CN117205152A - 一种药物载体，其制备方法及其在疾病治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能够高效靶向巨噬细胞的药物载体，其制备方法及其在疾病治疗中的应用。该药物载体包括细菌生物囊泡，其内载有药物大分子，其表面修饰有两种靶向元件，即靶向识别肿瘤组织的元件和靶向识别巨噬细胞的元件。在通过物理挤压产生上述细菌生物囊泡的过程中，完成其内部药物大分子的装载和其表面靶向元件的修饰过程，从而提高了药物的装载和递送效率。同时，所述细菌生物囊泡的产率是同等条件下细菌外泌囊泡的百倍以上。由于药物大分子是通过细菌内源产生的，因此选择合适的工程化细菌就能源源不断地表达所需药物。经证明，该药物载体为目前肿瘤的治疗提供了新的选择，可用于治疗包括乳腺癌和结直肠癌在内的恶性肿瘤。

Description

一种药物载体，其制备方法及其在疾病治疗中的应用

技术领域

本发明属于药物载体系统，具体涉及一种纳米级药物载体，其制备方法及其在疾病治疗中的应用。

技术背景

根据细菌的结构、形态和染色特性，可将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌有较厚的富含肽聚糖的细胞壁，而革兰氏阴性菌的膜结构分为内膜和外膜。由于革兰氏阴性菌和阳性菌在结构和生理上的差异，导致其可产生不同类型的细菌胞外囊泡。

细菌胞外囊泡的产生是一个自发的过程，不需要消耗能量。革兰氏阴性菌分泌的细菌胞外囊泡称为细菌外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)。

使用物理挤压的方法得到与细胞外囊泡及细菌来源囊泡相似的生物囊泡，该方法通过使细胞或细菌依次通过孔径逐渐减小的纳米级过滤器，连续挤压分解细胞或细菌，使细胞或细菌被挤压形成更多的纳米级别大小的囊泡，与从相同数量的细胞中产生的细胞外囊泡相比，这种制备方法可得到大约120倍的高产量。

由于细菌外膜囊泡或细菌膜囊体含有细菌外膜上的免疫原性物质，如脂多糖(lipo poly saccharide，LPS)等，在给药过程中容易引起机体的免疫排斥反应，因此，有研究开始使用去掉细菌外膜的细菌原生质体作为递药纳米囊泡的来源，以降低细菌生物囊泡的免疫原性。

肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，肿瘤相关巨噬细胞)大量存在于肿瘤组织中，在肿瘤的发生发展及转移中发挥着重要的作用。在小鼠肿瘤模型中，肿瘤相关巨噬细胞可介导肿瘤微环境的免疫抑制作用、促进血管生成、促进肿瘤细胞增殖和转移、导致肿瘤细胞对放疗、化疗耐药，肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤的发生发展及转移中发挥着重要的作用。研究表明，肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤的发生发展中具有双重作用。

研究显示，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)占肿瘤细胞总数的50％以上，在肿瘤的进展和侵袭中起着重要作用。作为肿瘤发展的双刃剑，所述肿瘤相关巨噬细胞存在两种表型，包括抗肿瘤M1型和促进肿瘤M2型(M2，也即免疫抑制性巨噬细胞)。在肿瘤发展的早期，抗肿瘤M1型的肿瘤相关巨噬细胞发挥作用，即M1型巨噬细胞发挥抑制肿瘤的作用。但在肿瘤的进展过程中，M1型巨噬细胞被“驯化”为促进肿瘤的M2型巨噬细胞，参与肿瘤的发生发展。因此，肿瘤相关巨噬细胞的靶向治疗是肿瘤免疫治疗的一个重要靶点，可成为肿瘤免疫治疗的新策略。

药物生物大分子属于生物制品，包括治疗性蛋白质和治疗性核酸。但在给药途径的选择时，生物大分子由于渗透性差，分子大、易聚集和降解等特点，难以穿透人体天然屏障，如皮肤、胃肠上皮等，且口服给药途径会导致生物药物在胃肠道中被降解等问题，一直是大分子在非侵入性给药途径无法逾越的障碍。另外，有些糖由于分子内氢键等原因难以直接溶于水，需要化学改性才能溶于水。带负电、不带电或难溶于水的特点，限制了大部分生物大分子作为药物的应用。因此，生物大分子作为药物的载体装载效率与递送效率一直是递药系统急需解决的一个问题。

病毒载体因其高效率的基因转染而备受欢迎，但由于脱靶的免疫原性，炎症反应和毒性等原因，与病毒载体相关的安全风险成为阻碍其广泛应用的主要原因。为了克服这一挑战，现有技术提出了非病毒基因转移方法，以改善对巨噬细胞的转染。然而，上述方法往往具有较低的基因转染效率或较高的细胞毒性。此外，基于阳离子脂质和聚合物的非病毒载体也已被研究并证明其在多种细胞中是有效的基因转染载体，但对于巨噬细胞不是有效的基因转染载体。

目前现有技术对于上述问题采取的方法为，首先得到药物递送载体(包括生物囊泡、脂质体等)，再通过电转、共孵育、反复冻融、超声等方式把大分子药物装载到递药载体内。但生物大分子药物(蛋白质、核酸等)由于其分子量较大以及稳定性较差的问题，这些方法的装载效率一直不理想，并且这些方法的装载过程很大可能会破坏递药载体的结构稳定性。且现有技术中使用的生物囊泡为细菌外泌囊泡，细菌外泌囊泡自然产率极低，需要大量的细胞和较长的培养周期，导致高生产成本，进而影响相关临床转化。

如专利“CN115429896A一种肿瘤相关巨噬细胞代谢调节和肿瘤杀伤协同作用的细菌外泌囊泡”中采用来自大肠杆菌BL21(DE3)的靶向识别巨噬细胞的囊泡结构，其通过甘露糖修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(PEG-DSPE)，与巨噬细胞表面的MR结合，靶向识别巨噬细胞。该专利中的囊泡为细菌自然分泌的细菌外膜囊泡(OMV，outer membranevesicle)，即细菌通过外膜突起而形成的纳米级囊泡，先通过超速离心得到细菌外膜囊泡OMV，然后通过电转的方式装载siRNA，最后通过超声的方式修饰靶向元件。上述专利中的所述细菌没有表达生物大分子，而是分离得到囊泡后通过电转的方式装载生物大分子药物。除了自然分泌的细菌外囊泡其数量不多这一缺点外，电转的方式也容易破环囊泡的膜结构，限制了细菌外泌囊泡作为药物载体的临床应用。因此，迫切需要开发一种能够高效靶向巨噬细胞的药物载体系统，从而对巨噬细胞进行高效的转染和/或递送药物。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷，本发明提供一种能够高效靶向巨噬细胞的靶向载体系统。

不同于细菌外泌囊泡，本发明采用细菌生物囊泡，两种囊泡有本质的区别：细菌生物囊泡来源于去除外膜(细胞壁)的细菌原生质体，因此囊泡的膜组成为细菌的内膜。而现有技术中的细菌外泌囊泡为细菌通过外膜突起而形成的纳米级囊泡，其膜组成来源于细菌外膜。由于细菌原生质体外膜的去除，本发明的细菌生物囊泡免疫原性更低，安全性更高。

同时，载体靶向修饰“一体化”的目的，从而实现了对巨噬细胞进行高效的转染和/或递送药物的目的。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第一个发明点为提供一种药物载体。

可选地，所述药物载体包括细菌生物囊泡，位于该细菌生物囊泡表面的靶向元件，以及位于该细菌生物囊泡表面和/或内部的生物成分。

可选地，所述药物载体为纳米级药物载体，所述纳米级药物载体的粒径范围为50-150nm，优选为100-130nm。

可选地，所述靶向元件包括靶向识别免疫细胞的元件和靶向识别肿瘤组织的元件。

可选地，所述靶向识别免疫细胞的元件和所述靶向识别肿瘤组织的元件通过连接元件和所述细菌生物囊泡相连。

可选地，所述连接元件为双链脂质长链化合物，所述双链脂质长链化合物包括但不限于脂酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸，优选为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。

可选地，所述靶向识别免疫细胞的元件为靶向识别巨噬细胞的元件，具体为特异性靶向识别肿瘤M2型巨噬细胞的元件。

可选地，所述特异性靶向识别肿瘤M2型巨噬细胞的元件包括靶向识别巨噬细胞的配基，所述配基包括但不限于抗体类配基、糖基类配基、肽类配基、天然受体表面结合物类配基和小分子化合物类配基，优选为糖基类配基半乳糖胺。

可选地，所述抗体类配基包括但不限于抗体分子配基、抗体片段配基和嵌合抗体配基。

可选地，所述糖基类配基包括但不限于透明质酸、甘露糖和半乳糖，优选为半乳糖胺。

可选地，所述肽类配基包括但不限于肽段M2pep、肽段UNO、结合肽CRV和CD163靶向结合短肽。所述M2pep肽段的氨基酸序列为CYEQDPWGVKWWY，所述肽段UNO的氨基酸序列为CSPGAKVRC、所述结合肽CRV的氨基酸序列为CRVLRSGSC,、所述CD163靶向结合短肽的氨基酸序列为CTHRSSVVC，所述肽段LyP-1的氨基酸序列为CGNKRTRGC。

可选地，所述天然受体表面结合物类配基包括但不限于包括但不限于叶酸和叶酸缀合物，优选为叶酸，其中天然化合物叶酸或叶酸缀合物可与叶酸受体结合。

可选地，为提高所述细菌生物囊泡在肿瘤组织中的积累效率，所述靶向识别肿瘤组织的元件包括任何有助于该细菌生物囊泡在肿瘤组织积累或浸润的基团，所述基团包括但不限于靶向识别肿瘤组织的肽类基团、靶向靶向识别肿瘤组织的抗体类基团、以及其他任意能提高所述药物载体水溶性的化合物类基团。

可选地，所述靶向识别肿瘤组织的肽类基团包括但不限于cRGD、MMP2特异性多肽和白蛋白；其中所述cRGD的氨基酸序列为Arg-Gly-Asp(RGD)，所述MMP2特异性多肽的氨基酸序列为Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln(GPLGIAGQ)。

可选地，所述靶向识别肿瘤组织的抗体类基团包括但不限于抗HER2抗体、抗CD22抗体、抗CEA抗体和抗ErbB2抗体。

可选地，所述能提高药物载体水溶性的化合物类可为聚乙二醇，所述聚乙二醇包括10-500个氧化乙烯单元。

可选地，所述聚乙二醇包括但不限于聚乙二醇2000，聚乙二醇3000，聚乙二醇4000和聚乙二醇8000，优选为聚乙二醇2000。

可选地，所述位于细菌生物囊泡内的生物成分为生物大分子。

可选地，所述生物大分子为细菌内源性表达的生物大分子。

可选地，所述生物大分子包括治疗性蛋白以及治疗性核酸。

可选地，所述治疗性蛋白包括但不限于细胞因子、抗体、多肽和CRISPR-Cas9核酸内切酶，优选为CRISPR-Cas9核酸内切酶。

可选地，所述治疗性核酸包括但不限于mRNA、干扰RNA、微小RNA、反义核酸、DNA序列、质粒和Cas9-gRNA复合物，优选为Cas9-gRNA复合物。

可选地，所述细菌生物囊泡来源于细菌原生质体，所述细菌原生质体来源于革兰氏阴性菌。

可选地，所述革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌、变形杆菌和脆弱拟杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

可选地，所述细菌生物囊泡来源于细菌原生质体，所使用的细菌可表达治疗性生物大分子药物，优选为CRISPR-Cas9系统中的靶向PI3Kγ基因的Cas9-gRNA复合物。该Cas9-gRNA复合物由质粒表达得到，且Cas9-gRNA复合物能与哺乳动物细胞核DNA相应的靶位置相结合并对靶基因进行编辑。

可选地，所述细菌生物囊泡靶向识别的巨噬细胞是免疫抑制型巨噬细胞，即M2型巨噬细胞(TAM2)。而来源于细菌原生质体的所述药物载体，除其内部除装载有质粒表达的生物大分子药物外，还具有细菌本身对M2型巨噬细胞(TAM2)起到免疫激活功能的物质_，从而重编程肿瘤微环境内关键的免疫抑制型巨噬细胞(M2)向抗肿瘤型的巨噬细胞(M1)转换，下调免疫抑制，增加免疫活性，最终活化与增殖导致杀伤性T细胞。

可选地，所述对M2型巨噬细胞有免疫激活功能的物质包括但不限于细菌DNA、RNA和免疫激活蛋白。

本发明的第二个发明点为提供一种上述药物载体的制备方法。

所述制备方法包括:

S1，将细菌原生质体分解为细菌生物囊泡；

S2，将所述生物大分子装载于所述细菌生物囊泡的内部；

S3，用靶向元件修饰所述细菌生物囊泡。

其中，所述步骤S1，所述步骤S2和所述步骤S3不分先后顺序；

可选地，在步骤S3中，所述靶向元件包括靶向识别免疫细胞的元件和靶向识别肿瘤组织的元件；

可选地，所述靶向识别免疫细胞的元件和所述靶向识别肿瘤组织的元件的摩尔比为(1:10)-(10:1)，具体可以为1:1、1:3、1:5、1:8、1:10、5:1、5:3、5:5、5:8、5:10、10:1、10:3、10:5或10:8；优选为1：1。

可选地，在步骤S1中，细菌原生质体为去除细胞壁的大肠杆菌，通过脂质体挤出器将所述去除细胞壁的大肠杆菌制备成为纳米囊泡。

可选地，在物理挤压所述细菌原生质体以形成所述细菌生物囊泡的过程中，将所述生物大分子装载于所述细菌生物囊泡的内部，同时将所述靶向识别免疫细胞的元件和所述靶向识别肿瘤组织的元件装载于所述细菌生物囊泡表面。

可选地，所述靶向识别免疫细胞的元件和所述靶向识别肿瘤组织的元件通过所述连接元件和所述细菌生物囊泡相连。

本发明的第三个发明点为提供上述药物载体在疾病治疗中的应用。

可选地，所述疾病包括肿瘤，所述肿瘤类型包括但不限于乳腺癌、结直肠癌和淋巴瘤。

可选地，所述药物载体的施用方式包括但不限于口服、皮内、腹膜内、肌内、皮下、静脉注射和粘膜表面给药。

可选地，所述药物载体的施用对象为哺乳动物或非哺乳动物，所述哺乳动物选自人、啮齿类动物、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、马、狗、狗和猴子，所述非哺乳动物为鸟类。

可选地，所述药物载体采用尾静脉注射的方式给予合适剂量，所述合适的剂量是能得到所需要的最终治疗效果的有效量。对于不同的疾病，所述有效量是能治疗相应疾病的公认剂量。

本发明具有如下有益效果：

1、现有技术中细菌外泌囊泡OMV自然产率极低，需要大量的细胞和较长的培养周期，导致高生产成本，进而影响相关临床转化。本发明通过物理挤压的方式把微米级细菌原生质体分解为纳米级的囊泡，可获得纳米级的，外观及结构类似于细菌外泌囊泡OMV的细菌生物囊泡，产率是细菌外泌囊泡的120倍以上，成本却大幅降低。因此得到的囊泡数量大大增加，同时能降低成本，在药物递送和再生医学中发挥重要作用。

2、现有技术多是先制备药物递送载体后，再通过电转、共孵育、反复冻融、超声等方式把大分子药物装载到载体内。但生物大分子药物(蛋白质、核酸等)分子量较大以及稳定性较差的问题，这些方法的装载效率一直不理想，并且这些方法的装载过程很大可能会破坏递药载体的结构稳定性。本发明中的生物大分子药物由细菌表达产生，工程化的细菌可作为治疗性生物大分子药物的“生产工厂”源源不断地表达生物分子药物。物理挤压得到载药囊泡的过程，同时完成药物装载和靶向元件修饰，免去制备囊泡后再装载药物和修饰靶向元件的步骤，具有生物分子药物生产、装载和载体修饰“一体化”的特点，真正实现了药物高效装载和靶向递送的目的。

3、免疫抑制微环境是肿瘤治疗的最大障碍之一，而M2极化巨噬细胞(TAM2型巨噬细胞)是免疫抑制的主要原因。本发明采取两个修饰元件，即靶向识别肿瘤相关M2型巨噬细胞的元件二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-半乳糖胺(DSPE-Galactosamine)和靶向识别肿瘤组织的元件二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，通过与M2型巨噬细胞表面的MGL受体结合。不同于上述专利中甘露糖修饰的靶向元件(与表面MR结合)，能更精准的靶向识别肿瘤组织内的TAM2型巨噬细胞，特别是乳腺癌和结直肠癌内的TAM2型巨噬细胞，从而为目前肿瘤的治疗提供了新的选择。

4、本发明提供的细菌生物囊泡靶向识别的巨噬细胞是免疫抑制型巨噬细胞即M2型巨噬细胞(TAM2)，因其来源于细菌，内部除装载质粒表达的大分子药物外，还含有细菌本身所具有的对M2型巨噬细胞有免疫激活功能的物质，包括细菌DNA、RNA和免疫激活蛋白等。因此，除细菌内源性表达的大分子药物有治疗作用外，细菌生物囊泡本身也具有治疗作用，二者加起来可增加治疗效果。从囊泡本身具有治疗作用这点来看，相比于脂质体这一类的载体更有优势。

5、细菌外膜含有多种高免疫原性的物质，如LPS，血溶素ClyA等，细菌外膜囊泡OMV在体内循环的过程容易引起机体免疫反应。而本发明由于细菌原生质体外膜的去除，其来源的囊泡免疫原性低，安全性更高。

附图说明

图1为所述药物载体的制备流程图；

图2a为所述囊泡形貌示意图，图2b为使用纳米颗粒示踪技术(NTA)检测所述囊泡的粒径大小示意图；

图3为所述靶向元件对细菌生物囊泡的修饰效果；

图4为囊泡内CRISPR-Cas9对细胞的基因编辑效率的结果；

图5为所述细菌生物囊泡对巨噬细胞的体外激活效果；

图6为药物载体对小鼠肿瘤的治疗效果；

图7为小鼠体重变化示意图。

具体实施方式

本发明所述细菌原生质体为本领域常见涵义，具体指革兰氏阴性菌去除了细菌外膜以及肽聚糖层，而革兰氏阳性菌去除了外周的肽聚糖层后得到的单层膜的球状体。通常使用溶菌酶消化细菌来得到细菌原生质体。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。

为了进一步了解本发明，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

1、本发明涉及的英文对应的中文含义

2、试剂和材料的来源

3、靶向元件的合成过程

二硬脂酰磷脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)的合成过程如下：

(1)称取0.445g草氨酸溶于30mL纯水，加入2.5mL 10％水合肼，室温搅拌反应过夜，减压旋蒸去除溶剂即得草酰肼。(产率：91％)

(2)称取2g mPEG2000-OH溶于10mL二氯甲烷中，加入2mL对羧基苯甲醛(1.2eq)、DCC(2.0eq.)和DMAP(0.1eq.)的DMF溶液，室温下反应24h，减压旋蒸去除溶剂，加入20mL纯水溶解，过滤除去不溶物，收集滤液，二氯甲烷萃取3次，每次5mL，合并滤液。减压浓缩后，浓缩液倒入大量冰乙醚中沉淀产物，过滤收集产物，真空干燥即得mPEG2000-Ph-CHO。(产率：90％)

(3)称取1g mPEG2000-Ph-CHO溶于10mL乙醇中，加入草酰肼(2.0eq.)溶解完全，回流反应6h，减压旋蒸去除溶剂，加入10mL纯水溶解，二氯甲烷萃取3次，每次5mL，合并滤液。减压浓缩后，浓缩液倒入大量冰乙醚中沉淀产物，过滤收集产物，真空干燥即得mPEG2000-hyd-COOH。(产率：90％)

(4)称取0.2g mPEG2000-hyd-COOH溶于5mL DMF中，加入2ml DSPE(1.0eq)、EDC(2.0eq.)和DMAP(0.1eq.)的氯仿溶液，40℃下反应12h，减压浓缩反应液，倒入大量冰乙醚中产生沉淀，过滤收集产物，真空干燥即得mPEG2000-hyd-DSPE。(产率：92％)

二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-半乳糖胺(DSPE-galactosamine)的合成过程如下：

称取0.2g DSPE-NHS溶于10mL氯仿中，加入5mL氨基半乳糖(2.0eq.)的DMSO溶液于三乙胺(2.0eq.)溶解完全，室温下反应6h后，将反应液转移至透析袋(截留分子量500)，于纯水中透析24h，收集透析液，冷冻干燥即得DSPE-Galactose产物。经检测，DSPE-Galactose产物的产率为90％。

实施例1

本实施例提供所述药物载体，该药物载体包括用于递送治疗性生物大分子的细菌生物囊泡，位于所述细菌生物囊泡表面的两种靶向元件以及包裹在所述细菌生物囊泡内的生物成分。

所述靶向元件包括两种靶向元件：即靶向识别肿瘤组织的元件和靶向识别巨噬细胞的元件。上述两种靶向元件通过所述连接元件连接所述细菌生物囊泡。所述连接元件为双链脂质长链，所述双链脂质长链包括但不限于：脂酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸，优选为脂酰磷脂酰乙醇胺(PE)。所述包裹在囊泡内的生物成分为细菌内源性表达的治疗性生物大分子。

所述肿瘤部位靶向基团包括但不限于：靶向肽、靶向蛋白、提高囊泡水溶性的化合物，优选为提高囊泡水溶性的化合物聚乙二醇2000(PEG2000)。所述巨噬细胞靶向基团包括但不限于：抗体、糖基、靶向肽、化合物等，优选为糖基半乳糖胺。

所述细菌生物囊泡来源于细菌原生质体，所使用的细菌可表达治疗性生物大分子药物，优选为CRISPR-Cas9系统中的靶向PI3Kγ基因的Cas9-gRNA复合物，该核酸蛋白复合物由质粒表达得到，且Cas9-gRNA复合物能与哺乳动物细胞核DNA相应的靶位置相结合并对靶基因进行编辑。

所述细菌内源性表达的治疗性大分子包括但不限于CRISPR，细胞因子，治疗性抗体，多肽，mRNA，干扰RNA，微小RNA，反义核酸、DNA序列、表达治疗性大分子药物的质粒，优选为CRISPR-Cas9系统中的Cas9-gRNA复合物，该核酸蛋白复合物由质粒表达得到，且Cas9-gRNA复合物能与哺乳动物细胞核DNA相应的靶位置相结合并对靶基因进行编辑。所述Cas9-gRNA复合物具体为表达靶向PI3Kγ基因的Cas9-gRNA复合物。

对于靶向蛋白，本发明选择巨噬细胞中的PI-3激酶γ(PI-3kinase gamma，PI3Kγ)，因为PI3Kγ基因在肿瘤微环境中维持肿瘤相关巨噬细胞的免疫抑制状态中起到非常重要的作用，巨噬细胞的PI3Kγ信号通过抑制抗肿瘤T细胞的激活促进免疫抑制。阻断PI3Kγ激活了免疫响应，显著抑制了移植瘤的生长。同时，阻断PI3Kγ还提高了肿瘤对已有抗癌药物的敏感性，协同增强了现有癌症免疫疗法的根除肿瘤的能力。临床研究表明，靶向PI3Kγ的抑制剂能够重编程肿瘤微环境内关键的免疫抑制型巨噬细胞(M2)向抗肿瘤巨噬细胞(M1)转换，下调免疫抑制，增加免疫活性，最终导致杀伤性T细胞的活化与增殖。而在小鼠动物模型中，阻断肿瘤相关巨噬细胞中的PI3Kγ能够刺激免疫反应，抑制肿瘤细胞的侵袭、转移和胰腺导管腺癌(PDAC)导致的纤维化瘢痕。

本发明所述的细菌生物囊泡的制备过程如下：

1、选择大肠杆菌BL21(DE3)菌株：该菌株是最常用的大肠杆菌表达菌株之一，是以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。

2、去除大肠杆菌BL21(DE3)的细胞壁，并将其转染可原核表达Cas9-gRNA复合物的质粒。在大肠杆菌BL21(DE3)菌株扩增时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其表达Cas9-gRNA复合物，具体为表达靶向PI3Kγ基因的Cas9-gRNA复合物，把大肠杆菌制备成原生质体后使用脂质体挤出器制备纳米囊泡。

3、在诱导大肠杆菌表达相关蛋白时，用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导,但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达。

4、利用CRISPR/Cas9系统可以有效靶向DNA序列，依据Science 339:819-23(2013)Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system构建该载体系统。

所述药物载体在疾病治疗，具体为乳腺癌和结直肠癌肿瘤治疗中的应用过程包括：

1、于每只BALB/c小鼠的腋下注射1×10⁶个4T1小鼠乳腺癌细胞，建立小鼠乳腺癌模型。于BALB/c小鼠腋下注射1×10⁶个CT26细胞，建立小鼠结直肠癌模型。

BALB/c小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

4T1小鼠乳腺癌细胞是从410.4瘤株中未经诱变筛得的6-硫鸟嘌呤抗性细胞株，常用作乳腺癌远端转移的研究模型及临床药物筛选使用最多的乳腺癌模型。

CT26细胞是小鼠大肠癌细胞，是以N-亚硝基-N-甲基氨基甲酸酯(NNMU)诱导形成的未分化结肠癌细胞株，克隆形成的细胞株命名为CT26.WT。

2、在植瘤后小鼠肿瘤直径达4-5mm开始尾静脉给药，每2天一次，对肿瘤进行治疗。

3、在肿瘤直径达1.5cm时处死小鼠，治疗结束时观察小鼠肿瘤直径大小。

利用本发明的药物载体能实现上述新的Cas9-gRNA复合物的给药方式，即通过细菌表达Cas9-gRNA复合物，随后把细菌通过物理挤压的方式制备成纳米级囊泡，并在囊泡制备过程中修饰有助于囊泡在肿瘤组织富集的元件和使囊泡靶向巨噬细胞的元件。囊泡能在尾静脉注射后在肿瘤部位积累并进一步被巨噬细胞吞噬，囊泡内的Cas9-gRNA可对巨噬细胞基因进行编辑，使肿瘤相关巨噬细胞从免疫抑制型的M2型转变为抗肿瘤的M1型，从而起到肿瘤治疗的效果。更重要的是，细菌生物囊泡内本身包含免疫原性物质，如细菌DNA、RNA等，能刺激巨噬细胞的极化。本发明使用的细菌生物囊泡对Cas9-gRNA这一核酸蛋白药物在体内循环过程中具有保护作用。

实施例2

本实施例提供所述细菌生物囊泡的制备过程。

1、将转染了可原核表达Cas9-gRNA复合物的质粒的大肠杆菌BL21(DE3)培养于200mL的液体LB培养基中，培养条件为37℃，200rpm，其中液体LB培养基根据《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著)配制。

2、当培养至OD600＝0.6后，加入IPTG至浓度为1mM，使质粒BPK764(自Addgene公司取得)表达Cas9-gRNA复合物，即spCas9以及sgRNA。摇床温度调为25℃，继续过夜培养。

3、大肠杆菌BL21(DE3)用Tri-HCl(50mM，pH 8.0)清洗2遍。

4、清洗完成后，使用含有20％蔗糖的Tris-HCl(50mM，pH 8.0)重悬细菌，摇晃离心管的同时缓慢加入0.4vol的0.25M EDTA(pH8.0)，接着缓慢加入0.2vol，5mg/mL溶菌酶，完成后置于37℃，80rpm孵育35min。孵育结束后，7500×g离心20min，弃上清，使用含有20％蔗糖的Tris-HCl(50mM，pH 8.0)清洗三遍，得到去掉细菌外膜的原生质体。

5、向原生质体加入摩尔比为1：1的肿瘤组织靶向的DSPE-hyd-PEG2000和巨噬细胞靶向的DSPE-galactosamine，使用脂质体挤出器把原生质体制备成为纳米囊泡，通过物理挤压，使原生质体接连通过孔径为5μm，1μm，0.4μm的聚碳酸酯膜。

过膜后使用密度梯度离心对纳米囊泡进行纯化(离心液成分：50％和10％碘克沙醇溶液，离心条件：100000×g，2.5h，4℃)，纳米囊泡聚于离心液中间层。

吸取中间层，进一步离心，120000×g，2h，4℃。弃上清，得到纳米级细菌生物囊泡，粒径大小为124.2±3.3nm。

每个细菌生物囊泡内包含6.26×10³个Cas9蛋白分子以及5.43×10⁴个sgRNA。将所得囊泡置于-80℃备用。

实验结果参见图2-a：囊泡呈圆形，具有完整的膜结构。与未进行元件修饰的囊泡相比，DSPE-hyd-PEG2000和DSPE-galactosamine的双修饰并未破坏囊泡的形状以及完整性。

使用纳米颗粒示踪技术(NTA)检测NVs的粒径大小，结果参见图2-b。

结果显示：纳米囊泡的粒径大小约为120nm，DSPE-hyd-PEG2000和DSPE-galactosamine的修饰并未显著改变囊泡的粒径大小。

如图3所示，使用荧光标记的元件对囊泡经行修饰，流式细胞术检测囊泡的荧光情况。结果显示，可检测到囊泡上带有元件标记的荧光，说明物理挤压的方法可成功对囊泡进行靶向性修饰。

实施例3

本实施例展示细菌生物囊泡的体外治疗效果：

1、从为通利华公司获得10只6周龄、体重14-18g的正常雌性C57BL6/J小鼠。以每笼5只圈养，把小鼠安置在南京大学的动物中心。并在进入研究前适应环境至少三天。动物室设置为每小时保持最少12至15次换气，自动计时器开启/关闭12小时的明/暗循环，给小鼠饮用正常无菌水。

2、小鼠脱颈处死后浸泡于装有75％酒精的烧杯内，约5分钟。取小鼠的大腿骨和小腿胫骨，把骨头表面的组织剥除干净，骨头浸泡于PBS，并转移至超净工作台。小鼠腿骨先后用75％酒精和PBS各浸泡5min，重复三次。剪去骨头两端，暴露中间骨髓，在70μm筛网中使用DMEM培养液冲洗骨腔，直至骨头透明发白，得到小鼠骨髓细胞。红细胞裂解液重悬骨髓细胞，冰上裂解5min。

3、最后用含10％FBS、20ng/mL M-CSF、1％双抗的DMEM重悬细胞，以1×10⁶个/ml的细胞密度接种于细胞培养皿中，5％ CO₂37℃培养7天得到骨髓源性巨噬细胞(BMDM)，第8天吸走所有培养液，加入含有40ng/mL IL-4的DMEM完全培养液，刺激48h，得到M2型骨髓源性巨噬细胞。

4、将7.5×10⁹个可表达靶向PI3Kγ基因的Cas9-sgRNA复合物的细菌生物囊泡与1.5×10⁵个BMDM共孵育48小时后，使用细胞基因组DNA提取试剂盒提取细胞DNA，使用T7核酸内切酶1(T7E1)检测囊泡内的CRISPR-Cas9系统对基因的编辑效率。

实验结果参见图4和图5。

如图4所示，通过T7E1处理可观察到待测DNA条带的断裂，说明囊泡中的Cas9-sgRNA复合体对BMDM细胞的PI3Kγ基因进行了切割，并且通过计算得到编辑效率为28.5％。

如图5流式细胞术结果可得，M2型BMDM与囊泡孵育后，巨噬细胞的M1型标志物CD86的表达明显上升，而M2型标志物CD206的表达显著下降。

实施例4

本实施例提供一种携载生物大分子药物的纳米载药系统应用于肿瘤治疗的动物实验效果：

1、从北京维通利华实验动物技术有限公司获得30只8周龄、体重18-20g的正常雌性BALB/c小鼠。将小鼠随机分成6组(每组5只动物)，并以每笼5只圈养，把小鼠养殖在南京大学模式动物研究所。

2、在进入研究前适应环境至少三天。动物室设置为每小时保持最少12次换气，最多15次换气，自动计时器开启/关闭12小时的明/暗循环，给小鼠饮用正常无菌水。

3、每只小鼠背部右下方，接近右后腿侧注射100μL小鼠乳腺癌细胞4T1细胞，数量为1×10⁶个，构建荷瘤小鼠模型。4T1小鼠乳腺癌细胞是从410.4瘤株中未经诱变筛得的6-硫鸟嘌呤抗性细胞株，常用作乳腺癌远端转移的研究模型及临床药物筛选使用最多的乳腺癌模型。

4、若为小鼠结直肠癌细胞CT26，则使用BALB/c小鼠。小鼠饲养在SPF级环境中，每日观察肿瘤生长情况。待肿瘤直径达4-5mm时，将小鼠随机分为6组，开始尾静脉给药治疗。每两天尾静脉注射1×10¹⁰个细菌生物囊泡，每次给药注射前测量瘤径并称取小鼠体重。CT26细胞是小鼠大肠癌细胞，是以N-亚硝基-N-甲基氨基甲酸酯(NNMU)诱导形成的未分化结肠癌细胞株。

5、观察细菌生物囊泡对于乳腺癌肿瘤或结直肠癌肿瘤的治疗效果：直至肿瘤直径大于1.5cm，处死小鼠，收取样品作后续的实验分析。整个实验过程严格按照动物伦理的指导。肿瘤体积计算公式为：V＝(L×W²)/2。

6、结果参见图6和图7：有效治疗组小鼠肿瘤瘤径增长缓慢，表明本发明的细菌生物囊泡对小鼠乳腺癌及结直肠癌具有治疗作用。小鼠体重在治疗过程中无明显降低，说明细菌生物囊泡对小鼠无明显毒副作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种药物载体，其特征在于，所述药物载体包括细菌生物囊泡，位于该细菌生物囊泡表面的靶向元件，以及位于该细菌生物囊泡表面和/或内部的生物成分。

2.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于，所述药物载体为纳米级药物载体，所述纳米级药物载体的粒径范围为50-150nm。

3.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于，所述靶向元件包括靶向识别免疫细胞的元件和靶向识别肿瘤组织的元件，所述靶向识别免疫细胞的元件和所述靶向识别肿瘤组织的元件通过连接元件和所述细菌生物囊泡相连。

4.根据权利要求3所述的药物载体，其特征在于，所述连接元件为双链脂质长链化合物，所述双链脂质长链化合物包括但不限于脂酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸。

5.根据权利要求3所述的药物载体，其特征在于，所述靶向识别免疫细胞的元件为靶向识别巨噬细胞的元件，所述靶向识别巨噬细胞的元件包括但不限于抗体类配基、糖基类配基、肽类配基、天然受体表面结合物类配基和小分子化合物类配基。

6.根据权利要求5所述的药物载体，其特征在于，所述抗体类配基包括但不限于抗体分子配基、抗体片段配基和嵌合抗体配基，所述糖基类配基包括但不限于透明质酸、甘露糖和半乳糖。

7.根据权利要求5所述的药物载体，其特征在于，所述肽类配基包括但不限于肽段M2pep、肽段UNO、结合肽CRV、靶向结合CD163的短肽和肽段LyP-1；

所述肽段M2pep的氨基酸序列为CYEQDPWGVKWWY；

所述肽段UNO的氨基酸序列为CSPGAKVRC；

所述结合肽CRV的氨基酸序列为CRVLRSGSC；

所述靶向结合CD163短肽的氨基酸序列为CTHRSSVVC；

所述肽段LyP-1的氨基酸序列为CGNKRTRGC。

8.根据权利要求5所述的药物载体，其特征在于，所述天然受体表面结合物类配基为可与叶酸受体结合的配基，包括但不限于叶酸和叶酸缀合物。

9.根据权利要求3所述的药物载体，其特征在于，所述靶向识别肿瘤组织的元件包括但不限于靶向识别肿瘤组织的肽类基团、靶向识别肿瘤组织的抗体类基团、以及能提高所述药物载体水溶性的化合物。

10.根据权利要求9所述的药物载体，其特征在于，所述靶向识别肿瘤组织的肽类基团包括但不限于cRGD、MMP2特异性多肽和白蛋白；

所述cRGD的氨基酸序列为Arg-Gly-Asp；

所述MMP2特异性多肽的氨基酸序列为Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln。

11.根据权利要求9所述的药物载体，其特征在于，所述能提高药物载体水溶性的化合物类可为聚乙二醇，所述聚乙二醇包括10-500个氧化乙烯单元。

12.根据权利要求9所述的药物载体，其特征在于，所述靶向识别肿瘤组织的抗体类基团包括但不限于抗HER2抗体、抗CD22抗体、抗CEA抗体和抗ErbB2抗体。

13.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于，所述生物成分为生物大分子，所述生物大分子被装载于所述细菌生物囊泡的表面和/或内部；

所述生物大分子包括治疗性蛋白和治疗性核酸；

所述治疗性蛋白包括但不限于细胞因子、抗体、多肽和CRISPR-Cas9核酸内切酶；

所述治疗性核酸包括但不限于mRNA、干扰RNA、微小RNA、反义核酸、DNA序列、质粒和Cas9-gRNA复合物。

14.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于，所述细菌生物囊泡来源于细菌原生质体，所述细菌原生质体来源于革兰氏阴性菌；所述革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌、变形杆菌和脆弱拟杆菌。

15.一种如权利要求1-14中任一项所述的药物载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

S1，将细菌原生质体分解为细菌生物囊泡；

S2，将所述生物大分子装载于所述细菌生物囊泡的内部；

S3，用靶向元件修饰所述细菌生物囊泡。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，步骤S1，S2和S3不分先后顺序；在步骤S3中，所述靶向元件包括靶向识别免疫细胞的元件和靶向识别肿瘤组织的元件；所述靶向识别免疫细胞的元件和所述靶向识别肿瘤组织的元件的摩尔比为(1:10)-(10:1)_。

17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，细菌原生质体为去除细胞壁的大肠杆菌，通过脂质体挤出器将所述去除细胞壁的大肠杆菌制备成为纳米囊泡。

18.一种如权利要求1-14中任一项所述的药物载体或如权利要求15-17中任一项所述的制备方法得到的药物载体在疾病治疗中的应用，其特征在于，所述疾病包括肿瘤，所述肿瘤类型包括但不限于乳腺癌、结直肠癌和淋巴瘤。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述药物载体的施用方式包括但不限于口服、皮内、腹膜内、肌内、皮下、静脉注射和粘膜表面给药，所述药物载体的施用对象为哺乳动物或非哺乳动物，所述哺乳动物选自人、啮齿类动物、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、马、狗、狗和猴子，所述非哺乳动物为鸟类。