CN117191934A - 脑干胶质瘤的血清诊断标志物、预后标志物，其筛选方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及脑干胶质瘤的血清诊断标志物、预后标志物，其筛选方法及应用。本发明提供一组脑干胶质瘤血清代谢标志物，具有安全、可动态检测的优势，本发明首次通过血清代谢指纹图谱，预测患者放疗敏感性，预后分析患者的高低风险。

Description

脑干胶质瘤的血清诊断标志物、预后标志物，其筛选方法及 应用

技术领域

本发明涉及脑干胶质瘤(BSG)的血清诊断标志物和预后标志物，其筛选方法及应用。

背景技术

脑干胶质瘤(BSG)占所有儿童脑肿瘤的10％-15％，其发病高峰年龄段是6-9岁。诊断为脑干胶质瘤的患者预后较差，中位生存时间为10-12个月，5年生存率低于10％。在临床环境中，放疗是脑干胶质瘤的标准治疗方法，能够有效缓解症状进展并延长几个月的无进展生存期。与晚期手术组相比，及早确诊和及时手术患者组能够有更长的总生存期(中位生存期：28.4月vs.18.7月)。精准诊断和预后，以及放疗期间的实时监测，对于脑干胶质瘤患者的疾病管理至关重要。然而，通过提取组织样本的组织活检有一定风险，特别是针对位于大脑重要区域的肿瘤。此外，活检很难通过充分采样来实现有效治疗的动态监测。

无创放射成像是手术前发现癌区、及时监测评估肿瘤预后的“唯一”技术。然而，成像方式仅在脑干胶质瘤检测中提供70％左右的准确性，因为图像分辨率受限(≈1mm)可能导致最小病变的误诊。由于成像技术的精度有限，因此迫切需要结合液体活检诊断。与其他实体肿瘤不同，脑干胶质瘤缺乏临床批准的循环生物标志物，因为脑干位于颅内区域，并且存在血脑屏障。此外，由于循环系统的突变有限，目前的合作技术努力(如循环肿瘤DNA测序等)几乎都无法在外周血中进行检测，几乎没有针对脑干胶质瘤的诊断血清代谢标志物。

生物标志物(蛋白质、核酸、代谢物等)检测因其无创等特点，在体外诊断中发挥越来越重要的作用。与功能受表观遗传调控的基因和翻译后修饰的蛋白质不同，代谢物是生化活性的直接标志，更易与表型相关联。因此，代谢物分析，或代谢组学，已经成为一种强有的工具，被逐渐用于体外诊断。

因此，设计和构建一种先进的代谢检测方法用于提取脑干胶质瘤中的血清代谢指纹，对于通过血清代谢标志物诊断脑干胶质瘤以及预测患者放疗敏感性，预后分析患者的高低风险具有重要作用。

发明内容

现有的活检和无创放射成像是检测脑干胶质瘤的主要方法，两种方法或存在安全性、准确性或无法动态检测的问题，代谢标志物为一个可行的方向，但是针对脑干胶质瘤的诊断血清代谢标志物几乎没有。本发明提供一组脑干胶质瘤血清代谢标志物进行指认，具有安全、可动态检测的优势。

本发明第一方面提供脑干胶质瘤的血清诊断标志物，所述标志物为一组血清中的代谢物，包括乳酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、2-氨基粘酸半醛、鸟氨酸中的至少一种。

本发明的标志物均为低分子量化合物，由于脑微血管内皮细胞的相容孔径为1.4-1.8nm，能够穿过血脑屏障。在脑干胶质瘤的影响下，代谢紊乱破坏了血液中肿瘤应激的稳态过程，引起生物能量扰动、内分泌干扰和氧化应激。脑干胶质瘤衍生代谢可能协同促进不良临床结果。研究发现，血脑屏障在分离血液和脑/脑脊液系统中的功能，以及促进代谢物运输的渗透性。本发明的以上血清诊断标志物可准确的对诊断脑干胶质瘤。

在本发明的优选实施方式中，所述脑干胶质瘤的血清诊断标志物为血清中的代谢物，包括乳酸、亮氨酸、苏氨酸、2-氨基粘酸半醛。

本发明第二方面提供所述脑干胶质瘤的血清诊断标志物的筛选方法，该方法包括以下步骤：

S1、使用纳米辅助的激光解吸电离质谱技术，对脑干胶质瘤患者和健康志愿者的血清样本进行代谢指纹谱图检测，得到所述代谢指纹谱图结果；

S2、将S1得到的结果数据，采用机器学习方法获取质荷比信号；

S3、通过质荷比信号分析得到脑干胶质瘤患者的诊断标志物。

本方法建立完整方法实现脑干胶质瘤的诊断，采用血清样本在纳米材料辅助激光解吸电离质谱中得到代谢指纹谱图，并用机器学习方法得到诊断性能。代谢谱分析用于了解脑内肿瘤如角质母细胞瘤的分子发病机制有较大意义，可分析获得脑干胶质瘤的代谢标志物。

质谱法通过在ppm水平内的高分辨率检测代谢物的质量电荷比(m/z)，应用于代谢生物标志物的分析和发现。最近，纳米粒子增强激光解吸/电离质谱(NPELDI-MS)被开发用于捕获代谢静态和动态快照，具有预处理操作少，检测速度快，痕量样品消耗少的特点。这在临床环境中可以实现迅速检测。并且在质谱检测之前，定制的无机纳米颗粒作为色谱替代方案被引入，以选择性地富集代谢物，这使得该平台更适合生物分析和生物流体检测。

优选地，所述无机纳米颗粒为铁纳米颗粒。

本发明所述方法中的S3步骤中的所述机器学习所用软件为Orange、python 3.8中的一种或两种。

血清代谢物谱，包括静态和动态代谢快照，可以提供捕获脑干胶质瘤关键代谢信息的替代方法，并在整个患者放疗过程中通过代谢终点实现肿瘤动态跟踪。

本发明所述脑干胶质瘤的血清诊断标志物在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中分别具有如下质荷比：

乳酸：135.0027±2、150.9766±2；缬氨酸：162.0502±2、亮氨酸：170.0571±2、苏氨酸：180.0037±2、2-氨基粘酸半醛：186.0148±2、鸟氨酸：193.035±2。

本发明第三方面提供第一方面提供脑干胶质瘤的血清诊断标志物在制备脑胶质瘤诊断仪器、产品中的应用。

本发明第四面提供一种脑胶质瘤诊断试剂盒，包括第一方面提供脑干胶质瘤的血清诊断标志物。

本发明第五方面提供脑干胶质瘤预后的血清标志物，所述标志物为一组血清中的代谢物，包括乳酸、二尿酸、磺酰二脲、二氢紫苏酸、2-磷酸-D-甘油酸、胞嘧啶、咖啡酸3-O-葡萄糖醛酸中的至少一种。

脑干胶质瘤的预后评估主要通过影像实现，无法通过代谢指纹图谱区分高低风险的技术问题，本发明首次通过血清代谢指纹图谱，预测患者放疗敏感性，预后分析患者的高低风险。

本发明可通过代谢指纹图谱区分疾病高低风险差异，实现脑干胶质瘤患者的预后评估。谱图可以反应患者的代谢情况，得到代谢指纹图谱之后可以就患者预后好坏进行评估，区分高风险组和低风险组，并使用KM曲线进行评估，高低风险组log rank test得到的p值小于0.05。

在本发明的优选实施方式中，所述脑干胶质瘤预后的血清标志物为血清中的代谢物，包括乳酸、二尿酸、二氢紫苏酸、2-磷酸-D-甘油酸、胞嘧啶、咖啡酸3-O-葡萄糖醛酸。

在本发明的优选实施方式中，所述脑干胶质瘤预后的血清标志物为血清中的代谢物，包括二尿酸、二氢紫苏酸、2-磷酸-D-甘油酸、胞嘧啶、咖啡酸3-O-葡萄糖醛酸。

本发明第六方面提供所述脑干胶质瘤的预后血清标志物在脑胶质瘤诊断预后判断中的应用。

本发明所述脑干胶质瘤预后的标志物的筛选方法为：通过对患者的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行收集，然后通过Cox回归分析，并通过影响系数乘积求和得到每个患者的预后风险，以此区分高低风险组，在计算每个样本预后风险时会得到对应的特征面板(由多个的m/z值组成)，经过HMDB搜索分析得到预后标志物。

本发明取得了如下积极效果：本发明提供一组脑干胶质瘤血清代谢标志物进行指认，具有安全、可动态检测的优势。脑干胶质瘤的预后评估主要通过影像实现，无法通过代谢指纹图谱区分高低风险的技术问题，本发明首次通过血清代谢指纹图谱，预测患者放疗敏感性，预后分析患者的高低风险。

附图说明

图1代谢指纹图谱的脑干胶质瘤诊断性能。

图2诊断标志物面板在脑干胶质瘤中的诊断性能。

图3通过代谢指纹图谱区分的高低风险组在训练集中的Kaplan-Meier曲线。

图4通过代谢指纹图谱区分的高低风险组在测试集中的Kaplan-Meier曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施方式详述本发明，但需说明的是，本发明的保护范围不受这些具体实施方式和原理性解释的限制，而是由权利要求书来确定。

本发明中，除了明确说明的内容之外，未提到的任何事宜或事项均直接适用本领域已知的那些而无需进行任何改变。而且，本文描述的任何实施方式均可以与本文描述的一种或多种其他实施方式自由结合，由此形成的技术方案或技术思想均视为本发明原始公开或原始记载的一部分，而不应被视为是本文未曾披露或预期过的新内容，除非本领域技术人员认为该结合明显不合理。

本发明所公开的所有特征可以任意组合，这些组合应被理解为本发明所公开或记载的内容，除非本领域技术人员认为该组合明显不合理。

本说明书所公开的数值点，不仅包括实施例中具体公开的数值点，还包括说明书中各数值范围的端点，这些数值点所任意组合的范围都应被视为本发明已公开或记载的范围。

本发明中的技术和科学术语，给出定义的以其定义为准，未给出定义的则按本领域的通常含义理解。

实施例1

使用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，进行血清代谢指纹谱图成像：

步骤1：仪器与试剂的准备：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，血清样本(来源于新华医院，60名健康人静脉血和73名脑干胶质瘤患者静脉血)，去离子水，基质(铁纳米颗粒)；

步骤2：将血清样本用去离子水稀释10倍；

步骤3：将铁纳米颗粒用去离子水配成1mg/mL的基质溶液；

步骤4：在质谱靶板上进行样品制备，每个稀释后的血清样本点样1μL，室温下干燥；

步骤5：在质谱靶板上进行基质制备，每个基质溶液点样1μL，室温下干燥；

步骤6：在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪中进行血清代谢指纹谱图成像；

步骤7：得到血清代谢指纹谱图，用于后续分析。

实施例2

对健康人和脑干胶质瘤患者血清代谢指纹谱图进行机器学习，实现对脑干胶质瘤诊断的准确预测：

步骤1：对通过实施例1得到的60名健康人和73名脑干胶质瘤患者血清进行代谢指纹谱图成像；

步骤2：在python 3.8上对133个血清代谢指纹谱图进行预处理，包括数据重采样，谱线平滑，基线校正，谱峰联配以及缺失值填充，得到202个m/z信号；

步骤3：在Orange上使用Lasso和Ridge算法对202个m/z信号进行特征选择，将133个参与者划分成训练集(45个健康人和54个病人)和测试集(15个健康人和19个病人)，全指纹图谱性能见图1，得到7个m/z特征，并挖掘得到的标志物(表1)，挑选的诊断面板性能见图2。

表1.筛选得到的脑干胶质瘤诊断代谢标志物面板

本发明建立完整方法实现脑干胶质瘤的诊断，采用血清样本在纳米材料辅助激光解吸电离质谱中得到代谢指纹谱图，并用机器学习方法得到诊断性能。代谢指纹图谱诊断性能AUC为0.912-0.958(图1)。

实现脑干胶质瘤的血清诊断标志物的筛选和验证,筛选的代谢标志物面板诊断性能AUC为0.923-0.933(图2)得到诊断标志物面板(表1)。

实施例3

对脑干胶质瘤患者血清代谢指纹谱图进行Cox回归分析，实现对脑干胶质瘤疗效评估的准确预测：

步骤1：仪器与试剂的准备：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，血清样本(62名脑干胶质瘤患者)，去离子水，基质(铁纳米颗粒)；

步骤2：将血清样本用去离子水稀释10倍；

步骤3：将铁纳米颗粒用去离子水配成1mg/mL的基质溶液；

步骤4：在质谱靶板上进行样品制备，每个稀释后的血清样本点样1μL，室温下干燥；

步骤5：在质谱靶板上进行基质制备，每个基质溶液点样1μL，室温下干燥；

步骤6：在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中得到质谱谱图；

步骤7：通过Cox回归分析，得到7个标志物构成的预后面板(表2)，并通过影响系数乘积求和得到每个患者的预后风险，以此区分高低风险组，并在训练集和测试集样本中进行验证(训练集：45例；测试集：17例；图3-4)；

步骤8：对评定的高低风险组进行KM曲线Log rank验证(p<0.05)。

本发明也实现通过代谢指纹图谱对患者的风险进行评估，通过九个m/z特征面板计算患者风险(表2)，并通过Kaplan-Meier曲线使用Log rank验证(p<0.05)(图3，图4)。

表2 Cox回归得到的预后标志物面板

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.脑干胶质瘤的血清诊断标志物，其特征在于，所述标志物为一组血清中的代谢物，包括乳酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、2-氨基粘酸半醛、鸟氨酸中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的脑干胶质瘤的血清诊断标志物，其特征在于，所述脑干胶质瘤的血清诊断标志物为血清中的代谢物，包括乳酸、亮氨酸、苏氨酸、2-氨基粘酸半醛。

3.权利要求1或2所述脑干胶质瘤的血清诊断标志物的筛选方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1、使用纳米辅助的激光解吸电离质谱技术，对脑干胶质瘤患者和健康志愿者的血清样本进行代谢指纹谱图检测，得到所述代谢指纹谱图结果；

S2、将S1得到的结果数据，采用机器学习方法获取质荷比信号；

S3、通过质荷比信号分析得到脑干胶质瘤患者的诊断标志物。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，S2步骤中的所述机器学习所用软件为Orange、python 3.8中的一种或两种。

5.权利要求1或2所述脑干胶质瘤的血清诊断标志物在制备脑胶质瘤诊断仪器、产品中的应用。

6.一种脑胶质瘤诊断试剂盒，包括权利要求1或2所述脑干胶质瘤的血清诊断标志物。

7.脑干胶质瘤预后的血清标志物，其特征在于，所述标志物为一组血清中的代谢物，包括乳酸、二尿酸、磺酰二脲、二氢紫苏酸、2-磷酸-D-甘油酸、胞嘧啶、咖啡酸3-O-葡萄糖醛酸中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的脑干胶质瘤预后的血清标志物，其特征在于，所述脑干胶质瘤预后的标志物为血清中的代谢物，包括乳酸、二尿酸、二氢紫苏酸、2-磷酸-D-甘油酸、胞嘧啶、咖啡酸3-O-葡萄糖醛酸。

9.权利要求7所述脑干胶质瘤的预后血清标志物在脑胶质瘤诊断预后判断中的应用。

10.权利要求7-8所述脑干胶质瘤预后的标志物的筛选方法，其特征在于，通过对患者的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行收集，然后通过Cox回归分析，并通过影响系数乘积求和得到每个患者的预后风险，以此区分高低风险组，在计算每个样本预后风险时会得到对应的特征面板(由多个的m/z值组成)，经过HMDB搜索分析得到预后标志物。