CN117205316A - 一种自组装纳米药物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自组装纳米药物、其制备方法及应用，所述自组装纳米药物至少包含阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素三种活性药物成分，所述阿托伐醌和新吲哚菁绿通过非共价作用力形成非共价结构，所述阿霉素通过化学作用力与所述阿托伐醌结合，形成肿瘤靶向纳米药物。所述肿瘤靶向纳米药物在近红外光和X射线同时照射处理下，可以通过改善乏氧和增加局部温度，从而达到放疗增敏下的协同杀伤肿瘤的效果，继而实现高效治疗肿瘤的作用。本发明制备方法简单、价格低廉、具有高靶向性、没有毒副作用，是一种集化疗增敏、光热增敏及改善乏氧环境于一体的增强放疗敏感性的可降解自组装纳米药物。

Description

一种自组装纳米药物、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种自组装纳米药物、其制备方法及应用。

背景技术

目前恶性肿瘤已经严重的威胁到了人们的生命与健康，给社会、家庭和个人均带来极大的经济负担和身心痛苦。在2021年2月4日，世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究机构在世界影响因子最高的学术期刊CA:ACancer Journal for Clinicians杂志发布了2020年的全球癌症最新数据。报告中表明2020年全球有1929万例新发癌症病例和996万例死亡病例。其中中国癌症死亡人数位居全球第一，占癌症死亡总人数30％。目前我国恶性肿瘤治疗水平低，导致国内恶性肿瘤发病率和死亡率一直居高不下，给社会带来了非常沉重的负担。

放射治疗是目前肿瘤治疗采取的主要手段之一，近60％的肿瘤病人接受放疗。它依赖于X射线，通过辐射引起癌细胞核中的DNA损伤和细胞凋亡来触发肿瘤消融，是临床广谱抗肿瘤治疗方法。此外，辐射还能激活水分子产生活性氧(ROS)，包括·OH、·H、H₂O⁺、H₃O⁺和·O₂，激活MAPKs和p53信号通路，诱导细胞凋亡。虽然目前放射治疗得到了迅猛的发展，已经成为治疗大部分恶性肿瘤的标准选择，然而放射治疗在临床上治疗不同类型的肿瘤时，依然面临着两个不可超越的挑战。其一是因为病人体内的软组织对类似于放疗射线(低传能线密度的射线)吸收较低，因此临床上通常增加放疗剂量(病人最大耐受剂量)才能够杀死肿瘤细胞，而这会对肿瘤周围的正常组织造成损伤；其二是因为肿瘤组织微环境属于乏氧环境，肿瘤细胞会对离子辐射产生抗性，导致放疗失效。

但是目前为止，临床上所使用的肿瘤治疗方法具有毒副作用大、肿瘤细胞会产生放疗抵抗、给药剂量大、治疗效果不理想等缺点。因此，如何减少放疗抵抗和副作用、增强放疗效果、提高靶向性仍是亟待解决的重大难题。

发明内容

本发明的目的是克服现有肿瘤治疗方法中肿瘤细胞存在放疗抵抗、靶向性差、治疗效果不佳的缺陷。

为了达到上述目的，本发明提供了一种自组装纳米药物，所述自组装纳米药物至少包含阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素三种活性药物成分，按质量比计，所述阿托伐醌：新吲哚菁绿：阿霉素＝(10～200)：(5～200)：(1～100)。

较佳地，所述自组装纳米药物的粒径为50nm～100nm。

较佳地，在近红外光波光为700nm～900nm下，所述自组装纳米药物具有吸收度。

较佳地，所述阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素自组装为阿托伐醌-新吲哚菁绿-阿霉素复合物，阿托伐醌和新吲哚菁绿通过π-π堆积和疏水作用力形成非共价结构，所述阿霉素通过氢键与所述阿托伐醌结合。

本发明还提供了一种自组装纳米药物的制备方法，包含以下步骤：

步骤S1，将阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素分别溶于DMSO中形成含有若干个非共价键的阿托伐醌母液、新吲哚菁绿母液、阿霉素母液；

步骤S2，将步骤S1中的所述阿托伐醌母液、新吲哚菁绿母液、阿霉素母液混合，各个非共价键发生结合反应，搅拌均匀后加入蒸馏水进一步促进结合反应，结合反应结束离心得到反应产物；其中，按体积比计，所述阿托伐醌母液、新吲哚菁绿母液、阿霉素母液＝(10～200)：(5～200)：(1～100)；

步骤S3，将步骤S2中得到的反应产物进行清洗，冻干，旋转蒸发，得到自组装纳米药物。

较佳地，所述阿托伐醌母液、新吲哚菁绿母液、阿霉素母液的浓度为10mg/mL～15mg/mL。

本发明还提供了一种如上任意一项所述的自组装纳米药物在制备抗肿瘤靶向纳米药物中的应用。

较佳地，所述自组装纳米药物与近红外光、X射线联合使用，用于制备肿瘤治疗增敏剂。

较佳地，所述自组装纳米药物为注射制剂。

较佳地，所述肿瘤为浅表实体肿瘤。

本发明的有益效果：

(1)本发明的阿托伐醌与新吲哚菁绿发生π-π堆积和疏水作用力，结合更加紧密，二者形成稳定的非共价结构，阿霉素通过氢键等化学作用力与其结合，三者形成稳定的自组装纳米药物，所述自组装纳米药物具有较好的稳定性、水溶性、生物相容性、较强的近红外吸收和良好的可降解性；阿托伐醌可以靶向肿瘤细胞的线粒体，改善肿瘤微环境的乏氧状态，新吲哚菁绿可以起到光热增敏效果，适当升温可以使肿瘤部位的血管扩张，提高乏氧肿瘤细胞对放射性的敏感性，阿霉素可以起到化疗增敏效果，因此将三者进行自组装起到协同作用，在近红外光和X射线同时照射处理下，通过改善乏氧和增加局部温度，从而达到放疗增敏下的协同杀伤肿瘤的效果，自组装得到具有集化疗增敏、光热增敏以及改善乏氧环境于一体的增强放疗敏感性的纳米药物，从而靶向肿瘤，达到高效治疗的效果。

(2)本发明的自组装纳米药物与放射疗法联合治疗时，所需要的放疗剂量较低，避免了对肿瘤细胞周围的正常细胞造成损伤。

(3)本发明的自组装纳米药物在发挥疗效前具有较佳的稳定性，在发挥疗效后，其形态发生显著变化，解体成无规则形态，同时光热性能也逐步丧失，说明发挥疗效之后自组装纳米药物发生一定程度上的降解，可以降低药物毒性。

(4)本发明通过非共价自组装方式制备纳米药物，相较于通过共价方式与药物结合，方法简便，有机步骤较少，产率较高，可携带药物量多。

附图说明

图1a为本发明的自组装纳米药物的粒径分布图。

图1b为本发明的自组装纳米药物的电位图。

图1c为本发明的自组装纳米药物的透射电镜图。

图1d为本发明的自组装纳米药物分别在蒸馏水、PBS缓冲液、DMEM培养基中12天的粒径变化图。

图1e为本发明的自组装纳米药物分别在蒸馏水、PBS缓冲液、DMEM培养基中12天的电位变化图。

图1f为本发明的自组装纳米药物在蒸馏水中1天、150天、360天的粒径强度变化图。

图1g为本发明的自组装纳米药物在蒸馏水中1天、150天、360天的粒径变化图。

图1h为本发明的自组装纳米药物在蒸馏水中1天、150天、360天的电位变化图。

图2a为本发明的不同浓度的自组装纳米药物的光热曲线图。

图2b为本发明的浓度为10μg/mL的自组装纳米药物和新吲哚菁绿的光热稳定性分析图。

图2c为本发明的不同浓度的自组装纳米药物的紫外-可见光光谱图。

图2d为本发明的不同浓度的自组装纳米药物在808nm近红外激光下照射10min后的紫外-可见光光谱图。

图2e为本发明的不同浓度的自组装纳米药物在808nm近红外激光下照射10min前后的粒径分布图。

图2f为本发明的自组装纳米药物的透射电镜图。

图2g为本发明的自组装纳米药物在808nm近红外激光下照射10min后的透射电镜图。

图3a为本发明的不同浓度的自组装纳米药物在不同处理方式下的细胞存活率结果图。

图3b为本发明的不同浓度的自组装纳米药物在不同处理方式下的平板克隆结果图。

图3c为本发明的不同浓度的自组装纳米药物在不同处理方式下的线粒体膜电位绿色荧光强度结果图。

图3d为本发明的不同浓度的自组装纳米药物在不同处理方式下的活性氧绿色荧光强度结果图。

图3e为本发明的不同浓度的自组装纳米药物在不同处理方式下的乏氧绿色荧光强度结果图。

图4a为本发明的相同浓度的新吲哚菁绿和自组装纳米药物的体内生物分布和代谢图。

图4b为本发明的乳腺癌细胞荷瘤小鼠的肿瘤部位的荧光强度的统计结果图。

图4c为本发明的自组装纳米药物在808nm近红外激光下照射10min后的体内生物分布和代谢情况。

图4d为本发明的乳腺癌细胞荷瘤小鼠的肿瘤部位的荧光强度的统计结果图。

图5a为荷瘤小鼠注射PBS溶液和自组装纳米药物进行不同处理之后，其肿瘤在24天的照片。

图5b为荷瘤小鼠注射PBS溶液和自组装纳米药物进行不同处理方式后，其肿瘤在24天的体重。

图5c为不同治疗组治疗后的肿瘤体积记录图。

图5d不同治疗组的小鼠体重记录图。

图5e正常小鼠注射PBS溶液和自组装纳米药物进行不同处理方式后，在30天后，其小鼠心肝脾肺肾的HE染色图。

图6a为本发明的阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素表面基团。

图6b为本发明的阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素三者活性药物通过相互作用力结合形成自组装纳米药物示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

随着纳米医学的发展，多功能的纳米放疗增敏剂为增强肿瘤细胞放射敏感性、提高放疗效果提供了新的机遇，在肿瘤放射治疗中显示出了巨大的应用潜能。目前纳米材料提高肿瘤放疗敏感性的途径主要包括以下几种：①含高原子系数金属元素的纳米材料可直接通过物理增敏途径促进自由基生成实现放疗增敏，比如金、银、铂等贵金属纳米材料和含钆、铪、钽、钨、铋等重金属元素的纳米材料；②铁氧体类纳米材料可以通过芬顿反应或哈伯-韦斯反应催化ROS的生成，高反应活性的ROS可以杀伤肿瘤，从而对肿瘤细胞起到放疗增敏；③半导体纳米材料在X射线等高能光子照射时，会产生光电效应、康普顿散射或电子对湮没现象，生成空穴和溅射出材料的二次电子，逃逸出的二次电子纳米材料附近的受体(水，氧等)捕获并通过氧化还原反应诱导生物分子产生自由基、超氧化物、羟基自由基、过氧亚硝酸根阴离子或一氧化氮自由基，可以局部和靶向性地破坏肿瘤细胞，从而具有放疗增敏的作用；④纳米材料还可以负载H₂O₂酶、氧载体等改善肿瘤乏氧微环境实现放疗增敏；⑤纳米材料负载DNA修复抑制剂、细胞周期抑制剂、NO供体、GSH抑制剂、肿瘤血管生成抑制剂等功能基团实现放疗增敏；⑥纳米放疗增敏剂与光热剂、化疗药物、光敏剂等结合通过综合治疗实现放疗增敏，比如：热疗可以提高肿瘤局部组织温度，软化血管并促进肿瘤微环境的血液循环和氧输运，提高了乏氧肿瘤细胞对放射线的敏感性，并抑制肿瘤细胞的放疗损伤修复，实现热疗辅助增敏放疗的热-放协同治疗，再者光动力治疗和放疗过程中都会产生杀伤性的自由基而起到肿瘤抑制的作用。近年来，纳米放疗增敏剂的临床转化也取得了一系列的进展与突破，比如FDA批准治疗前列腺癌的纳米药物NBTXR3(主要成分为二氧化铪)已经进入临床实验。由此可见，纳米材料在放疗增敏领域具有十分巨大的开发和应用前景。但是目前实现纳米药物放疗增敏的临床运用仍然面临诸多挑战，比如价格昂贵、制备方案复杂、毒性大、治疗效果不理想等，因此，亟需开发新型的高效、低毒、价格低廉的纳米放疗增敏剂。

自组装纳米材料就是将结构单元(可以是原子/分子，分子集团，纳米尺度聚集体等)借助分子间弱相互作用自发形成稳定的、具有特定结构和功能的、主要以非共价键结合的聚集体系。自组装的关键是分子自发地通过无数的非共价键(疏水作用力、氢键等)的弱相互作用力产生协同作用，非共价键的弱相互作用力维持自组装体系结构的稳定性和完整性。自组装纳米技术有着以下优势：①可以选择生物相容性好的分子进行自组装，使得材料具有生物降解及pH降解等特性，可以作为药物载体；②分子自组装的加工工艺体系简单，质量可控，有望进行批量生产；③分子自组装的成本较低、环境污染小。近年来，前体药物和纳米技术在药物传递领域的广泛应用极大地丰富了抗肿瘤药物的递送策略，基于小分子药物的自组装纳米药物递送系统将前体药物和纳米技术的优点结合到一起，以其载药量高、稳定性好、毒副作用低、肿瘤靶向性强等优势，已成为化疗药物递送研究的热点。目前用于药物传递的纳米药物的临床运用仍然面临诸多挑战：价格昂贵、制备方案复杂、毒性大、治疗效果不理想等，基于上述描述可发现自组装纳米材料的出现为解决这一系列的问题现提供了契机。然而，关于自组装纳米材料用于放疗增敏却鲜有报道，因此，基于新型可降解的自组装纳米药物用于肿瘤放疗增敏的研究，不仅具有十分重要的科学意义，还具有实现产业化的前景。

乏氧微环境可增强肿瘤对抗肿瘤药物的耐药性，有些情况下导致肿瘤对放疗表现出抵抗性。在很多种情况下，肿瘤复发源于病灶清除不完全，由细胞耐药亚群和残留灶转移增生而致。乏氧微环境可诱导细胞周期暂停，中断细胞衰老死亡的进程，抑制人体抑癌基因的活性从而产生耐药性。乏氧微环境也可以通过诱导一些耐药基因表达，合成相关药物运输蛋白，从药物提取和运输的角度阻断其作用，产生肿瘤细胞耐药性。综上所述，本申请欲提供一种集化疗增敏、光热增敏以及改善乏氧环境于一体的自组装纳米材料。

本申请的自组装纳米药物包含具有临床荧光成像诊断潜能和光热治疗效果的新吲哚菁绿(IR820)，所述新吲哚菁绿的结构式如式I所示，吲哚菁绿的结构式如式II所示，因为化学结构的改变，导致二者水溶性存在差异，吲哚菁绿不溶于水，新吲哚菁绿溶于水；吲哚菁绿的发射波长在810nm左右，新吲哚菁绿的发射波长在820nm左右，因此相较于吲哚菁绿，本申请的新吲哚菁绿可以穿透更深的活体组织，起到更好的效果。

阿霉素(Doxorubicin，DOX)是一种抗肿瘤抗生素，可以抑制RNA和DNA的合成，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属于周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有灭杀作用。阿托伐醌与阿霉素两者之间难以形成稳定的非共价结构，在溶液中二者始终各自单独存在，因此加入新吲哚菁绿可以让三者发生自组装。如图6a和图6b所示，本申请的阿托伐醌(ATO)与新吲哚菁绿(IR820)各自的苯环发生π-π堆积，阿托伐醌表面的疏水基团-Cl与新吲哚菁绿表面的疏水基团-SO₃H发生疏水作用力，形成稳定的非共价结构，阿霉素顺势通过氢键等化学作用力进入其中，和磷脂双分子层相类似，两个疏水分子亲水的那一端在外表面，而疏水的那一端在内表面。疏水作用力是指水介质中小分子之间的相对位置总是倾向于把疏水残基埋藏在分子内部的力，所以疏水作用力会使水分子压迫两个疏水分子靠近在一起，从而结合更加紧密。而π-π堆积是两个苯环之间的堆积作用，是相互吸引的，可以与氢键一起发生相互作用，所以也会使二者结合更加紧密。本申请由阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素自组装为阿托伐醌-新吲哚菁绿-阿霉素复合物，以下所指的纳米药物即为阿托伐醌-新吲哚菁绿-阿霉素复合物，该复合物并不是三种组分简单的混合而成的松散的结构，而是三种组分形成的紧密的复合结构。本申请无需添加其他溶剂辅助自组装，使得阿托伐醌(ATO)、新吲哚菁绿(IR820)、阿霉素(DOX)三者形成稳定的自组装结构纳米药物，合成方法方便简单、载药量大、见效快、毒性低、可以同步实现抗肿瘤药物的靶向快速释放。

实施例1

本申请的自组装纳米药物的制备方法包含以下步骤：

步骤S1，将阿托伐醌(购自阿拉丁，95233-18-4)、新吲哚菁绿(购自麦克林，172616-80-7)、阿霉素(购自阿拉丁，25316-40-9)分别溶于DMSO中配制成浓度为10mg/mL的阿托伐醌母液、新吲哚菁绿母液、阿霉素母液，按质量比计，所述阿托伐醌：新吲哚菁绿：阿霉素＝(10～200)：(5～200)：(1～100)；在DMSO中，所述阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素暴露出各自的非共价键，以便于后续的结合反应；

步骤S2，按体积比计，将阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素以100：(200/100/50/20/10/5):10μL的比例加入至5mL的玻璃瓶中进行磁力搅拌，磁力搅拌的转速为500rpm～1000rpm，在室温下各个非共价键发生结合反应2h～4h，结合反应结束，加入2mL～4mL的蒸馏水，继续搅拌4h～24h，加入蒸馏水之后进一步促进非共价键之间的结合；

步骤S3，反应结束后，将反应液转移至离心管中进行离心，离心转速设置为14000rpm～22000rpm，离心时间为10min～30min，离心结束后，使用蒸馏水反复冲洗离心产物3次，冻干和旋转蒸发，对固体有效成分定容至1mL的注射制剂，得到自组装纳米药物，于4℃冰箱保存备用。

本发明的制备方法采用的是磁力搅拌自组装法，相较于超声自组装法容易产生大量的热，对小分子药物的活性和功能会产生潜在的影响，本发明的磁力搅拌自组装法的优势在于不会产生热，因此避免了相关潜在影响。

本发明的自组装纳米药物可以分散在任何适于临床应用的生理盐水(如质量分数为0.9％的氯化钠溶液)或缓冲液(如pH＝7～9的PBS缓冲液)中，并以注射制剂的方式施用至生物体中，所述注射制剂还可以包含有葡萄糖、甘油、乙醇、丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、聚氧基化的异硬脂醇、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、溶解剂、缓冲剂、止痛剂、稳定剂等药学上可接受的物质。

1.自组装纳米药物的物理表征

如图1a和图1b所示，制备得到的不同配比的自组装纳米药物的粒径和电位结果不同，选择阿托伐醌：新吲哚菁绿：阿霉素＝100:50:10的比例进行后续实验。如图1c所示，制备得到的自组装纳米药物为粒径50nm～100nm的球形颗粒。如图1d和图1e所示，将制备得到的自组装纳米药物放置于蒸馏水、PBS缓冲液和DMEM培养基中，所述自组装纳米药物的粒径和电位基本维持稳定，说明本发明的自组装纳米药物具有较强的稳定性。如图1f、图1g、图1h所示，本发明的自组装纳米药物在蒸馏水中保存360天，其粒径和电位基本维持稳定，说明该自组装纳米药物具有较长时间的稳定性。

2.自组装纳米药物的光热和光热可降解性能表征

取出备用的自组装纳米药物，使用紫外分光光度计对其进行测定分析，其中阿托伐醌、新吲哚菁绿及阿霉素的浓度分别为6000μg/mL，750μg/mL和150μg/mL，后续实验均以新吲哚菁绿的浓度来定义所述自组装纳米药物的浓度，即自组装纳米药物的浓度为750μg/mL。

将自组装纳米药物分别稀释成浓度为1、2、4、10、15μg/mL的分散液，将不同浓度的分散液放置在波长为808nm的激光器(购自上海西龙光电科技有限公司)下，以1W/cm²的功率照射10min，使用热成像仪记录温度随时间的变化趋势。如图2a所示，在同样的光照密度下(1W/cm²)，随着自组装纳米药物浓度的增加，分散液的温度越来越高，说明本发明制备得到的自组装纳米药物具有良好的光热效果，并存在浓度依赖性，即分散液的浓度越高，其温度越高。

将10μg/mL的新吲哚菁绿和分散液，分别放在波长为808nm的激光器下以1W/cm²的功率照射10min，停止照射10min后重新继续照射，重复进行四个升温、降温循环，温度变化监测结果如图2b所示，在经历了四个升温/降温循环中，分散液的升温效果要优于单一的新吲哚菁绿；随着时间的推移，分散液的温度下降，说明在光热处理之后，分散液中的纳米药物可能发生了一定程度的降解。

将分散液分别稀释成浓度为1、2、4、6、10、15μg/mL的分散液，分别进行紫外-可见光光谱吸光度扫描，结果如图2c所示，证明纳米药物的紫外-可见光光谱吸光度随着浓度的升高而增高。

将分散液分别稀释成浓度为1、2、4、10、15μg/mL的分散液，将不同浓度的分散液放置在波长为808nm的激光器(购自上海西龙光电科技有限公司)下，以1W/cm²的功率照射10min，然后再进行紫外-可见光光谱吸收度扫描，结果如图2d所示，证明纳米药物在808nm激光照射后，其紫外-可见光光谱吸收度相对于未照射的纳米药物，其吸光度降幅较大，说明纳米药物在光热之后可能发生了一定程度的降解。

将自组装纳米药物在使用808nm的激光处理前后，分别对其进行粒径测定和透射电子显微镜观察，结构如图2e、图2f、图2g所示，说明在经历后808nm激光照射之后，纳米药物的粒径逐渐变大，形状变得无规则，综上表明，表明纳米药物在光热之后发生了一定程度的降解。

3.自组装纳米药物的细胞杀伤性能

在96孔板中，使用DMEM+10％FBS培养液培养4T1乳腺癌细胞，细胞密度接近50％密度时，将纳米药物溶解在PBS分散液母液配制到DMEM完全培养基中，配制成浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5μg/mL，在96孔板中分为四组，分别为纳米药物、纳米药物+照射组、纳米药物+放疗组、纳米药物+照射+放疗组。将纳米药物+照射组和纳米药物+照射+放疗组在808nm(1W/cm²)近红外光下照射5min，纳米药物+放疗组和纳米药物+照射+放疗组接受6Gly的放射治疗，继续培养24h，培养结束后使用CCK-8法测定细胞存活率，结果如图3a所示，肿瘤细胞的存活率随着纳米药物的浓度升高而逐渐降低，并且纳米药物+照射+放疗组表现出更好的肿瘤杀伤效果，说明纳米药物在一定温度下可以放疗增敏，达到更好的肿瘤细胞克隆抑制效果。

在6孔板中，使用DMEM+10％FBS培养液培养4T1乳腺癌细胞，每孔500个细胞，将纳米药物溶解在PBS分散液母液配制到DMEM完全培养基中，配制成浓度分别为0、0.01、0.02和0.05μg/mL，在6孔板中分为四组，分别为纳米药物、纳米药物+照射组、纳米药物+放疗组、纳米药物+照射+放疗组。将纳米药物+照射组和纳米药物+照射+放疗组在808nm(1W/cm²)近红外光下照射5min，纳米药物+放疗组和纳米药物+照射+放疗组接受6Gly的放射治疗，继续培养24h，随后换成正常培养基继续培养6天，进行结晶紫染色，实验结果如图3b所示，纳米药物可以明显抑制肿瘤细胞的克隆能力，并且纳米药物+照射+放疗组的平板克隆抑制能力更加明显，说明纳米药物在一定温度下可以放疗增敏，达到很好的肿瘤细胞克隆抑制效果。

将纳米药物溶解于PBS分散液母液配制到DMEM完全培养基中，配制成浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1μg/mL，加入6孔板中，分为四组，分别为纳米药物、纳米药物+照射组、纳米药物+放疗组、纳米药物+照射+放疗组。然后纳米药物+照射组和纳米药物+照射+放疗组在808nm(1W/cm²)近红外光下照射5分钟，随后纳米药物+放疗组和纳米药物+照射+放疗组接受6Gly的放射治疗，随后，各组则与JC-1荧光探针、DCFH-DA探针(10μM)和乏氧荧光探针共孵育30分钟后，用无血清的DMEM培养基洗三次，并用200μL的PBS重悬后，在流式细胞计数仪下计数并统计差异，实验结果如图3c、图3d、图3e所示，图3c说明纳米药物可以降低肿瘤细胞线粒体膜电位，破坏线粒体的功能，并且纳米药物+照射+放疗组的线粒体破坏功能更加明显，表明纳米药物在一定温度下可以放疗增敏，达到更好的肿瘤细胞线粒体破坏效果；图3d说明纳米药物可以在一定程度上升高肿瘤细胞内活性氧水平，并且在纳米药物+照射+放疗组中，其细胞内活性氧水平急剧升高，表明纳米药物在一定温度下可以放疗增敏，可以更好的升高肿瘤细胞内活性氧水平。图3e说明纳米药物在一定程度上可以改善肿瘤细胞内乏氧情况，并且纳米药物+照射+放疗组相较于单纯的纳米药物组，其细胞内乏氧状态升高，但是因为纳米药物在一定温度下可以放疗增敏，剧增了细胞内活性氧的水平，消耗了其节省的氧气，故在此一正一反的比较下，表明纳米药物+照射+放疗组具有较强的氧气节约能力。

4.自组装纳米药物在荷瘤小鼠的体内代谢和生物分布

用DMEM+10％ FBS培养液培养4T1乳腺癌细胞(购于ATCC)，培养传代，每只小鼠在后背侧下方注射10⁶个4T1乳腺癌细胞，建立BALB/c小鼠皮下荷瘤模型，待肿瘤体积长至约为100mm³时，将荷瘤小鼠随机分成两组，分别为：新吲哚菁绿和纳米药物组。每组5只小鼠，新吲哚菁绿分散液和纳米药物分散液均采用尾静脉注射的方式给药，新吲哚菁绿分散液和纳米药物分散液均用1×PBS缓冲液配制成浓度为200μg/mL，且在小鼠尾静脉注射的量为100μL。注射完之后，在连续不同的时间点，即0、1、2、14、24、36、48、60、72、84和96h进行成像研究，并在96h的时候，将小鼠处死，取离体肿瘤进行体外活体成像，并进行统计分析，结果如图4a和图4b所示，表明同等浓度的新吲哚菁绿和纳米药物在小鼠体内的代谢和生物分布明显不同，纳米药物组明显延长了药物在体内的代谢和生物分布，并且提高了纳米药物在肿瘤部位的蓄积，为后续治疗提供了物质基础。

用DMEM+10％ FBS培养液培养4T1乳腺癌细胞(购于ATCC)，培养传代，每只小鼠在后背侧下方注射10⁶个4T1乳腺癌细胞，建立BALB/c小鼠皮下荷瘤模型，待肿瘤体积长至约为100mm³时，将荷瘤小鼠随机分成两组，分别为：纳米药物和纳米药物+808nm组。每组5只小鼠，纳米药物分散液浓度为200μg/mL，且在小鼠尾静脉注射的量为100μL。注射完之后，在连续不同的时间点，即0、1、2、14、24、25、26、28、36、48、72、96、120、144、168、216、264、312、360、408和456h进行成像研究，并在24h的时候，对纳米药物+808nm照射组的小鼠肿瘤进行808nm(1W/cm²)近红外光照10分钟，后续继续观察拍摄；在456h时，处死全部小鼠，取离体肿瘤进行体外活体成像，并进行统计分析，结果如图4c和图4d所示，表明纳米药物在经过808nm的激光处理之后，肿瘤部位荧光强度急剧下降，表明其内部发生了降解，激光处理之后，肿瘤部位局部升温，造成细胞死亡，进而引发炎症反应和肿瘤细胞抗原释放，从而不断有材料向肿瘤部位聚集，发挥后续的放疗增敏效果。

5.自组装纳米药物用于荷瘤小鼠的体内治疗

用DMEM+10％ FBS培养液培养4T1乳腺癌细胞(购于ATCC)，培养传代，每只小鼠在后背侧下方注射10⁶个4T1乳腺癌细胞，建立BALB/c小鼠皮下荷瘤模型，待肿瘤体积长至约为100mm³时，将荷瘤小鼠随机分成八组，分别为：(1)对照组，即只注射PBS缓冲溶液；(2)PBS+808nm组，注射PBS缓冲液并进行近红外照射；(3)PBS+放疗组，注射PBS缓冲液并进行放疗；(4)PBS+808nm+放疗组，注射PBS缓冲液并且进行近红外照射和放疗；(5)纳米药物组，即只注射纳米药物缓冲溶液；(6)纳米药物+808nm组，注射纳米药物缓冲溶液并进行近红外照射；(7)纳米药物+放疗组，注射纳米药物并进行放疗；(8)纳米药物+808nm+放疗组，注射纳米药物缓冲溶液并进行近红外照射和放疗；

新吲哚菁绿分散液和纳米药物分散液均采用尾静脉注射的方式给药，新吲哚菁绿分散液和纳米药物分散液均用1×PBS缓冲液配制成浓度为200μg/mL，且在小鼠尾静脉注射的量为100μL。尾静脉注射完成24h后，PBS+808nm组、PBS+808nm+放疗组、纳米药物+808nm组和纳米药物+808nm+放疗组的小鼠肿瘤部位接受808nm(1W/cm²)近红外光照10分钟；中等光热治疗后，PBS+放疗组、PBS+808nm+放疗组、纳米药物+放疗组和纳米药物+808nm+放疗组继续接受放射治疗。然后持续每两天记录小鼠肿瘤大小、小鼠体重至第24天(治疗当天为第0天)以及24天后取出肿瘤拍照并称重，结果如图5a、图5b、图5c、图5d所示，图5a表明纳米药物+808nm+放疗组的肿瘤变小甚至消失了，与其他七组相比，具有显著性差异，说明纳米药物+照射+放疗起到协同作用可以有效的抑制肿瘤的生长；图5b表明在24天，将所有小鼠处死后，取离体肿瘤组织进行称重，纳米药物+808nm+放疗组的肿瘤质量明显小于其他七组，具有显著性差异，表明纳米药物+照射+放疗起到协同作用可以有效的抑制肿瘤的生长；图5c表明经过治疗后，纳米药物+808nm+放疗组小鼠肿瘤体积没有增长趋势，并逐渐减小，其他七组肿瘤体积逐渐增长，在第24天时，纳米药物+808nm+放疗组与其他七组的肿瘤体积具有显著差异，证明纳米药物+808nm+放疗起到协同作用可以有效抑制肿瘤的生长；图5d表明各个治疗组小鼠体重在24天的记录内并无显著差异，证明纳米药物在小鼠治疗中无明显毒副作用。进一步地，如图5e所示，在注射PBS和纳米药物的两组小鼠中，将其继续观察30天后，取其心肝脾肺肾进行HE染色，发现两组之间，心肝脾肺肾大脏器并没有发生损伤，故进一步表明纳米药物在小鼠治疗中无明显毒副作用。

综上所述，本发明将具有临床荧光成像诊断潜能和光热治疗效果的新吲哚菁绿、具有降低癌细胞的耗氧率从而改善肿瘤微环境的乏氧状态的阿托伐醌以及广谱抗癌药物阿霉素进行自组装，阿托伐醌与新吲哚菁绿发生π-π堆积和疏水作用力结合形成稳定的非共价结构，阿霉素通过氢键进入其中，三者组装成稳定的纳米药物，制备得到集化疗增敏、光热增敏以及改善乏氧环境于一体的增强放疗敏感性的纳米药物，所述纳米药物表现出较好的稳定性、水溶性、生物相容性，在近红外光和X射线同时照射处理下，通过改善乏氧和增加局部温度，从而达到放疗增敏下的协同杀伤肿瘤的效果，从而实现高效治疗肿瘤的作用，在发挥疗效之后纳米药物发生降解，避免出现药物毒性。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种自组装纳米药物，其特征在于，所述自组装纳米药物至少包含阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素三种活性药物成分，按质量比计，所述阿托伐醌：新吲哚菁绿：阿霉素＝(10～200)：(5～200)：(1～100)。

2.如权利要求1所述的自组装纳米药物，其特征在于，所述自组装纳米药物的粒径为50nm～100nm。

3.如权利要求1所述的自组装纳米药物，其特征在于，在近红外光波光为700nm～900nm下，所述自组装纳米药物具有吸收度。

4.如权利要求1所述的自组装纳米药物，其特征在于，所述阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素自组装为阿托伐醌-新吲哚菁绿-阿霉素复合物，所述阿托伐醌和新吲哚菁绿通过π-π堆积和疏水作用力形成非共价结构，所述阿霉素通过氢键与所述阿托伐醌结合。

5.一种自组装纳米药物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

步骤S1，将阿托伐醌、新吲哚菁绿、阿霉素分别溶于DMSO中形成含有若干个非共价键的阿托伐醌母液、新吲哚菁绿母液、阿霉素母液；

步骤S2，将步骤S1中的所述阿托伐醌母液、新吲哚菁绿母液、阿霉素母液混合，各个非共价键发生结合反应，搅拌均匀后加入蒸馏水进一步促进结合反应，结合反应结束离心得到反应产物；其中，按体积比计，所述阿托伐醌母液、新吲哚菁绿母液、阿霉素母液＝(10～200)：(5～200)：(1～100)；

步骤S3，将步骤S2中得到的反应产物进行清洗，冻干，旋转蒸发，得到自组装纳米药物。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述阿托伐醌母液、新吲哚菁绿母液、阿霉素母液的浓度为10mg/mL～15mg/mL。

7.一种根据权利要求1～4中任意一项所述自组装纳米药物在制备抗肿瘤靶向纳米药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述自组装纳米药物与近红外光、X射线联合使用，用于制备肿瘤治疗增敏剂。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述自组装纳米药物为注射制剂。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为浅表实体肿瘤。