CN117186202B - 一种新细胞因子csbf及其在干眼治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新细胞因子CSBF及其在干眼治疗中的应用，新细胞因子CSBF为人类CSBF蛋白或小鼠CSBF蛋白，CSBF重组蛋白可作为靶点应用于制备用于治疗干眼的药物中。本申请发现干眼小鼠角膜Csbf表达增加，Csbf敲除小鼠干眼加重，提示CSBF在干眼免疫中发挥抑炎作用。CSBF重组蛋白可减轻干眼小鼠眼表损伤，同时抑制高渗刺激下人角膜上皮细胞的炎症因子水平，提示CSBF可治疗干眼，本专利中的CSBF可作为干眼治疗的新靶点，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，特别涉及一种新细胞因子CSBF及其在干眼治疗中的应用。
背景技术
干眼是临床最常见的眼表疾病，占眼科门诊患者的30%以上，主要症状包括眼睛干涩、异物感、烧灼感与瘙痒，严重威胁眼健康，是近二十年眼科发展最快的领域之一。眼表炎症与损伤是干眼的核心发病机制之一，细胞因子在干眼发病的炎症和免疫调控环节发挥了重要作用。
目前，已成功上市并应用于临床的靶向炎症因子的干眼药物较少，代表性药物为抑制IL-2产生及CD4+T细胞活化的环孢素滴眼液，但其仍存在治疗周期长、疗效不一等问题，因此必须探索新的治疗药物或靶点来提高干眼的治疗效果。
结肠衍生的SUSD2 结合蛋白（Colon-derived SUSD2 binding factor，CSBF）又称C10orf99（Chromosome 10 open reading frame 99 ），是北京大学医学部免疫学系韩文玲教授课题组发现的具有重要免疫调控功能的新细胞因子。人、小鼠CSBF 分别含有81、78 个氨基酸，二者均为经典分泌蛋白，N 端24 个氨基酸是典型的信号肽序列。国内外对于CSBF的功能研究尚不多。近年来有报道指出CSBF 在银屑病皮损组织中显著高表达，或可作为银屑病的诊断标志物。有证据表明，CSBF 在银屑病中起保护作用。银屑病与干眼同属于皮肤黏膜相关疾病，二者在发病机制和治疗措施方面有很多共同点。但目前，尚无研究报道CSBF在干眼发病中发挥的重要作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新细胞因子CSBF及其在干眼治疗中的应用，CSBF在干眼发病中发挥着重要作用。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
本申请的第一目的在于提供一种新细胞因子CSBF在制备治疗干眼药物中的应用。
优选地，所述新细胞因子CSBF为人类CSBF蛋白或小鼠CSBF蛋白。
本申请的第二目的在于提供一种CSBF重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：通过亚克隆法构建人CSBF 的表达质粒pCDNA3.1-hCSBF-6×His-2×Strep-Flag和小鼠CSBF 的表达质粒pcDB-mCsbf-Flag-2xStrep-6xHis，转染293F细胞进行诱导表达后提取并纯化上清中蛋白，鉴定，得到CSBF重组蛋白。
本申请的第三目的在于提供一种CSBF重组蛋白。
本申请的第四目的在于提供一种CSBF重组蛋白作为靶点在制备用于治疗干眼的药物中的应用。
本申请的第五目的在于提供一种用于诊断干眼症的试剂盒，所述试剂盒包括CSBF重组蛋白。
本申请的第六目的在于提供一种CSBF重组蛋白在制备诊断干眼试剂盒或诊断试剂中的应用。
优选地，所述CSBF重组具有较好的抗炎作用，能显著降低高渗刺激下人角膜上皮细胞的炎症因子水平。
优选地，所述炎症因子包括IL1B、IL6和TNFA。
本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
本申请发现干眼小鼠角膜Csbf表达增加，Csbf敲除小鼠干眼加重，提示CSBF在干眼免疫中发挥抑炎作用。CSBF重组蛋白可减轻干眼小鼠眼表损伤，同时抑制高渗刺激下人角膜上皮细胞的炎症因子水平，提示CSBF可治疗干眼。本专利中的CSBF可作为干眼治疗的新靶点，具有很好的应用前景。
附图说明
被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。
图1为正常及干眼条件下CSBF表达情况，其中：（A）Csbf在正常小鼠结膜组织中高表达；（B）与对照组小鼠相比，干眼组小鼠角膜Csbf 的mRNA表达水平升高；（C）高渗刺激（体外模拟干眼环境）处理人源化角膜上皮3h、8h、12h和24h后，CSBF的表达均上调。
图2 为Csbf -/- 小鼠鼠尾DNA的基因型鉴定结果。
图3为四组小鼠眼表参数分析，其中：（A）泪液分泌量结果；（B）CFS评分；（C）CFS染色图片。
图4为小鼠CSBF重组蛋白的的考马斯亮蓝染色结果。注：Marker：蛋白电泳指示条带；NC：镍柱结合过程流出液；mCSBF：浓缩的小鼠CSBF蛋白。
图5 为CSBF重组蛋白对干眼小鼠眼表体征的影响: 干眼+CSBF治疗组与干眼组相比，CFS评分减低（A和B），泪液分泌量无明显改变（C）；（D）正常组300 mOsm、高渗刺激500mOsm及不同浓度CSBF重组蛋白干预后人源化角膜上皮细胞中炎症因子IL1B、IL6和TNFA的表达情况。 ns P＞0.05，*P＜0.05，***P＜0.001。
具体实施方式
现在来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
实施例1CSBF表达情况
（1）Real-time PCR检测正常小鼠不同组织Csbf表达水平：二氧化碳处死小鼠后，取材小鼠不同组织（包括角膜上皮、角膜基质、结膜、睑板腺、泪腺、皮肤、结肠、淋巴结、脾脏），Trizol法提取不同组织总RNA后分光光度计确定RNA浓度及纯度（OD260/280+电泳），取2μg RNA反转录，构建相应目的基因的Real-time PCR引物（跨越内含子），Real-time PCR检测小鼠不同组织CsbfmRNA表达水平（如图1-A所示）。
（2）干眼小鼠模型制作并检测其角膜Csbf表达：取8-10周龄雌性C57BL/6小鼠，置于湿度15±3%、风速3-5米/秒、温度21-23℃的干燥环境中，皮下注射东莨菪碱（0.5mg/0.1ml）4次/日，间隔4-6小时，饲养14天作为混合型小鼠急性干眼模型。对照组小鼠饲养在正常环境中（湿度=60-80％；温度=21-23℃）。二氧化碳处死上述两组小鼠后，分别取材角膜组织检测CsbfmRNA表达水平（如图1-B所示）。
（3）人源化角膜上皮细胞等渗或高渗处理后检测CSBF表达：将人源化角膜上皮细胞培养在DMEM/F12培养基中，细胞汇合度接近70%时加入等渗（310 mOsm）或高渗（500mOsm）溶液刺激，其中等渗条件为正常DMEM/F12培养基，高渗条件为正常DMEM/F12培养基中加入 90mM NaCl。角膜上皮细胞在不同渗透压条件下分别处理3h、8h、12h、24h后检测CSBF mRNA表达水平（如图1-C所示）。
实施例2 利用CRISPR/Cas9技术制备Csbf -/- 小鼠
申请人所在课题组利用CRISPR/Cas9 技术制备Csbf 敲除小鼠（C57BL/6小鼠来源）。目标基因（MGI 号）：2610528A11Rik（MGI:1917295）。设计的guide RNA 序列为：GAGCCGGAGTCTCACGCCTA(5’-3’)，预期使第一外显子缺失111 个碱基对（包括翻译起始位点ATG）。
提取小鼠鼠尾DNA，采用PCR 方法鉴定小鼠基因型（如图2所示）。对PCR 结果中WT与KO 的目的片段进行测序。
结果表明：与WT 小鼠相比，KO 小鼠Csbf 基因缺失111 个碱基对（包括翻译起始位点ATG），与预期相同。上述结果证明我们成功制备了Csbf -/- 小鼠。
实施例3Csbf基因敲除导致干眼小鼠眼表损伤加重
（1）酚红棉线实验检测小鼠泪液分泌量：取酚红棉线，将其一端置于小鼠外眦部停留15秒，取出后将湿润变色部分与标尺比对测量长度，登记数值（如图3-A所示）。
（2）荧光素钠染色（CFS）检测小鼠眼表损伤：将1μL浓度为0.5%的荧光素钠染液滴入小鼠结膜囊，于裂隙灯下钴蓝光观察小鼠角膜染色情况（如图3-C所示）。根据NEI系统对角膜染色严重程度进行评分：角膜分为中央区及周边共5个区域，每个区域根据染色情况评0-3分（如图3-B所示）。
结果表明：（A）泪液分泌量结果：WT干眼组与WT组相比，KO干眼组与KO组相比，泪液分泌量在第7天和第14天均有显著下降。但WT干眼组与KO干眼组相比，同时间点泪液分泌量无明显差异（P＞0.05）。（B）CFS结果和（C）CFS评分：四组小鼠角膜起始状态CFS均阴性，四组之间CFS评分无明显差异（P＞0.05）。造模14天以后，WT组和KO组CFS仍为阴性，CFS评分无明显差异（P＞0.05）；WT干眼组角膜有散在点状着色，KO干眼组角膜大面积着色并有融合。WT干眼组较WT组CFS评分增高，KO干眼组较WT干眼组CFS评分也显著增高。注：CFS：角膜荧光素钠染色。**P＜0.01，***P＜0.001。
实施例4 CSBF重组蛋白制备
本发明中使用亚克隆法构建小鼠CSBF 的表达质粒pcDB-mCsbf-Flag-2xStrep-6xHis，转染293F细胞，3天后提取并纯化上清中蛋白。采用镍柱结合蛋白His标签+咪唑洗脱的方法提取小鼠CSBF蛋白，随后超滤管浓缩小鼠CSBF蛋白。考马斯亮蓝染色显示蛋白纯度较高（如图4所示）。
（1）CSBF重组蛋白的表达和纯化方法具体如下：
1）利用293F细胞表达人和小鼠重组蛋白的详细方法
按照5x10^5 cells/ml 的接种量往1L的摇瓶的300ml培养基中接种细胞，于37℃，120rpm 5%二氧化碳浓度的摇床培养箱中孵育24h，直到细胞密度达到1x10^6 cells/ml。吸取300ug的已过滤除菌的质粒（pCDNA3.1-hCSBF-6×His-2×Strep-Flag或pCDNA3.1-mCsbf-6×His-2×Strep-Flag）加到30ml的PBS中，涡旋充分混匀，将1.2ml过滤除菌的PEI溶液（0.5mg/ml）加入到PBS/DNA的混合液中，PEI-DNA 混合液室温下静置20min，将PEI-DNA混合液加到细胞里。转染后，将细胞放于37℃，120 rpm，5%二氧化碳浓度的摇床培养箱中继续孵育，最佳上清收取时间根据预实验判定为转染后第4天。3000 g 离心5 min，留存上清，45μm滤器过滤上清。
2）利用HisTrap excel预装柱（品牌：Cytival，货号：29048586）和Cytiva AKTA go液相层析系统从上清中纯化CSBF蛋白。
A. 所需缓冲液如下：
① 平衡/结合缓冲液：20mM 磷酸盐缓冲液（NaH2PO4/Na2HPO4），0.5M NaCl，pH7.4；
② 洗涤缓冲液：20mM 磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，50mM 咪唑，pH7.4；
③ 洗脱缓冲液： 20mM 磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，500mM 咪唑，pH7.4。
B. 样品准备
收集293F上清至离心管，4500 rpm，4℃离心5 min去除细胞后，通过0.45 μm过滤器过滤样品，以去除细胞碎片和/或其他杂质颗粒。
C. 纯化操作
a. 用蒸馏水填充泵管；取下塞子并将以"液滴对液滴（drop-to-drop）"的方式将预装柱连接到色谱系统或实验室泵，以避免将空气进入柱子；确保连接器已拧紧以防止泄漏；
b. 除去色谱柱出口处的盖子；
c. 使用5 个柱体积蒸馏水洗去乙醇，流速为1mL/min；
d. 使用至少5 个柱体积结合缓冲液平衡柱子，流速为1mL/min-4mL/min；
e. 上样，流速为1mL/min-4mL/min；
f. 使用20个柱体积洗涤缓冲液洗柱，流速为1mL/min ；
g. 使用5个柱体积洗脱缓冲液进行一步法洗脱。
D. 超滤
a. 将洗脱液装入30kDa超滤管中，5000rpm，4℃离心10min，留取下层滤过液。加入5mL PBS洗涤超滤管，5000rpm，4℃离心10min，留取下层滤过液；
b. 将两次滤过液合并，装入3kDa超滤管中，5000rpm，4℃离心30min，留取上层超滤管内液体；
c. 10mL PBS洗涤超滤管内液体，5000rpm，4℃离心30分钟，弃下层滤过液，重复三次。最后一次超滤将上层液体浓缩至500μL并留取滤过液；
d. 纯化所得的蛋白质通过BCA定量检测浓度，并经过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色确认纯度。
（2）人CSBF蛋白序列MPLLLLLPLLWAGALAMRGSHHHHHHGSSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEKGGSADYKDDDDKGAGSTGGTKRRPAKAWSGRRTRLCCHRVPSPNSTNLKGHHVRLCKPCKLEPEPRLWVVPGALPQV。
（3）小鼠CSBF蛋白序列
MPLLLLLPLLWAGALAMRGSHHHHHHGSSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEKGGSADYKDDDDKGAGSTGGTRRHPAKSLKLRRCCHLSPRSKLTTWKGNHTRPCRLCRNKLPVKSWVVPGALPQI。
实施例5 CSBF重组蛋白滴眼的治疗效果
动物实验分为三组：对照组，干眼组和干眼+CSBF重组蛋白组。与干眼组相比，干眼+CSBF重组蛋白组小鼠的眼表损伤减轻（CFS评分，图5-A、B），泪液分泌量（酚红棉线实验）无明显差别（图5-C）。细胞实验结果提示，0.1ng/mL和0.01ng/mL的CSBF重组蛋白有较好的抗炎作用，能显著降低高渗刺激（模拟干眼环境）下炎症因子IL1B、IL6和TNFA的上调（图5-D）。
本结果中小鼠CSBF重组蛋白滴眼和人CSBF重组蛋白处理人源化角膜上皮细胞的方法如下，其余实验操作的详细步骤同前。
（1）小鼠CSBF重组蛋白滴眼：在制备干眼小鼠模型的同时，对干眼小鼠给予10 ng/μLCSBF重组蛋白局部滴眼，2 μL/次/眼，每天2次，与打药频率一致。点药流程：单手握住小鼠，使其睁大眼，2.5 μL移液器吸取2 μL重组蛋白，滴加至眼球表面，点完后继续保持小鼠不动30 s。
（2）人CSBF重组蛋白处理人源化角膜上皮细胞：24孔板接种人源化角膜上皮细胞，1.5*10^5/孔，24小时后使用不同浓度的人CSBF重组蛋白预处理2h，而后高渗（500 mOsm）处理细胞，3h后收RNA，检测不同渗透压刺激及不同浓度CSBF重组蛋白处理后炎症因子IL1B、 IL6和TNFA的表达水平。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (5)
1.一种细胞因子CSBF在制备治疗干眼药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞因子CSBF为人类CSBF蛋白或小鼠CSBF蛋白。
3. CSBF重组蛋白在制备用于治疗干眼的药物中的应用，其特征在于，所述CSBF重组蛋白通过以下方法制备得到：通过亚克隆法构建人CSBF 的表达质粒pCDNA3.1-hCSBF-6×His-2×Strep-Flag和小鼠CSBF 的表达质粒pcDB-mCsbf-Flag-2xStrep-6xHis，转染293F细胞进行诱导表达后提取并纯化上清中蛋白，鉴定，得到CSBF重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CSBF重组蛋白具有抗炎作用，能降低高渗刺激下人角膜上皮细胞的炎症因子水平。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述炎症因子包括IL1B、IL6和TNFA。
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