CN117192114A - 基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒及方法，其属于微生物检测技术领域，该金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒包括磁珠、裂解酶LysGH15突变体以及融合EGFP的荧光蛋白54AE；所述裂解酶LysGH15突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述荧光蛋白54AE的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明通过将噬菌体裂解酶LysGH15突变体包被在磁珠上对目标菌株进行捕获，随后用构建的荧光蛋白54AE对其进行标记，通过荧光强度下降率，建立起一种对样品中金黄色葡萄球菌进行定量检测的方法。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体是一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒及方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是一种革兰氏阳性菌，直径约为1μm，在显微镜下排列成葡萄串状，无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。该菌是常见的食源性致病菌，对环境的适应性强，广泛存在于人和动物的皮肤、皮脂腺和粘膜等部位，还存在于健康个体的鼻腔和肠道，引发各种感染。近年来，随着抗生素的发现和大规模的生产，耐药性金黄色葡萄球菌的出现给人类的健康和畜牧业造成了巨大威胁。
然而，S.aureus传统检测方法存在步骤多、操作繁琐、耗时长等缺点，故需要进行改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒，包括磁珠、裂解酶LysGH15突变体以及融合EGFP的荧光蛋白54AE；所述裂解酶LysGH15突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述荧光蛋白54AE的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述磁珠为Ni-NTA磁珠。
优选地，所述荧光蛋白54AE的制备方法包括以下步骤：
以含有裂解酶LysGH15突变体基因的重组质粒为模板，使用裂解酶LysGH15突变体的上下游引物进行PCR扩增，得到第一PCR扩增产物；
以含有EGFP基因的重组质粒为模板，使用EGFP的上下游引物进行PCR扩增，得到第二PCR扩增产物；
以所述第一PCR扩增产物和第二PCR扩增产物为模板，使用荧光蛋白54AE的上下游引物进行PCR扩增，得到54AE基因；
将所述54AE基因与线性化的质粒载体进行重组后，再转化至克隆菌株中，得到表达菌株；
对所述表达菌株进行诱导表达后，再经纯化处理，得到所述荧光蛋白54AE。
优选地，所述裂解酶LysGH15突变体的上下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:3-4所示。
优选地，所述EGFP的上下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5-6所示。
优选地，所述荧光蛋白54AE的上下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7-8所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其采用上述的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒进行检测，具体包括以下步骤：
将裂解酶LysGH15突变体包被在磁珠上，得到包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠；
将待检测样品与包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠进行混匀，并经孵育反应后，再加入荧光蛋白54AE进行荧光检测。
优选地，孵育反应的温度为37℃，时间为20-25min。
优选地，将裂解酶LysGH15突变体包被在磁珠上，得到包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠的步骤，具体包括：
将磁珠与含有裂解酶LysGH15突变体的蛋白溶液进行混合偶联后，再用BSA封闭残余位点，得到包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠。
优选地，当所述磁珠为Ni-NTA磁珠时，每60μL的磁珠所包被的裂解酶LysGH15突变体的总量为30-70μg。
本发明提供的基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒，是利用“双抗夹心”原理标记金黄色葡萄球菌，具有速度快、操作简单、特异性强等优势，避免了潜在细菌的干扰。该方法可作为食品安全等相关领域快速、灵敏、实时检测金黄色葡萄球菌的候选策略或候选方案。具体的，本发明通过构建融合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的荧光蛋白54AE，将噬菌体裂解酶LysGH15突变体包被在磁珠上对目标菌株进行捕获，随后用荧光蛋白54AE对其进行标记，通过荧光强度下降率，建立起一种对样品中金黄色葡萄球菌进行定量检测的方法。
附图说明
图1是本发明实施例中54AE基因扩增的结果图；
图2是本发明实施例中54AE蛋白表达纯化的结果图；
图3是本发明实施例中优化Ni-NTA磁珠使用量的结果图；
图4是本发明实施例中优化LysGH15-54A包被磁珠包被量的结果图；
图5是本发明实施例中优化LysGH15-54A-MBs免疫捕获时间的结果图；
图6是本发明实施例中金黄色葡萄球菌荧光检测方法敏感性检测的结果图；
图7是本发明实施例中金黄色葡萄球菌荧光检测方法特异性检测的结果图；
图8是本发明实施例中金黄色葡萄球菌荧光检测方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
噬菌体裂解酶是噬菌体基因组编码的作用于细菌细胞壁肽聚糖的一类水解酶，通常有由一个或多个N端催化结构域和一个C端细胞壁结合结构域(CBD)组成的模块化结构，该结构将裂解酶通过配体的非共价结合连接到宿主细菌细胞壁表面的配体上。有报道表明，单个细菌细胞表面有约107个结合位点。亲和力高，结合能力强，是特异性识别细菌的理想元件。
免疫磁珠技术在细菌捕获过程中利用特异性抗体与目标细菌上抗原的相互作用，实现了高度的特异性。免疫磁珠具有高度活化的表面积，在样品中易于分散，并能快速实现与目标细菌之间相互作用，从而节省分析时间并简化样品处理程序。这种方法快速、高效、操作简便，适用于复杂样本的检测。
本发明实施例构建了裂解酶LysGH15突变体和融合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的荧光蛋白54AE。将噬菌体裂解酶LysGH15突变体包被在磁珠上对目标菌株进行捕获，随后用荧光蛋白54AE对其进行标记，通过荧光强度下降率，如下公式，建立起一种对样品中金黄色葡萄球菌进行定量检测的方法。荧光强度下降率＝(阴性对照荧光信号值-样品荧光信号值)/阴性对照荧光信号值。具体的方案如下：
在本发明的一个实施例中，提供了一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒，包括磁珠、裂解酶LysGH15突变体(LysGH15-54A)以及融合EGFP的荧光蛋白54AE；上述裂解酶LysGH15突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，具体为：MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSENLYFQGMAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRIKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYQQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKKSASKTPAPKKKATLKVSKNHINYTMDKRGKKPEGMVIHNDAGRSSGQQYENSLANAGYARYANGIAHYYGSEGYVWEAIDAKNQIAWHTGDGTGANSGNFRFAGIEVCQSMSASDAQFLKNEQAVFQFTAEKFKEWGLTPNRKTVRLHMEFVPTACPHRSMVLHTGFNPVTQGRPSQAIMNKLKDYFIKQIKNYMDKGTSSSTVVKDGKTSSASTPATRPVTGSWKKNQYGTWYKPENATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATIVYDEVCIQAGHIWIGYNAYNGDRVYCPVRTCQGVPPNHIPGVAWGVFK*；上述荧光蛋白54AE的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:2所示，具体为：MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSENLYFQGMAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRIKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYQQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKKSASKTPAPKKKATLKVSKNHINYTMDKRGKKPEGMVIHNDAGRSSGQQYENSLANAGYARYANGIAHYYGSEGYVWEAIDAKNQIAWHTGDGTGANSGNFRFAGIEVCQSMSASDAQFLKNEQAVFQFTAEKFKEWGLTPNRKTVRLHMEFVPTACPHRSMVLHTGFNPVTQGRPSQAIMNKLKDYFIKQIKNYMDKGTSSSTVVKDGKTSSASTPATRPVTGSWKKNQYGTWYKPENATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATIVYDEVCIQAGHIWIGYNAYNGDRVYCPVRTCQGVPPNHIPGVAWGVFKGGGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*。
其中，裂解酶LysGH15突变体命名为LysGH15-54A，其表达与纯化可以采用常规技术，依据如序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸进行设计即可。
在本发明的一个优选实施例中，上述磁珠为市售的Ni-NTA磁珠，但不限于此。
在本发明的一个优选实施例中，上述荧光蛋白54AE的制备方法包括以下步骤：
S1、以含有裂解酶LysGH15突变体基因的重组质粒为模板，使用裂解酶LysGH15突变体的上下游引物进行PCR扩增，得到第一PCR扩增产物；
S2、以含有EGFP基因的重组质粒为模板，使用EGFP的上下游引物进行PCR扩增，得到第二PCR扩增产物；
S3、以上述第一PCR扩增产物和第二PCR扩增产物为模板，使用荧光蛋白54AE的上下游引物进行PCR扩增，得到54AE基因；
S4、将上述54AE基因与线性化的质粒载体进行重组后，再转化至克隆菌株中，得到表达菌株；
S5、对上述表达菌株进行诱导表达后，再经纯化处理，得到上述荧光蛋白54AE。
在本发明的一个优选实施例中，上述裂解酶LysGH15突变体的上下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3-4所示，具体如表1所示。
在本发明的一个优选实施例中，上述EGFP的上下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5-6所示，具体如表1所示。
在本发明的一个优选实施例中，上述荧光蛋白54AE的上下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7-8所示，具体如表1所示。
表1
在本发明的另一实施例中，还提供了一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其采用上述的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒进行检测，具体包括以下步骤：
S1、将裂解酶LysGH15突变体包被在磁珠上，得到包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠；
S2、将待检测样品与包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠进行混匀，并经孵育反应后，再加入荧光蛋白54AE进行荧光检测。
在本发明的一个优选实施例中，孵育反应的温度为37℃，时间为20-25min。
在本发明的一个优选实施例中，将裂解酶LysGH15突变体包被在磁珠上，得到包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠的步骤，具体包括：
S11、将磁珠与含有裂解酶LysGH15突变体的蛋白溶液进行混合偶联后，再用BSA封闭残余位点，得到包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠。
在本发明的一个优选实施例中，当所述磁珠为Ni-NTA磁珠时，每60μL的磁珠所包被的裂解酶LysGH15突变体的总量为30-70μg。需要说明的是，采用不同的磁珠以及不同浓度的蛋白溶液，可以根据实际情况对二者的比例进行调整。
下述实施例为本发明在实际应用中的部分具体实施案例，但不局限于此。
实施例1：该实施例提供了一种荧光蛋白54AE的构建及纯化表达方法，具体包括以下步骤：
S1、使用无缝克隆法构建pGEX-4T-1-54AE融合基因，具体操作如下：共经历三轮PCR；首先，以pET-15b-LysGH15-54A质粒(pET-15b与LysGH15-54A基因重组的质粒)为模板，使用LysGH15-54A的上下游引物(如上表1所示)扩增LysGH15-54A基因；以pET-28a-EGFP质粒(pET-28a与EGFP基因重组的质粒)为模板，使用EGFP的上下游引物(如上表1所示)扩增EGFP基因；将扩增的基因产物使用DNA产物胶回收试剂盒回收；接着，将前两轮的PCR产物作为第三轮PCR的模板，使用54AE的上下游引物(如上表1所示)扩增54AE基因，并使用DNA产物胶回收试剂盒回收。上述前两轮的PCR反应体系如表2所示，第三轮的PCR反应体系如表3所示，上述三轮的PCR反应程序如表4所示。
表2
表3
表4
S2、将pGEX-4T-1质粒用限制性内切酶QuickCutTM BamH I、Xho I酶在37℃条件下，双酶切1小时，核酸电泳鉴定酶切产物，使用普通DNA产物回收试剂盒回收酶切产物并用ddH2O洗脱后测定浓度，-20℃保存。双酶切反应体系见表5：
表5
S3、根据下表6的连接体系使用市售的无缝克隆试剂盒，将54AE基因、线性化的pGEX-4T-1载体以及2×Seamless Cloning Mix混合后在50℃下孵育15分钟，再采用热激法转化至克隆菌株DH5α感受态中。然后将菌液全部涂布在含有终浓度为1％的氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中，180r/min，37℃恒温培养箱培养12h。
表5
另外，上述54AE基因扩增的结果如图1所示；图1中M表示Marker，1表示LysGH15-54A基因扩增，2表示EGFP基因扩增，3表示54AE基因扩增，4为54AE质粒双酶切验证。
S4、在过夜培养后的氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上挑取阳性克隆于高压灭菌的5mLLB培养基中，并加入5μL氨苄青霉素，置于37℃(180r/min)恒温培养箱中过夜培养。取1mL菌液送至生工生物工程有限公司长春测序部测序，测序结果用DNAman软件进行序列比对分析，比对正确的菌液用质粒DNA小提试剂盒(生工)进行质粒的提取，然后将质粒转化至BL21感受态细胞中。构建成功的克隆菌株和表达菌株用30％的甘油保存至-80℃冰箱中。
S5、表达：将构建好的表达菌株接种于LB培养基中，37℃培养至对数生长期(OD600＝0.6)。待菌液在冰水混合物中冷却后向其中加入IPTG(终浓度为0.5mM)，置于16℃摇床低温诱导约16h。将诱导好的菌液收集至心管中，4℃8000g离心10min，弃上清，收集沉淀，用适量的Tris-HCl(pH＝8.0)重悬沉淀。随后进行超声破碎，4℃，13500g离心10min后取上清。
纯化：取2mL已混匀的GST琼脂糖凝胶填料于12mL亲和层析空柱中，向填料中加入10mL已预冷的Tris-HCl平衡层析柱。将超声破碎后的裂解液上清用0.45μm滤器过滤后转移到装有琼脂糖凝胶填料的亲和层析柱中，4℃孵育过夜。松开亲和层析柱下面的盖子，在重力作用下柱子内的液体流出，取40μL流穿液用于SDS-PAGE分析。加入已预冷的Tris-HCl缓冲液洗涤以除去杂蛋白，得到荧光蛋白54AE。
标签切除：按每10μg的GST标签蛋白加入1μg的TEV蛋白酶的比例加入蛋白酶，4℃孵育过夜。松开亲和层析柱下面的盖子，收集流出液，此时流出液中仅包含切除标签后的目的蛋白和TEV酶。再将流出液加入预先用Tris-HCl平衡好的Ni-NTA亲和层析中结合30min，除去蛋白溶液中的TEV酶。
蛋白浓度测定：用Bradford蛋白浓度测定试剂盒对浓缩后蛋白进行浓度测定，具体操作步骤可见说明书。使用Tris-NaCl(pH＝7.5)缓冲溶液将蛋白稀释到合适储存浓度后置于液氮罐中速冻，立即储存于-80℃备用。
另外说明，上述54AE蛋白表达纯化的结果如图2所示；图2，中M表示Marker，1表示诱导前全菌，2表示诱导后全菌，3表示流穿峰，4为酶切后。
实施例2：该实施例提供了一种LysGH15-54A包被磁珠的制备方法，其包括以下步骤：
S1、吸取60μL的市售Ni-NTA磁珠于1.5mL离心管中，加入800μL平衡缓冲液，洗涤2次，每次洗涤10s；
S2、弃上清，加入40μL平衡缓冲液重悬磁珠，同时加入30μL含有LysGH15-54A的蛋白溶液(浓度为1mg/mL)，混合后至旋转混合仪上混合偶联30min；
S3、将离心管放磁力架上，弃上清，并用平衡缓冲液洗涤2次。然后用800μL的2％的BSA封闭偶联产物的残余位点，旋转混合30min后用磷酸缓冲液洗涤2次，得到LysGH15-54A包被磁珠(命名为LysGH15-54A-MBs)。
实施例3：如图8所示，该实施例提供了一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其包括以下步骤：
将金黄色葡萄球菌USA300用BHI培养基(将3.85g的BHI粉末溶解于100mL蒸馏水中)培养，在37℃，180r/min的条件下培养至OD600＝0.6。用磷酸缓冲液洗涤3次后调至适当浓度。吸取1mL调好的菌液于高压灭菌后的离心管中，取60μL上述偶联后的LysGH15-54A-MBs与其混匀，置于旋转混合仪上，37℃条件下孵育反应25min。磷酸盐缓冲液为阴性对照。反应结束后，将离心管置于磁力架上，弃上清后向得到的贴壁沉淀中加入300μL上述得到得到荧光蛋白54AE(蛋白量为200μg)，轻轻地吹打混匀，然后置于旋转混合仪上37℃孵育15min。最后用荧光分光光度计检测上清的荧光信号值。
实施例4：该实施例提供了一种Ni-NTA磁珠使用量的优化方法，具体如下：
按照实施例2提供的方法，吸取20μL、40μL、60μL、80μL、100μL的Ni-NTA磁珠于试管中，用1mL平衡缓冲液洗涤两次，每次10s；接着，加入40μL的含有LysGH15-54A的蛋白溶液(浓度为1mg/mL)与80μL平衡缓冲液至旋转混合仪上混合25min。将不同量的免疫磁珠与1mL的1×106CFU/mL浓度的金黄色葡萄球菌悬浊液混合孵育。后续按照实施例3提供的荧光蛋白标记步骤进行试验，重复三次，根据荧光强度下降率确定Ni-NTA磁珠的最佳使用量。结果如图3所示，当Ni-NTA磁珠使用量为60μL时，荧光强度下降率最高，所以，Ni-NT A磁珠使用量优选为60μL。
实施例5：该实施例提供了一种LysGH15-54A包被磁珠包被量的优化方法，具体如下：
按照实施例2提供的方法，向60μL的Ni-NTA磁珠中分别加入30μL、50μL、70μL、90μL、110μL的含有LysGH15-54A的蛋白溶液(浓度为1mg/mL)，然后与2倍体积的平衡缓冲液混合后置于旋转混合仪上混合25min，制备不同条件的包被磁珠。将不同包被量的包被磁珠与1mL的1×106CFU/mL浓度的金黄色葡萄球菌悬浊液混合孵育。然后按照实施例3的荧光蛋白标记步骤进行试验。重复三次，根据荧光值的大小确定包被磁珠所需蛋白的最佳使用量。结果如图4所示，当包被LysGH15-54A包被量为30μL时，荧光强度下降率最高，故LysGH15-54A包被磁珠包被量优选为30μL。
实施例6：该实施例提供了一种LysGH15-54A-MBs免疫捕获时间的优化方法，具体如下：
按照实施例2提供的方法，吸取5份60μL的Ni-NTA磁珠，加入30μL的含有LysGH15-54A的蛋白溶液(浓度为1mg/mL)与60μL平衡缓冲液混合，具体操作同上，分别与1mL的1×106CFU/mL浓度的金黄色葡萄球菌悬浊液孵育反应(即免疫捕获)5min、10min、15min、20min、25min，后续步骤按照上述实施例3的荧光蛋白标记步骤进行试验。重复三次，根据荧光强度的变化，进而确定免疫捕获的最佳时间。结果如图5所示，当免疫捕获时间为25min时，荧光强度下降率为最高，表明捕获效果最好，故LysGH15-54A-MBs免疫捕获时间优选为25min。
实施例7：该实施例是对上述提供的金黄色葡萄球菌荧光检测方法的检测效果进行评价，具体如下：
(1)灵敏性评价：将金黄色葡萄球菌培养至OD600＝0.6，倍比稀释后进行菌落计数。对计数好的金葡菌进行10倍倍比稀释，使菌的浓度由106CFU/mL梯度降至103CFU/mL。在最优条件下，以验证金黄色葡萄球菌荧光检测方法的敏感性。结果如图6所示，本发明实施例提供的检测方法的检测线性范围在1.0×103-1.0×106CFU/mL，线性回归方程为Y＝0.02087X2-0.02853X-0.09542，相关系数为0.989。此方程中，X轴和Y轴分别为荧光信号值和金黄色葡萄球菌的浓度。本发明实施例提供的检测方法可在40min内完成对金黄色葡萄球菌的检测。上述结果表明，本发明实施例提供的检测方法可用于临床早期诊断中的金黄色葡萄球菌的快速检测。
(2)特异性评价：根据细菌生长特性，将沙门氏菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克利伯菌用LB培养基培养。粪肠球菌、金黄色葡萄球菌USA300、金黄色葡萄球菌w3275，用BHI培养基培养。在最佳条件下，制备6份LysGH15-54-MBs。分别将1mL的106CFU/mL的金黄色葡萄球菌、肺炎克利伯菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克利伯菌、粪肠球菌悬浊液与LysGH15-54A-MBs孵育反应25min。余下步骤同上实施例3，通过与阴性对照荧光强度的变化来确定该检测方法的特异性。结果如图7所示，金黄色葡萄球菌w3275和USA300荧光强度下降率为正值，结果均为阳性。肺炎克利伯菌，粪肠球菌，沙门氏菌，铜绿假单胞菌，大肠杆菌，鲍曼不动杆菌荧光强度下降率基本为0或负值，结果均为阴性，符合预期结果；上述结果说明，本发明实施例提供的检测方法的特异性较好。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容。
Claims (10)
1.一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒，包括磁珠，其特征在于，还包括裂解酶LysGH15突变体以及融合EGFP的荧光蛋白54AE；所述裂解酶LysGH15突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述荧光蛋白54AE的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠为Ni-NTA磁珠。
3.根据权利要求2所述的基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒，其特征在于，所述荧光蛋白54AE的制备方法包括以下步骤：
以含有裂解酶LysGH15突变体基因的重组质粒为模板，使用裂解酶LysGH15突变体的上下游引物进行PCR扩增，得到第一PCR扩增产物；
以含有EGFP基因的重组质粒为模板，使用EGFP的上下游引物进行PCR扩增，得到第二PCR扩增产物；
以所述第一PCR扩增产物和第二PCR扩增产物为模板，使用荧光蛋白54AE的上下游引物进行PCR扩增，得到54AE基因；
将所述54AE基因与线性化的质粒载体进行重组后，再转化至克隆菌株中，得到表达菌株；
对所述表达菌株进行诱导表达后，再经纯化处理，得到所述荧光蛋白54AE。
4.根据权利要求3所述的基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒，其特征在于，所述裂解酶LysGH15突变体的上下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3-4所示。
5.根据权利要求3所述的基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒，其特征在于，所述EGFP的上下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5-6所示。
6.根据权利要求3所述的基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒，其特征在于，所述荧光蛋白54AE的上下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7-8所示。
7.一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其特征在于，采用权利要求1-6中任一项所述的金黄色葡萄球菌荧光检测试剂盒进行检测，具体包括以下步骤：
将裂解酶LysGH15突变体包被在磁珠上，得到包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠；
将待检测样品与包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠进行混匀，并经孵育反应后，再加入荧光蛋白54AE进行荧光检测。
8.根据权利要求7所述的基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其特征在于，孵育反应的温度为37℃，时间为20-25min。
9.根据权利要求7所述的基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其特征在于，将裂解酶LysGH15突变体包被在磁珠上，得到包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠的步骤，具体包括：
将磁珠与含有裂解酶LysGH15突变体的蛋白溶液进行混合偶联后，再用BSA封闭残余位点，得到包被有裂解酶LysGH15突变体的磁珠。
10.根据权利要求9所述的基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其特征在于，当所述磁珠为Ni-NTA磁珠时，每60μL的磁珠所包被的裂解酶LysGH15突变体的总量为30-70μg。
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