CN117209552B - 一种葫芦素b衍生物a2及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葫芦素B衍生物A2及其制备方法和应用，葫芦素B衍生物A2的结构式为本发明提供的一种葫芦素B衍生物A2对人非小细胞肺癌细胞系A549增殖活性具有很强的抑制作用，IC_{50 50}值仅为0.009μM，比葫芦素B对A549增殖抑制活性提高了近10倍，并且对正常细胞L02的毒性降低了近10倍，选择性系数比葫芦素提高了近100倍。异种移植小鼠实验结果与细胞结果一致，可以作为治疗人非小细胞肺癌的候选药物；提供的制备方法具有原料来源丰富，反应条件温和，反应过程操作便宜，所用试剂便宜易得、低毒或无毒，成本低，适于工业化生产。

Description

一种葫芦素B衍生物A2及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗癌药物技术领域，尤其是涉及一种葫芦素B衍生物A2及其制备方法和应用。

背景技术

2018年世界卫生组织下属的国际癌症研究中心对全球185个国家36种癌症的发病率和死亡率进行了估算，发布的《2018全球癌症统计数据》显示，肺癌、女性乳腺癌、结肠直肠癌是全球发病率最高的三种癌症，死亡率分别位列第一、第五和第二。虽然在2020年国际癌症研究中心的统计数据显示乳腺癌的发病率首次超过肺癌成为全球第一大癌症，乳腺癌和肺癌的发病率分别占全球癌症病例总数的11.7％和11.4％，但是肺癌仍然是死亡率最高的癌症，占癌症死亡总数的18.0％。

大约85％的肺癌病理类型是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，该类肺癌的早期临床表现不特异，大部分NSCLC患者在临床确诊时已经处于晚期阶段，无法通过手术进行根治性治疗。放化疗为治疗晚期NSCLC的主要手段，特异性酪氨酸激酶抑制剂及免疫治疗的引入，虽然提高了NSCLC的综合治疗效果，但这些药物仅用于治疗某些具有特定基因突变的患者，且随着治疗时间延长，均不可避免地出现治疗耐药等情况。

因此，开发对NSCLC细胞增殖活性有强效抑制作用、作用人群更广泛、毒副作用更低的药物，以提高NSCLC患者的生存率、甚至治愈，是科研工作者永恒不变的奋斗目标。

葫芦素B(Cucurbitacin B)是从葫芦科等植物中分离得到的一类四环三萜类化合物，是葫芦素家族中含量最丰富的成员，具有广泛的药理活性，既往研究表明，葫芦素B具有保护肝、消炎和抗肿瘤等多种生物学活性。研究表明葫芦素B对肝癌、乳腺癌、喉癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤细胞系表现出抑制作用。研究表明，用葫芦素B治疗的肺癌以剂量和时间依赖方式抑制STAT3的磷酸化，从而导致生长停滞和细胞凋亡。葫芦素B因其在多种肿瘤细胞中的抗肿瘤作用，成为癌症研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种葫芦素B衍生物A2及其制备方法和应用，以提供一种对NSCLC细胞增殖有更强抑制作用、作用人群更广泛、毒副作用更低的新的化合物，以期提高NSCLC患者的生存率，为NSCLC患者的治愈贡献力量。

为实现上述目的，本发明提供一种葫芦素B衍生物A2及其制备方法和应用，一种葫芦素B衍生物A2，结构式如下：

一种如上所述的葫芦素B衍生物A2的制备方法，步骤如下：

1)将4-氟苯胺、原甲酸三乙酯和肼基甲酸甲酯放入无水甲醇中回流；

2)TLC监测反应完成后，加入甲醇钠，得到玫红色沉淀，然后在反应溶液中加蒸馏水使固体析出，再用蒸馏水反复冲洗，直至产物变白，再将所得产物与氯乙酸进行取代反应，得到中间体1a；

3)将中间体1a与葫芦素B加入1,2-二氯乙烷溶液中，以1-羟基苯并三氮唑和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐作为催化剂，60℃下以200-400rpm的速度持续搅拌直至TLC监测反应完全；

4)待反应完全后将反应液倒入1.5倍1,2-二氯乙烷溶液体积的蒸馏水中，用1.5倍1,2-二氯乙烷溶液体积的乙酸乙酯分三次萃取，收集乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去乙酸乙酯，对产物进行纯化即得葫芦素B衍生物A2。

葫芦素B衍生物A2的反应式为：

优选的，所述步骤1)中4-氟苯胺：原甲酸三乙酯：肼基甲酸甲酯的物质的量比为1:1.5:1.5；回流温度为70℃。

优选的，所述步骤2)中加入甲醇钠的物质的量为4-氟苯胺物质量的1.5倍；变白的产物与氯乙酸的物质的量比1:1.5，以无水碳酸钾和乙腈为催化剂，TLC监测反应完成。

优选的，所述步骤3)中4-氟苯基三唑酮：葫芦素B：1,2-二氯乙烷溶液的物质的量比为1.2:1:100。

优选的，所述步骤4)中减压旋蒸的参数设置为压力1.3-2.0kPa，水浴温度为30-40℃。

优选的，所述步骤4)中纯化方法为硅胶色谱法；采用硅胶色谱法，以体积比为100:1-30:1的二氯甲烷甲醇溶液作为展开剂洗脱。

一种如上所述的葫芦素B衍生物A2在抗肿瘤药物中的应用。

因此，本发明提供的一种葫芦素B衍生物A2及其制备方法和应用，其具体技术效果如下：

(1)本发明提供的一种葫芦素B衍生物A2对人非小细胞肺癌细胞系A549增殖活性具有很强的抑制作用，IC₅₀值仅为0.009μM，比葫芦素B对A549增殖抑制活性提高了近10倍，并且对正常细胞L02的毒性降低了近10倍，选择性系数比葫芦素提高了近100倍；异种移植小鼠实验结果与细胞结果一致，可以作为治疗人非小细胞肺癌的候选药物；

(2)本发明提供的制备方法具有原料来源丰富，反应条件温和，反应过程操作便宜，所用试剂便宜易得、低毒或无毒，成本低，适于工业化生产。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是葫芦素及其衍生物A2对人肺癌A549细胞的抗增殖活性及对L02正常细胞的毒性结果；

图2是葫芦素B及其衍生物A2对异种移植小鼠体内肿瘤的影响结果。

具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

为了使得本申请的目的、技术方案及优点更加明确、透彻和完整，下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下详细说明均是实施例的说明，旨在对本发明提供进一步详细说明。除非另有指明，本发明所采用的所有技术术语与本申请所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同。

实施例中用于回流的装置是集热式恒温加热磁力搅拌器(上海豫康科教仪器设备有限公司)；TLC监测的仪器是Goodsee-10型薄层色谱成像仪为上海科哲生化科技有限公司公司生产；硅胶色谱柱自己装填，所用硅胶为青岛海洋化工有限公司生产；减压旋蒸通过选旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)完成；酶标仪为公司生产；电子称为上海精天电子仪器有限公司公司生产；游标卡尺为浙江温州三和量具仪器有限公司生产；核磁共振波普数据由核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克光谱仪器公司，BRUKER AV—300)测定。

4-氟苯胺、原甲酸三乙酯、肼基甲酸甲酯、无水甲醇、甲醇钠、氯乙酸、葫芦素B、1,2-二氯乙烷、1-羟基苯并三氮唑、乙酸乙酯、二氯甲烷、无水硫酸钠分别购自麦克林试剂有限公司，纯度为分析纯。

人肺癌A549细胞株和L02细胞株均购自普诺赛公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、0.25％胰蛋白酶均购自美国Gibco BRL公司；青霉素、链霉素购自索莱宝公司，Balbc/nude小鼠购自上海灵畅公司。

实施例一

制备一种葫芦素B衍生物A2，步骤如下：

1)准确称取4-氟苯胺1.11g、原甲酸三乙酯2.22g、肼基甲酸甲酯1.35g，放入100mL的圆底烧瓶中，加入50mL无水甲醇，磁力搅拌下70℃回流约8小时。TLC监测反应完成后，加入1.665g甲醇钠，继续回流反应4小时得到玫红色溶液。

2)在反应溶液中加入100mL蒸馏水，析出玫红色固体，抽滤后用蒸馏水反复冲洗，直至产物变为白色固体，60℃过夜烘干。

3)取上述所得产物0.91g，无水碳酸钾1.40g和氯乙酸0.71g加入圆底烧瓶中，加入30mL乙腈，磁力搅拌下回流反应，TLC监测反应完成后，减压移除乙腈得到中间体1a粗品。以体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇为流动相，柱层析纯化的1a纯品。

4)取上述中间体1a 0.284g与0.56g葫芦素B，加入10mL 1,2-二氯乙烷溶液中，以1-羟基苯并三氮唑(HOBT)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)作为催化剂，60℃下以200rpm的速度持续搅拌直至TLC监测反应完全。

5)待反应完全后，将反应液倒入15mL水中，加入15ml乙酸乙酯，分三次萃取，收集乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤三次，用无水硫酸钠除去水分，在1.3-2.0kPa，水浴温度为30-40℃条件下减压旋蒸除去乙酸乙酯，得到白色油状物。

6)用硅胶色谱法进行纯化，二氯甲烷甲醇(100:1-30:1)为展开剂洗脱后得到目标产物葫芦素B衍生物A2纯品。

实施例二

对获得的葫芦素B衍生物A2进行核磁共振氢谱和碳谱测定，方法如下：称取20mg实施例一制备的葫芦素B衍生物A2，装入核磁管中，加入0.7mL的氘代氯仿溶解后，用BRUKERAV—300核磁共振仪测定核磁共振氢谱和碳谱。

效果例一

检测实施例一制备的葫芦素B衍生物A2对人非小细胞肺癌细胞系A549增殖情况的影响，采用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)比色法，以葫芦素B为对照，方法如下：

S1-1、取对数生长期的A549细胞和L02细胞株以5000-8000CFU/每孔均匀地接种在含10％FBS的DMEM培养基的96孔板中(每孔含150μL培养基)，于细胞培养箱中培养过夜。

S1-2、向培养基中分别加入10、2、0.4、0.8、0.016、0.008、0.004、0.002、0.0004、0.00008μM的葫芦素B衍生物A2和葫芦素B，孵育72h后，96孔板弃液，轻柔加入200μL 10％三氯乙酸，置于4℃冰箱中固定30min，弃液，每个浓度设置5个生物学重复。

S1-3、再加入300μL双蒸水洗三次，室温干燥1h，加入80μL 4％的SRB，染色20min后弃染液，用1％乙酸洗三次，室温干燥。

S1-4、用200μL浓度为10mM的unbufferered Trisbase(pH＝10.5)溶解，平板震荡5min。

S1-5、使用酶标仪在545nm处测量吸光值，按下式计算抑制率

抑制率(％)＝(1-给药孔OD值/对照孔OD值)

根据抑制率与给药浓度绘制对数曲线图得半数抑制浓度，结果见图1和表1，其中图1中A部分左图为不同浓度葫芦素B(CuB)和衍生物A2(A2)对L02细胞系的影响结果，图1中A部分右图为不同浓度CuB和A2对A549细胞系的抑制结果；图1中B部分为A部分的定量分析结果。

表1

效果例二

采用异种移植的方法检测葫芦素B衍生物A2的体内抗肿瘤活性，方法如下：

S2-1、将购买的体重为16-18g的雄性无胸腺BALB/C裸鼠在SPF级别下饲养7d后将悬浮于125μL DMEM培养基中的A549细胞(1×10⁷)注射到小鼠的腋下。

S2-2、当每组的肿瘤体积增加到100mm³左右时，将小鼠随机分为3组，每组6只。给药组给药剂量为0.5mg/kg，以5％DMSO/30％PEG400/65％双蒸水作为媒介物注入腹腔。空白对照组只注射相同剂量的媒介物。

S2-3、前6d每天给药一次，给药方式为腹腔注射，后面考虑到小鼠的耐受性，改为2d给药一次，共给药14次。

S2-4、每2d测量一次小鼠体重和肿瘤体积，给药结束后，处死小鼠，切除肿瘤并用电子秤称重。使用游标卡尺确定肿瘤大小，并使用如下标准公式计算肿瘤体积(mm³)和肿瘤抑制率(％)：

肿瘤体积＝(L×W²)/2，(L为长度，W为宽度)；

肿瘤抑制率(％)＝(1-治疗组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量)×100％。

结果见图2，其中图2中A部分为体内抗肿瘤实验流程，B部分为各组裸鼠的生存率，C部分为给药结束后各组解剖得到的肿瘤平均重量及其抑制率，D部分为各组肿瘤体积的变化趋势，E部分各组裸鼠的体重变化趋势，F部分为给药结束后解剖得到的肿瘤。

结果分析

实施例一制备的葫芦素B衍生物A2的核磁共振氢谱和碳谱数据为：

White powder；yield 28％；m.p.¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.73(s,1H),7.60-7.50(m,2H),7.24-7.15(m,2H),7.08(d,J＝15.6Hz,1H),6.49(d,J＝15.6Hz,1H),5.82(d,J＝5.2Hz,1H),5.57(dd,J＝13.6,5.5Hz,1H),4.85-4.69(m,2H),4.37(t,J＝7.8Hz,1H),4.30(s,1H),3.25(d,J＝14.8Hz,1H),2.85(d,J＝12.4Hz,1H),2.71(d,J＝14.7Hz,1H),2.51(d,J＝7.1Hz,1H),2.48-2.36(m,1H),2.26-2.15(m,1H),2.02(s,3H),2.00-1.79(m,4H),1.64(d,J＝4.2Hz,1H),1.58(s,3H),1.56(s,3H),1.46(s,3H),1.37(s,3H),1.32(s,3H),1.27(s,3H),1.10(s,3H),0.99(s,3H).¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ211.18,203.50,201.41,169.22,165.72,161.65,159.68,151.08(d,J＝11.25Hz),138.42,133.54,128.78,123.16(d,J＝8.75Hz,2C),119.84,119.29,115.60(d,J＝23.75Hz,2C),78.31,77.20,73.79,70.28,57.17,50.25,49.65,47.65,47.44,47.06,45.53,44.31,41.35,33.25,30.88,28.68,27.59,25.42,24.96,22.92,22.84,20.93,20.25,18.98,18.88.ESI-HRMS(m/z)calcd for C₄₂H₅₂FN₃O₁₀[M+Na]⁺:800.3534,found:800.3532.

由核磁共振结果可以看出，实施例一制备的葫芦素B衍生物A2的结构式为下图所示，纯度为98％，制备葫芦素B衍生物A2的反应式为：

由图1和表1可以看出，实施例一制备的葫芦素B衍生物A2在A549细胞中表现出很强的抗增殖活性，其IC₅₀值为0.009±0.003μM，比葫芦素B的抗增值活性提高近10倍(葫芦素B的IC₅₀值为0.019±0.022μM)，并且对正常细胞的毒性较先导物葫芦素B降低了近10倍(实施例一制备的葫芦素B衍生物A2对L02细胞毒性的IC₅₀为0.1±0.008μM，葫芦素B为0.011±0.003μM)，选择性系数比葫芦素B提高近100倍(实施例一制备的葫芦素B衍生物A2的选择性系数为11.11，葫芦素B为0.58)。

由图2中B部分可以看出，葫芦素B治疗组在给药8次后，小鼠出现严重腹水现象，小鼠腹部累积大量奶白色液体，小鼠呈消瘦状态。根据动物伦理学要求，为减轻小鼠痛苦，将其处死。这种现象在给药12次与14次时也陆续发生，而A2治疗组则没有该现象。并且，0.5mg/kg剂量下，葫芦素B治疗组和A2治疗组对小鼠肿瘤生长的抑制率分别为53％，80％，与空白对照组比具有显著性差异。

因此，本发明提供的一种葫芦素B衍生物A2对人非小细胞肺癌细胞系A549增殖活性具有很强的抑制作用，IC₅₀值仅为0.009μM，比葫芦素B对A549增殖抑制活性提高了近10倍，并且对正常细胞L02的毒性降低了近10倍，选择性系数比葫芦素提高了近100倍。异种移植小鼠实验结果与细胞结果一致，可以作为治疗人非小细胞肺癌的候选药物；提供的制备方法具有原料来源丰富，反应条件温和，反应过程操作便宜，所用试剂便宜易得、低毒或无毒，成本低，适于工业化生产。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种葫芦素B衍生物A2，其特征在于，结构式如下：

2.一种如权利要求1所述的葫芦素B衍生物A2的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)将4-氟苯胺、原甲酸三乙酯和肼基甲酸甲酯放入无水甲醇中回流；

2)TLC监测反应完成后，加入甲醇钠，得到玫红色沉淀，然后在反应溶液中加蒸馏水使固体析出，再用蒸馏水反复冲洗，直至产物变白，再将所得产物与氯乙酸进行取代反应，得到中间体1a；

3)将中间体1a与葫芦素B加入1,2-二氯乙烷溶液中，以1-羟基苯并三氮唑和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐作为催化剂，60℃下以200-400rpm的速度持续搅拌直至TLC监测反应完全；

4)待反应完全后将反应液倒入1.5倍1,2-二氯乙烷溶液体积的蒸馏水中，用1.5倍1,2-二氯乙烷溶液体积的乙酸乙酯分三次萃取，收集乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去乙酸乙酯，对产物进行纯化即得葫芦素B衍生物A2。

3.根据权利要求2所述的一种葫芦素B衍生物A2的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中4-氟苯胺：原甲酸三乙酯：肼基甲酸甲酯的物质的量比为1:1.5:1.5；回流温度为70℃。

4.根据权利要求2所述的一种葫芦素B衍生物A2的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中加入甲醇钠的物质的量为4-氟苯胺物质量的1.5倍；变白的产物与氯乙酸的物质的量比1:1.5，以无水碳酸钾和乙腈为催化剂，TLC监测反应完成。

5.根据权利要求2所述的一种葫芦素B衍生物A2的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中4-氟苯基三唑酮：葫芦素B：1,2-二氯乙烷溶液的物质的量比为1.2:1:100。

6.根据权利要求2所述的一种葫芦素B衍生物A2的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中减压旋蒸的参数设置为压力1.3-2.0kPa，水浴温度为30-40℃。

7.根据权利要求2所述的一种葫芦素B衍生物A2的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中纯化方法为硅胶色谱法；采用硅胶色谱法，以体积比为100:1-30:1的二氯甲烷甲醇溶液作为展开剂洗脱。

8.一种如权利要求1所述的葫芦素B衍生物A2在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤为非小细胞肺癌。