CN117187151A - 一种生产l-高丝氨酸的基因工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产L‑高丝氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。所述菌株以Escherichia coli MG1655为出发菌株，通过强化EMP途径，增加草酰乙酸、天冬氨酸及谷氨酸供应，强化L‑高丝氨酸合成途径，阻断丙酮酸竞争途径，优化NADPH水平，增强L‑高丝氨酸输出并阻断其摄入，最终构建了一株非营养缺陷型，无需诱导剂，不携带质粒的高丝氨酸高产菌株。该菌株经过46h发酵，L‑高丝氨酸产量达163.7g/L，转化率达到54％。该方法采用的发酵工艺简单，无需额外添加营养物质，不携带质粒，无需诱导，易于控制，更加稳定，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。
Description
技术领域：
本发明涉及一种生产L-高丝氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。
背景技术：
L-高丝氨酸是一种高附加值的非蛋白质氨基酸，是苏氨酸和蛋氨酸等必需氨基酸的前体物质。L-高丝氨酸作为重要的平台化合物，被广泛用于合成高丝氨酸内酯、γ-丁内酯、异丁醇等重要化学品。L-高丝氨酸还是合成L-草铵膦的前体。目前L-高丝氨酸主要通过小规模化学法合成，但是存在原材料昂贵，反应条件苛刻，提取过程复杂以及污染环境等问题。相比之下，微生物发酵法生产成本低，条件温和，并且绿色环保，近年来该法被广泛应用于生产各种氨基酸。
目前谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌这两种工业微生物被广泛应用于发酵法生产L-高丝氨酸。周景文等(202010439183.2)阻断C.glutamicum ATCC 13032中高丝氨酸降解途径，并通过加强高丝氨酸合成通量，最终高丝氨酸产量达8.8g/L。该方法的不足之处在于，该工程菌携带用于过表达关键基因的重组质粒，从而需要添加抗生素来保证质粒稳定遗传，需要添加诱导剂来激活基因表达，导致生产成本增加，并损伤细胞生长。柳志强等(201810844040.2)，阻断了大肠杆菌高丝氨酸竞争、降解途径，并在基因组过表达了高丝氨酸合成途径的相关基因，最终高丝氨酸产量达60g/L。上述方法的不足之处在于，该工程菌需要额外添加L-苏氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸等用于恢复细胞生长，这无疑使发酵过程复杂化并且增加了生产成本。谢新开等(201710106474.8)通过点突变技术弱化大肠杆菌中编码高丝氨酸激酶的基因thrB，使得在不添加任何氨基酸的情况下，高丝氨酸积累量达47g/L。该方法同样使用质粒过表达关键基因。谢新开等(201710953111.8)，通过敲除thrB基因，阻断高丝氨酸向苏氨酸降解途径，并在大肠杆菌基因组上多拷贝高丝氨酸合成途径中的关键基因，使得高丝氨酸产量达88g/L。该菌株为营养缺陷型菌株，需要额外添加L-苏氨酸等营养物质。牟庆璇等通过调控L-天冬氨酸合成途径的通量配比，增强途径关键酶的表达和促进L-高丝氨酸外排，高丝氨酸产量达84.1g/L。Ceren Alkim等通过优化葡萄糖运输和糖酵解、TCA和乙醛酸循环、高丝氨酸合成三个模块间的碳通量，最终高丝氨酸产量达110.8g/L。上述两株工程菌同样携带用于过表达关键基因的重组质粒。此外，还存在发酵周期长、转化率低等不足。
发明内容：
为解决上述需要添加抗生素和(或)诱导剂及额外的营养物质导致生产成本增加，损伤细胞生长等瓶颈问题，发明提供一种非营养缺陷型、不携带质粒的产L-高丝氨酸的基因工程菌及采用该菌直接发酵生产L-高丝氨酸的方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案之一是：提供一株L-高丝氨酸高产菌株，所述菌株以Escherichia coli MG1655为出发菌株，在基因组上敲除乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因lacI，将高丝氨酸激酶编码基因thrB弱化表达，过表达天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I编码基因thrA、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc、吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB以及苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA；在此基础上过表达天冬氨酸转氨酶编码基因aspC、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA、天冬氨酸激酶III编码基因lysC、高丝氨酸脱氢酶编码基因hom、NADPH依赖的天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asd；敲除丙酮酸激酶编码基因pykA、丙酮酸脱氢酶编码基因poxB、乙酸激酶编码基因ackA、乳酸脱氢酶编码基因ldhA；过表达谷氨酸脱氢酶编码基因rocG、天冬氨酸解氨酶编码基因aspA，弱化表达α-酮戊二酸脱氢酶编码基因sucAB，过表达NADP+依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因gapN，敲除氨基酸摄入载体蛋白编码基因cycA；上述基因编辑顺序并无先后之分；
进一步地，将NADPH依赖的天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asd替换为NADH依赖的天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asdtm进行过表达；
进一步地，将丙酮酸激酶编码基因pykA替换为pykF进行敲除；
进一步地，敲除lacI基因，获得E.coli MG1655ΔlacI；
进一步地，thrA基因的过表达为三拷贝；
进一步地，所述thrB弱化表达是通过将thrB原启动子替换为PfliC弱启动子实现的；
进一步地，所述PfliC弱启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
进一步地，所述rhtA基因的过表达采用的启动子为Plpp启动子；
进一步地，所述Plpp启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述thrA、ppc、pntAB、aspC、pckA、lysC、hom、asd/asdtm、rocG、aspA和gapN基因的过表达采用的启动子为强启动子Ptrc；
进一步地，所述Ptrc强启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；
进一步地，所述sucAB弱化表达是通过将sucAB原启动子替换为PfliA弱启动子实现的；
进一步地，所述PfliA弱启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；
进一步地，所述天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶编码基因thrA，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-Protein ID:NP_414543.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
进一步地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-Protein ID:NP_418391.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
进一步地，所述嘧啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-Protein ID:416120.1和NP_416119.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
进一步地，所述苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-Protein ID:NP_415334.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
进一步地，天冬氨酸转氨酶的编码基因aspC，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-ProteinID:NP_415448.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
进一步地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因pckA，来自曼海姆产琥珀酸菌MBEL55E，NCBI-Protein ID:AAU38900.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
进一步地，所述天冬氨酸激酶III的编码基因lysC，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-Protein ID:NP_418448.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
进一步地，所述高丝氨酸脱氢酶的编码基因hom，来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，NCBI-Protein ID:AUI00721.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
进一步地，所述天冬氨酸半醛脱氢酶的编码基因asd，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-Protein ID:NP_417891.1，其特征为NADPH依赖，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；天冬氨酸半醛脱氢酶的编码基因asdtm，来自运动替斯崔纳菌KA081020-065，NCBI-Protein ID:WP_014746527.1，其特征为NADH依赖，核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，优选asdtm；
进一步地，所述丙酮酸激酶的编码基因pykA，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-ProteinID:NP_416368.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
进一步地，所述丙酮酸激酶的编码基因pykF，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-ProteinID:NP_416191.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
进一步地，所述丙酮酸脱氢酶的编码基因poxB，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-Protein ID:NP_415392.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
进一步地，所述乙酸激酶的编码基因ackA，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-ProteinID:NP_416799.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
进一步地，所述乳酸脱氢酶的编码基因ldhA，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-ProteinID:NP_415898.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
进一步地，所述谷氨酸脱氢酶的编码基因rocG，来自枯草芽孢杆菌168，NCBI-Protein ID:NP_391659.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
进一步地，所述天冬氨酸解氨酶的编码基因aspA，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-Protein ID:NP_418562.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
进一步地，所述α-酮戊二酸脱氢酶的编码基因sucAB，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-Protein ID:NP_415254.1和NP_415255.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
进一步地，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因gapN，来自变形链球菌NG5，NCBI-Protein ID:AAA91091.1，其特征为NADP+依赖，核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
进一步地，所述氨基酸摄入载体蛋白的编码基因cycA，来自大肠杆菌MG1655，NCBI-Protein ID:NP_418629.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案之二是：提供构建上述L-高丝氨酸基因工程菌的方法，包括如下步骤：
(1)E.coli MG1655ΔlacI的构建
以野生型大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物lac-1/lac-2及lac-3/lac-4扩增lacI的上下游同源臂，然后利用重叠PCR获得lacI上下游同源臂重叠片段UlacI-DlacI；
将RB-lac1/RB-lac2退火后连接至pGRB，获得pGRB-lacI；
将pGRB-lacI和UlacI-DlacI电转化至含pREDcas9的E.coli MG1655，经筛选获得lacI敲除菌株E.coli MG1655ΔlacI。
(2)HOM-1的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增thrB启动子上下游同源臂UPthrB、DPthrB，并通过重叠PCR获得重叠片段UPthrB-Pflic-DPthrB；
PG-1/PG-2退火后连接至pGRB，获得pGRB 1；
将pGRB 1和UPthrB-Pflic-DPthrB电转化至含pREDcas9的E.coli MG1655ΔlacI，经筛选获得thrB弱化菌株HOM-1。
(3)HOM-2的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增ylbe上下游同源臂Uylbe、Dylbe以及thrA，并通过重叠PCR获得重叠片段Uylbe-Ptrc-thrA-Dylbe；
PG-3/PG-4退火后连接至pGRB，获得pGRB 2；
将pGRB 2和Uylbe-Ptrc-thrA-Dylbe电转化至含pREDcas9的HOM-1，经筛选获得thrA过表达菌株HOM-2。
(4)HOM-3的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增yjit上下游同源臂Uyjit、Dyjit以及ppc，并通过重叠PCR获得重叠片段Uyjit-Ptrc-ppc-Dyjit；
PG-5/PG-6退火后连接至pGRB，获得pGRB 3；
将pGRB 3和Uyjit-Ptrc-ppc-Dyjit电转化至含pREDcas9的HOM-2，经筛选获得ppc过表达菌株HOM-3。
(5)HOM-4的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增rph上下游同源臂Urph、Drph以及thrA，并通过重叠PCR获得重叠片段Urph-Ptrc-thrA-Drph；
PG-7/PG-8退火后连接至pGRB，获得pGRB 4；
将pGRB 4和Urph-Ptrc-thrA-Drph电转化至含pREDcas9的HOM-3，经筛选获得thrA过表达菌株HOM-4。
(6)HOM-5的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增yjip上下游同源臂Uyjip、Dyjip以及thrA，并通过重叠PCR获得重叠片段Uyjip-Ptrc-thrA-Dyjip；
PG-9/PG-10退火后连接至pGRB，获得pGRB 5；
将pGRB 5和Uyjip-Ptrc-thrA-Dyjip电转化至含pREDcas9的HOM-4，经筛选获得thrA过表达菌株HOM-5。
(7)HOM-6的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增gapc上下游同源臂Ugapc、Dgapc以及pntAB，并通过重叠PCR获得重叠片段Ugapc-Ptrc-pntAB-Dgapc；
PG-11/PG-12退火后连接至pGRB，获得pGRB 6；
将pGRB 6和Ugapc-Ptrc-pntAB-Dgapc电转化至含pREDcas9的HOM-5，经筛选获得pntAB过表达菌株HOM-6。
(8)HOM-7的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增ygay上下游同源臂Uygay、Dygay以及Plpp和rhtA，并通过重叠PCR获得重叠片段Uygay-Plpp-rhtA-Dygay；
PG-13/PG-14退火后连接至pGRB，获得pGRB 7；
将pGRB 7和Uygay-Plpp-rhtA-Dygay电转化至含pREDcas9的HOM-6，经筛选获得rhtA过表达菌株HOM-7。
(9)HOM-8的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增ycgH上下游同源臂UycgH、DycgH以及aspC，并通过重叠PCR获得重叠片段UycgH-Ptrc-aspC-DaspC；
PG-15/PG-16退火后连接至pGRB，获得pGRB 8；
将pGRB 8和UycgH-Ptrc-aspC-DycgH电转化至含pREDcas9的HOM-7，经筛选获得aspC过表达菌株HOM-8。
(10)HOM-9的构建
以曼海姆产琥珀酸菌MBEL55E基因组为模版，扩增pckA，以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增yeeP上下游同源臂UyeeP、DyeeP，并通过重叠PCR获得重叠片段UyeeP-Ptrc-pckA-DyeeP；
PG-17/PG-18退火后连接至pGRB，获得pGRB 9；
将pGRB 9和UyeeP-Ptrc-pckA-DyeeP电转化至含pREDcas9的HOM-8，经筛选获得pckA过表达菌株HOM-9。
(11)HOM-10的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版分别扩增yghX上下游同源臂UyghX、DyghX以及lysC，并通过重叠PCR获得重叠片段UyghX-Ptrc-lysC-DyghX；
PG-19/PG-20退火后连接至pGRB，获得pGRB 10；
将pGRB 10和UyghX-Ptrc-lysC-DyghX电转化至含pREDcas9的HOM-9，经筛选获得lysC过表达菌株HOM-10。
(12)HOM-11的构建
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032为模板，扩增hom；以大肠杆菌MG1655基因组为模版分别扩增yciQ上下游同源臂UyciQ、DyciQ，并通过重叠PCR获得重叠片段UyciQ-Ptrc-hom-DyciQ；
PG-21/PG-22退火后连接至pGRB，获得pGRB 11；
将pGRB 11和UyciQ-Ptrc-hom-DyciQ电转化至含pREDcas9的HOM-10，经筛选获得hom过表达菌株HOM-11。
(13)HOM-12的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增tehB上下游同源臂UtehB、DtehB以及asd，并通过重叠PCR获得重叠片段UtehB-Ptrc-asd-DtehB；
PG-23/PG-24退火后连接至pGRB，获得pGRB 12；
将pGRB 12和UtehB-Ptrc-asd-DtehB电转化至含pREDcas9的HOM-11，经筛选获得asd过表达菌株HOM-12。
(14)HOM-13的构建
以运动替斯崔纳菌KA081020-065基因组为模版，扩增asdtm，以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增tehB上下游同源臂UtehB、DtehB，并通过重叠PCR获得重叠片段UtehB-Ptrc-asdtm-DtehB；
将pGRB 12和UtehB-Ptrc-asdtm-DtehB电转化至含pREDcas9的HOM-11，经筛选获得asdtm过表达菌株HOM-13。
(15)HOM-14的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增pykA上下游同源臂UpykA、DpykA，并通过重叠PCR获得重叠片段UpykA-DpykA；
PG-25/PG-26退火后连接至pGRB，获得pGRB 13；
将pGRB 13和UpykA-DpykA电转化至含pREDcas9的HOM-13，经筛选获得敲除pykA菌株HOM-14。
(16)HOM-15的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增pykF上下游同源臂UpykF、DpykF，并通过重叠PCR获得重叠片段UpykF-DpykF；
PG-27/PG-28退火后连接至pGRB，获得pGRB 14；
将pGRB 14和UpykF-DpykF电转化至含pREDcas9的HOM-13，经筛选获得敲除pykF菌株HOM-15。
(17)HOM-16的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增poxB上下游同源臂UpoxB、DpoxB，并通过重叠PCR获得重叠片段UpoxB-DpoxB；
PG-29/PG-30退火后连接至pGRB，获得pGRB 15；
将pGRB 15和UpoxB-DpoxB电转化至含pREDcas9的HOM-15，经筛选获得敲除poxB菌株HOM-16。
(18)HOM-17的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增ackA上下游同源臂UackA、DackA，并通过重叠PCR获得重叠片段UackA-DackA；
PG-31/PG-32退火后连接至pGRB，获得pGRB 16；
将pGRB 16和UackA-DackA电转化至含pREDcas9的HOM-16，经筛选获得敲除ackA菌株HOM-17。
(19)HOM-18的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增ldhA上下游同源臂UldhA、DldhA，并通过重叠PCR获得重叠片段UldhA-DldhA；
PG-33/PG-34退火后连接至pGRB，获得pGRB 17；
将pGRB 17和UldhA-DldhA电转化至含pREDcas9的HOM-17，经筛选获得敲除ldhA菌株HOM-18。
(20)HOM-19的构建
以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，扩增rocG，以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增lacZ编码基因上下游同源臂Ulac、Dlac，并通过重叠PCR获得重叠片段Ulac-Ptrc-rocG-Dlac；
PG-35/PG-36退火后连接至pGRB，获得pGRB 18；
将pGRB 18和Ulac-Ptrc-rocG-Dlac电转化至含pREDcas9的HOM-18，经筛选获得rocG过表达菌株HOM-19。
(21)HOM-20的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增mbhA上下游同源臂UmbhA、DmbhA以及aspA，并通过重叠PCR获得重叠片段UmbhA-Ptrc-aspA-DmbhA；
PG-37/PG-38退火后连接至pGRB，获得pGRB 19；
将pGRB 19和UmbhA-Ptrc-aspA-DmbhA电转化至含pREDcas9的HOM-19，经筛选获得aspA过表达菌株HOM-20。
(22)HOM-21的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增sucAB启动子上下游同源臂UpsucAB、DpsucAB，并通过重叠PCR获得重叠片段UpsucAB-PfliA-DpsucAB；
PG-39/PG-40退火后连接至pGRB，获得pGRB 20；
将pGRB 20和UpsucAB-PfliA-DpsucAB电转化至含pREDcas9的HOM-20，经筛选获得sucAB弱化菌株HOM-21。
(23)HOM-22的构建
以变形链球菌NG5基因组为模板，利用引物gapN-1/gapN-2扩增gapN，以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增yjgX上下游同源臂UyjgX、DyjgX，并通过重叠PCR获得重叠片段UyjgX-Ptrc-gapN-DyjgX；
PG-41/PG-42退火后连接至pGRB，获得pGRB 21；
将pGRB 21和UyjgX-Ptrc-gapN-DyjgX电转化至含pREDcas9的HOM-21，经筛选获得gapN过表达菌株HOM-22。
(24)HOM-23的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增cycA上下游同源臂UcycA、DcycA，并通过重叠PCR获得重叠片段UcycA-DcycA；
PG-43/PG-44退火后连接至pGRB，获得pGRB 22；
将pGRB 22和UcycA-DcycA电转化至含pREDcas9的HOM-22，经筛选获得敲除cycA菌株HOM-23。
本发明解决上述问题所采用的技术方案之三是：提供菌株HOM-8至HOM-23中任意菌株在生产L-高丝氨酸中的应用；
进一步地，采用所述菌株发酵生产L-高丝氨酸的方法，包括以下步骤：
发酵罐发酵：以10％-20％接种量将种子培养物接至装有发酵培养基的发酵罐进行发酵培养，发酵温度30-37℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在20-50％，流加葡萄糖溶液(含0-5g/甜菜碱)，维持残糖浓度为0.1-0.5％，维持发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期46-54h。
进一步地，种子培养方法如下：用接种环将新鲜斜面活化的菌株接种至种子培养基中，调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-800rpm，30-35℃培养6-8h；
进一步地，种子培养基成分为：15-30g/L葡萄糖，2-5g/L酵母粉，1-5g/L胰蛋白胨，1.5-3g/L KH2PO4，5-15mg/L FeSO4·7H2O，4-12mg/L MnSO4，其余为水，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
进一步地，发酵培养基成分为：10-20g/L葡萄糖，2-6g/L酵母粉，1-5g/L胰蛋白胨，1-3g/L KH2PO4，0.5-2g/L MgSO4·7H2O，5-15mg/L FeSO4·7H2O，5-15mg/L MnSO4，其余为水，pH调至6.8-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
其中，经过46-54h发酵，菌株HOM-23的L-高丝氨酸产量达到140.2-160.7g/L，未检测到其他氨基酸和有机酸。
有益效果：
(1)本发明以E.coli MG1655为出发菌株，通过启动子替换动态调控高丝氨酸降解途径，平衡细胞生长和高丝氨酸生产，利用系统代谢工程手段加强高丝氨酸合成通量、优化NADPH水平并修饰高丝氨酸运输系统，最终通过阻断L-高丝氨酸的摄入途径，构建了一株非营养缺陷型，无需诱导剂，不携带质粒的高丝氨酸高产菌株。菌株HOM-23经过46h发酵，L-高丝氨酸产量达160.7g/L，转化率达54％，生产强度达3.49g/L/h。在整个发酵过程中未检测到副产物。
(2)该方法采用的发酵工艺简单，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。与现有技术相比，本发明获得的工程菌株和工艺无营养缺陷，不携带质粒，无需添加抗生素、诱导剂等，其L-高丝氨酸产量和发酵强度进一步提升且优于现有技术。
附图说明：
图1实施例20L-高丝氨酸基因工程菌HOM-23的发酵过程曲线。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-8的构建
本实施例是在前期构建的菌株HOM-7(本发明菌株HOM-7的构建过程与中国发明专利ZL202110103820.3中HOM-7菌株的构建过程一致，因此本发明中HOM-1至HOM-7的菌株构建参考ZL202110103820.3(CN 112779204 B)，以下实施例直接在ZL202110103820.3专利构建的HOM-7菌株的基础上进行后续菌株的构建)基础上进行进一步改造。
(1)重叠片段UycgH-Ptrc-aspC-DaspC的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物ycgH-1/ycgH-2、ycgH-3/ycgH-4以及aspC-1/aspC-2扩增ycgH的上下游同源臂和aspC基因，其中包含Ptrc启动子(Ptrc启动子设计在aspC基因扩增引物中，下同)，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含ycgH上、下游同源臂、Ptrc-aspC的融合片段UycgH-Ptrc-aspC-DaspC。
(2)pGRB 8质粒的构建
根据ycgH序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列PG-15/PG-16，二者退火后利用重组试剂盒ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(南京诺唯赞医疗科技有限公司)连接至质粒pGRB，经转化E.coli DH5α、含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基筛选、测序鉴定获得重组质粒pGRB 8。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-8的构建
将重组质粒pGRB 8和融合片段UycgH-Ptrc-aspC-DaspC电转化至含有pREDcas9质粒的HOM-7(ZL202110103820.3)感受态细胞中，复苏后涂布于含100μg/mL壮观霉素、氨苄青霉素的LB固体培养上，32℃恒温过夜培养。次日用引物ycgH-1/ycgH-4进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。活化转化子，并添加终浓度为0.2mmol/L的阿拉伯糖，32℃振荡培养过夜，使pGRB8丢失；然后42℃振荡培养过夜，使pREDcas9质粒丢失，获得过表达aspC的菌株HOM-8。
实施例2：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-9的构建
(1)重叠片段UyeeP-Ptrc-pckA-DyeeP的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物yeeP-1/yeeP-2、yeeP-3/yeeP-4扩增yeeP的上下游同源臂，以曼海姆产琥珀酸菌MBEL55E基因组为模版(或者根据SEQ IDNO.10所示的pckA基因序列)，利用引物pckA-1/pckA-2，扩增pckA基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含yeeP上、下游同源臂、Ptrc-pckA的融合片段UyeeP-Ptrc-pckA-DyeeP。(2)pGRB 9质粒的构建
根据yeeP序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-17和PG-18，二者退火后利用重组试剂盒ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(南京诺唯赞医疗科技有限公司)连接至质粒pGRB，经转化E.coli DH5α、含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基筛选、测序鉴定获得重组质粒pGRB 9。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-9的构建
将重组质粒pGRB 9和融合片段UyeeP-Ptrc-pckA-DyeeP电转化至含有pREDcas9质粒的HOM-8感受态细胞中，复苏后涂布于含100μg/mL壮观霉素、氨苄青霉素的LB固体培养上，32℃恒温过夜培养。次日用引物yeeP-1/yeeP-4进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。活化转化子，并添加终浓度为0.2mmol/L的阿拉伯糖，32℃振荡培养过夜，使pGRB 9丢失；然后42℃振荡培养过夜，使pREDcas9质粒丢失，获得过表达pckA的菌株HOM-9。
实施例3：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-10的构建
(1)重叠片段UyghX-Ptrc-lysC-DyghX的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物yghX-1/yghX-2、yghX-3/yghX-4以及lysC-1/lysC-2扩增yghX的上下游同源臂，和lysC基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含yghX上、下游同源臂、Ptrc-lysC的融合片段UyghX-Ptrc-lysC-DyghX。
(2)pGRB 10质粒的构建
根据yghX序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列PG-19和PG-20，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 10。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-10的构建
将重组质粒pGRB 10和融合片段UyghX-Ptrc-lysC-DyghX转化至含有pREDcas9质粒的HOM-9的感受态细胞中，用引物yghX-1/yghX-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得过表达lysC的菌株HOM-10。
实施例4：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-11的构建
(1)重叠片段UyciQ-Ptrc-hom-DyciQ的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物yciQ-1/yciQ-2、yciQ-3/yciQ-4扩增yciQ的上下游同源臂，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032为模板，利用引物hom-1/hom-2，扩增hom基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含yciQ上、下游同源臂、Ptrc-hom的融合片段UyciQ-Ptrc-hom-DyciQ。
(2)pGRB 11质粒的构建
根据yciQ序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-21和PG-22，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 11。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-11的构建
将重组质粒pGRB 11和融合片段UyciQ-Ptrc-hom-DyciQ转化至含有pREDcas9质粒的HOM-10的感受态细胞中，用引物yciQ-1/yciQ-4鉴定阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得过表达hom的菌株HOM-11。
实施例5：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-12的构建
(1)重叠片段UtehB-Ptrc-asd-DtehB的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物tehB-1/tehB-2、tehB-3/tehB-4以及asd-1/asd-2扩增tehB的上下游同源臂，和asd基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含tehB上、下游同源臂、Ptrc-asd的融合片段UtehB-Ptrc-asd-DtehB。
(2)pGRB 12质粒的构建
根据tehB序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-23和PG-24，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 12。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-12的构建
将重组质粒pGRB 12和融合片段UtehB-Ptrc-asd-DtehB转化至含有pREDcas9质粒的HOM-11的感受态细胞中，用引物tehB-1/tehB-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得过表达asd的菌株HOM-12。
实施例6：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-13的构建
(1)重叠片段UtehB-Ptrc-asdtm-DtehB的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物tehB-1/tehB-2、tehB-3/tehB-4扩增tehB的上下游同源臂，以运动替斯崔纳菌KA081020-065基因组为模版(或SEQ IDNO.14所示的asdtm基因)，利用引物asdtm-1/asdtm-2，扩增asdtm基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含tehB上、下游同源臂、Ptrc-asdtm的融合片段UtehB-Ptrc-asdtm-DtehB。
(2)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-13的构建
将重组质粒pGRB 12和融合片段UtehB-Ptrc-asdtm-DtehB转化至含有pREDcas9质粒的HOM-11的感受态细胞中，用引物tehB-1/tehB-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得过表达asdtm的菌株HOM-13。
实施例7：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-14的构建
(1)重叠片段UpykA-DpykA的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物pykA-1/pykA-2、pykA-3/pykA-4扩增pykA的上下游同源臂，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含pykA上、下游同源臂的融合片段UpykA-DpykA。
(2)pGRB 13质粒的构建
根据pykA序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-25和PG-26，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 13。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-14的构建
将重组质粒pGRB 13和融合片段UpykA-DpykA转化至含有pREDcas9质粒的HOM-13的感受态细胞中，用引物pykA-1/pykA-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得敲除pykA的菌株HOM-14。
实施例8：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-15的构建
(1)重叠片段UpykF-DpykF的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物pykF-1/pykF-2、pykF-3/pykF-4扩增pykF的上下游同源臂，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含pykF上、下游同源臂的融合片段UpykF-DpykF。
(2)pGRB 14质粒的构建
根据pykF序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-27和PG-28，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 14。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-15的构建
将重组质粒pGRB 14和融合片段UpykF-DpykF转化至含有pREDcas9质粒的HOM-13的感受态细胞中，用引物pykF-1/pykF-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得敲除pykF的菌株HOM-15。
实施例9：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-16的构建
(1)重叠片段UpoxB-DpoxB的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物poxB-1/poxB-2、poxB-3/poxB-4扩增poxB的上下游同源臂，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含poxB上、下游同源臂的融合片段UpoxB-DpoxB。
(2)pGRB 15质粒的构建
根据poxB序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列PG-29和PG-30，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 15。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-16的构建
将重组质粒pGRB 15和融合片段UpoxB-DpoxB转化至含有pREDcas9质粒的HOM-15的感受态细胞中，用引物poxB-1/poxB-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得敲除poxB的菌株HOM-16。
实施例10：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-17的构建
(1)重叠片段UackA-DackA的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物ackA-1/ackA-2、ackA-3/ackA-4扩增ackA的上下游同源臂，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含ackA上、下游同源臂的融合片段UackA-DackA。
(2)pGRB 16质粒的构建
根据ackA序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-31和PG-32，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 16。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-17的构建
将重组质粒pGRB 16和融合片段UackA-DackA转化至含有pREDcas9质粒的HOM-16的感受态细胞中，用引物ackA-1/ackA-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得敲除ackA的菌株HOM-17。
实施例11：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-18的构建
(1)重叠片段UldhA-DldhA的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物ldhA-1/ldhA-2、ldhA-3/ldhA-4扩增ldhA的上下游同源臂，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含ldhA上、下游同源臂的融合片段UldhA-DldhA。
(2)pGRB 17质粒的构建
根据poxB序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-33和PG-34，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 17。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-18的构建
将重组质粒pGRB 17和融合片段UldhA-DldhA转化至含有pREDcas9质粒的HOM-17的感受态细胞中，用引物ldhA-1/ldhA-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得敲除ldhA的菌株HOM-18。
实施例12：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-19的构建
(1)重叠片段Ulac-Ptrc-rocG-Dlac的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物lac-1/lac-2、lac-3/lac-4扩增lacZ编码基因的上下游同源臂，以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，利用引物rocG-1/rocG-2，扩增rocG基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含lacZ编码基因上、下游同源臂、Ptrc-rocG的融合片段Ulac-Ptrc-rocG-Dlac。
(2)pGRB 18质粒的构建
根据lacZ编码基因序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-35和PG-36，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 18。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-19的构建
将重组质粒pGRB 18和融合片段Ulac-Ptrc-rocG-Dlac转化至含有pREDcas9质粒的HOM-18的感受态细胞中，用引物lac-1/lac-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得过表达rocG的菌株HOM-19。
实施例13：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-20的构建
(1)重叠片段UmbhA-Ptrc-aspA-DmbhA的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物mbhA-1/mbhA-2、mbhA-3/mbhA-4以及aspA-1/aspA-2扩增mbhA的上下游同源臂，和aspA基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含mbhA上、下游同源臂、Ptrc-aspA的融合片段UmbhA-Ptrc-aspA-DmbhA。
(2)pGRB 19质粒的构建
根据mbhA序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-37和PG-38，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 19。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-20的构建
将重组质粒pGRB 19和融合片段UmbhA-Ptrc-aspA-DmbhA转化至含有pREDcas9质粒的HOM-19的感受态细胞中，用引物mbhA-1/mbhA-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得过表达aspA的菌株HOM-20。
实施例14：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-21的构建
(1)重叠片段UpsucAB-PfliA-DpsucAB的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物PsucAB-1/PsucAB-2、PsucAB-3/PsucAB-4扩增sucAB启动子的上下游同源臂，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含sucAB启动子上、下游同源臂、启动子PfliA(PfliA设计在引物中)的融合片段UpsucAB-PfliA-DpsucAB。
(2)pGRB 20质粒的构建
根据sucAB启动子序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-39和PG-40，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 20。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-21的构建
将重组质粒pGRB 20和融合片段UpsucAB-PfliA-DpsucAB转化至含有pREDcas9质粒的HOM-20的感受态细胞中，用引物PsucAB-1/PsucAB-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得菌株HOM-21。
实施例15：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-22的构建
(1)重叠片段UyjgX-Ptrc-gapN-DyjgX的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物yjgX-1/yjgX-2、yjgX-3/yjgX-4扩增yjgX的上下游同源臂，以变形链球菌NG5基因组为模版(或者以SEQ ID NO.23所示的gapN基因)，利用引物gapN-1/gapN-2，扩增gapN基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含yjgX上、下游同源臂、Ptrc-gapN的融合片段UyjgX-Ptrc-gapN-DyjgX。
(2)pGRB 21质粒的构建
根据yjgX序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-41和PG-42，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 21。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-22的构建
将重组质粒pGRB 21和融合片段UyjgX-Ptrc-gapN-DyjgX转化至含有pREDcas9质粒的HOM-21的感受态细胞中，用引物yjgX-1/yjgX-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得菌株HOM-22。
实施例16：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-23的构建
(1)重叠片段UcycA-DcycA的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物cycA-1/cycA-2、cycA-3/cycA-4扩增cycA的上下游同源臂，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含cycA上、下游同源臂的融合片段UcycA-DcycA。
(2)pGRB 22质粒的构建
根据cycA序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-43和PG-44，通过上述实施例2的方法构建重组质粒pGRB 22。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-23的构建
将重组质粒pGRB 22和融合片段UcycA-DcycA转化至含有pREDcas9质粒的HOM-22的感受态细胞中，用引物cycA-1/cycA-4筛选阳性转化子。并按上述实施例2的方法丢失质粒，获得菌株HOM-23。
实施例17：L-高丝氨酸基因工程菌摇瓶发酵
(1)种子培养
分别将高丝氨酸基因工程菌HOM-7、HOM-8、HOM-9、HOM-10、HOM-11、HOM-12、HOM-13、HOM-14、HOM-15、HOM-16、HOM-17、HOM-18、HOM-19、HOM-20、HOM-21、HOM-22和HOM-23接种到LB固体培养基斜面上，以HOM-7为对照，培养12h。然后接种至30mL种子培养基中，37℃，220rpm摇床振荡培养8h。
(2)发酵培养
以1％接种量接种至发酵培养基，35℃，220rpm摇床振荡培养48h。发酵过程中当培养基中葡萄糖耗尽时补充60％葡萄糖2-3次维持残糖浓度为0.1-0.5％，每次补充1mL，用氨水调节pH约为7。
(3)发酵液中L-高丝氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定L-高丝氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
各菌株L-高丝氨酸产量如下表所示：
菌株高丝氨酸产量
其中：
种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，2g/L胰蛋白胨，2g/LKH2PO4，1g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，2.0％苯酚红，pH 7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：20g/L葡萄糖，3g/L酵母提取物，1g/L胰蛋白胨，3g/LKH2PO4，1.8g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，2.0％苯酚红，pH 7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例18：菌株HOM-23的5L发酵罐发酵
(1)种子培养：用接种环将5支经新鲜斜面活化的菌株HOM-23全部接种至装有3L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-700rpm，32℃培养7h。
(2)发酵罐发酵：以10％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度30℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-600rpm，溶氧维持在20％，流加浓度为80％的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期52h。
(3)发酵液中L-高丝氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释20倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HOM-23的L-高丝氨酸产量达到145.6g/L，转化率达到50％，未检测到其他氨基酸和有机酸。
其中：
种子培养基成分为：15g/L葡萄糖，3g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，1.5g/LKH2PO4，5mg/L FeSO4·7H2O，12mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：10g/L葡萄糖，2g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，1g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，5mg/L FeSO4·7H2O，5mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例19：菌株HOM-23的5L发酵罐发酵
(1)种子培养：用接种环将5支经新鲜斜面活化的菌株HOM-23全部接种至装有3L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-600rpm，30℃培养8h。
(2)发酵罐发酵：以15％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-800rpm，溶氧维持在40％，流加浓度为80％的葡萄糖溶液(含甜菜碱2g/L)，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期50h。
(3)发酵液中L-高丝氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HOM-23的L-高丝氨酸产量达到154.3g/L，转化率达到51％，未检测到其他氨基酸和有机酸。
其中：
种子培养基成分为：30g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，1g/L胰蛋白胨，3g/LKH2PO4，15mg/LFeSO4·7H2O，12mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：20g/L葡萄糖，6g/L酵母粉，1g/L胰蛋白胨，3g/LKH2PO4，2g/LMgSO4·7H2O，15mg/L FeSO4·7H2O，15mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例20：菌株HOM-23的5L发酵罐发酵
(1)种子培养：用接种环将5支经新鲜斜面活化的菌株HOM-23全部接种至装有3L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-800rpm，35℃培养6h。
(2)发酵罐发酵：以20％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度37℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在50％，流加浓度为80％的葡萄糖溶液(含甜菜碱5g/L)，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期46h。
(3)发酵液中L-高丝氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HOM-23的L-高丝氨酸产量达到163.7g/L，转化达到54％，未检测到其他氨基酸和有机酸。
其中：
种子培养基成分为：25g/L葡萄糖，3g/L酵母粉，4g/L胰蛋白胨，2g/LKH2PO4，10mg/LFeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：15g/L葡萄糖，3.5g/L酵母粉，4g/L胰蛋白胨，2g/LKH2PO4，1.5g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
本发明实施例所用引物序列列表：
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以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求。
Claims (9)
1.一株L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株以大肠杆菌为出发菌株，在基因组上敲除乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因lacI，将高丝氨酸激酶编码基因thrB弱化表达，过表达天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I编码基因thrA、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc、吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB以及苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA；在此基础上过表达天冬氨酸转氨酶编码基因aspC、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA、天冬氨酸激酶III编码基因lysC、高丝氨酸脱氢酶编码基因hom、NADPH依赖的天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asd；敲除丙酮酸激酶编码基因pykA、丙酮酸脱氢酶编码基因poxB、乙酸激酶编码基因ackA、乳酸脱氢酶编码基因ldhA；过表达谷氨酸脱氢酶编码基因rocG、天冬氨酸解氨酶编码基因aspA，弱化表达α-酮戊二酸脱氢酶编码基因sucAB，过表达NADP+依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因gapN，敲除氨基酸摄入载体蛋白编码基因cycA。
2.如权利要求1所述的一株L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于，所述生产菌株以Escherichia coli MG1655为出发菌株。
3.如权利要求1所述的一株L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株还包含以下改造中的至少一种：
(1)将NADPH依赖的天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asd替换为NADH依赖的天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asdtm进行过表达；
(2)将丙酮酸激酶编码基因pykA替换为pykF进行敲除；
(3)thrA基因的过表达为三拷贝；
(4)所述thrB弱化表达是通过将thrB原启动子替换为PfliC弱启动子实现的；
(5)所述rhtA基因的过表达采用的启动子为Plpp启动子；
(6)所述thrA、ppc、pntAB、aspC、pckA、lysC、hom、asd/asdtm、rocG、aspA和gapN基因的过表达采用的启动子为强启动子Ptrc；
(7)所述sucAB弱化表达是通过将sucAB原启动子替换为PfliA弱启动子实现的。
4.如权利要求1所述的一株L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于，
所述天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶编码基因thrA，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述嘧啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述天冬氨酸转氨酶的编码基因aspC，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因pckA，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述天冬氨酸激酶III的编码基因lysC，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述高丝氨酸脱氢酶的编码基因hom，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述天冬氨酸半醛脱氢酶的编码基因asd，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
所述天冬氨酸半醛脱氢酶的编码基因asdtm，核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
所述丙酮酸激酶的编码基因pykA，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
所述丙酮酸激酶的编码基因pykF，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
所述丙酮酸脱氢酶的编码基因poxB，核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
所述乙酸激酶的编码基因ackA，核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
所述乳酸脱氢酶的编码基因ldhA，核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
所述谷氨酸脱氢酶的编码基因rocG，核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
所述天冬氨酸解氨酶的编码基因aspA，核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
所述α-酮戊二酸脱氢酶的编码基因sucAB，核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因gapN，核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
所述氨基酸摄入载体蛋白的编码基因cycA，核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
5.权利要求1-4任意一项所述生产菌株的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，是在生产L-高丝氨酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，采用所述菌株发酵生产L-高丝氨酸的方法，包括以下步骤：
发酵罐发酵：以10％-20％接种量将种子培养物接至装有发酵培养基的发酵罐进行发酵培养，发酵温度30-37℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在20-50％，流加含0-5g/甜菜碱的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％，维持发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期46-54h。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵培养基成分为：10-20g/L葡萄糖，2-6g/L酵母粉，1-5g/L胰蛋白胨，1-3g/L KH2PO4，0.5-2g/L MgSO4·7H2O，5-15mg/L FeSO4·7H2O，5-15mg/L MnSO4，其余为水，pH调至6.8-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，种子培养方法如下：用接种环将新鲜斜面活化的菌株接种至种子培养基中，调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-800rpm，30-35℃培养6-8h；
种子培养基成分为：15-30g/L葡萄糖，2-5g/L酵母粉，1-5g/L胰蛋白胨，1.5-3g/LKH2PO4，5-15mg/L FeSO4·7H2O，4-12mg/L MnSO4，其余为水，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
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