CN117222722A - 核酸扩增用敏化剂、核酸扩增用组合物和检查试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供核酸扩增用敏化剂,其是包含来源于用下述式(1)表示的单体的结构单元的聚合物,式中符号的定义如说明书中所述。
Description
技术领域
本发明涉及核酸扩增用敏化剂、核酸扩增用组合物和检查试剂盒。
背景技术
核酸扩增法是将成为靶标的核酸从几拷贝扩增至几万倍以上的方法,为了基因检查、微生物检查、病毒检查而在各种各样的领域中被有效利用。
核酸扩增法的代表性的方法是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)法。在典型的PCR法中,通过重复以下这三个工序进行核酸的扩增:(1)模板DNA的变性(从双链DNA向单链DNA解离),(2)引物退火至单链模板DNA,(3)通过DNA聚合酶进行引物的延伸。在经典的终点PCR法中,通过在经历了规定的反应循环的反应终点(endpoint)将扩增产物通过荧光性化合物等可视化或者测定溶液的浊度来进行检测。
典型的PCR法是扩增DNA的方法,但也可应用于RNA的扩增,将这样的PCR法被称为逆转录聚合酶链式反应法(以下有时简称为“RT-PCR法”)。在RT-PCR法中,通过使用逆转录酶的酶反应由RNA合成互补DNA(以下有时简称为“cDNA”),以该cDNA为模板进行PCR,由此扩增RNA。
还已知根据PCR法中得到的扩增产物的量来确定初始的核酸的量的方法,将这种PCR法称为定量聚合酶链式反应法(以下有时简称为“qPCR法”)。qPCR法在狭义上是指实时PCR法,其为使用荧光DNA染色试剂或荧光探针将每个PCR循环中扩增的DNA量可视化的方法。其中,特别是使用荧光探针的方法作为在可特异性地检测目标核酸的扩增这一点上可靠性高的方法而已知。
还已知将RT-PCR法和qPCR法组合的逆转录-定量PCR法(以下有时简称为“RT-qPCR法”)。RT-qPCR法可进一步被分为:在不同的容器中进行cDNA合成和qPCR法的两步法;将它们在同一容器内作为一系列的反应来进行的一步法。其中,在操作的简便性、来自系统外的污染物少、作为测定对象的核酸的检测灵敏度(以下有时简称为“灵敏度”)高的方面,一步法为优异的。
进一步地,近年来还开发了数字PCR法(以下有时简称为“dPCR法”)这种方法,其应用微流路形成技术等,将反应液分配到几十~几万个极小的区域中,一起进行PCR,从有扩增的区域的比例利用统计模型确定初始的核酸浓度。dPCR法是终点PCR法的发展形式。
除了如上所述的确定靶标核酸的有无和/或量的目的以外,PCR法还用于确定靶标核酸的核苷酸序列的目的(测序)。在测序PCR法中,存在以Sanger法为代表的各种方法,但均以终点PCR法为基本原理。
在此,在利用核酸扩增法时,在定性、定量和确定序列的任一项中,其灵敏度经常成为问题。因此,对促进PCR的技术进行了各种研究。
例如,广泛进行了通过向PCR法的反应液中添加盐(例如氯化钾、硫酸铵等)、甜菜碱、多元醇等来提高灵敏度。然而,通过添加这些成分来提高灵敏度是有限度的,寻求在更高的水平上提高灵敏度。
例如,已知有添加单链DNA结合蛋白(SSB)以使双链DNA不稳定化的方法。另外,在专利文献1中,作为用于促进DNA的伸长反应的通用性高的DNA复制促进因子(添加剂),公开了突变型PCNA(增殖核抗原)单体。然而,由这些蛋白构成的添加剂存在难以大量生产、保存稳定性存在问题、制造成本高这种课题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2007/004654号。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供与由蛋白构成的添加剂相比量产性和保存稳定性优异的核酸扩增用敏化剂。
用于解决课题的手段
本发明人反复进行了深入研究,结果发现了包含来源于用下述式(1)表示的单体的结构单元的聚合物可适合用作核酸扩增用敏化剂:
[化学式1]
基于该见解的本发明如下所示。
[1]核酸扩增用敏化剂,其是包含来源于用以下式(1)表示的单体的结构单元的聚合物:
[化学式2]
(式中,
X1表示(甲基)丙烯酰氧基或(甲基)丙烯酰氨基,
L1表示可具有1个羟基的碳原子数为2~4的亚烷基或者碳原子数为2~4的亚烷基氧基亚烷基,以及
R1~R3各自独立地表示碳原子数为1~3的烷基)。
[2]根据上述[1]所述的核酸扩增用敏化剂,其是由来源于用上述式(1)表示的单体的1种结构单元构成的均聚物。
[3]根据上述[1]所述的核酸扩增用敏化剂,其是进一步包含来源于用以下式(2)表示的单体的结构单元的共聚物:
[化学式3]
(式中,
R4表示氢原子或甲基,以及
R5表示氢原子或碳原子数为1~20的烷基)。
[4]根据上述[3]所述的核酸扩增用敏化剂,其中R5是碳原子数为12~18的烷基。
[5]根据上述[1]、[3]或[4]所述的核酸扩增用敏化剂,其是进一步包含来源于用以下式(3)表示的单体的结构单元的共聚物:
[化学式4]
(式中,
R6表示氢原子或甲基,以及
R7表示具有2个以上羟基的碳原子数为3~6的烷基)。
[6]核酸扩增用组合物,其包含上述[1]~[5]中任一项所述的核酸扩增用敏化剂。
[7]根据上述[6]所述的核酸扩增用组合物,其用于逆转录聚合酶链式反应法。
[8]根据上述[6]或[7]所述的核酸扩增用组合物,其用于定量聚合酶链式反应法。
[9]根据上述[6]~[8]中任一项所述的核酸扩增用组合物,其进一步包含引物。
[10]根据上述[9]所述的核酸扩增用组合物,其中引物是长度为10~40个碱基的寡核苷酸。
[11]根据上述[9]或[10]所述的核酸扩增用组合物,其中引物的浓度为0.1~3.0μM。
[12]检查试剂盒,其包含上述[6]~[11]中任一项所述的核酸扩增用组合物。
[13]根据上述[12]所述的检查试剂盒,其用于临床检查。
[14]根据上述[12]或[13]所述的检查试剂盒,其中检查对象为病毒。
[15]核酸扩增法,其包括使用上述[1]~[5]中任一项所述的聚合物作为敏化剂。
[16]核酸扩增法,其包括将上述[6]~[11]中任一项所述的核酸扩增用组合物和包含所扩增的核酸的样品混合,调制核酸扩增用反应液。
[17]根据上述[15]或[16]所述的核酸扩增法,其是逆转录聚合酶链式反应法。
[18]根据上述[15]~[17]中任一项所述的核酸扩增法,其是定量聚合酶链式反应法。
发明效果
本发明的核酸扩增用敏化剂在核酸扩增法中可提高核酸的检测灵敏度。另外,由于本发明的核酸扩增用敏化剂是合成聚合物,所以与由蛋白构成的添加剂相比量产性和保存稳定性为优异的。
具体实施方式
以下详细地说明本发明。
本说明书中,“(甲基)丙烯酰氧基”基本上意指“丙烯酰氧基或甲基丙烯酰氧基”。在可存在多个(甲基)丙烯酰氧基的情况下,“(甲基)丙烯酰氧基”意指“丙烯酰氧基和/或甲基丙烯酰氧基”。与“(甲基)丙烯酰氧基”类似的其他术语也是与“(甲基)丙烯酰氧基”相同的含义。
另外,本说明书中,在记载阶段性的数值范围的情况下,各数值范围的下限值和上限值可组合。例如,在记载“优选10~100、更优选20~90”的情况下,可将“优选的下限值:10”和“更优选的上限值:90”组合(即,“10~90”的数值范围也在本说明书的范围内)。
[核酸扩增用敏化剂]
本发明的核酸扩增用敏化剂(以下有时记为“本发明的敏化剂”)是包含来源于用下述式(1)表示的单体(以下有时简称为“单体(1)”)的结构单元的聚合物(以下有时简称为“本发明的聚合物”):
[化学式5]
在此,核酸扩增用敏化剂意指用于提高核酸扩增法中的核酸的检测灵敏度的添加剂。
作为核酸扩增法,例如可列举:聚合酶链式反应(PCR)法、环介导等温扩增(LAMP)法、转录介导扩增(TMA)法、嵌合引物引发的核酸等温扩增(Isothermal and Chimericprimer-initiated Amplification of Nucleic acids,IICAN)法、链置换扩增(SDA)法、连接酶链式反应(LCR)法、基于核酸序列的扩增(NASBA)法等。核酸扩增法优选为PCR法。即,本发明的敏化剂优选用于聚合酶链式反应法。
作为PCR法,优选上述的逆转录聚合酶链式反应法。即,本发明的敏化剂优选用于逆转录聚合酶链式反应法。
作为PCR法,优选上述的定量聚合酶链式反应法。即,本发明的核敏化剂优选用于定量聚合酶链式反应法。
本发明的敏化剂可仅使用1种,也可并用2种以上。另外,本发明的敏化剂可与其他添加剂并用。
来源于单体(1)的结构单元(以下有时简称为“结构单元(1)”)意指具有单体(1)中所含的(甲基)丙烯酰基的碳-碳双键反应而形成的结构的结构单元。来源于其他单体的结构单元也是与来源于单体(1)的结构单元相同的含义。
单体(1)可仅使用1种,也可并用2种以上。即,本发明的敏化剂可以是由1种结构单元(1)构成的均聚物,也可以是包含2种以上结构单元(1)的共聚物。上述共聚物可以是无规共聚物,也可以是嵌段共聚物,还可以是包含无规部分和嵌段部分两者的共聚物。在本发明的聚合物不含结构单元(1)以外的结构单元的情况下,本发明的敏化剂优选为由1种结构单元(1)构成的均聚物,更优选为由来源于2-(甲基)丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元构成的均聚物,进一步优选为由来源于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元构成的均聚物。
以下,依次对式(1)中的基团进行说明。式(1)中的X1表示(甲基)丙烯酰氧基(即CH2=CR-CO-O-,R:氢原子或甲基)或(甲基)丙烯酰氨基(即CH2=CR-CO-NH-,R:氢原子或甲基)。从原料获取性的观点来看,X1优选为(甲基)丙烯酰氧基、更优选为甲基丙烯酰氧基。
式(1)中的L1表示可具有1个羟基的碳原子数为2~4的亚烷基或者碳原子数为2~4的亚烷基氧基亚烷基。上述亚烷基可以是直链状,也可以是支链状。作为可具有1个羟基的碳原子数为2~4的亚烷基,例如可列举-C2H4-。作为碳原子数为2~4的亚烷基氧基亚烷基,例如可列举-C2H4-O-C2H4-。从原料获取性的观点来看,L1优选为-C2H4-或-C2H4-O-C2H4-、更优选为-C2H4-(即亚乙基)。
式(1)中的R1~R3各自独立地表示碳原子数为1~3的烷基。上述烷基可以是直链状,也可以是支链状。作为碳原子数为1~3的烷基,例如可列举甲基、乙基、丙基等。从原料获取性的观点来看,R1~R3优选均为甲基。
优选的单体(1)是X1为(甲基)丙烯酰氧基、L1为-C2H4-或-C2H4-O-C2H4-且R1~R3为甲基的单体。更优选的单体(1)是X1为(甲基)丙烯酰氧基、L1为亚乙基且R1~R3为甲基的单体(即2-(甲基)丙烯酰氧乙基磷酰胆碱)。进一步优选的单体是2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱。单体(1)可使用市售品。
本发明的聚合物除了结构单元(1),还可进一步包含来源于用式(2)表示的单体(以下有时简称为“单体(2)”)的结构单元(以下有时简称为“结构单元(2)”):
[化学式6]
单体(2)可仅使用1种,也可并用2种以上。即,本发明的聚合物可以是包含1种或更多种的结构单元(1)以及1种或更多种的结构单元(2)的共聚物。上述共聚物可以是无规共聚物,也可以是嵌段共聚物,还可以是包含无规部分和嵌段部分两者的共聚物。
以下,依次对式(2)中的基团进行说明。式(2)中的R4表示氢原子或甲基。从聚合物的保存稳定性的观点来看,R4优选为甲基。
式(2)中的R5表示氢原子或碳原子数为1~20的烷基。上述烷基可以是直链状,也可以是支链状。作为碳原子数为1~20的烷基,例如可列举甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。
从敏化效果的观点来看,R5优选为碳原子数1~20的烷基、更优选为碳原子数2~20的烷基、进一步优选为碳原子数12~18的烷基、特别优选为碳原子数12~18的直链烷基。另外,在本发明的聚合物进一步包含来源于用下述式(3)表示的单体的结构单元的情况下,R5优选为碳原子数3~6的烷基。
作为单体(2)的具体例子,可列举(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸戊酯、(甲基)丙烯酸己酯、(甲基)丙烯酸庚酯、(甲基)丙烯酸辛酯、(甲基)丙烯酸壬酯、(甲基)丙烯酸癸酯、(甲基)丙烯酸十一烷基酯、(甲基)丙烯酸十二烷基酯、(甲基)丙烯酸十三烷基酯、(甲基)丙烯酸十四烷基酯、(甲基)丙烯酸十五烷基酯、(甲基)丙烯酸鲸蜡酯、(甲基)丙烯酸十七烷基酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯等。单体(2)可使用市售品。
在单体(2)的上述具体例子中,优选(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸戊酯、(甲基)丙烯酸己酯、(甲基)丙烯酸庚酯、(甲基)丙烯酸辛酯、(甲基)丙烯酸壬酯、(甲基)丙烯酸癸酯、(甲基)丙烯酸十一烷基酯、(甲基)丙烯酸十二烷基酯、(甲基)丙烯酸十三烷基酯、(甲基)丙烯酸十四烷基酯、(甲基)丙烯酸十五烷基酯、(甲基)丙烯酸鲸蜡酯、(甲基)丙烯酸十七烷基酯和(甲基)丙烯酸硬脂酯,更优选(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸十二烷基酯、(甲基)丙烯酸十三烷基酯、(甲基)丙烯酸十四烷基酯、(甲基)丙烯酸十五烷基酯、(甲基)丙烯酸鲸蜡酯、(甲基)丙烯酸十七烷基酯和(甲基)丙烯酸硬脂酯,进一步优选(甲基)丙烯酸丁酯和(甲基)丙烯酸硬脂酯,特别优选甲基丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸硬脂酯。
在本发明的聚合物包含结构单元(1)和结构单元(2)的情况下,从敏化效果的观点来看,相对于结构单元(1)和结构单元(2)总计100摩尔(即用于聚合的单体(1)和单体(2)总计100摩尔),结构单元(1)的量(即用于聚合的单体(1))优选为30~99摩尔、更优选为30~90摩尔、进一步优选为50~90摩尔、特别优选为75~90摩尔,结构单元(2)的量(即用于聚合的单体(2))优选为1~70摩尔、更优选为10~70摩尔、进一步优选为10~50摩尔、特别优选为10~25摩尔。
本发明的聚合物除了结构单元(1),还可进一步包含来源于用式(3)表示的单体(以下有时简称为“单体(3)”)的结构单元(以下有时简称为“结构单元(3)”):
[化学式7]
单体(3)可仅使用1种,也可并用2种以上。即,本发明的聚合物可以是包含1种或更多种的结构单元(1)以及1种或更多种的结构单元(3)的共聚物,也可以是包含1种或更多种的结构单元(1)、1种或更多种的结构单元(2)以及1种或更多种的结构单元(3)的共聚物。上述共聚物可以是无规共聚物,也可以是嵌段共聚物,还可以是包含无规部分和嵌段部分两者的共聚物。
以下,依次对式(3)中的基团进行说明。R6表示氢原子或甲基。从聚合物的保存稳定性的观点来看,R6优选为甲基。
式(3)中的R7表示具有2个以上羟基的碳原子数为3~6的烷基。R7中的羟基的数量优选为2~5。上述烷基可以是直链状,也可以是支链状。作为碳原子数为3~6的烷基,例如可列举丙基、丁基、戊基、己基等。
作为单体(3)的具体例子,可列举单(甲基)丙烯酸甘油酯、苏糖醇单(甲基)丙烯酸酯、赤藓糖醇单(甲基)丙烯酸酯、木糖醇单(甲基)丙烯酸酯、阿拉伯糖醇单(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇单(甲基)丙烯酸酯、半乳糖醇单(甲基)丙烯酸酯、山梨糖醇单(甲基)丙烯酸酯等。这些之中,优选单(甲基)丙烯酸甘油酯和木糖醇单(甲基)丙烯酸酯,更优选单(甲基)丙烯酸甘油酯,进一步优选单甲基丙烯酸甘油酯。
单体(3)可使用市售品,也可通过公知的方法来制造。例如,单体(3)可通过(甲基)丙烯酸或其衍生物(例如酰氯化物)与具有3个以上羟基的多元醇的酯化反应来制造。酯化反应为众所周知的,本领域技术人员可适当设定其条件来进行。
在本发明的聚合物包含结构单元(1)和结构单元(3)的情况下,从敏化效果的观点来看,相对于结构单元(1)和结构单元(3)总计100摩尔(即用于聚合的单体(1)和单体(3)总计100摩尔),结构单元(1)的量(即用于聚合的单体(1))优选为30~80摩尔、更优选为30~70摩尔、进一步优选为30~60摩尔,结构单元(3)的量(即用于聚合的单体(3))优选为20~70摩尔、更优选为30~70摩尔、进一步优选为40~70摩尔。
在本发明的聚合物包含结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)的情况下,从敏化效果的观点来看,相对于结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)总计100摩尔(即用于聚合的单体(1)、单体(2)和单体(3)总计100摩尔),结构单元(1)的量(即用于聚合的单体(1))优选为30~80摩尔、更优选为30~70摩尔、进一步优选为30~60摩尔,结构单元(2)的量(即用于聚合的单体(2))优选为10~60摩尔、更优选为20~60摩尔、进一步优选为30~60摩尔,结构单元(3)的量(即用于聚合的单体(3))优选为10~60摩尔、更优选为10~50摩尔、进一步优选为10~40摩尔。
本发明的聚合物在不损害本发明效果的范围内可包含来源于不同于上述单体(1)~(3)的其他单体的其他结构单元。其他单体可仅使用1种,也可并用2种以上。作为其他单体,没有特别限定,但例如可列举(甲基)丙烯酸苄酯、(甲基)丙烯酸异冰片酯等。本发明的聚合物中的其他结构单元的量相对于全部结构单元优选为20摩尔%以下。本发明的聚合物更优选不含其他结构单元。
本发明的聚合物优选为选自由1种结构单元(1)构成的均聚物,由结构单元(1)和结构单元(2)构成的共聚物以及由结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)构成的共聚物的至少一种;更优选为由1种结构单元(1)构成的均聚物,由结构单元(1)和结构单元(2)构成的共聚物,或由结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)构成的共聚物。需要说明的是,在本说明书中,“由1种结构单元(1)构成的均聚物”意指其全部的结构单元(重复单元)由1种结构单元(1)构成的均聚物,“由结构单元(1)和结构单元(2)构成的共聚物”意指其全部结构单元(重复单元)由结构单元(1)和结构单元(2)构成的共聚物,“由结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)构成的共聚物”意指其全部结构单元(重复单元)由结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)构成的共聚物。其他同样的表述也是同样的含义。
对本发明聚合物的重均分子量没有特别限定,但优选为10,000~1,000,000。需要说明的是,该重均分子量例如可通过使用了EcoSEC系统(东曹株式会社制造)等的凝胶过滤层析通过聚乙二醇换算来确定。
本发明的聚合物可通过公知的方法(例如国际公开2018/216628号所记载的方法等)制造。
本发明的敏化剂(即本发明的聚合物)的使用量用下述的核酸扩增用组合物中的浓度来确定。从敏化效果和抑制上述组合物的粘度增加的观点来看,上述组合物中的本发明的敏化剂的浓度优选为0.00001~10w/v%、更优选为0.001~1w/v%、进一步优选为0.01~0.5w/v%。需要说明的是,在使用2种以上敏化剂的情况下,上述浓度意指2种以上敏化剂的浓度的总计。对于以下的其他成分所记载的浓度,在使用2种以上该成分的情况下,上述浓度也意指2种以上该成分的浓度的总计。
[本发明的敏化剂(本发明的聚合物)的优选例]
作为本发明的敏化剂(本发明的聚合物)的优选例,可列举以下的本发明的敏化剂(I)(本发明的聚合物(I))~本发明的敏化剂(IV)(本发明的聚合物(IV))。
<本发明的敏化剂(I)(本发明的聚合物(I))>
本发明的敏化剂(I)(本发明的聚合物(I))为选自以下均聚物(I-1)、共聚物(I-2)和共聚物(I-3)的至少一种,优选为以下均聚物(I-1)、共聚物(I-2)或共聚物(I-3):
均聚物(I-1),其由来源于2-((甲基)丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1)构成;
共聚物(I-2),其由
来源于2-((甲基)丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1),和
来源于(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸戊酯、(甲基)丙烯酸己酯、(甲基)丙烯酸庚酯、(甲基)丙烯酸辛酯、(甲基)丙烯酸壬酯、(甲基)丙烯酸癸酯、(甲基)丙烯酸十一烷基酯、(甲基)丙烯酸十二烷基酯、(甲基)丙烯酸十三烷基酯、(甲基)丙烯酸十四烷基酯、(甲基)丙烯酸十五烷基酯、(甲基)丙烯酸鲸蜡酯、(甲基)丙烯酸十七烷基酯或(甲基)丙烯酸硬脂酯的结构单元(2)
构成,并且相对于结构单元(1)和结构单元(2)总计100摩尔,结构单元(1)的量为30~99摩尔而结构单元(2)的量为1~70摩尔;以及
共聚物(I-3),其由
来源于2-((甲基)丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1),
来源于(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸戊酯、(甲基)丙烯酸己酯、(甲基)丙烯酸庚酯、(甲基)丙烯酸辛酯、(甲基)丙烯酸壬酯、(甲基)丙烯酸癸酯、(甲基)丙烯酸十一烷基酯、(甲基)丙烯酸十二烷基酯、(甲基)丙烯酸十三烷基酯、(甲基)丙烯酸十四烷基酯、(甲基)丙烯酸十五烷基酯、(甲基)丙烯酸鲸蜡酯、(甲基)丙烯酸十七烷基酯或(甲基)丙烯酸硬脂酯的结构单元(2),和
来源于单(甲基)丙烯酸甘油酯或木糖醇单(甲基)丙烯酸酯的结构单元(3)
构成,并且相对于结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)总计100摩尔,结构单元(1)的量为30~80摩尔、结构单元(2)的量为10~60摩尔而结构单元(3)的量为10~60摩尔。
在本发明的敏化剂(I)(本发明的聚合物(I))中,优选共聚物(I-2)中的结构单元(1)的量为30~90摩尔而结构单元(2)的量为10~70摩尔,以及共聚物(I-3)中的结构单元(1)的量为30~70摩尔、结构单元(2)的量为20~60摩尔而结构单元(3)的量为10~50摩尔。需要说明的是,共聚物(I-2)中的上述结构单元的量的基准为结构单元(1)和结构单元(2)总计100摩尔,以及共聚物(I-3)中的上述结构单元的量的基准为结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)总计100摩尔。
在本发明的敏化剂(I)(本发明的聚合物(I))中,更优选共聚物(I-2)中的结构单元(1)的量为50~90摩尔而结构单元(2)的量为10~50摩尔,以及共聚物(I-3)中的结构单元(1)的量为30~60摩尔、结构单元(2)的量为30~60摩尔而结构单元(3)的量为10~40摩尔。需要说明的是,共聚物(I-2)中的上述结构单元的量的基准为结构单元(1)和结构单元(2)总计100摩尔,以及共聚物(I-3)中的上述结构单元的量的基准为结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)总计100摩尔。
在本发明的敏化剂(I)(本发明的聚合物(I))中,进一步优选共聚物(I-2)中的结构单元(1)的量为75~90摩尔而结构单元(2)的量为10~25摩尔,以及共聚物(I-3)中的结构单元(1)的量为30~60摩尔、结构单元(2)的量为30~60摩尔而结构单元(3)的量为10~40摩尔。需要说明的是,共聚物(I-2)中的上述结构单元的量的基准为结构单元(1)和结构单元(2)总计100摩尔,以及共聚物(I-3)中的上述结构单元的量的基准为结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)总计100摩尔。
<本发明的敏化剂(II)(本发明的聚合物(II))>
本发明的敏化剂(II)(本发明的聚合物(II))为选自以下均聚物(II-1)、共聚物(II-2)和共聚物(II-3)的至少一种,优选为以下均聚物(II-1)、共聚物(II-2)或共聚物(II-3):
均聚物(II-1),其由来源于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1)构成;
共聚物(II-2),其由
来源于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1),和
来源于(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸十二烷基酯、(甲基)丙烯酸十三烷基酯、(甲基)丙烯酸十四烷基酯、(甲基)丙烯酸十五烷基酯、(甲基)丙烯酸鲸蜡酯、(甲基)丙烯酸十七烷基酯或(甲基)丙烯酸硬脂酯的结构单元(2)
构成,并且相对于结构单元(1)和结构单元(2)总计100摩尔,结构单元(1)的量为30~90摩尔而结构单元(2)的量为10~70摩尔;以及
共聚物(II-3),其由
来源于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1),
来源于(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸十二烷基酯、(甲基)丙烯酸十三烷基酯、(甲基)丙烯酸十四烷基酯、(甲基)丙烯酸十五烷基酯、(甲基)丙烯酸鲸蜡酯、(甲基)丙烯酸十七烷基酯或(甲基)丙烯酸硬脂酯的结构单元(2),和
来源于单(甲基)丙烯酸甘油酯的结构单元(3)
构成,并且相对于结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)总计100摩尔,结构单元(1)的量为30~70摩尔、结构单元(2)的量为20~60摩尔而结构单元(3)的量为10~50摩尔。
在本发明的敏化剂(II)(本发明的聚合物(II))中,优选共聚物(II-2)中的结构单元(1)的量为50~90摩尔而结构单元(2)的量为10~50摩尔,以及共聚物(II-3)中的结构单元(1)的量为30~60摩尔、结构单元(2)的量为30~60摩尔而结构单元(3)的量为10~40摩尔。需要说明的是,共聚物(II-2)中的上述结构单元的量的基准为结构单元(1)和结构单元(2)总计100摩尔,以及共聚物(II-3)中的上述结构单元的量的基准为结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)总计100摩尔。
在本发明的敏化剂(II)(本发明的聚合物(II))中,更优选共聚物(II-2)中的结构单元(1)的量为75~90摩尔而结构单元(2)的量为10~25摩尔,以及共聚物(II-3)中的结构单元(1)的量为30~60摩尔、结构单元(2)的量为30~60摩尔而结构单元(3)的量为10~40摩尔。需要说明的是,共聚物(II-2)中的上述结构单元的量的基准为结构单元(1)和结构单元(2)总计100摩尔,以及共聚物(II-3)中的上述结构单元的量的基准为结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)总计100摩尔。
<本发明的敏化剂(III)(本发明的聚合物(III))>
本发明的敏化剂(III)(本发明的聚合物(III))为选自以下均聚物(III-1)、共聚物(III-2)和共聚物(III-3)的至少一种,优选为以下均聚物(III-1)、共聚物(III-2)或共聚物(III-3):
均聚物(III-1),其由来源于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1)构成;
共聚物(III-2),其由
来源于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1),和
来源于(甲基)丙烯酸丁酯或(甲基)丙烯酸硬脂酯的结构单元(2)
构成,并且相对于结构单元(1)和结构单元(2)总计100摩尔,结构单元(1)的量为50~90摩尔而结构单元(2)的量为10~50摩尔;以及
共聚物(III-3),其由
来源于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1),
来源于(甲基)丙烯酸丁酯或(甲基)丙烯酸硬脂酯的结构单元(2),和
来源于单甲基丙烯酸甘油酯的结构单元(3)
构成,并且相对于结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)总计100摩尔,结构单元(1)的量为30~60摩尔、结构单元(2)的量为30~60摩尔而结构单元(3)的量为10~40摩尔。
在本发明的敏化剂(III)(本发明的聚合物(III))中,优选共聚物(III-2)中的结构单元(1)的量为75~90摩尔而结构单元(2)的量为10~25摩尔。需要说明的是,共聚物(III-2)中的上述结构单元的量的基准为结构单元(1)和结构单元(2)总计100摩尔。
<本发明的敏化剂(IV)(本发明的聚合物(IV))>
本发明的敏化剂(IV)(本发明的聚合物(IV))为选自以下均聚物(IV-1)、共聚物(IV-2)和共聚物(IV-3)的至少一种,优选为以下均聚物(IV-1)、共聚物(IV-2)或共聚物(IV-3):
均聚物(IV-1),其由来源于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1)构成;
共聚物(IV-2),其由
来源于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1),和
来源于甲基丙烯酸丁酯或甲基丙烯酸硬脂酯的结构单元(2)
构成,并且相对于结构单元(1)和结构单元(2)总计100摩尔,结构单元(1)的量为75~90摩尔而结构单元(2)的量为10~25摩尔;以及
共聚物(IV-3),其由
来源于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的结构单元(1),
来源于甲基丙烯酸丁酯或甲基丙烯酸硬脂酯的结构单元(2),和
来源于单甲基丙烯酸甘油酯的结构单元(3)
构成,并且相对于结构单元(1)、结构单元(2)和结构单元(3)总计100摩尔,结构单元(1)的量为30~60摩尔、结构单元(2)的量为30~60摩尔而结构单元(3)的量为10~40摩尔。
[核酸扩增用组合物]
本发明还提供包含本发明的敏化剂的核酸扩增用组合物(以下有时记为“本发明的组合物”)。在本发明的组合物中,本发明的敏化剂可仅使用1种,也可并用2种以上。在此,核酸扩增用组合物意指用于核酸扩增法的组合物。核酸扩增法的说明如上所述。核酸扩增法优选为PCR法。即,本发明的组合物优选用于聚合酶链式反应法。
作为PCR法,优选上述的逆转录聚合酶链式反应法。即,本发明的组合物优选用于逆转录聚合酶链式反应法。
作为PCR法,优选上述的定量聚合酶链式反应法。即,本发明的组合物优选用于定量聚合酶链式反应法。
本发明的组合物可通过将本发明的敏化剂,根据需要与用于核酸扩增的其他成分一起,溶解于水等溶剂中来调制。即,本发明的组合物优选为含有本发明的敏化剂和水(以及根据需要的其他成分)的组合物。本发明的组合物中的本发明的敏化剂的浓度的说明如上所述。
作为用于核酸扩增的其他成分,可使用在以PCR为代表的公知的核酸扩增中使用的的公知成分。作为这样的成分,例如可列举缓冲液、底物、引物、DNA聚合酶、荧光DNA染色试剂、荧光探针、惰性参比(passive reference)、核酸等。其他成分均可仅使用一种,也可并用2种以上。
作为缓冲液,没有特别限定,但例如可列举将三(羟甲基)氨基甲烷、Tricine、Bicine等碱和硫酸、盐酸、乙酸、磷酸等酸混合,将pH调节至6~9、更优选7~8左右的缓冲液。另外,期望缓冲液适当含有镁盐和/或锰盐。另外,缓冲液可进一步包含氯化钾、硫酸铵等盐。另外,缓冲液可进一步包含二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲酰胺、甘油等水溶性有机溶剂。另外,缓冲液可进一步包含聚氧脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚等表面活性剂。另外,缓冲液可进一步包含牛血清白蛋白等蛋白。
作为底物,没有特别限定,但例如可列举脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷三磷酸(dCTP)的混合物(dNTP)。在此,也可将一部分和/或全部的dTTP置换成脱氧尿苷三磷酸(dUTP)。另外,在测序PCR等中,还优选进行适量添加二脱氧腺苷三磷酸(ddATP)、二脱氧胸苷三磷酸(ddTTP)、二脱氧鸟苷三磷酸(ddGTP)、二脱氧胸苷三磷酸(ddCTP)的混合物或它们的荧光标记物。
作为引物,例如可列举长度为10~40个碱基的寡核苷酸。上述寡核苷酸的长度优选为15~30个碱基,更优选为15~25个碱基。上述寡核苷酸可通过已知的方法设计、调制。上述寡核苷酸可具有由荧光素等形成的发出荧光的基团。
引物可仅使用一种,也可将两种引物作为1对使用,还可为了同时扩增多个区域而使用多个引物。本发明的组合物中的引物浓度优选为0.1~25μM,更优选为0.1~15μM,进一步优选为0.5~10μM。
作为DNA聚合酶,可使用公知的DNA聚合酶。从耐热性的观点来看,优选来源于嗜热细菌、嗜热古菌、超嗜热细菌、超嗜热古菌的酶及其突变型酶。DNA聚合酶是根据核酸扩增的目的从DNA依赖性DNA聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶或者兼具两者的功能的酶中适当选择的。另外,可适当选择是否使用具有核酸酶活性的DNA聚合酶或者不具有核酸酶活性的DNA聚合酶中的任一种。
作为荧光DNA染色试剂,没有特别限定,但例如可列举SYBRTM Green I等。
作为荧光探针,没有特别限定,但例如可列举TaqManTM探针。
惰性参比可根据核酸扩增的目的而适当选择。作为惰性参比,例如可列举ROXTM染料等。
作为核酸,除了上述的引物、荧光探针以外,例如也可使用任意的DNA和/或RNA作为外源性对照基因。在此,核酸可以是体外合成的核酸,也可以是通过公知方法由细胞、微生物、病毒等调制的核酸。在此,该细胞、微生物、病毒等可在自然界或环境中从人或者动植物采集,还可被分离/培养。
在本发明的组合物中,可进一步添加矿物油等油、玻璃珠、磁珠等固相载体。
另外,可利用选择多种上述各成分组合而成的试剂盒型产品、进一步将这些成分预先混合而成的母料混合(master mix)(有时也称为始发混合(primer mix)、预混(premix)等)型产品等。
[检查试剂盒]
本发明的组合物可通过与必需的构成构件组合而制成检查试剂盒。本发明提供包含本发明的组合物的检查试剂盒。对上述构成构件没有特别限定,但例如可列举样本采集用器具、样本采集容器、样本预处理用试剂、校正用标准品、检查用器具、消耗品、测定盒、操作说明书等。上述构成构件根据检查方案而适当选择。上述构成构件可与检查试剂盒一同包装。另外,作为上述构成构件,可使用市售品。另外,作为上述构成构件,可使用指定的标准的构件。
本发明的检查试剂盒例如用于基因检查、微生物检查、病毒检查,优选用于病毒检查。即,本发明的检查试剂检查试剂盒的检查对象优选为病毒。
作为使用本发明的检查试剂盒的检查,例如可列举在医疗、兽医学、法医学、药品分析、食品分析、环境调查等领域进行的检查,这些之中,优选在医疗、兽医学领域进行的检查,更优选在医疗领域进行的检查。本发明的检查试剂盒优选用于临床检查,更优选用于体外诊断。
[核酸扩增法]
本发明还提供:(i)核酸扩增法,其包括将本发明的聚合物作为敏化剂使用;以及(ii)核酸扩增法,其包括将本发明的组合物与含有所扩增核酸的样品混合以调制用于核酸扩增的反应液。本发明的核酸扩增法中的本发明的聚合物和本发明的组合物的说明如上所述。另外,只要没有特别记载,则核酸扩增法的说明也如上所述。
本发明的核酸扩增法中使用的样品含有所扩增的核酸。样品优选为含有水和所扩增核酸的样品液。样品可含有1种核酸,也可含有2种以上核酸。样品中的核酸的浓度可根据核酸扩增的目的适当确定,但在可调整浓度的情况下,优选为1~1020拷贝/μL,更优选为1~1010拷贝/μL,进一步优选为1~105拷贝/μL,特别优选为1~500拷贝/μL,最优选为1~100拷贝/μL。
在本发明的核算扩增法中,相对于本发明的组合物的用量1μL,样品的用量优选为痕量~1μL,更优选为0.01~1μL,进一步优选为0.2~0.4μL。
本发明的核酸扩增法优选为逆转录聚合酶链式反应法。另外,本发明的核酸扩增法优选为定量聚合酶链式反应法。
实施例
以下,通过实施例等具体地说明本发明,但本发明并不限于这些实施例。
[聚合物(核酸扩增用敏化剂)的合成]
[合成例1]
称量40.0g作为单体(1)的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(以下有时简称为“MPC”)至聚合用玻璃烧瓶中,加入60.0g纯化水溶解单体(1),向所得溶液中加入0.31g作为聚合引发剂的偶氮二异丁腈(以下记作“AIBN”)。在将反应容器内充分进行氮气置换后,在搅拌下,于70℃下加热6小时,从而进行聚合。将得到的反应液用冰冷却,滴加到乙醚中,从而使聚合物沉淀。将沉淀物滤出,用乙醚洗涤后,进行真空干燥,得到了白色粉末状的均聚物(以下记作“聚合物1”)。聚合物1的重均分子量通过下述条件下的凝胶过滤层析(以下有时简称为“GPC”)测定,以聚乙二醇换算为1,030,000。
[合成例2]
称量6.0g作为单体(1)的MPC和4.0g作为单体(2)的甲基丙烯酸(以下有时简称为“MA”)(单体(1)/单体(2)=30/70(摩尔比))至聚合用玻璃烧瓶中,加入90.0g纯化水溶解单体(1)和单体(2),向所得溶液中加入0.78g AIBN。之后与合成例1同样地操作,得到了无规共聚物(以下记为“聚合物2”)。聚合物2的重均分子量通过下述条件下的GPC测定,以聚乙二醇换算为680,000。
[合成例3]
称量19.4g作为单体(1)的MPC和2.2g作为单体(2)的甲基丙烯酸丁酯(以下有时简称为“BMA”)(单体(1)/单体(2)=80/20(摩尔比))至聚合用玻璃烧瓶中,加入39.3g纯化水和39.3g乙醇溶解单体(1)和单体(2),向所得溶液中加入0.02g AIBN。在将烧瓶内充分进行氮气置换后,在搅拌下,于60℃下加热5小时,从而进行聚合。之后与合成例1同样地操作,得到了无规共聚物(以下记为“聚合物3”)。聚合物3的重均分子量通过下述条件下的GPC测定,以聚乙二醇换算为600,000。
[合成例4]
称量11.7g作为单体(1)的MPC和3.3g作为单体(2)的甲基丙烯酸硬脂酯(以下有时简称为“SMA”)(单体(1)/单体(2)=80/20(摩尔比))至聚合用玻璃烧瓶中,加入85g乙醇溶解单体(1)和单体(2),向所得溶液中加入0.06g AIBN。在将烧瓶内充分进行氮气置换后,在搅拌下,于60℃下加热6小时,从而进行聚合。之后与合成例1同样地操作,得到了无规共聚物(以下记为“聚合物4”)。聚合物4的重均分子量通过下述条件下的GPC测定,以聚乙二醇换算为43,000。
[合成例5]
称量8.4g作为单体(1)的MPC、2.1g作为单体(2)的BMA和4.5g作为单体(3)的单甲基丙烯酸甘油酯(以下有时简称为“GLM”)(单体(1)/单体(2)/单体(3)=40/40/20(摩尔比))至聚合用玻璃烧瓶中,加入42.5g纯化水和42.5g乙醇溶解单体(1)、(2)和(3),向所得溶液中加入0.15g AIBN。之后与合成例3同样地操作,得到了无规共聚物(以下记为“聚合物5”)。聚合物5的重均分子量通过下述条件下的GPC测定,以聚乙二醇换算为22,000。
[GPC测定]
合成例1~5中得到的聚合物1~5的GPC测定在以下的条件下实施。
GPC系统:EcoSEC系统(东曹株式会社制造);
柱:串联连接Shodex OHpak SB-802.5HQ(昭和电工株式会社制造)和SB-806HQ(昭和电工株式会社制造);
展开溶剂:20mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.4);
检测器:示差折光检测器;
分子量标准:EasiVial PEG/PEO(Agilent Technologies制造);
流速:0.5mL/分钟;
柱温:40℃;
样品:将得到的聚合物用展开溶剂稀释以使最终浓度为0.1重量%;
注入量:100μL。
将合成例1~5中使用的单体及其摩尔比以及得到的聚合物的重均分子量归纳在下述表1中。
[表1]
单体(1) | 单体(2) | 单体(3) | 单体的摩尔比 | 重均分子量 | |
聚合物1 | MPC | - | - | 100/0/0 | 1,030,000 |
聚合物2 | MPC | MA | - | 30/70/0 | 680,000 |
聚合物3 | MPC | BMA | - | 80/20/0 | 600,000 |
聚合物4 | MPC | SMA | - | 80/20/0 | 43,000 |
聚合物5 | MPC | BNM | GLM | 40/40/20 | 22,000 |
单体的摩尔比=单体(1)/单体(2)/单体(3);
MPC:2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱;
MA:甲基丙烯酸;
BMA:甲基丙烯酸丁酯;
SMA:甲基丙烯酸硬脂酯;
GLM:单甲基丙烯酸甘油酯。
[实施例1~5和比较例1]
[样品溶液]
将SARS-CoV-2RT-qPCR检测试剂盒(富士胶片和光纯药株式会社制造)所附的阳性对照RNA,N set No.2(N2)按照上述试剂盒所附文件用不含核酸酶的纯化水(以下有时记作“PW(不含核酸酶)”)稀释至10拷贝/μL,调制了样品溶液。使用PW(不含核酸酶)代替上述样品溶液作为阴性对照。
[反应液]
使用上述试剂盒的构成品和50×ROX惰性参比(株式会社Nippon Gene制造),调制表2所示的通用组成的溶液,向其中添加规定量的合成例1~5中得到的聚合物,加入规定量的PW(不含核酸酶),从而调制了核酸扩增用组合物。将15μL所得的核酸扩增用组合物分配到PCR板(带条码的MicroAmpTM快速光学96孔反应板,0.1mL,AppliedBioscience制造),再掺入5μL上述样品溶液,调制了总计20μL的反应液。将所得反应液的组成记载于下述表2。
需要说明的是,在上述操作中,添加了2μL浓度为反应液中聚合物的终浓度的10倍的聚合物水溶液。例如,在“反应液中的聚合物1的终浓度为0.1 w/v%的条件”下,混合2μL聚合物1的1 w/v%的水溶液和13μL共通组成的成分和PW(不含核酸酶)的溶液,调制15μL核酸扩增用组合物,向其中加入5μL样品溶液,调制了20μL反应液。
[表2]
*SARS-CoV-2 RT-qPCR检测试剂盒(富士胶片和光纯药株式会社制造)的构成品;
**株式会社Nippon Gene制造。
[反应]
将分配有上述反应液的PCR板设置于StepOnePlusTM实时PCR系统(AppliedBioscience制造),按照表3所示的温度程序进行RT-qPCR法。需要说明的是,荧光强度的读取按照表3中的步骤#5进行。
[表3]
[结果]
在表4-1所示的各条件下,按照上述步骤进行RT-qPCR法,由终点荧光强度和下式算出终点增强率:
终点增强率(%)=100×(F-F0)/F0
(式中,F表示添加了聚合物的情况下的终点荧光强度,F0表示未添加聚合物的情况下(比较例1)的终点荧光强度)。
在此,终点荧光强度是指PCR法的最终循环(第60循环)中的荧光强度,荧光强度是指ΔRn值。结果显示于表4-1。
[表4-1]
样品液中的核酸浓度:10拷贝/μL
[比较例2~5]
在比较例2~5中,将实施例1~5中使用的本发明的敏化剂(即聚合物1~5)置换成表4-2所示的各添加剂(即牛血清白蛋白(以下记作“BSA”,Sigma-Aldrich制造)、二甲基亚砜(以下记作“DMSO”)、聚乙二醇6000(以下记作“PEG 6000”)或T4基因32蛋白(株式会社Nippon Gene制造)),算出终点增强率(%)。具体而言,在表4-2所示的各条件下,按照上述[实施例1~5和比较例1]的步骤进行RT-qPCR法,由终点荧光强度和下式算出终点增强率:
终点增强率(%)=100×(F-F0)/F0
(式中,F表示添加了添加剂的情况下的终点荧光强度,F0表示未添加添加剂的情况下(比较例1)的终点荧光强度)。
结果显示于表4-2。
[表4-2]
如表4-1所示,使用了本发明的敏化剂(即聚合物1~5)的实施例1~5的终点增强率为372~583%。另一方面,如表4-2所示,使用了除本发明的敏化剂以外的添加剂(即BSA、DMSO、PEG 6000或T4基因32蛋白)的比较例2~5的终点增强率为76~157%。由这些结果得知如果使用本发明的敏化剂,则可提高作为测定对象的核酸的检测灵敏度。
[实施例6~10和比较例6]
[样品]
将SARS-CoV-2RT-qPCR检测试剂盒(富士胶片和光纯药株式会社制造)所附的阳性对照RNA,N set No.2(N2)按照上述试剂盒所附文件用PW(不含核酸酶)稀释,调制了核酸浓度为160、40、10、2.5或0.0625拷贝/μL的样品液。另外,使用PW(不含核酸酶)代替上述样品液作为阴性对照。
[反应液]
使用上述试剂盒的构成品和50×ROX惰性参比(株式会社Nippon Gene制造)、合成例1~5中得到的聚合物,与实施例1~5和比较例1同样地操作,调制了15μL核酸扩增用组合物。在该核酸扩增用组合物中掺入5μL上述样品溶液,调制了总计20μL的反应液。需要说明的是,反应液中的聚合物的终浓度如下述表5所记载。
[反应]
与实施例1~5和比较例1同样地操作,进行RT-qPCR法。
[结果]
在表5所示的各条件下,按照上述步骤进行了RT-qPCR法。在各条件下以N=2进行反应,将在两次反应中均发现扩增的判定为“具有强检测”(表5中记作“PP”),将在一次反应中发现扩增的判定为“具有弱检测”(表5中记作“P”),将在两次反应中均未发现扩增的判定为“无检测”(表5中记作“N”)。另外,将判定为“具有强检测”和“具有弱检测”的样品溶液中的最低核酸浓度判定为各自的检测下限。需要说明的是,在不存在“具有弱检测”的判定的情况下,判定为“具有弱检测的检测下限”=“具有强检测的检测下限”。结果显示于表5。
如表5所示,在使用了本发明的敏化剂(即聚合物1~5)的实施例6~10中,与未使用这些敏化剂的比较例6相比,“具有强检测”和/或“具有弱检测”的检测下限降低。由这些结果得知,如果使用本发明的敏化剂,则可提高作为测定对象的核酸的检测灵敏度。
产业可用性
如果使用本发明的敏化剂,则可在核酸扩增法(特别是PCR法)中提高作为测定对象的核酸的检测灵敏度。本发明的敏化剂可适用于用于基因检查、微生物检查、病毒检查等的核酸扩增法。
本申请以在日本申请的特愿2021-12400号为基础,其内容全部均包含在本申请说明书中。
Claims (11)
1.核酸扩增用敏化剂,其是包含来源于用以下式(1)表示的单体的结构单元的聚合物:
[化学式1]
式中,
X1表示(甲基)丙烯酰氧基或(甲基)丙烯酰氨基,
L1表示可具有1个羟基的碳原子数为2~4的亚烷基或者碳原子数为2~4的亚烷基氧基亚烷基,以及
R1~R3各自独立地表示碳原子数为1~3的烷基。
2.根据权利要求1所述的核酸扩增用敏化剂,其是由来源于用上述式(1)表示的单体的1种结构单元构成的均聚物。
3.根据权利要求1所述的核酸扩增用敏化剂,其是进一步包含来源于用以下式(2)表示的单体的结构单元的共聚物:
[化学式2]
式中,
R4表示氢原子或甲基,以及
R5表示氢原子或碳原子数为1~20的烷基。
4.根据权利要求3所述的核酸扩增用敏化剂,其中R5是碳原子数为12~18的烷基。
5.根据权利要求1、3或4所述的核酸扩增用敏化剂,其是进一步包含来源于用以下式(3)表示的单体的结构单元的共聚物:
[化学式3]
式中,
R6表示氢原子或甲基,以及
R7表示具有2个以上羟基的碳原子数为3~6的烷基。
6.核酸扩增用组合物,其包含权利要求1~5中任一项所述的核酸扩增用敏化剂。
7.根据权利要求6所述的核酸扩增用组合物,其用于逆转录聚合酶链式反应法。
8.根据权利要求6或7所述的核酸扩增用组合物,其用于定量聚合酶链式反应法。
9.检查试剂盒,其包含权利要求6~8中任一项所述的核酸扩增用组合物。
10.根据权利要求9所述的检查试剂盒,其用于临床检查。
11.根据权利要求9或10所述的检查试剂盒,其中检查对象为病毒。
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