CN117210566A - 一种人onecut2、ccna1基因甲基化快速检测组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合及检测方法，本方法包括收集尿液标本，提取ONECUT2、CCNA1基因片段，将提取的基因片段进行亚硫酸盐转化，利用设计的特定引物探针组合物癌基因片段进行基因扩增，通过检测尿液中的甲基化程度判定是否罹患膀胱癌，提高了检测的方便性和准确性，便于临床推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于体外核酸检测技术领域，具体为通过对人尿液DNA中ONECUT2、CCNA1基因甲基化检测来对膀胱癌进行辅助诊断的一种方法及试剂盒，特别是指一种人ONECUT2、CCNA1基因甲基化检测的方法、相关引物探针组合、反应程序及检测试剂盒、以及相关应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，世界范围内膀胱癌发病率位居恶性肿瘤的第9位，死亡率居恶性肿瘤的第13位；在我国，膀胱癌发病率为5.80/10万；死亡率为2.37/10万，位居恶性肿瘤第13位[1]。
目前，膀胱癌的诊断和监测通常需要结合膀胱镜、上尿路影像检查和尿细胞学检查。膀胱镜用于确诊，影像学用于诊断和评估转移情况。膀胱镜检查和影像学检查在检测尿道小病变时灵敏度有限，频繁的膀胱镜检测使得患者依从性降低，在这些病例中，需要依赖尿细胞学，这是应用最广泛的无创检测和监测膀胱癌的方法。尽管其特异性高(约86％)，但细胞病理学的应用受到低敏感性(48％)和人为判断的误差，限制了其在低级别肿瘤中的应用。
目前有多种相对成熟的尿液膀胱肿瘤标志物检查技术，包括核基质蛋白22(NMP22)、膀胱肿瘤抗原相关(BTAstat及BTAtrak)、免疫-细胞检查、纤维蛋白原降解产物和尿荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)等[2]。这些检测的敏感性高但特异性较低，临床上尚未广泛应用。然而，尿液标记物可作为辅助(或伴随)测试，以提高膀胱镜检查时的灵活性或作为替代测试以减少膀胱镜检查的次数。高效、快速、操作简便的实时荧光定量PCR成为分子诊断领域的主要方法。
DNA甲基化为DNA化学修饰的一种形式，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价结合一个甲基基团；能够在不改变DNA序列的前提下，影响表达、基因与蛋白质互作等[3][4]；研究表明，某些肿瘤相关基因的异常甲基化在肿瘤发生早期即可出现，可作为诊断和监测的特异性标志物[5][6]。
论文
[1]邢念增等.膀胱癌诊疗指南2022版.国卫办医函〔2022〕104号.
[2]Ferro，M.，et al.，Liquid Biopsy Biomarkers in Urine：A Route towardsMolecular Diagnosis and Personalized Medicine of Bladder Cancer.Journal ofPersonalized Medicine，2021.11(3)：p.237.
[3]Baylin，S.B.and P.A.J.N.R.C.Jones，A decade of exploring the cancerepigenome—biological and translational implications.2011.11(10)：p.726-734.
[4]Larsen，L.K.，et al.，DNA-Methylation-Based Detection of UrologicalCancer in Urine：Overview of Biomarkers and Considerations on BiomarkerDesign，Source of DNA，and Detection Technologies.International Journal ofMolecular Sciences，2019.20(11)：p.2657.
[5]Ruan,W.,Chen,X.,Huang,M.et al.A urine-based DNA methylation assayto facilitate early detection and risk stratification of bladder cancer.ClinEpigenet 13,91(2021).
[6]Dahmcke,Christina M.,et al."A prospective blinded evaluation ofurine-DNA testing for detection of urothelial bladder carcinoma in patientswith gross hematuria."European Urology 70.6(2016):916-919.
发明内容
为了提高膀胱癌检测准确度和灵敏度，本发明对尿液中DNA甲基化进行检测，用于在诊断膀胱癌时作为膀胱镜的有效补充(辅助诊断)；在术后监测期，作为尿细胞学的替代方案，及时发现复发病例，减少膀胱镜的使用次数(复发监测)。
本发明的主要目的就是针对目前临床一线缺乏准确性高的无创的膀胱癌辅助诊断技术，开发基于ONECUT2、CCNA1基因甲基化检测的产品，用于膀胱癌辅助诊断与监测。本发明提供一种膀胱癌甲基化检测方法、相关引物探针组合、反应程序及检测试剂盒、以及相关应用。开发出了可以特异、准确、快速并适用于大规模推广应用的膀胱癌甲基化基因检测试剂盒。
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了膀胱癌甲基化基因ONECUT2、CCNA1快速检测的引物探针组合物，通过扩增引物对检测探针的巧妙设计，避免了多个引物对及对应的检测探针之间的相互干扰；并经验证，使用上述引物探针组合检测ONECUT2、CCNA1基因甲基化，特异性好，灵敏度高。
优选的，ONECUT2、CCNA1 2个位点的6条PCR扩增引物和探针如下表1所示。
表1、靶向ONECUT2、CCNA1的引物及探针组合物
进一步地，所述ONECUT2、CCNA1基因的引物探针5’端标记有所述荧光基团，所述探针的3’端标记有所述荧光淬灭集团；
进一步地，所述ONECUT2、CCNA1基因的引物探针荧光基团选自FAM、VIC、CY5、ROX、HEX、JOE、NED、Texas Red或CY3中的至少1种，且各不相同；
进一步地，所述淬灭集团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或TAMRA中的至少1种。
本发明的第二方面，提供了一种用于人ONECUT2、CCNA1甲基化基因检测的试剂盒，其包括所述的用于分型检测ONECUT2、CCNA1基因甲基化的PCR扩增体系。
优选的，所述PCR扩增体系中包括DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、PCR缓冲体系、PCR增强剂、PCR稳定剂中的至少一种，包含Tris、KCl(10mM-500mM)、(NH4)2SO4(10mM-500mM)、甘油(1％-50％)、BSA(0.001mg/mL-1mg/mL)、Tween 20(0.1％-10％)、二硫苏糖醇(1mM/mL-100mM/mL)、甜菜碱(0.1M-3M)以及DMSO(0.1％-10％)。
进一步地，所述PCR缓冲体系的pH值在7.5-9.5(25℃)。
本发明的第三方面，提供膀胱癌甲基化基因ONECUT2、CCNA1快速检测的方法，包括步骤：
步骤1：尿液脱落细胞DNA的提取以及转化；
步骤2：以步骤1所获得的核酸溶液作为模板，建立一个快速、准确的，选择性特异性扩增目标核酸序列的荧光定量PCR体系，扩增目标基因ONECUT2、CCNA1和参照基因ACTB；
步骤3：通过步骤2的荧光定量PCR检测结果，判断待测样本膀胱癌甲基化基因的甲基化状态。
本发明的第四方面，提供了一种试剂盒检测范围内甲基化的阳性对照和阴性对照方法，步骤如下：
试剂盒中包含阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为人ONECUT2、CCNA1基因甲基化DNA，所述阴性对照为正常人基因组转化后DNA
按照上述第三方面公开的方法，将上述试剂盒对人离体样本进行检测。
本发明的有益效果：
本发明采用以尿液DNA为标本，通过实时荧光定量PCR进行分子诊断快速检测膀胱癌该方法具备如下优点：
基于随机尿液样本，样本易获取；
荧光定量PCR检测，操作简单，结果易判读，全程闭管无污染；
针对甲基化位点设计的引物结合TaqMan探针，保证了检测的灵敏度和特异性。
附图说明
图1为CCNA1甲基化位点引物探针设计图。
图2为ONECUT2甲基化位点引物探针设计图。
图3为ONECUT2、CCNA1双阳样本峰图。
图4为ONECUT2单阳样本峰图，经过一代测序验证，与本试剂盒结果一致。
图5为CCNA1单阳样本峰图，经过一代测序验证，与本试剂盒结果一致。
图6为阴性样本峰图，经过一代测序验证，与本试剂盒结果一致。
图7为ACTB内标标准曲线测试，采用不同浓度梯度的模板进行10倍的稀释，稀释6个梯度，3个重复，显示扩增效率在97％，R2＝0.99，显示除较好的扩增性能。
图8为ONECUT2标准曲线测试，采用不同浓度梯度的模板进行10倍的稀释，稀释6个梯度，3个重复，显示扩增效率在98％，R2＝0.99，显示除较好的扩增性能。。
图9为CCNA1标准曲线测试，采用不同浓度梯度的模板进行10倍的稀释，稀释6个梯度，3个重复，显示扩增效率在100％，R2＝0.99，显示除较好的扩增性能。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
需要说明的是，这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下本方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。
实施例1、设计靶向ONECUT2、CCNA1探针
Taqman探针法的工作原理是利用了Taq酶的5’→3’外切酶活性。由于探针的5’端标以荧光报告基团(如FAM)，靠近3’端标以荧光淬灭基团MGB，两者之间构成能量传递结构。因此，当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基团吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交，当PCR进入延伸(复制)期，Taq酶从引物3’端开始，随新链沿DNA模板延伸，当延伸到探针结合的位置时，在其5’→3’端外切酶活性作用下，将探针切断。此时，荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。随着荧光信号的积累，便可通过荧光PCR仪检测出来。相对的，当探针序列与目的基因序列不匹配时，探针无法与目标序列结合，PCR延伸过程中就无法切断此特异性探针，自然也就不会出现相应的荧光信号。
样本DNA在亚硫酸盐处理后，未甲基化的C转化为U，在随后的PCR中U转变为T，也就是所谓的C-T转换，而甲基化的C则保持不变，通过对目标区域的CpG位点设计针对甲基化的特异性引物和Taqman探针，即可检测目标区域的甲基化状态。
通过NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)查取ONECUT2、CCNA1基因序列，采用Primer Express3.0软件设计特异性引物和荧光探针，
其中，ONECUT2、CCNA1靶标序列(转化前)：
ONECUT2 SEQ ID No.1：
CACtTTCtCAAACAAATGTGTATATGGAGGGAGATCGATGCtGATAATGTTTAGAAGATTAAAAGAGCATTAATGCtGGCAACAATAACGTAAACGTGTGGACCCAGATTTCATTGATCtGGAACtTGATCCGGCGCGTTTCCAGTAAGCCCGACGGCGCGCtCtTCCCAGCAGAGCGCtCACCAGCGCCACGGCCCCGCGGTTTTCCAGCGGTGCCGCtTCGCCAGCtCtGCGCGGGTTCtCCCGTCtGACCGCAGCtCCtCCCCCGCGAGGCCCCAGCCCGCCtTACtTCCCCGAGGTTTTCtCCtCCtCtCGCGGGGCtCtCtGCCCtCtGCACCCCCtCCCCCGACCtCtGCACCACCCGCCCCtGTGCGCACACACCGCtACtTGCGCtTCCGGCGATCCGCCtGGGCGGCtGGGTCCGCGAAGCCAATGC。
CCNA1 SEQ ID No.2：
CCtCCCAGGCCGGGGGCGCGGACCAGAGGGGACGTGTGCAGACGGCCGCGGTCAGCCCCACCtCGCCCGGGCGGAGACGCACAGCtGGAGCtGGAGGGCCGTCGCCCGTTGGGCCCtCAGGGGCCtGAACGCCCAGGGGTCGCGGCGAGTCCACCCGGAGCGAGTCAGGTGAGCAGGTCGCCATGGCGATGCGGCCCCGGAGAGCGCACGCCtGCCGCGGTCGGCATGGAAACGCtCCCGCtAGGTCCGGGGGCGCCGCtGATTGGCCGATTCAACAGACGCGGGTGGGCAGCtCAGCCGCATCGCtAAGCCCGG。
经过筛选获得引物以及荧光标记组合物(图1和图2)，具体序列信息如表2所示：
表2、靶向ONECUT2、CCNA1序列的引物组与荧光标记
实施例2检测试剂盒的制备
利用上述实施例1获得的引物组以及荧光标记，结合内参基因CtAB以及常规的PCR扩增试剂盒成分，制备获得检测试剂盒。
其中，CtAB基因的引物和探针如下所示：
试剂盒成分如下表3所示：
表3、ONECUT2、CCNA1甲基化检测试剂盒：
实施例3、试剂盒检测效果验证
利用上述实施例2中的试剂盒检测临床尿液样本，样本收集于2022年8月到2023年2月，共计40例，膀胱癌20例(男11女9例)，正常人20例(男12女8)。每例样本50-80ml，膀胱癌患者的临床分期、病理分型按照国际TMN标准进行。
具体操作步骤如下所示：
1.样本预处理：
试剂盒检测前需要进行样本DNA提取与转化，使用尿液DNA提取和亚硫酸盐转化试剂盒(推荐使用试剂盒名称：Quick-DNATM Urine Kit；备案号：Cat.No：D3061；公司名称：ZYMO RESEARCH；EZ DNA Methylation-Lightning Kit；备案号：REF：D5031-E；公司名称：ZYMO RESEARCH)进行样本预处理。若使用其他型号的试剂盒，需先进行适用性测试。
检测所需的尿液样本体积应大于为80ml，建议根据检测需要的样本体积，按照尿液DNA提取和亚硫酸盐转化试剂盒说明书要求进行预处理。处理后的尿DNA可直接用于检测。
2.样本检测：
1)取出在-15～-25℃条件下避光保存的试剂盒，将试剂盒组份平衡至室温；
2)取出相应数量的96孔板或PCR反应管；
3)根据当次实验所进行的反应数计算并移取相应量的试剂，反应数指标本次检验量加上1个空白对照(以纯化水代替DNA)、1个阳性质控品、1个阴性质控品，剩余试剂放回-15～-25℃条件下避光保存；
4)按以下方案配制反应；反应体系(20μL体系)
5)模板溶液指步骤1中预处理后的样本混合溶液、阳性质控品、阴性质控品、空白对照品；
6)将96孔板封膜或盖好PCR反应管盖，2000rpm离心10秒，将其放入荧光定量PCR仪内；
7)按表4所述条件进行PCR扩增：
表4、PCR扩增参数设置
3.结果分析(参照各仪器使用说明书进行设置，以下分析以ABI系列仪器为例)：
1)分析运行结果，将基线的起始点设为第“3”个循环，终点设为第“17”个循环，阈值设置如下
注：可视具体状况进行微调
4.质量控制
1)外源对照该试剂盒包含阳性对照品和阴性对照品。应在每次反应中添加这些对照品以检测反应是否成功，同时确保反应的有效性。阳性对照品和阴性对照品的反应Ct值应该在有效范围内，如下表5，如果反应Ct值在其有效范围之外，此次测试结果无效。
表5、Ct值判定范围
| 对照品结果 | ONECUT2和CCNA1结果 | ACTB结果 |
| 阳性对照品有效 | Ct≤34 | Ct≤34 |
| 阴性对照品有效 | Ct>40或undetermined | Ct≤34 |
2)内源对照内源对照能够检测亚硫酸盐转化的ACTB DNA，同时能够检测样品是否满足实验要求(包括样本制备是否正确，样本DNA含量是否满足要求)。ONECUT2、CCNA1反应的结果与ACTB PCR结果的Ct值相关。如果ACTB PCR结果的Ct值超出有效范围，则反应无效。因为过高的ACTB Ct值表示BisDNA浓度过低或者PCR反应的抑制。
3)空白对照品：检测结果中检测通道Ct值无信号。若信号升起，且Ct值≤40，则此次实验结果无效，建议重新实验。
5.结果判读
阴性对照、阳性对照和内控合格之后，则可按照下述对结果进行判定：
表6、结果判定标准
样本检测结果判定：
表7、阳性判定标准
注意：PCR结果的阴阳性以Ct值为判定标准，而不以S型曲线判定。
结果
分别针对CtAB、ONECUT2和CCNA1三者的引物特异性进行检测，结果如图7-9所示，分别，稀释6个梯度、3个重复的条件下，显示扩增效率均>97％，R2＝0.99，具有良好的扩增性能。
分别就ONECUT2、CCNA1但阳性以及双阳性检测，结果如图3-6所示，本试剂盒结果与一代测序验证结果一致。
40例样本检测结果如表8所示
表8 40例样本检测Ct值
综合2个标志物的检测结果，按照如下公式计算得到灵敏度和特异性：灵敏度＝检测结果为阳性的膀胱癌样本数/总的膀胱癌样本数；
特异性＝检测结果为阴性的非膀胱癌样本数/总的非膀胱癌样本数；
根据上述公式，该2基因的组合灵敏度达到了85％，特异性达到了95％。
Claims (10)
1.一种用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：
ONECUT2-F：AGAGCGTTTATTAGCGTTAC；
ONECUT2-R：GAACtAAAACCtCGCG；
ONECUT2-P：TGTCGTTTCGTTAGTTTTGCG；
CCNA1-F：CGGCGAGTTTATTCG；
CCNA1-R：ACCGCGACAAACG；
CCNA1-P：TATGGCGATGCGGTTTCGG。
2.根据权利要求1所述用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合，其特征在于，还包括用于检测内参基因的引物探针；所述用于检测内参基因的引物探针包括：
ACTB-F：TGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT
ACTB-R：CAATAAAACCtACtCCtCCCtTAA
ACTB-P：ACCACCCAACACACAATAACAAACACA。
3.一种用于检测膀胱癌相关基因的反应体系，其特征在于，包括ONECUT2和CCNA1基因反应体系；所述ONECUT2和CCNA1基因反应体系包括用于检测ONECUT2和CCNA1基因的引物探针组合、PCR反应液和DNA模板。
4.根据权利要求3所述用于检测膀胱癌相关基因的反应体系，其特征在于，所述反应体系中还包括用于检测权利要求2所述内参基因的引物探针。
5.权利要求1-2任一项所述组合或权利要求3-4任一项所述反应体系在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用。
6.一种含有权利要求1-2任一项所述组合或权利要求3-4任一项所述反应体系的检测试剂盒。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阳性对照和阴性对照，其中所述阳性对照为ONECUT2、CCNA1甲基化基因序列质粒，所述阴性对照为正常人基因组转化后DNA。
8.一种ONECUT2和CCNA1甲基化检测方法，其特征在于，包括：
收集尿液标本，洗涤获取尿脱落细胞，提取ONECUT2和CCNA1甲基化癌基因片段；
将提取的ONECUT2和CCNA1癌基因片段进行亚硫酸盐转化，设计如权利要求3或4所述反应体系扩增；
对基因扩增后的Ct值与临界值进行比较分析，判断检测结果。
9.一种膀胱癌评估系统，其特征在于，包括：
基因片段提取模块，用于收集尿液标本，提取ONECUT2和CCNA1癌基因片段；
基因扩增模块，用于将提取的ONECUT2和CCNA1癌基因片段进行亚硫酸盐转化，设计如权利要求3或4所述反应体系，利用所述反应体系对亚硫酸盐转化后的ONECUT2和CCNA1癌基因片段进行基因扩增；
分析模块，用于对基因扩增后的Ct值与临界值进行比较分析，当Ct值小于或等于临界值时为阳性，表明收集的尿脱落细胞中含有甲基化的ONECUT2、CCNA1基因中的至少一种。
10.一种内嵌有权利要求9所述评估系统的检测装置。
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