CN117210401B - 一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂、培养基及其制备方法 - Google Patents
一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂、培养基及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂、培养基及其制备方法。一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括培养基本体，该培养基本体适于间充质干细胞生长。此外，所述培养基还包括额外添加于所述培养基本体中的血清和盐类添加剂，能够高效促进所述间充质干细胞贴壁生长。所述血清的用量小于等于培养基总体积的5%；所述盐类添加剂在所述培养基中的浓度不超过21000mg/L。本申请将血清和一定浓度的钠盐和/或钾盐添加到基础培养基中，促进MSC贴壁生长，提高细胞贴壁率，缩短细胞的收获时间，减少了原代细胞的损失，提高了细胞利用率，并且对于MSC以及多能干细胞衍生的MSC具有很高的适用性。
Description
技术领域
本申请涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂、培养基及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）是一类具有多向分化潜能及极强自我更新能力的成体干细胞，可在退行性疾病、创伤修复、自身免疫性疾病等多领域发挥重要作用。根据来源可依次分类为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。MSC具有贴壁性，呈纤维状，来源珍贵。细胞贴壁的过程，细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面。然后，细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。因此，培养细胞贴壁时常依赖于供者状态，即供者不同脐带自身特性不同，由此贴壁情况质量不一，在多次传代过程中易造成不同程度的细胞损失。
为提高细胞的利用率，现有的促细胞贴壁技术多为通过改善培养容器表面吸附能力实现，改善方法包括物理方法和化学方法，物理处理主要通过射频真空等离子体、微波等离子体实现，化学处理主要通过应用吸附、接枝技术在固体基底表面施加吸附层实现，皆可在一定程度上允许细胞粘附到培养容器表面。
但是，经物理处理的培养容器表面亲水持久性较差，大概在半年左右，而化学处理的培养容器表面可能存在溶剂残留，细胞毒性较大。更为重要的是，对于贴壁难度较大的细胞，培养容器需额外添加胞外基质蛋白、胶原蛋白等成分来制备吸附层，该种吸附层制备耗时长，无法保证完全无菌，且储存寿命短。同样，应用现有的培养容器培养MSC或多能干细胞衍生的MSC时，弱粘附对培养方面有明显的限制。
现有技术中也会使用到粘连蛋白、转铁蛋白等物质来促进细胞贴壁，但其使用的条件有诸多限制。更为重要的是，某些种类的干细胞来源珍贵，如人源脐带间充质干细胞，提高细胞贴壁率可有效缩短细胞的收获时间，减少相应的试剂成本，减少原代细胞的损失，以及提高利用率。因此，需要一种能够促进间充质干细胞贴壁生长的培养基。
发明内容
针对上述现有技术的不足之处，本申请通过试验验证，得到了一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基及其制备方法，并可以广泛应用于组织块、细胞等培养过程涉及间充质干细胞生长的步骤中。
本申请是通过以下技术方案实现的：
本申请的其中一个发明点为提供一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括培养基本体，该培养基本体适于间充质干细胞生成。此外，所述培养基还包括额外添加于所述培养基本体中的血清和盐类添加剂，能够高效促进所述间充质干细胞贴壁生长。
进一步地，所述血清的用量小于等于培养基总体积的5%；所述盐类添加剂在所述培养基中的浓度不超过21000mg/L。
进一步地，所述盐类添加剂包括无机钠盐和/或无机钾盐，若同时含有钠盐和钾盐，则所述钠盐的浓度大于钾盐的浓度。
进一步地，若同时含有钠盐和钾盐，则所述钠盐浓度≥6150mg/L，所述钾盐浓度≥200mg/L；若含有钠盐，不含有钾盐，则所述钠盐浓度为6150~14000mg/L；若含有钾盐，不含有钠盐，则所述钾盐浓度为200~700mg/L。
进一步地，所述钠盐包括氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠中的至少一种，所述钾盐包括磷酸二氢钾和/或硝酸钾。
进一步地，所述培养基本体为基础培养基，其包括无机盐、氨基酸、维生素和能量底物；所述基础培养基优选为DME/F-12、MEM或DMEM。
进一步地，所述培养基本体中若无机盐含有钠盐和/或钾盐，则钠盐和/或钾盐总浓度不超过7500mg/L；
所述培养基本体的无机盐包括氯化钙、硫酸铜、硝酸铁、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸锌中的至少一种；
所述能量底物为D-葡萄糖和/或丙酮酸钠。
本申请的另一个发明点为提供一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂，所述制剂包括以上任意一段所述的血清和盐类添加剂。
本申请的另一个发明点为提供一种上述促进间充质干细胞贴壁生长的培养基的制备方法，在无菌条件下，称取配制所述盐类添加剂的钠盐和/或钾盐，溶于水中混匀，滤膜过滤后保存，保存温度为2~8℃；使用时与所述基础培养基和血清混匀，得到所述促进间充质干细胞贴壁生长的培养基。
本申请的最后一个发明点为以上所述的培养基或制剂在促进间充质干细胞贴壁生长的应用。
本申请的有益效果如下：
1、本申请将血清和一定浓度的钠盐和/或钾盐添加到基础培养基中，促进MSC贴壁生长，提高细胞贴壁率，缩短细胞的收获时间，减少了原代细胞的损失，提高了细胞利用率，并且对于MSC以及多能干细胞衍生的MSC具有很高的适用性。
2、本申请的制剂和培养基组分简单，产生的效果明显，不易造成污染，无副作用。
3、本申请培养基的制备方法简单易操作，促进MSC贴壁生长同时实验成本低。相较于基础培养基中只添加血清的方法，根据本申请的血清使用量大幅减少，降低了实验及生产成本。
附图说明
图1是实施例3细胞形态。
图2是对比例2细胞形态。
图3是实施例4细胞形态。
图4是实施例5细胞形态。
图5是对比例4细胞形态。
图6是对比例5细胞形态。
图7是实施例6细胞形态。
图8是对比例6细胞形态。
图9是实施例7细胞形态。
图10是实施例8细胞形态。
图11是实施例3-MSC组细胞形态。
图12是实施例3-Vero组细胞形态。
图13是实施例3-WI-38组细胞形态。
图14是空白对照组-MSC组细胞形态。
图15是空白对照组-Vero组细胞形态。
图16是空白对照组-WI-38组细胞形态。
图17是对比例7细胞形态。
图18是对比例8细胞形态。
图19是对比例9细胞形态。
图20是对比例1细胞形态。
图21是对比例3细胞形态。
具体实施方式
在以下实施例中对本申请进行充分详细地描述，以允许本领域技术人员实践本申请，并且可作出逻辑结构、机械、电和化学变化，而不背离本申请的实质或范围。以下为本申请较佳的实施例，不能被认为用于限定本申请的实施范围。
本申请使用的间充质干细胞为人源间充质干细胞，脐带源自医院，细胞由申请人提取并进行传代培养。
实施例1
一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括：
（a）培养基本体，此处可为任何培养基，只要适合间充质干细胞生长的便可，优选基础培养基。
（b）血清，如胎牛血清（FBS），其可购自依科赛生物科技（太仓）有限公司，其用量小于等于培养基总体积的5%。需要说明的是，血清有促进细胞贴壁生长的作用，添加血清是细胞培养中传统的技术手段，如果以血清替代物代替血清使用，其它条件不变，其应该理解为本申请技术方案的常规替换方案，属于本申请的保护范围。
（c）盐类添加剂，其加入(a)中的培养基本体中，该盐类添加剂在所述培养基中的浓度不超过21000mg/L。血清有促进细胞贴壁生长的作用，本申请中盐类添加剂和血清配合能够进一步促进间充质干细胞的贴壁，并减少原本的血清用量。
上述的盐类添加剂包括无机钠盐和/或无机钾盐，有机盐无法达到促进贴壁的效果，若同时含有钠盐和钾盐，则所述钠盐的浓度通常大于钾盐的浓度，其贴壁效果更佳。例如所述钠盐浓度≥6150mg/L，所述钾盐浓度≥200mg/L。若含有钠盐，不含有钾盐，则所述钠盐浓度为6150~14000mg/L；若含有钾盐，不含有钠盐，则所述钾盐浓度为200~700mg/L。
以上盐类添加剂的浓度为本申请选取的合理范围，超过或低于本申请限定的浓度范围则对MSC无法起到促进贴壁生长的作用。
上述的钠盐包括氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠中的至少一种，所述钾盐包括磷酸二氢钾和/或硝酸钾。以上盐为市售商品，购买容易，价格实惠。
作为进一步优选的实施方式，上述的基础培养基组分通常可包括无机盐、氨基酸、维生素和能量底物。所述培养基本体中若无机盐含有钠盐和/或钾盐，则其浓度不超过7500mg/L。
基础培养基中通常含有一定的无机盐，达到维持正常渗透压和酸碱平衡、维持细胞的形态和功能等作用，钠盐的加量通常在7200mg/L左右，钾盐的加量通常在300mg/L，该加量属于培养基的正常加量，不会对贴壁生长有任何促进作用。只有在此基础上，再额外加入以上所述的特定量的盐类添加剂，才能够实现大大提高间充质干细胞贴壁的作用。此处基础培养基中的无机盐可包括无水氯化钙、无水硫酸铜、九水合硝酸铁、七水合硝酸铁、氯化钾、无水氯化镁、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸氢二钠、一水合磷酸二氢钠和/或七水硫酸锌中的任意一种或几种，当然，也可以为其他的盐类，只要能够满足其功能便可。
所述氨基酸：L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-一水合天冬氨酸、L-天冬氨酸、L-一水合半胱氨酸盐酸盐、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-二水合酪氨酸二钠盐、L-缬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸和/或L-丝氨酸。
所述维生素：D-生物素、泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、硫胺素盐酸盐和/或维生素B12。
所述能量底物：D-葡萄糖和/或丙酮酸钠。
所述基础培养基还可包括缓冲剂、次黄嘌呤二钠盐、亚油酸和硫辛酸等中的至少一种。
作为进一步优选的实施方式，所述基础培养基中若含有以下组分，则其含量通常为：每种氨基酸均不低于4.45mg/L、葡萄糖1000~4500mg/L、所述次黄嘌呤二钠盐不低于2.7mg/L、所述亚油酸不低于0.04mg/L，所述硫辛酸不低于0.105mg/L。
上述的基础培养基可为DME/F-12、MEM或DMEM等。如：DME/F-12（购自格来赛生命科技(上海)有限公司），其各组分及浓度如下：无机盐类成分及组成包括无水氯化钙116.61mg/L、无水硫酸铜0.0013mg/L、九水合硝酸铁0.05mg/L、七水合硝酸铁0.417mg/L、氯化钾311.8mg/L、无水氯化镁28.61mg/L、无水硫酸镁48.84mg/L、氯化钠6999.5mg/L、无水磷酸氢二钠71.02mg/L、一水合磷酸二氢钠62.5mg/L、七水硫酸锌0.43mg/L；氨基酸类成分包括L-丙氨酸4.45mg/L、L-精氨酸盐酸盐147.5mg/L、L-一水合天冬氨酸7.501mg/L、L-天冬氨酸6.65mg/L、L-一水合半胱氨酸盐酸盐17.56mg/L、L-苏氨酸53.45mg/L、L-色氨酸9.02mg/L、L-二水合酪氨酸二钠盐55.79mg/L、L-缬氨酸52.85mg/L；维生素类成分包括D-生物素0.0036mg/L、泛酸钙2.24mg/L、氯化胆碱8.98mg/L、叶酸2.65mg/L、肌醇12.6mg/L、烟酰胺2.02mg/L、盐酸吡哆醇2.03mg/L、核黄素0.22mg/L、硫胺素盐酸盐2.17mg/L、维生素B120.68mg/L；D-葡萄糖3151mg/L、HEPES3575mg/L、次黄嘌呤二钠盐2.7mg/L、亚油酸0.04mg/L、硫辛酸0.105mg/L和碳酸氢钠1200mg/L。
该促进间充质干细胞贴壁生长的培养基的制备方法比较简单，通常在无菌条件下，称取所述钠盐和/或所述钾盐，溶于无菌注射用水中混匀，滤膜过滤后保存，保存温度为2~8℃；使用时与所述基础培养基混匀，得到所述促进间充质干细胞贴壁生长的培养基。
本实施例中的培养基本体或基础培养基还可根据实际情况包含其他组分。
实施例2
一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂，所述制剂为实施例1中所述的盐类添加剂或盐类添加剂与血清的配合。由于实施例1中已经介绍，这里不再赘述。
实施例3
一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括：（a）DME/F-12培养基，（b）5%的FBS和（c）盐类添加剂，其包括钠盐和钾盐，钠盐为氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠，钾盐为磷酸二氢钾和硝酸钾，所述钠盐浓度为10100mg/L，所述钾盐浓度为250mg/L。
在无菌条件下，分别称取氯化钠9g、磷酸氢二钠1g、硫酸钠0.1g、磷酸二氢钾0.2g和硝酸钾0.05g，于1L无菌注射用水中混匀，经0.22μm滤膜过滤后得到盐溶液。量取盐溶液和1×浓度的DME/F-12培养基各200ml，等体积混匀，混匀后得到培养基，终浓度为0.5×，并添加5%的FBS。
实施例4
一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括：（a）DME/F-12培养基，（b）5%的FBS和（c）盐类添加剂，其包括钠盐，钠盐为氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠，所述钠盐浓度为10350mg/L。
在无菌条件下，分别称取氯化钠9.25g、磷酸氢二钠1g和硫酸钠0.1g，于1L无菌注射用水中混匀，经0.22μm滤膜过滤后得到盐溶液。培养基的配制过程同实施例3。
实施例5
一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括：（a）DME/F-12培养基，（b）5%的FBS和（c）盐类添加剂，其包括钾盐，钾盐为磷酸二氢钾和硝酸钾，所述钾盐浓度为200mg/L。
在无菌条件下，分别称取磷酸二氢钾0.15g和硝酸钾0.05g，于1L无菌注射用水中混匀，经0.22μm滤膜过滤后得到盐溶液。培养基的配制过程同实施例3。
实施例6
一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括：（a）DME/F-12培养基，（b）5%的FBS和（c）盐类添加剂，其包括钠盐和钾盐，钠盐为氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠，钾盐为磷酸二氢钾和硝酸钾，所述钠盐浓度为10100mg/L，所述钾盐浓度为250mg/L。
在无菌条件下，分别称取氯化钠9g、磷酸氢二钠1g、硫酸钠0.1g、磷酸二氢钾0.2g和硝酸钾0.05g，于1L无菌注射用水中混匀，经0.22μm滤膜过滤后得到盐溶液。量取盐溶液和2×浓度的DME/F-12培养基各200ml，等体积混匀，混匀后得到培养基，终浓度为1×，并添加5%的FBS。
实施例7
一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括：（a）MEM培养基，（b）5%的FBS和（c）盐类添加剂，其包括钠盐和钾盐，钠盐为氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠，钾盐为磷酸二氢钾和硝酸钾，所述钠盐浓度为10100mg/L，所述钾盐浓度为250mg/L。
MEM（购自上海源培生物技术有限公司），其各组分及浓度如下：无机盐类成分及组成包括无水氯化200mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钾400mg/L、氯化钠6800mg/L、一水合磷酸二氢钠140mg/L；氨基酸类成分包括L-丙氨酸8.9mg/L、L-精氨酸盐酸盐126.4mg/L、L-天冬氨酸13.3mg/L、L-苏氨酸47.6mg/L、L-色氨酸10mg/L、L-缬氨酸46.8mg/L、甘氨酸7.5mg/L、L-蛋氨酸15mg/L、L-亮氨酸52.5mg/L、L-谷氨酸14.7mg/L；维生素类成分D-泛酸钙1mg/L、烟酰胺1mg/L、叶酸1mg/L、肌醇2mg/L、烟酰胺1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、核黄素0.1mg/L、盐酸素盐酸盐1mg/L。其他组分：D-葡萄糖1000mg/L、丙酮酸钠110mg/L。
盐溶液的配制过程同实施例3。量取盐溶液和1×浓度的MEM培养基各200ml，等体积混匀，混匀后得到培养基，终浓度为0.5×，并添加5%的FBS。
实施例8
一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括：（a）DMEM培养基，（b）5%的FBS和（c）盐类添加剂，其包括钠盐和钾盐，钠盐为氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠，钾盐为磷酸二氢钾和硝酸钾，所述钠盐浓度为10100mg/L，所述钾盐浓度为250mg/L。
DMEM（购自武汉普诺赛生命科技有限公司），其各组分及浓度如下：无机盐类成分及组成包括无水氯化钙200mg/L、无水硫酸铜0.0013mg/L、九水合硝酸铁0.1mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400mg/L、无水磷酸二氢钠109mg/L、七水硫酸锌0.43mg/L；氨基酸类成分包括甘氨酸30mg/L、L-精氨酸盐酸盐84mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐62.6mg/L、L谷氨酰胺584mg/L、L-组氨酸盐酸盐一水合物42mg/L、L-苏氨酸95mg/L、L-色氨酸16mg/L、L-二水合酪氨酸二钠盐103.79mg/L、L-缬氨酸94mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L-蛋氨酸30mg/L、L-苯丙氨酸66mg/L；维生素类成分包括尼克酰胺4mg/L、D-泛酸钙4mg/L、氯化胆碱4mg/L、叶酸4mg/L、肌醇7.2mg/L、烟酰胺2.02mg/L、盐酸吡哆醇4mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺素4mg/L、维生素B12 0.68mg/L；D-葡萄糖4500mg/L、丙酮酸钠110mg/L、碳酸氢钠3700mg/L。
盐溶液的配制过程同实施例3。量取盐溶液和1×浓度的DMEM培养基各200ml，等体积混匀，混匀后得到培养基，并添加5%的FBS。
对比例1
在无菌条件下，量取1×浓度的DME/F-12培养基200ml，与无菌注射用水等体积混匀。
对比例2
在无菌条件下，量取1×浓度的DME/F-12培养基200ml，与无菌注射用水等体积混匀，添加5%的FBS。
对比例3
在无菌条件下，量取1×浓度的DME/F-12培养基200ml，与无菌注射用水等体积混匀，添加10%的FBS。
对比例4
一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括：（a）DME/F-12培养基，和（c）盐类添加剂，其包括钠盐和钾盐，钠盐为氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠，所述钠盐浓度为10100mg/L，钾盐为磷酸二氢钾和硝酸钾，所述钾盐浓度为250mg/L。
盐溶液和培养基的配制过程同实施例3。
对比例5
在无菌条件下，分别称取氯化镁9.27g、硫酸铜0.3g、硫酸铁0.15g、硫酸锌0.03g和氯化钙0.6g，盐的总浓度为10350mg/L。于1L无菌注射用水中混匀，经0.22μm滤膜过滤后得到盐溶液。量取盐溶液和1×浓度的DME/F-12培养基各200ml，等体积混匀，混匀后得到培养基，并添加5%的FBS。
对比例6
在无菌条件下，量取2×浓度的DME/F-12培养基200ml，与无菌注射用水等体积混匀，混匀后得到培养基，终浓度为1×，并添加5%的FBS。
对比例7
一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括：（a）DME/F-12培养基，（b）5%的FBS和（c）盐类添加剂，其包括钠盐和钾盐，钠盐为氯化钠、磷酸氢二钠、硫酸钠，所述钠盐浓度为15000mg/L，钾盐为磷酸二氢钾、硝酸钾，所述钾盐浓度为800mg/L。
盐溶液和培养基的配制过程同实施例3。
对比例8
一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括：（a）DME/F-12培养基，（b）5%的FBS和（c）盐类添加剂，其包括钠盐，钠盐为氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠，所述钠盐浓度为15000mg/L。
盐溶液和培养基的配制过程同实施例4。
对比例9
一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括：（a）DME/F-12培养基，（b）5%的FBS和（c）盐类添加剂，其包括钾盐，钾盐为磷酸二氢钾和硝酸钾，所述钾盐浓度为800mg/L。
盐溶液和培养基的配制过程同实施例5。
试验1：证明（1）本申请盐类添加剂和血清配合能够促进MSC贴壁，
（2）同时添加钠盐和钾盐的效果优于单独添加钠盐或钾盐，
（3）添加其它类盐对MSC无促进贴壁生长作用。
具体内容如下：
本试验选取实施例3~5、对比例1、对比例2、对比例4和对比例5。各取5ml与5×105个总细胞（MSC，活率≥95%）混合均匀后分别接种至T25细胞培养瓶中，37℃、5%CO2环境中培养6小时后，记录细胞形态，并消化收获计数，计算贴壁率。
在进行细胞培养时，细胞可依据生长特性分为贴壁、悬浮、半贴壁三种类别，其中贴壁依赖型细胞是指培养时该种细胞需先贴附在一定固相表面后才能开始生长及增殖，贴附过程主要依靠自身分泌或培养基中提供的粘附因子实现。如果贴壁失败，贴壁细胞将一直处于悬浮状态，无法进行生长及增殖，将迅速衰老及死亡。培养时间优选为6小时的依据是，短于该时间，存在贴壁细胞未贴壁情况，长于该时间，存在贴壁细胞分裂增殖情况，都不能真实反映贴壁情况。
统计前，由于上清中含有死细胞及未贴壁细胞，先弃去培养上清，并用PBS洗涤一次，尽量减少计数的影响因素，在弃去死细胞及未贴壁细胞的基础上所消化的细胞统计为贴壁细胞。贴壁率（%）=消化后总细胞数/接种总细胞数×100%。
MSC呈纤维细胞样生长，细胞在支持物表面呈梭形、纺锤状或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核。本试验中实施例3细胞形态如图1所示，实施例4细胞形态如图3所示，实施例5细胞形态如图4所示，对比例1细胞形态如图20所示，对比例2细胞形态如图2所示，对比例4细胞形态如图5所示，对比例5细胞形态如图6所示。通过细胞形态可以得出，实施例3~5培养基能够促进MSC贴壁，细胞汇合情况高。进一步地，实施例3较实施例4和实施例5促贴壁能力更优。
本试验的细胞贴壁率如表1所示，实施例3~5细胞的贴壁率高于对比例1、对比例2、对比例4和对比例5。上述汇合情况及贴壁率结果共同说明本申请盐类添加剂和血清配合能够促进MSC贴壁，MSC生长状况良好，并且同时添加钠盐和钾盐的效果优于单独添加钠盐或钾盐，添加其它类盐对MSC无促进贴壁生长作用。
表1 试验1细胞贴壁率情况
| 试验组 | 接种总细胞数 （个/ml） | 消化后总细胞数 （个/ml） | 贴壁率（%） |
| 实施例3 | 5×105 | 4.05×105 | 81 |
| 实施例4 | 5×105 | 3.55×105 | 71 |
| 实施例5 | 5×105 | 3.63×105 | 73 |
| 对比例1 | 5×105 | 1.03×105 | 21 |
| 对比例2 | 5×105 | 2.98×105 | 60 |
| 对比例4 | 5×105 | 2.81×105 | 56 |
| 对比例5 | 5×105 | 2.13×105 | 43 |
试验2：证明本申请培养基促贴壁的效果不受基础培养基浓度的影响。
具体内容如下：
本试验选取实施例3、实施例6和对比例6。各取5ml与5×105个总细胞（MSC，活率≥95%）混合均匀后分别接种至T25细胞培养瓶中，37℃、5%CO2环境中培养6小时后，记录细胞形态，并消化收获计数，计算贴壁率。
本试验中实施例3细胞形态如图1所示，实施例6细胞形态如图7所示，对比例6细胞形态如图8所示。通过细胞形态可以得出，实施例3和实施例6的汇合情况趋于一致，且高于对比例6。
本试验的细胞贴壁率如表2所示，实施例3和实施例6细胞的贴壁率高于对比例6，本申请培养基能够促进MSC贴壁，MSC生长状况良好。实施例3和实施例6的贴壁率高，且数值相近。
上述汇合情况及贴壁率结果共同说明在合理浓度范围内，本申请培养基促贴壁的效果不受基础培养基浓度的影响。
表2 试验2细胞贴壁率情况
| 试验组 | 接种总细胞数 （个/ml） | 消化后总细胞数 （个/ml） | 贴壁率（%） |
| 实施例3 | 5×105 | 4.05×105 | 81 |
| 实施例6 | 5×105 | 4.14×105 | 83 |
| 对比例6 | 5×105 | 2.61×105 | 52 |
试验3：证明基础培养基种类不会影响本申请培养基对MSC的促贴壁作用。
具体内容如下：
本试验选取实施例3、实施例7、实施例8和对比例2。各取5ml与5×105个总细胞（MSC，活率≥95%）混合均匀后分别接种至T25细胞培养瓶中，37℃、5%CO2环境中培养6小时后，记录细胞形态，并消化收获计数，计算贴壁率。
本试验中实施例3细胞形态如图1所示，实施例7细胞形态如图9所示，实施例8细胞形态如图10所示，对比例2细胞形态如图2所示。通过细胞形态可以得出，实施例3、实施例7和实施例8的汇合情况高于对比例2。
本试验的细胞贴壁率如表3所示，实施例3、实施例7和实施例8细胞的贴壁率均高于对比例2，本申请培养基能够促进MSC贴壁，MSC生长状况良好。
上述汇合情况及贴壁率结果共同说明本申请基础培养基选用DME/F-12、MEM或DMEM都能达到本申请促贴壁的效果，满足本申请内容的基础培养基种类不会影响本申请培养基对MSC的促贴壁作用。
表3 试验3细胞贴壁率情况
| 试验组 | 接种总细胞数 （个/ml） | 消化后总细胞数 （个/ml） | 贴壁率（%） |
| 实施例3 | 5×105 | 4.05×105 | 81 |
| 实施例7 | 5×105 | 4.14×105 | 83 |
| 实施例8 | 5×105 | 4.16×105 | 83 |
| 对比例2 | 5×105 | 2.98×105 | 60 |
试验4：证明本申请培养基能够促进MSC贴壁，对Vero和WI-38效果不明显。
具体内容如下：
本试验选取实施例3的培养基，分为等量的3组。
（1）取5ml与5×105个总细胞（MSC，活率≥95%）混合均匀后接种至第一组T25细胞培养瓶中。（2）取5ml与5×105个总细胞（非洲绿猴肾细胞Vero，购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司，活率≥95%）混合均匀后接种至第二组T25细胞培养瓶中。（3）取5ml与5×105个总细胞（人胚肺细胞WI-38，购自中国典型培养物保藏中心，活率≥95%）混合均匀后接种至第三组T25细胞培养瓶中。
设置空白对照组：（4）取5mlDME/F-12培养基与5×105个总细胞（MSC，活率≥95%）混匀后接种至T25细胞培养瓶中。（5）取5mlDME/F-12培养基与5×105个总细胞（Vero，活率≥95%）混匀后接种至T25细胞培养瓶中。（6）取5mlDME/F-12培养基与5×105个总细胞（WI-38，活率≥95%）混匀后接种至T25细胞培养瓶中。
各组均在37℃、5%CO2环境中培养6小时，记录细胞形态，并消化收获计数，计算贴壁率。
实施例3-MSC组细胞形态如图11所示，实施例3-Vero组细胞形态如图12所示，实施例3-WI-38组细胞形态如图13所示。空白对照组-MSC组细胞形态如图14所示，空白对照组-Vero组细胞形态如图15所示，空白对照组-WI-38组细胞形态如图16所示。通过细胞形态及汇合情况可以得出，本申请对MSC有促进贴壁生长作用，对Vero和WI-38无促进贴壁生长作用。
本试验的细胞贴壁率如表4所示，实施例3-MSC组细胞的贴壁率高于其他两组，可以得出本申请培养基能够促进MSC贴壁，对Vero和WI-38效果不明显。
表4 试验4细胞贴壁率情况
| 试验组 | 接种总细胞数 （个/ml） | 消化后总细胞数 （个/ml） | 贴壁率（%） |
| 实施例3-MSC组 | 5×105 | 4.62×105 | 92 |
| 实施例3-Vero组 | 5×105 | 3.32×105 | 66 |
| 实施例3-WI-38组 | 5×105 | 3.19×105 | 64 |
| 空白对照组-MSC组 | 5×105 | 2.89×105 | 58 |
| 空白对照组-Vero组 | 5×105 | 3.02×105 | 60 |
| 空白对照组-WI-38组 | 5×105 | 3.11×105 | 62 |
试验5：证明高浓度的钠盐和/或钾盐不能促进MSC贴壁。
具体内容如下：
本试验选取实施例3~5和对比例7~9。各取5ml与5×105个总细胞（MSC，活率≥95%）混合均匀后分别接种至T25细胞培养瓶中，37℃、5%CO2环境中培养6小时后，记录细胞形态，并消化收获计数，计算贴壁率。
本试验中实施例3细胞形态如图1所示，实施例4细胞形态如图3所示，实施例5细胞形态如图4所示，对比例7细胞形态如图17所示，对比例8细胞形态如图18所示，对比例9细胞形态如图19所示。通过细胞形态及汇合情况可以得出，实施例3~5对MSC有促进贴壁生长作用，对比例7~9不能促进MSC贴壁生长。
本试验的细胞贴壁率如表5所示，实施例3~5细胞的贴壁率高于对比例7~9，本申请培养基能够促进MSC贴壁，MSC生长状况良好。
上述汇合情况及贴壁率结果共同说明高浓度的钠盐和/或钾盐不能促进MSC贴壁。
表5 试验5细胞贴壁率情况
| 试验组 | 接种总细胞数 （个/ml） | 消化后总细胞数 （个/ml） | 贴壁率（%） |
| 实施例3 | 5×105 | 4.05×105 | 81 |
| 实施例4 | 5×105 | 3.55×105 | 71 |
| 实施例5 | 5×105 | 3.63×105 | 73 |
| 对比例7 | 5×105 | 3.01×105 | 60 |
| 对比例8 | 5×105 | 2.92×105 | 58 |
| 对比例9 | 5×105 | 2.75×105 | 55 |
试验6：证明相较于对比例3基础培养基中只添加血清的方法，实施例3盐类添加剂和血清配合使用的血清用量大幅减少。
具体内容如下：
本试验选取实施例3、对比例2和对比例3。各取5ml与5×105个总细胞（MSC，活率≥95%）混合均匀后分别接种至T25细胞培养瓶中，37℃、5%CO2环境中培养6小时后，记录细胞形态，并消化收获计数，计算贴壁率。
本试验中实施例3细胞形态如图1所示，对比例2细胞形态如图2所示，对比例3细胞形态如图21所示。本试验的细胞贴壁率如表6所示，实施例3和对比例3细胞的贴壁率高于对比例2。
上述汇合情况及贴壁率结果共同说明相较于对比例3基础培养基中只添加血清的方法，实施例3盐类添加剂和血清配合使用细胞贴壁率高，血清用量大幅减少。
表6 试验6细胞贴壁率情况
| 试验组 | 接种总细胞数 （个/ml） | 消化后总细胞数 （个/ml） | 贴壁率（%） |
| 实施例3 | 5×105 | 4.05×105 | 81 |
| 对比例2 | 5×105 | 2.98×105 | 60 |
| 对比例3 | 5×105 | 2.85×105 | 57 |
细胞培养的原代细胞和血清十分珍贵，根据本申请方法可以减少血清用量，降低了实验成本，尤其是在投入生产后，极大的降低了生产成本，本申请在贴壁细胞培养方面具有显著的进步。
此外应理解，在阅读了本申请的内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括基础培养基，所述基础培养基为DME/F-12、MEM或DMEM；其特征在于，还包括：
血清：其用量小于等于培养基总体积的5%；和
盐类添加剂：
所述盐类添加剂包括钠盐和钾盐，所述钠盐浓度为10100mg/L，所述钾盐浓度为250mg/L，其中，所述钠盐包括氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠，其质量比为9：1：0.1，所述钾盐包括磷酸二氢钾和硝酸钾，其质量比为4：1；
或所述盐类添加剂为钠盐，所述钠盐浓度为10350mg/L，所述钠盐包括氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠，其质量比为9.25：1：0.1；
或所述盐类添加剂为钾盐，所述钾盐浓度为200mg/L，所述钾盐包括磷酸二氢钾和硝酸钾，其质量比为3：1；
所述血清和所述盐类添加剂为额外添加于所述基础培养基，能够高效促进所述间充质干细胞贴壁生长。
2.根据权利要求1所述的一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，其特征在于，所述基础培养基，其包括无机盐、氨基酸、维生素和能量底物。
3.根据权利要求2所述的一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，其特征在于，在所述基础培养基中，若无机盐含有钠盐和/或钾盐，则钠盐和/或钾盐总浓度不超过7500mg/L；
所述基础培养基中的无机盐包括氯化钙、硫酸铜、硝酸铁、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸锌中的至少一种；
所述能量底物为D-葡萄糖和/或丙酮酸钠。
4.一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求1~3中任意一项所述的血清和盐类添加剂。
5.一种根据权利要求1~3中任意一项所述的促进间充质干细胞贴壁生长的培养基的制备方法，其特征在于，在无菌条件下，称取配制所述盐类添加剂的钠盐和/或钾盐，溶于水中混匀，滤膜过滤后保存，保存温度为2~8℃；使用时与所述基础培养基和血清混匀，得到所述促进间充质干细胞贴壁生长的培养基。
6.一种根据权利要求1~3中任意一项所述的培养基或权利要求4所述的制剂在促进间充质干细胞贴壁生长中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202311484448.0A CN117210401B (zh) | 2023-11-09 | 2023-11-09 | 一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂、培养基及其制备方法 |
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|---|---|---|---|
| CN202311484448.0A CN117210401B (zh) | 2023-11-09 | 2023-11-09 | 一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂、培养基及其制备方法 |
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Citations (7)
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-
2023
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