所述产品是非保健食品。在另一些实施方案中，所述产品是非药物。

针对不同的产品类别，对于所述产品的具体形态，本发明不做特别限定，示例性的，可以为固体形式或液体形式。

对于所述产品所针对的人群，本发明不做特别限定，示例性的，所述产品可以用于婴幼儿、儿童、青少年或成人。

在一些具体的实施方案中，本发明所述的产品可以是婴幼儿配方奶粉、婴儿辅食、儿童配方奶粉、儿童零食、孕妇调制奶粉、中老年奶粉或营养或膳食补充剂。

在另一些具体的实施方案中，本发明所述的产品可以是饮料(碳酸类饮料、果蔬汁饮料、功能饮料、茶类饮料、乳饮料、酒精饮料、速溶咖啡、谷物粉，坚果粉或藕粉等)、糖果(凝胶糖果、硬质糖果、压片糖等)、乳及乳制品(来源于生鲜牛(羊)乳的鲜乳、乳粉、乳清粉、发酵乳、奶酪或炼乳等)、面食制品(挂面、方便面、馒头、包子、饺子或馄饨，以及面包、蛋糕或饼干等烘焙食品)等。

在其他一些具体的实施方案中，本发明所述的产品为口服制剂，所述口服制剂包括但不限于片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、喷雾剂、茶剂、胶囊剂或口服液等。

本发明提供的产品原则上适合所有人群，尤其适合于免疫力低下，或对增强免疫力有需求，或对抑制炎症反应有需求的人群。对于针对不同特性的人群也可以对产品中的组分进行相应的调整。

在使得所述产品获得有效的增强免疫力，抑制炎症反应，以及预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病的作用的同时，所述产品中各物质的含量也相对应的满足相关市场规定或要求。

进一步，对于N-乙酰神经氨酸和双歧杆菌属益生菌在产品中的用量，可以依据不同地区或国家的相关法律法规的规定而使用。在一些优选的实施方案中，在所述产品中，所述组合物必要组分中的N-乙酰神经氨酸占所述产品总质量的0.01％-1％，优选0.05％-0.6％。在一些优选的实施方案中，在所述产品中，所述组合物必要组分中的唾液酸化寡糖占所述产品总质量的0.06％-1.1％，优选0.15％-0.75％。在一些优选的实施方案中，在所述产品中，所述组合物必要组分中的双歧杆菌属益生菌占所述产品总质量的10⁸-10¹³CFU/g，优选10⁹-10¹¹CFU/g。

有助于增强免疫力的用途

本发明提出利用唾液酸或唾液酸化物质与双歧杆菌属益生菌以特定比例复配，可以增强免疫力，且两种物质之间具有协同增效的作用。因此，本发明提供的组合物可以用于制备有助于增强免疫力的产品，本发明所述的产品(例如食品或保健食品等)也能够增强免疫力。

抑制炎症反应的用途

本发明提出利用唾液酸或唾液酸化物质与双歧杆菌属益生菌以特定比例复配，可以用于抑制炎症反应，且两种物质之间具有协同增效的作用。因此，本发明提供的组合物可以用于制备具有抑制炎症反应的能力的产品，本发明所述的产品(例如食品、保健食品或药物)也具有抑制炎症反应的能力。

在一些实施方案中，本发明所述的抑制炎症反应不以预防和/或治疗疾病为目的，并且所述炎症反应也并未达到成为疾病的程度，此时具有抑制炎症反应能力的组合物或产品可以为食品或保健食品。同时，本发明所述的抑制炎症反应可以用于提高免疫力，本发明提供的产品也可以通过抑制炎症反应来提高免疫力。在另一些实施方案中，本发明所述的抑制炎症反应以预防/或治疗疾病为目的，例如当流感病毒感染后，抑制炎症反应以避免流感对机体造成损害，此时具有抑制炎症反应能力的组合物或产品可以为药物。

本发明所述的炎症反应包括炎症因子表达的升高，在一些实施方案中，所述炎症因子包括TNF-α、IL-6和iNOS中的任意一种或多种。

同时，本发明还提供了一种抑制炎症反应的方法，所述方法包括向对有需要的人群施用适量的所述组合物，或所述产品。所述施用包括有需要的人群口服、口含或吸入所述组合物或所述产品。通过摄入所述组合物或产品，可以有效抑制炎症反应，包括疾病状态下的炎症反应或非疾病状态的炎症反应。

预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病的用途

本发明提出利用唾液酸或唾液酸化物质与双歧杆菌属益生菌以特定比例复配，可以用于预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病，且两种物质之间具有协同增效的作用。因此，本发明提供的组合物可以用于制备用于预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病的药物，本发明所述的药物也具有预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病的能力。

本发明所述的病毒感染性呼吸道疾病包括流感病毒感染引起的呼吸道疾病，典型的，包括甲型H1N1流感病毒感染引起的呼吸道疾病。

此外，在一些实施方案中，本发明所述的病毒感染性呼吸道疾病具有引起炎症反应的症状；进一步，所述炎症反应包括炎症因子表达的升高；更进一步，所述炎症因子包括TNF-α、IL-6和iNOS中的任意一种或多种。

同时，本发明还提供了一种预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病的方法，所述方法包括向对有需要的人群施用适量的所述组合物，或所述药物。所述施用包括有需要的人群口服、口含或吸入所述组合物或所述药物。通过摄入所述组合物或药物，可以有效预防和/或治疗例如流感病毒等感染性呼吸道疾病。

实施例

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规的试剂、方法和设备。

如引用文献(王倩雯.缓解呼吸道病毒感染的益生菌筛选和机制研究[D].江南大学,2022.)中所述，病毒感染后，宿主会激活机体的免疫响应，以抵抗其感染，保护机体健康；但免疫反应虽然以消灭病毒为目的，然而抗病毒过程却会直接对机体造成伤害，并最终加重了呼吸道的炎症和损伤。因此，为了筛选适当的有助于协同提高免疫力的组合物并证明其功效，本发明以流感病毒侵染细胞为示例模型，从抗病毒和抑制炎症反应两个方面对组合物的有助于提高免疫力的功效进行展示和验证。

1制剂组合物抗流感病毒实验方案

1.1.1细胞和病毒

细胞株(HEP-2)购自ATCC。甲型H1N1流感病毒是由中国疾病预防控制中心提供，-80℃冷藏。

1.1.2实验材料与试剂

实验材料：SA(N-乙酰神经氨酸)，3’-SL(3'-唾液酸乳糖)，6’-SL(6'-唾液酸乳糖)，长双歧杆菌BB536。称取各物质适量，用DMSO溶解成20mM的母液。H1N1流感病毒液鸡胚传代2次，测定病毒效价为2^-7。

96孔板购自Corning Costar(Cambridge，MA，USA)公司；DMEM培养基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司；双抗(10,000U/mL青霉素-10,000g/mL链霉素)(10,000U/mL Penicillin-10,000U/mL Streptomycin))购自北京索莱宝生物科技有限公司。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)购自美国Sigma公司。

细胞培养液：DMEM培养基含10％FBS和1％双抗；

细胞维持液：DMEM培养基含2％FBS和1％双抗。

1.1.3仪器

细胞培养箱；光学显微镜；超净工作台，水浴锅，RT-PCR检测仪，Western Blot检测系统。

1.1.4实验方法

1)H1N1流感病毒TCID₅₀的测定

用不含血清的DMEM培养基对流感病毒H1N1冻存液进行10倍递次稀释，将稀释好的各个浓度的病毒液依次接种到铺满单层细胞的96孔板中，100μL/孔，每个浓度6复孔，设正常细胞对照组。将加入病毒液的96孔板在37℃，5％的CO₂培养箱中吸附2h，之后用细胞维持液替换掉病毒稀释液，再置于培养箱中继续培养48h后观察细胞形态，记录孔数和病变程度，当细胞对照组接近于正常形态，被病毒感染的细胞病变率≥50％的孔作为病变孔，按Reed-Muench法计算病毒的半数细胞培养物感染量(TCID₅₀)。

2)功能性物质对细胞毒性实验

将HEP-2细胞复苏，传代3-4次待细胞生长良好，胰酶消化，用完全培养基将细胞的浓度稀释为1.5×10⁵个/mL，吹打混匀后接种于96孔板，100μL/孔，37℃、5％ CO₂培养箱中孵育24h。用培养液将待测物分别连续对倍递次稀释(最大浓度200μM)，将各浓度加入96孔板，100μL/孔，每个浓度3复孔，设空白对照组。放入37℃，5％ CO₂培养箱中持续培养48h，观察细胞形态，弃上清，用PBS将CCK-8配成10％的溶液，每孔加入100μL，作用1h后用酶标仪于540nm波长处测定细胞吸光度，根据公式：细胞存活率％＝给药组的吸光度值(A)/细胞对照组吸光度值(A)×100％，计算细胞存活率。

3)功能性组合物抗H1N1病毒有效率检测

设置正常细胞对照(阴性对照组)、流感病毒对照组(阳性对照组)和给药组。取已长成单层细胞的培养板，吸除培养液，加入100TCID₅₀的病毒液(流感病毒对照组和给药组)或培养基(正常细胞对照组)，100μL/孔，在37℃、5％ CO₂培养箱中吸附4h后，将流感病毒液吸除，加入适合剂量的化合物各100μL，每浓度3个复孔，重复3次。48h后观察细胞形态，弃上清，用PBS将CCK-8配成10％的溶液，每孔加入100μL，作用1h后用酶标仪于540nm波长处测定细胞吸光度A值，根据公式：抑制率(％)＝(药物平均A值-病毒对照组平均A值)/(细胞对照平均A值-病毒对照组平均A值)×100％，计算药物对病毒致细胞的病变抑制率。

4)功能性组合物抗H1N1病毒机制研究

设置正常细胞对照(空白对照组)、流感病毒对照组(模型对照组)和给药组(见表4)。取已长成单层细胞的培养板，吸除培养液，加入100TCID₅₀的病毒液(流感病毒对照组和给药组)或培养基(正常细胞对照组)，1.0mL/孔，在37℃、5％ CO₂培养箱中吸附4h后，将流感病毒液吸除，加入适合剂量的化合物各1.0mL，每浓度3个复孔，重复3次。48h后取上清用ELISA试剂盒检测炎症因子TNF-α，iNOS和IL-6的含量。

设置正常细胞对照(空白对照组)、流感病毒对照组(模型对照组)和给药组(见表4)。取已长成单层细胞的培养板，吸除培养液，加入100TCID₅₀的病毒液(流感病毒对照组和给药组)或培养基(正常细胞对照组)，1.0mL/孔，在37℃、5％ CO₂培养箱中吸附4h后，将流感病毒液吸除，加入适合剂量的化合物各1.0mL，每浓度3个复孔，重复3次。48h后吸除上清液，用预冷PBS洗细胞两次，Trizol提取总RNA，逆转录后采用实时荧光定量PCR检测炎症因子TNF-α，iNOS和IL-6的mRNA表达量。

2实验结果

本研究中首先考察了几种功能性物质对HEP-2细胞的毒性，结果如图1和表1所示。从图中可以看出SA和两种唾液酸寡糖(3’-SL和6’-SL)在浓度达到200μM时细胞的存活率仍可达到100％，这说明这三种物质对细胞的存活率没有影响；而益生菌BB536在浓度达到2000μg/mL时，细胞的存活率小于80％，1000μg/mL时，细胞的存活率接近80％，说明2000μg/mL这个剂量对细胞具有一定的毒性，但同时发现BB536的半数毒性浓度(TC₅₀)仍大于给药的最大浓度(见表1)，进一步说明这四种物质在给药范围内对细胞的存活率影响不大。结合上述结果，在药物抗病毒有效率的检测实验中，功能蛋白和益生菌的最大浓度设置为2000μg/mL，其中益生菌的活度为2×10¹¹CFU/g，故益生菌的最大浓度也即4×10⁸CFU/mL。

表1功能活性物质组分对HEP-2细胞毒性

化合物	TC₅₀
		SA	>1000μM
3’-SL	>2000μM
		6’-SL	>2000μM
BB536	>2000μg/mL

进一步对这4种功能性物质在抑制病毒致细胞病变方面的作用进行了研究，结果如表2所示，从表中可以看出SA和唾液酸化寡糖3’-SL对H1N1流感病毒致HEP-2细胞病变具有明显的抑制作用，IC₅₀值分别为48.37±1.08μM和54.32±2.05μM。而BB536的IC₅₀值大于1000μg/mL，说明其单独对H1N1流感病毒致HEP-2细胞病变的抑制作用不显著。进一步考察了三种功能性物质在高低不同浓度下，以及不同配比下对病毒致细胞病变的抑制作用，其中SA和3’-SL的低高浓度分别设置为10μM和40μM，根据分子量进行单位转换为μg/mL；BB536的低高浓度分别为40μg/mL和160μg/mL，结果如表3所示。从表中可以看出SA和3’-SL在高浓度时对病毒致细胞病变的抑制率可达60％以上，而BB536在高浓度时抑制率仅为34％，但将SA和3’-SL分别与BB536组合后发现SA和BB536的组合中对细胞病变的抑制率可以达到83.36％，说明两种物质组合后起到协同增效的作用。3’-SL与BB536组合后对细胞病变的抑制率为65.52％，比3’-SL高浓度剂量时高了5.52％，协同增效作用次于SA与BB536的组合。

表2功能性物质成分对病毒致细胞病变的抑制结果

化合物	IC₅₀
		SA	48.37±1.08μM
3’-SL	54.32±2.05μM
		6’-SL	>200μM
BB536	>1000μg/mL

表3功能性物质成分组合物对病毒致细胞病变的抑制率

基于前期的初步研究，进一步对SA和BB536抑制H1N1流感病毒的作用机制进一步研究，具体实施方案设计如表4所示。

表4不同剂量功能性组合物抑制H1N1流感病毒实验设计方案

流感病毒侵染机体细胞后，会通过Toll样受体(TLR)通路传导激活NF-κB通路，引起炎症反应并导致细胞的凋亡。TLR激活刺激抗病毒应答，并可能导致促炎介质的大量分泌。在炎症诱导的免疫反应中，促炎细胞因子TNF-α、IL-6等起着关键的调节作用。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是由多种细胞在炎症反应和免疫调节刺激时产生的一种多效性细胞因子，可以诱导细胞调亡。IL-6是急性期反应的强激活剂，有助于全身和局部炎症反应。过量的IL-6可诱发多种慢性炎症疾病。NO自由基在炎症和免疫反应中同样至关重要。它由NOS(eNOS)和iNOS等酶通过l-精氨酸途径合成。在正常生理条件下，休眠细胞内iNOS处于休眠状态。然而，在病理条件下，它产生大量的NO，并在慢性感染、炎症中发挥双重作用。减少NO的产生可能是治疗多种炎症性疾病的有效策略。本研究首先利用ELISA的方法对两种促炎因子的生成进行了检测，并且进一步采用PCR对炎症因子在基因水平上的mRNA的表达量进行再次确定。

从表5中可以看出正常细胞对照组中促炎因子TNF-α、IL-6和iNOS的量分别为59.67±6.67pg/mL、246.39±8.24pg/mL和2.87±0.09pg/mL，而经过病毒侵染后的模型组中三者的量分别达到了144.11±1.92pg/mL、417.62±6.46pg/mL和5.14±0.25pg/mL，三种炎症因子均有显著升高(如表5和6所示)，说明造模成功。通过功能性物质SA和益生菌BB536低中高不同剂量干预处理，发现促炎因子的量均有降低(表5)；经过差异显著分析后发现，除了BB536在低浓度时TNF-α因子与模型组无显著差异(p＞0.05)外，BB536的中高浓度和SA的低中高三个浓度下的三个免疫因子TNF-α，IL-6和iNOS均比模型组极显著降低(p≤0.0005)(如表6所示)。

表5功能性物质及其不同组合在抗H1N1病毒过程中炎症因子生成量

	分组	TNF-α(pg/mL)	IL-6(pg/mL)	iNOS(pg/mL)
					对比例1	C	59.67±6.67	246.39±8.24	2.87±0.09
对比例2	M	144.11±1.92	417.62±6.46	5.14±0.25
					对比例3	SA-H	80.89±7.56	300.65±1.01	3.63±0.30
对比例4	BB536-H	97.11±10.09	302.39±2.70	3.86±0.14
					对比例5	SA-M	87.11±5.89	306.42±8.88	4.10±0.08
对比例6	BB536-M	101.89±8.39	326.18±5.54	4.13±0.13
					对比例7	SA-L	104.78±10.46	321.75±3.25	4.17±0.05
对比例8	BB536-L	125.22±1.92	346.95±5.79	4.43±0.39
					实施例1	SA+BB LL	100.78±6.94	297.31±5.99	3.80±0.03
实施例2	SA+BB LM	91.44±4.29	297.98±9.01	3.51±0.05
					实施例3	SA+BB LH	79.33±6.51	290.85±2.91	3.84±0.12
实施例4	SA+BB ML	67.11±8.00	273.01±2.58	3.71±0.07
					实施例5	SA+BB MM	72.67±3.38	288.70±2.23	3.40±0.19
实施例6	SA+BB MH	65.33±4.51	288.44±7.79	3.24±0.10
					实施例7	SA+BB HL	43.00±5.77	287.95±8.00	3.23±0.02
实施例8	SA+BB HM	47.44±3.85	299.01±2.59	3.21±0.09
					实施例9	SA+BB HH	54.84±5.72	285.26±3.26	3.23±0.26

表6各组间炎症因子生成量差异比较

进一步地对9组功能性组合物抑制H1N1流感病毒的功效与两种单一物质进行了对比分析，结果如图2和图3所示。

从图2中可以看出BB536组合SA后三个炎症因子的生成浓度比BB536单体作用的浓度均有降低，尤其SA以中高剂量与BB536组合时协同增效的效果更加显著。表7显示了采用单因素方差分析后的结果。从表中可以看出9个功能性物质组合与BB536低浓度相比，三个免疫因子TNF-α，IL-6和iNOS均极显著(p＜0.01)降低；与BB536中剂量单独作用相比，除了LL组和LM组的TNF-α浓度无显著差异(p＞0.05)，LL组，ML组和MM组的iNOS浓度无显著差异外，其余各组三个免疫因子均极显著降低(p＜0.01)；而与BB536高剂量组相比，SA以低中高剂量与BB536组合后TNF-α的浓度均极显著降低(p＜0.01)，同时SA以高剂量与BB536组合后iNOS的生成浓度极显著降低(p＜0.01)。

从图3可以看出，9个功能性物质组合与SA低中高三个浓度单独作用相比时也看到了协同增效的效果。具体地利用单因素方差分析(如表7所示)检验后发现，SA高剂量与BB536三个剂量分别组合后(HL组，HM组和HH组)的三个炎症因子(TNF-α、IL-6和iNOS)生成量均极显著低于SA低剂量组(SA-L)；与SA中剂量组(SA-M)相比，发现除HM组的IL-6因子与SA-M组无显著差异(p＞0.05)外，其余指标均极显著降低(p＜0.01)；与SA高剂量组相比，炎症因子IL-6和iNOS均未产生显著差异(p＞0.05)，但HL组、HM组和HH组的TNF-α生成浓度极显著低于SA-H组(p＜0.01)。

通过以上分析可以看出，SA+BB(HL)组、SA+BB(HM)组和SA+BB(HH)组在抑制H1N1甲流病毒炎症因子产生上效果极显著高于SA和BB536单独作用。

进一步地，本研究采用mRNA的表达量比较了三个组合(HL组、HM组、HH组)在基因水平上的炎症因子产生情况，结果如图4所示。从图中可以看出，SA+BB(HL)组的三个炎症因子的mRNA表达量低于SA+BB(HM)组和SA+BB(HH)组，经过Two way ANOVA检验后发现HL组的TNF-αmRNA表达量与HH组无显著差异(p＞0.05)，但显著低于HM组(p＜0.05)；而对于IL-6，HL组显著低于HM组和HH组(p＜0.05)，HM组和HH组间无显著差异(p＞0.05)；而对于炎症因子iNOS，三组间均无显著差异(p＞0.05)。故从以上分析可以看出，唾液酸SA和益生菌BB536在高低剂量组合时(即SA/BB536为1:0.16×10⁷mg/CFU)搭配的情况下具有最优的抑制H1N1病毒致细胞感染产生的炎症反应。

表7各组间炎症因子生成量差异比较

产业上的可利用性

本发明提供的组合物可以在食品、保健食品或药物等多领域广泛使用。

Claims

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如下两个必要组分：

(i)所示的第一组分和(ii)所示的第二组分：

所述第二组分(ii)，选自双歧杆菌属益生菌中的一种或多种；

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一组分(i)中，所述唾液酸化寡糖包括3’-唾液酸化乳糖、6’-唾液酸化乳糖、唾液酸化-乳糖-N-四糖a、唾液酸化-乳糖-N-四糖b、唾液酸化-乳糖-N-四糖c和二唾液酸-乳糖-N-四糖中的任意一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述第二组分(ii)中，所述双歧杆菌属益生菌包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌动物亚种、动物双歧杆菌乳亚种、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种和长双歧杆菌婴儿亚种中的任意一种或多种。

4.根据权利要求1～3任一项所述的组合物在制备具有抑制炎症反应的能力和/或有助于增强免疫力的产品中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述炎症反应包括炎症因子表达的升高。

6.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述产品包括食品、保健食品或药物。

7.根据权利要求1～3任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗病毒感染性呼吸道疾病的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述病毒包括流感病毒。

9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述病毒感染性呼吸道疾病具有引起炎症反应的症状。

10.一种产品，其特征在于，所述产品包括根据权利要求1～3任一项所述的组合物和如下成分中的任意一种或多种：植物制品成分、动物肉制品成分、动物乳制品成分、功能性添加成分和任意的可接受的辅料。