CN117180242A - 龙血素a在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了龙血素A在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用，属于制药领域。龙血素A对标准敏感幽门螺杆菌、临床敏感及耐药幽门螺杆菌等均具有很好的抗菌活性，最低抑菌浓度范围为4～16μg/mL，对幽门螺杆菌的生物膜形成具有抑制作用，能破坏成熟的幽门螺杆菌生物膜，比甲硝唑效果强。龙血素A能杀死阿莫西林诱导形成的幽门螺杆菌球形菌和自然诱导形成的球形菌。龙血素A在酸性条件下也具有很强的杀菌作用，杀菌效果优于甲硝唑。龙血素A具有特异性抗幽门螺杆菌的效果，并且能与临床常见抗幽门螺杆菌的抗生素以及奥美拉唑具有协同或相加作用。龙血素A在抗幽门螺杆菌过程中不易产生耐药，对小鼠胃内定植幽门螺杆菌有很强的杀灭作用，其与奥美拉唑联用的效果与标准三联疗法相当。
Description
技术领域
本发明属于制药领域，提供龙血素A的制药用途。
背景技术
早在1983年，巴里.马歇尔就发现了幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，以下简称Hp)，他在58例患者的胃窦黏膜标本中发现螺旋或弯曲杆菌，并分离鉴定了这种致病菌是革兰氏阴性微需氧菌。在后续的研究中，Hp也被证明与胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)和胃癌相关。1994年，WHO(世界卫生组织)通过长期的流行病学统计以及哺乳动物实验证明了Hp的致癌能力，将幽门螺杆菌归类为I类致癌原，可见该病原菌对人类致病的严重性以及危害性。Hp感染之后，主要分布在人体的胃、十二指肠等部位，在胃内Hp尿素酶水解尿素产生氨气形成“氨云”，保护菌体免于胃酸的侵蚀，菌体还会分泌过氧化氢酶和过氧化物歧化酶，逃避中性粒细胞的杀伤作用；Hp在胃粘膜上皮细胞定植生长后，会释放细胞毒素CagA、空泡毒素VacA等毒力因子，对上皮细胞造成损伤，导致急性、慢性胃炎，如果病情进一步发展和演变，则形成慢性萎缩性胃炎、胃上皮肠化生、不典型增生，最终演变为胃癌。
目前，世界卫生组织推荐的根除Hp感染的治疗方案是三联或四联疗法，前者即质子泵抑制剂(奥美拉唑等)加两种抗生素(克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星和甲硝唑等选二种)，后者再添加铋剂(枸橼酸铋钾等)。但随着抗生素的广泛、长期使用，Hp对抗生素的耐药越来越严重，导致根除率越来越低，“难治性病例”越来越多。尤其在经济发展水平较低的区域，耐药现状更加严重，针对如此严峻的耐药形势，新型抗幽门螺杆菌化合物的发掘具有十分重要的研究意义。
发明内容
本发明是针对上述存在的技术问题提供一种龙血素A在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
龙血素A的化学式如下式，是临床所用中药龙血竭中的有效活性成分，龙血竭具有活血、抗炎、抗菌、镇痛、降血脂以及促进表皮修复等药理作用。
龙血素A在制备抗菌药物中的应用，所述菌为幽门螺杆菌，包括临床耐药幽门螺杆菌以及敏感性幽门螺杆菌。
龙血素A与质子泵抑制剂的组合物在制备抗耐药性或敏感性幽门螺杆菌药物中的应用。
上述质子泵抑制剂为奥美拉唑。
龙血素A在制备治疗耐药性或敏感性幽门螺杆菌感染导致的急、慢性胃炎，胃、十二指肠溃疡药物中的应用。
治疗幽门螺杆菌感染的药物，组分为龙血素A和奥美拉唑。
有益效果：龙血素A可用于制备抗菌感染的药物。本发明展示的龙血素A对浮游生长的和已形成的成熟生物膜的幽门螺杆菌都有很好的杀灭作用，对阿莫西林诱导形成以及自然形成的球形菌具有杀灭作用，可用于治疗耐药性或敏感性幽门螺杆菌感染导致的急、慢性胃炎，胃、十二指肠溃疡等胃部疾病，而且毒副作用小，对肠道菌群的稳态具有维持作用，能有效缓解幽门螺杆菌耐药性问题。
附图说明
图1.体外诱导检测幽门螺杆菌G27菌株对龙血素A的耐药性。
图2.龙血素A对两种条件诱导形成的幽门螺杆菌G27球形菌的杀菌效果。A，4×MIC和16×MIC条件下，龙血素A对阿莫西林诱导形成的球形菌的杀菌作用评价；B，4×MIC和16×MIC条件下，龙血素A对自然培养诱导形成的球形菌的杀菌作用评价；C，扫描电镜下观察龙血素A对球形菌的杀菌效果；D，阿莫西林诱导形成的球形菌以及自然诱导形成的球形菌分别在1小时和12小时处理后的球形菌形态；注：LrA,龙血素A；MTZ,甲硝唑；AMX,阿莫西林；CLA，克拉霉素；LEV，左氧氟沙星。
图3.龙血素A对幽门螺杆菌G27菌株的生物被膜形成的抑制作用以及对成熟生物被膜的破坏作用。A,结晶紫染色法检测1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC龙血素A对幽门螺杆菌G27菌株的生物被膜形成的抑制作用；B,Alarm Blue染色法检测1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC龙血素A对幽门螺杆菌G27菌株成熟生物被膜的破坏作用。注：LrA,龙血素A；MTZ,甲硝唑，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；C，Alarm Blue染色方法检测龙血素A对G27菌株的生物被膜形成的抑制作用；D,SYTO9-PI双染色和激光共聚焦检测龙血素A对G27菌株成熟生物被膜的杀灭作用。
图4.龙血素A体外酸性条件下抗幽门螺杆菌活性检测。在pH为2.5并且含有10mMUrea的处理条件下，检测1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC龙血素A对幽门螺杆菌G27菌株的杀灭作用，并在相同MIC倍数处理条件下，检测对照药甲硝唑的酸性条件下杀菌作用。注：LrA,龙血素A；MTZ,甲硝唑。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图5.龙血素A在小鼠体内对NSH57菌株和BHKS00388菌株的杀灭作用。A,幽门螺杆菌感染小鼠构建急性胃炎动物模型和药物治疗流程图；B，不同治疗组治疗后幽门螺杆菌NSH57菌株在小鼠胃粘膜定植量的检测结果。C，不同治疗组治疗后幽门螺杆菌BHKS00388在小鼠胃粘膜定植量检测结果。设溶剂对照组(CMC，0.5％羧甲基纤维素钠+0.2％吐温80)、三联治疗组(OPZ+AC)、奥美拉唑和龙血素A联用治疗组(OPZ+LrA)。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；D，龙血素A对耐药幽门螺杆菌BHKS00388感染的小鼠胃粘膜炎症的修复作用。胃粘膜组织分别进行HE染色和TUNEL染色，放大400倍。
图6.龙血素A处理对小鼠粪便菌群的多样性和组成的影响。A,用Chao1(左)和Shannon(右)指数从16S rRNA基因测序数据计算出三组药物治疗组的小鼠肠道菌群的α-多样性分析；B,基于OTU丰度的PCA分析，括号内的数字表示主要成分对样品差异的贡献度，一个点代表每个样品，置信区间设定为0.99；C，在门水平上，从测序数据中确定的每组样品中细菌的相对丰度。数据根据每个组的样本数沿X轴进行聚类。D，在属水平上，每组样品的16SrRNA的平均丰度分析。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员可全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1龙血素A体外抗幽门螺杆菌的活性测定
通过测定龙血素A对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(MIC)来确定其抗幽门螺杆菌的活性。
(1)材料
①化学品：龙血素A、B、C、D以及Loureiriol、剑叶龙血素A、剑叶龙血素C购于ChemFaces公司，甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素和左氧氟沙星等购于阿拉丁公司。
②菌株：幽门螺杆菌标准菌株26695和G27；其他临床菌株为南京医科大学附属第一医院和附属逸夫医院从临床患者胃粘膜样本中分离鉴定所得。
③培养基和主要试剂：脑心浸液培养液(BHI)、哥伦比亚培养基、选择性抗生素(万古霉素、多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶)、小牛血清(FCS)和100％二甲基亚砜(DMSO)。
④主要仪器：BINDER CB160三气培养箱、紫外分光光度计、恒温摇床(Thermo)、离心机、电子天平等。
⑤耗材：EP管、离心管、Tip头等。
(2)方法：采用液体稀释法检测龙血素A对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(MIC，100μL体系)
①分别配备6.4mg/mL的龙血素A、B、C、D以及Loureiriol、剑叶龙血素A、剑叶龙血素C和12.8mg/mL的甲硝唑(MTZ)储存溶液，溶剂均为100％DMSO。
②备用菌液制备：取固体平板上对数期生长的幽门螺杆菌用BHI(含10％FCS)制作成菌悬液，在三气培养箱摇菌培养至对数期，调整浓度OD600为0.2(菌量浓度约为1×108CFU/mL)，稀释10倍，菌量约为1×107CFU/mL，备用。
③96孔板制备：第一孔先加BHI培养液(含10％FCS)178μL，再加2μL的龙血素A、B、C、D以及Loureiriol、剑叶龙血素A、剑叶龙血素C储存溶液，采用二倍稀释法稀释至第8孔；另外一排孔以同样方法加甲硝唑。
④加菌液：取10μL备用菌液加入上述每孔中(每孔菌量浓度约为1.0×106CFU/mL)内，龙血素A、B、C、D以及Loureiriol、剑叶龙血素A、剑叶龙血素C的浓度依次为64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL。另外一排每孔分别加100μL BHI培养液(含10％FCS)，作为无菌对照组；再一排每孔分别加90μL BHI培养液(含10％FCS)和10μL上述备用菌液，作为阳性对照组，放置三气培养箱培养。
⑤结果判断：培养48或72h后判读结果，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔(即不含药物)内细菌明显生长以及无菌对照组无菌生长时，试验才有意义。重复3次试验。
(3)结果
结果见表1。
表1龙血素A及系列化合物对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(μg/mL)
注：LrA，龙血素A；LrB，龙血素B；LrC，龙血素C；LrD，龙血素D；Con A，剑叶龙血素A；Con C，剑叶龙血素C；MTZ,甲硝唑。
从上表可知，龙血素A对30株幽门螺杆菌(包括2株标准菌株和28株临床耐药菌株)的MIC范围为4～16μg/mL，比其他系列化合物的抗菌效果更好，表明龙血素A在体外对幽门螺杆菌具有很强的抗菌活性，具有良好的开发前景。
实施例2龙血素A体外抗菌谱的检测
(1)材料
①化学品：龙血素A购于Chem Faces公司，甲硝唑购于阿拉丁公司，氨苄西林、两性霉素B、万古霉素购于MCE公司。
②菌株：幽门螺杆菌标准菌株26695和G27以及ATCC菌株，其他临床菌株为南京医科大学附属第一医院和附属逸夫医院从临床患者胃粘膜样本中分离鉴定所得。
③培养基和主要试剂：BB培养基、LB培养基、其余同前所述。
④主要仪器：37℃培养箱、其余同前所述
⑤耗材同前所述。
(2)方法：采用液体稀释法检测龙血素A对革兰阴性菌、革兰阳性菌以及真菌的最低抑菌浓度(MIC，100μL体系)。幽门螺杆菌检测方法同上，其他非Hp菌株的菌量终浓度为每孔菌量浓度约为1.0×105CFU/mL，真菌的菌量终浓度为1.0×102CFU/mL
(3)结果
结果见表2。
表2龙血素A的抗菌谱(μg/mL)
由表2所示，龙血素A对幽门螺杆菌具有特异性抗菌作用，对其他革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌没有抗菌效果。
实施例3龙血素A与临床常用抗生素及奥美拉唑的体外棋盘法药敏检测
(1)材料
①化学品：龙血素A购于Chem Faces公司，左氧氟沙星、甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、四环素、呋喃唑酮购于阿拉丁公司，奥美拉唑购买于MCE生物试剂公司。
②菌株：幽门螺杆菌标准菌株26695和G27，其他临床菌株为南京医科大学附属第一医院和附属逸夫医院从临床患者胃粘膜样本中分离鉴定所得。
③培养基和主要试剂：BB培养基、LB培养基、其余同前所述。
④主要仪器：37℃培养箱、三气培养箱、其余同前所述
⑤耗材同前所述。
(2)方法：通过联合药敏实验检测龙血素A分别与左氧氟沙星、甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、四环素、呋喃唑酮、奥美拉唑的联合抗菌效果，具体操作如下：
①化合物a药板的制备：将化合物a稀释为400倍MIC，取50μl至96孔板的B3孔，并在B4～B12孔中加入25μl DMSO，从B3孔中取25ul药液至B4孔，吹打混匀，再取25ul药液至下一孔，吹打混匀，通过2倍梯度稀释至B12孔，备用；
②化合物b药板的制备：将96孔板先在全板上，铺上90μl BHI+10％FCS液体培养基，在C2～C12孔，继续铺上89μl BHI+10％FCS液体培养基，加入1μl的化合物b母液使得化合物b终浓度为MIC的4倍，向下倍比稀释，A行设置为阴性对照孔不加菌只含100μl液体培养基，第1列为阳性对照孔不含药只含90μl液体培养基和10μl菌液；
③联合药敏板的制备：用排枪将化合物a药板中的化合物a取1μl对应加入到化合物b药板中，即B3～B12孔的化合物a取1μl加入到b药板的B3～B12孔、C3～C12孔、D3～D12孔、E3～E12孔、F3～F12孔、G3～G12孔、H3～H12孔；
④菌液的接种：将Hp标准菌株G27培养至对数生长期，在BHI+10％FCS液体培养基中调整为OD600＝0.015，约为1×107CFU/ml，在联合药敏板上接种，每孔接种10μl，阳性对照孔加菌，阴性对照孔不加菌，置三气培养箱培养2～3天，观察结果；
⑤结果判读：培养48～72h后，若阳性对照孔细菌生长良好，可进行结果判读，第2列可以观察并记录化合物a的单独用药MIC，B行可以观察记录化合物b单独用药的MIC值，观察到联合用药抑菌孔时记录化合物a、b的药物浓度，并进行FICI值计算，FICI＝MICa联合/MICa单独+MICb联合/MICb单独)，若FICI≤0.5时，则表明两种化合物具有协同作用；若FICI值介于0.5～1，则表明两种化合物具有相加作用；若FICI值介于1～4，则表明两种化合物之间为无关作用；若FICI＞4，则表明两种化合物之间是拮抗作用，联合药敏实验共进行三次独立重复。
(3)结果
结果见表3。
表3龙血素A与临床常用抗生素及PPI对10株Hp菌株的联合抗菌作用
注：LrA为龙血素A；LEV为左氧氟沙星；MTZ为甲硝唑；CLR为克拉霉素；AMX为阿莫西林；TET为四环素；FZD为呋喃唑酮；PPI为奥美拉唑
从上表可知，龙血素A与临床常用抗生素联合使用时，表现出更多的相加作用，而与奥美拉唑联合使用时，在60％的菌株中显示出协同作用。因此，龙血素A具有与临床常用抗生素或者奥美拉唑协同抗幽门螺杆菌感染的治疗潜力，具有良好的开发前景。
实施例4龙血素A体外对幽门螺杆菌的耐药性检测
(1)材料
如实施例1材料。
(2)方法
将幽门螺杆菌G27菌株从新鲜固体平板接种到5mL BHI(含10％FCS)中，调整菌液浓度至OD600＝0.2左右，再添加龙血素A至终浓度4μg/mL(1/2×MIC)，放置三气培养箱培养48小时，观察细菌生长情况，并取菌液传代，继续上述方法诱导耐药，如生长良好，则倍增龙血素A浓度，如生长缓慢或不生长，则维持现有龙血素A浓度。共进行60天的耐药诱导，每隔4天检测MIC。对照组为甲硝唑，起始浓度设置也为1/2×MIC。
结果见图1。由图1所示，在连续传代期间，未观察到幽门螺杆菌G27对龙血素A耐药性的形成，而幽门螺杆菌G27在前5次传代后发展出对甲硝唑的抗性，导致MIC增加了4倍。这些结果证明龙血素A在幽门螺杆菌中具有极低的诱导耐药性的趋势。
实施例5龙血素A体外对球形幽门螺杆菌的抗菌作用
(1)材料
如实施例1材料。
(2)方法：采用平板菌落计数法检测龙血素A对球形幽门螺杆菌的抗菌活性。
①阿莫西林诱导形成的球形菌：将幽门螺杆菌G27菌株从新鲜固体平板接种到布鲁氏肉汤培养液(含2％FCS)，调整菌液浓度至OD600＝0.4左右，再添加阿莫西林至终浓度0.063μg/mL，放置三气培养箱培养24小时，革兰氏染色镜检观察确定G27菌株全部转变为球形菌，而对照实验(未添加阿莫西林)中G27菌株为螺杆状，12小时培养之后仍旧为球形(图2D)。
②自然诱导形成的球形菌：将幽门螺杆菌G27菌株从新鲜固体平板接种到布鲁氏肉汤培养液(含2％FCS)，调整菌液浓度至OD600＝0.1左右，放置三气培养箱培养96小时，革兰氏染色镜检观察确定G27菌株全部转变为球形菌，12小时培养之后仍旧为球形(图2D)。
③药物处理：离心球形菌株弃上清，添加布鲁氏肉汤培养液(含2％FCS)稀释至菌量终浓度约为OD600＝0.5，然后分别加入64×MIC终浓度的阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星和4×MIC/16×MIC龙血素A，放置三气培养箱培养。
④平板计数：在1h、12h取出100μL菌液，直接在每100μl体系中加入10μl AlarmBlue检测试剂，避光置于三气培养箱培养4h，通过酶标仪检测荧光强度，激发光530nm，发射光590nm。
(3)结果
结果见图2。由图2所示，龙血素A体外对抗幽门螺杆菌球形菌有极强的杀灭作用，在4×MIC和16×MIC处理条件下随着时间的延长，能逐渐杀灭两种条件诱导形成的球形菌，而临床常用抗生素如阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星等在64×MIC条件下也难以杀灭球形菌，数据表明龙血素A对幽门螺杆菌球形菌具有更强、更好的杀菌效果，具有良好的开发前景。
实施例6龙血素A对幽门螺杆菌生物被膜的杀灭作用
(1)材料
结晶紫购于阿拉丁公司，检测试剂包括两种荧光染料SYTO9和碘化丙啶(PI)，Alarm Blue其余材料如实施例1材料。
(2)方法：采用结晶紫染色、荧光共聚焦和平板菌落计数法检测龙血素A对幽门螺杆菌的抗生物膜活性。
①龙血素A对幽门螺杆菌生物膜形成的抑制作用：将幽门螺杆菌G27菌株在添加10％FBS的布鲁氏菌肉汤中过夜培养，用上述新鲜培养基稀释至OD600为0.15，并向其中加入不同浓度的龙血素A、甲硝唑(作为阳性对照)或等量的DMSO(作为溶剂对照)，然后铺在96孔板，置于三气培养箱中培养3天后，用结晶紫染色法检测生物膜的相对量。
②龙血素A对已形成的成熟生物被膜的破坏作用：将幽门螺杆菌G27菌株在添加10％FBS的布鲁氏菌肉汤中过夜培养，用上述新鲜培养基稀释至OD600为0.15，然后铺在96孔板，置于三气培养箱中培养3天以形成生物膜后，弃去培养基，然后用PBS清洗平板两次。在新鲜布鲁氏菌肉汤中添加不同浓度的龙血素A、MTZ(作为阳性对照)或等量的DMSO(作为溶剂对照)，加入96孔板中继续培养24小时，用结晶紫染色法检测生物被膜的相对量。
③激光共聚焦显微镜检测龙血素A对生物膜中细菌活性的影响。生物膜内的细菌活力通过使用Live/Dead BacLight细菌活力试剂盒(Invitrogen，美国)进行评估，该试剂盒由两种荧光染料SYTO9和碘化丙啶(PI)组成。如上制备幽门螺杆菌G27菌株生物膜，用不同浓度的龙血素A、MTZ(作为阳性对照)或等量的DMSO(作为溶剂对照)处理。在三气培养箱孵育24小时后，用PBS洗涤未黏附的生物膜3次，然后用两种荧光染料在室温下黑暗中染色30分钟。漂洗后，使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM710；Carl Zeiss，德国)观察图像，并随机检查更多视野。荧光染料SYTO9和PI区分活细胞(绿色细胞)和死亡细胞(红色细胞)。
④Alarm Blue检测龙血素A对生物膜中细菌活性的影响。如上制备和处理幽门螺杆菌G27细胞的生物膜。并在微需氧条件下处理24小时后，直接在每100μl体系中加入10μlAlarm Blue检测试剂，避光置于三气培养箱培养4h，取出进行拍照统计，通过颜色变化观察生物膜中细菌的活力。
(3)结果
结果如图3。由图3A所示，龙血素A可抑制幽门螺杆菌生物膜的形成，由图3B所示，龙血素A具有破坏幽门螺杆菌成熟生物膜的能力，且抗生物膜活性强于甲硝唑。由图3C和3D所示，龙血素A可杀灭生物膜中的幽门螺杆菌，其活性强于甲硝唑。
实施例7龙血素A在酸性条件下对幽门螺杆菌的杀菌作用
(1)材料
用稀盐酸调节pH＝2.5的BHI培养基，以及1M的Urea缓冲液，其余材料如实施例1材料。
(2)方法：采用CFU计数的方法检测龙血素A在酸性条件下对幽门螺杆菌的杀菌作用。
①将幽门螺杆菌G27菌株在添加10％FCS的BHI培养基中过夜培养，第一组用中性BHI+10％FCS稀释至OD600为0.3，分别用DMSO、1/4×MIC MTZ和LrA、1/2×MIC MTZ和LrA、1×MIC MTZ和LrA处理30分钟，分别取出100μl用中性BHI+10％FCS进行梯度稀释，涂布在哥伦比亚血琼脂培养基上，置入三气培养箱培养。
②第二组用pH＝2.5的BHI+10％FCS+10mM Urea缓冲液稀释至OD600为0.3，分别用DMSO、1/4×MIC MTZ和LrA、1/2×MIC MTZ和LrA、1×MIC MTZ和LrA处理30分钟，分别取出100μl用中性BHI+10％FCS进行梯度稀释，涂布在哥伦比亚血琼脂培养基上，置入三气培养箱培养，4天后进行CFU统计。
(3)结果
结果如图4。图4可见龙血素A在1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC条件下，在pH＝2.5时对幽门螺杆菌G27具有杀菌作用，且在每一个浓度梯度条件下的杀菌效果均优于甲硝唑。
实施例8龙血素A对小鼠胃内定植的幽门螺杆菌NSH57菌株的杀灭效果检测
(1)材料
菌株为幽门螺杆菌小鼠驯化菌株NSH57，小鼠为SPF级别的6周龄雌性C57BL/6小鼠，其他如实施例1材料。
(2)方法
①幽门螺杆菌NSH57菌株感染小鼠的体内模型构建：参考文章(Huang Y,Hang X,Jiang X,Zeng L,Jia J,Xie Y,Li F,Bi H.In Vitro and In Vivo Activities of ZincLinolenate,a Selective Antibacterial Agent against Helicobacterpylori.Antimicrob Agents Chemother[J].2019；63(6):e00004-19)。取10％小鼠胃组织检测幽门螺杆菌定植，定植量范围为1×105CFU/g以上认为定植成功，检测结果均有幽门螺杆菌定植，模型构建成功。
②分组：将造模成功的感染组平均分成3组，分别为奥美拉唑加龙血素A给药量为28mg/kg)组、奥美拉唑加阿莫西林(给药量14mg/kg)和克拉霉素(给药量为7mg/kg)组(标准三联组)、溶剂对照组，每组8只；所有组中奥美拉唑的给药量为138.2mg/kg，未感染幽门螺杆菌的8只小鼠为阴性对照组。
③给药：采取灌胃给药法，奥美拉唑先于其他药物前30分钟给药，给药后禁食禁水4小时；小鼠体重按照平均20g/只计算，每天给药1次，连续3天；溶剂对照组给0.5％羧甲基纤维素钠+0.2％吐温80溶液，容量、次数与上述相同。
④小鼠处理：最后一次给药48小时后进行安乐死，取胃组织进行幽门螺杆菌的分离培养和鉴定，并计算定植量。
(3)结果
结果如图5。由图5B所示，奥美拉唑加龙血素A组对小鼠体内幽门螺杆菌的杀灭作用与三联治疗组(奥美拉唑加阿莫西林和克拉霉素)相当。
实施例9龙血素A对小鼠胃内定植的多重耐药幽门螺杆菌BHKS00388菌株的杀灭效果检测
(1)材料
菌株为幽门螺杆菌小鼠驯化菌株BHKS00388，小鼠为SPF级别的6周龄雌性C57BL/6小鼠，其他如实施例1材料。
(2)方法
①幽门螺杆菌BHKS00388菌株感染小鼠的体内模型构建：参考文章(Huang Y,HangX,Jiang X,Zeng L,Jia J,Xie Y,Li F,Bi H.In Vitro and In Vivo Activities ofZinc Linolenate,a Selective Antibacterial Agent against Helicobacterpylori.Antimicrob Agents Chemother[J].2019；63(6):e00004-19)。取10％小鼠胃组织检测幽门螺杆菌定植，定植量范围为1×105CFU/g以上认为定植成功，检测结果均有幽门螺杆菌定植，模型构建成功。
②分组：实验组将造模成功的感染组平均分成3组，分别为奥美拉唑加龙血素A给药量为28mg/kg)组、奥美拉唑加阿莫西林(给药量14mg/kg)和克拉霉素(给药量为14mg/kg)组(标准三联组)、溶剂对照组，每组6只；所有组中奥美拉唑的给药量为64.1mg/kg，未感染幽门螺杆菌的6只小鼠为阴性对照组。
③给药：采取灌胃给药法，奥美拉唑先于其他药物前30分钟给药，给药后禁食禁水4小时；每天给药1次，连续4天；溶剂对照组给0.5％羧甲基纤维素钠+0.2％吐温80溶液，容量、次数与上相同。
④小鼠处理：离最后一次给药后1天，采集小鼠粪便，进行16S rRNA基因(V3-V4区)测序分析，离最后一次给药后48小时将小鼠进行安乐死，取胃组织，一半组织进行幽门螺杆菌的分离培养和鉴定，计算定植量，另一半组织进行病理切片染色。
(3)结果
如图5C所示，奥美拉唑加龙血素A联用组对小鼠体内耐药幽门螺杆菌的杀灭效果与三联治疗组相当。如图5D，龙血素A给药组对小鼠胃粘膜损伤的修复能力明显优于三联治疗组，且能减少对胃黏膜细胞的凋亡作用。如图6所示，OPZ+LrA治疗组和CMC-Na组的肠道微生物群在ɑ-多样性和β-多样性方面没有明显差异，而三联疗法的微生物群落结构则有明显变化，因此，LrA治疗导致小鼠肠道微生物群的多样性和组成的变化非常小。
Claims (5)
1.龙血素A在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
2.龙血素A与质子泵抑制剂的组合物在制备抗耐药性或敏感性幽门螺杆菌药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述质子泵抑制剂为奥美拉唑。
4.龙血素A在制备治疗耐药性或敏感性幽门螺杆菌感染导致的急、慢性胃炎、胃、十二指肠溃疡药物中的应用。
5.治疗幽门螺杆菌感染的药物组合物，其特征在于组分为龙血素A和奥美拉唑。
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