CN117180228A - 一种用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒、制备方法及其应用 - Google Patents
一种用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒、制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于纳米药物载体技术领域，具体涉及一种用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒、制备方法及其应用。其中，阿托伐他汀纳米颗粒包括肿瘤细胞来源的生物成分和阿托伐他汀，其中肿瘤细胞来源的生物成分为肿瘤细胞用抗肿瘤药物进行预处理后产生的。本发明的阿托伐他汀纳米颗粒对肿瘤免疫治疗具有显著增效作用，无明显毒副作用，且成本低廉。本发明的阿托伐他汀纳米颗粒利用阿托伐他汀的药理活性及仿生纳米药物的递送特性，提高药物递送效率并发挥肿瘤免疫治疗的辅助作用，和经典肿瘤免疫药物联用后发挥协同作用，有望为肿瘤免疫治疗药物的开发提供新的思路和途径。
Description
技术领域
本发明属于纳米药物载体技术领域，具体涉及一种用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒、制备方法及其应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗主要指应用免疫学原理和方法，通过激活体内的免疫细胞和增强机体抗肿瘤免疫应答，特异性地清除肿瘤微小残留病灶、抑制肿瘤生长的治疗方法。与传统的化疗和放疗不同，抗肿瘤免疫治疗并非直接针对肿瘤细胞，而是通过刺激免疫系统的反应，以增强机体对肿瘤的抵抗力。由于其副作用小、治疗效果明显，正逐渐成为未来肿瘤治疗的发展方向，被称为继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
近年来，科研人员开发了多种新型免疫治疗策略，显著增强抗肿瘤免疫治疗药效。免疫检查点抑制剂通过改善肿瘤周围免疫微环境，从而激活体内免疫细胞活性达到抗肿瘤目的。目前上市的免疫检查点抑制剂主要包括：PD-1/PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂。STING是细胞内在代谢检查点，通过靶向己糖激酶2（HK2）阻断其己糖激酶活性，从而限制肿瘤的有氧糖酵解，促进体内抗肿瘤免疫。通过使用STING降解抑制剂能抑制肿瘤生长，提高抗肿瘤免疫治疗的药效。此外也有研究表明，转化生长因子β（TGF-β）信号通路是诱导肿瘤免疫耐受的关键机制之一，而TGF-β受体抑制剂能够克服TGF-β信号通路介导的免疫耐受，提高抗肿瘤免疫治疗疗效。
阿托伐他汀是HMG-CoA还原酶选择性抑制剂，具有降血脂、抗动脉粥样硬化及保护心血管等作用，阿托伐他汀通过抑制HMG-CoA还原酶的活性可以有效降低血浆胆固醇。近年来，有研究指出阿托伐他汀药物对肿瘤具有一定的抑制作用，尤其是在肝癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌等肿瘤中均显示出较好的抑制效果。深入研究表明，阿托伐他汀具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤血管生成等作用，并被证明可以作用于多种信号转导通路产生抗肿瘤作用，且不良反应较常规的化疗药物小，有望将阿托伐他汀用于抗肿瘤免疫治疗。但对于阿托伐他汀在肿瘤免疫治疗应用的研究较少，特别是缺乏对其和免疫检查点抑制剂等经典肿瘤免疫药物的联用效果进行实验性验证。
在肿瘤免疫治疗中，如何递送药物也是个难点。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒、制备方法及其应用。
本发明所采取的技术方案如下：一种用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒，其包括肿瘤细胞来源的生物成分和阿托伐他汀，其中肿瘤细胞来源的生物成分为肿瘤细胞用抗肿瘤药物进行预处理后产生的。
优选的，所述阿托伐他汀纳米颗粒的粒径在120-300 nm之间。
如上所述的用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1）将肿瘤细胞用抗肿瘤药物进行预处理；
2）收集步骤1）处理后的肿瘤细胞，加入阿托伐他汀溶液重悬得到肿瘤细胞混悬液；
3）将步骤2）得到的肿瘤细胞混悬液通过挤出机进行挤出，得到细胞过滤液；
4）对细胞过滤液离心得到所述的阿托伐他汀纳米颗粒。
优选的，步骤1）中所采用的肿瘤细胞为非人源肿瘤细胞。
优选的，步骤1）中，肿瘤细胞采用低浓度的抗肿瘤药物共培养预处理，具体地，在本发明中，抗肿瘤药物的添加浓度为使细胞与抗肿瘤药物共培养预处理12h后存活率为80-90%。
优选的，步骤1）中，所述抗肿瘤药物为化疗药物，如紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨、顺铂、卡铂、依托泊苷、足叶乙苷、表阿霉素、阿霉素、草酸铂等，具体可以为一种化疗药物或多种化疗药物的组合。
优选的，步骤2）中，肿瘤细胞混悬液中细胞量为5~8×106cells/mL。
优选的，步骤3）中，通过挤出机使细胞混悬液依次通过10 μm，2 μm，1 μm，0.45 μm滤膜，得到细胞过滤液。
优选的，步骤4）中，细胞过滤液以10,000g离心10分钟，弃沉淀，上清液以150,000g离心120分钟，收集沉淀重悬后即得到所述的阿托伐他汀纳米颗粒。
如上所述的用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒在制备肿瘤免疫治疗增效剂的应用。
本发明的有益效果如下：本发明所提供的阿托伐他汀纳米颗粒，采用肿瘤细胞用抗肿瘤药物进行预处理后产生的肿瘤细胞来源的生物成分包封阿托伐他汀，形成阿托伐他汀纳米颗粒，利用其纳米效应和肿瘤细胞膜归巢效应，提高了被动靶向和主动靶向性，从而提高有效治疗物质在病变位置的蓄积水平，有利于提高药物利用度和有效率。
本发明所提供的制备方法，为将肿瘤细胞用抗肿瘤药物进行预处理后产生的生物成分与阿托伐他汀混合后，通过挤出法制备了阿托伐他汀纳米颗粒，对药物起到了增溶、稳定作用，进一步有利于提高药物利用度和有效率。此外，整个制备过程操作简单，条件稳定，重现性良好。
本发明通过大量试验发现所述阿托伐他汀纳米颗粒对肿瘤免疫治疗具有显著增效作用，无明显毒副作用，且成本低廉。因此，从整体上来说，阿托伐他汀纳米颗粒对于目前临床广泛采用的肿瘤免疫治疗具有较好的辅助作用，更为重要的是，其安全性良好，显著优于普通的化疗-免疫治疗的联合治疗方案，且能显著降低患者及医疗机构的诊疗费用等优点。本发明的阿托伐他汀纳米颗粒利用阿托伐他汀的药理活性及仿生纳米药物的递送特性，提高药物递送效率并发挥肿瘤免疫治疗的辅助作用，和经典肿瘤免疫药物联用后发挥协同作用，有望为肿瘤免疫治疗药物的开发提供新的思路和途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1为阿托伐他汀纳米颗粒的细胞安全性评价。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1 阿托伐他汀纳米颗粒的制备
按照处方及制备要点（表1），将肿瘤细胞接种于10 cm的培养皿中，待细胞覆盖率达到80%~90%时，进行低浓度化疗药物条件处理。在培养12小时后，去除培养基，用冰冷的PBS洗三次，随后用细胞铲挂下后收集细胞。用400 μg/mL的阿托伐他汀溶液将细胞重悬，得到5~8×106 cells/mL的细胞混悬液。利用微型挤出机分别让细胞混悬液依次通过10 μM，2μM，1 μM，0.45 μM滤膜，每个尺寸滤膜重复2次。收集细胞过滤液，离心（10,000 g，10分钟）弃沉淀。将上清液继续离心（150,000 g，120分钟），并收集沉淀即为阿托伐他汀纳米颗粒。
将得到的阿托伐他汀纳米颗粒，用PBS重悬后，观察是否有丁达尔效应并通过动态光散射检测纳米颗粒的平均尺寸。
表1 阿托伐他汀纳米颗粒的处方及制备要点
| 组别 | 细胞系 | 药物 | 细胞存活率 | 丁达尔效应 | 粒径 | PDI |
| 1 | 4T1 | 紫杉醇 | 86 | 有 | 220.58 | 0.185 |
| 2 | 4T1 | 紫杉醇 | 82 | 有 | 253.83 | 0.224 |
| 3 | 4T1 | 紫杉醇+阿霉素 | 86 | 有 | 244.62 | 0.184 |
| 4 | 4T1 | 多西他赛 | 85 | 有 | 248.45 | 0.238 |
| 5 | 4T1 | 顺铂+阿霉素 | 83 | 有 | 231.93 | 0.228 |
| 6 | Pan02 | 紫杉醇 | 85 | 有 | 274.06 | 0.214 |
| 7 | Pan02 | 盐酸吉西他滨+盐酸表柔比星 | 88 | 有 | 234.72 | 0.200 |
| 8 | 3T3 | 紫杉醇 | 81 | 有 | 287.15 | 0.239 |
| 9 | 4T1 | - | 100 | 有 | 273.93 | 0.241 |
| 10 | 4T1 | 紫杉醇 | 94 | 有 | 229.04 | 0.236 |
| 11 | 4T1 | 紫杉醇 | 60 | 有 | 252.22 | 0.368 |
| 12 | 4T1 | H2O2 | 85 | 有 | 217.54 | 0.291 |
其中，表1中，组别1-7、8-12所采用的细胞系4T1、Pan02均为非人源肿瘤细胞，组别8所采用的细胞系为小鼠来源的成纤维细胞；组别1-8、10-11所采用的药物紫杉醇等均为化疗药物，组别12采用的药物H2O2为氧化损伤试剂。
实施例2 阿托伐他汀纳米颗粒的表征及安全性评价
取实施例1中制备得到的阿托伐他汀纳米颗粒，通过高效液相色谱法测定纳米颗粒中的药物含量。药物携载是纳米药物制剂制备中的关键因素之一，对药物的安全性和毒性反应具有重要影响。根据以下公式计算包封率：包封率(%)=纳米颗粒中的阿托伐他汀质量（mg）/投药量（mg）。实施例1制备得到的阿托伐他汀纳米颗粒的包封率结果见表2。
表2 阿托伐他汀纳米颗粒的抗肿瘤药物残留量及阿托伐他汀包封率
| 组别 | 包封率（%） |
| 1 | 22.74 |
| 2 | 18.41 |
| 3 | 17.56 |
| 4 | 23.48 |
| 5 | 18.74 |
| 6 | 21.21 |
| 7 | 17.65 |
| 8 | 16.21 |
| 9 | 18.68 |
| 10 | 27.24 |
| 11 | 12.75 |
| 12 | 15.74 |
实施例1中制备的阿托伐他汀包封率见表2.该结果表明在处方范围及工艺参数变化内，药物包封率总体在15~30%左右，表明制备工艺基本合理。
随后采用MTT法对阿托伐他汀纳米颗粒的细胞安全性进行评价。具体来说，将制备得到的阿托伐他汀纳米颗粒用培养基稀释至2 μg/mL，空白样品组1（制备时未加入阿托伐他汀，粒径为196.25 nm）、阿托伐他汀溶液也按照同比例稀释作为对照。将永生化人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞与不同样品进行孵育24 h，最后采用MTT法检测细胞存活率。根据图1结果所示，该结果表明在处方范围及工艺参数变化内的细胞安全性良好，不因抗肿瘤药物前处理产生显著的细胞毒性。如组别11所示，当抗肿瘤药物浓度过高，导致处理后的肿瘤细胞存活率较低时，最终制备得到的阿托伐他汀纳米颗粒会具有一定的细胞毒性。因此，从安全性角度，抗肿瘤药物浓度应优选设置为使细胞与该浓度的抗肿瘤药物共培养12小时后的存活率高于80%。
实施例3 阿托伐他汀纳米颗粒对荷瘤小鼠抗肿瘤免疫治疗的增效作用。
（1） B16F10荷瘤小鼠模型的建立
在6-8周的C57BL/6小鼠的右侧近后肢部位接种B16F10细胞（1×106 mL-1）。每日观察小鼠的生长状态并测量肿瘤大小，当移植瘤长至50-100mm3时，将实验小鼠随机分组。按照给药方案实施后（记为第1天），每三天测量记录各组实验小鼠的体重和瘤体积。第21天，安乐死小鼠，将移植瘤剥离称重记录。anti-PD-1单抗共给药3次，本发明样品共给药7次（第15天后不再给药）。
（2） 实验分组
模型组：生理盐水
对照组1：隔天经尾静脉注射阿托伐他汀溶液隔天注射（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）
对照组2：每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
对照组3：隔天经尾静脉注射未载药实施例1样品组1
对照组4：隔天经尾静脉注射实施例1样品组1（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）
实验组1：隔天经尾静脉注射实施例1样品组1（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
实验组2：隔天经尾静脉注射实施例1样品组2（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
实验组3：隔天经尾静脉注射实施例1样品组3（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
实验组4：隔天经尾静脉注射实施例1样品组4（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
实验组5：隔天经尾静脉注射实施例1样品组5（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
实验组6：隔天经尾静脉注射实施例1样品组6（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
实验组7：隔天经尾静脉注射实施例1样品组7（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
实验组8：隔天经尾静脉注射实施例1样品组8（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
实验组9：隔天经尾静脉注射实施例1样品组9（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
实验组10：隔天经尾静脉注射实施例1样品组10（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
实验组11：隔天经尾静脉注射实施例1样品组11（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
实验组12：隔天经尾静脉注射实施例1样品组12（阿托伐他汀：25 mg/kg/次）+每周anti-PD-1单抗经尾静脉注射（250 μg/只/次）
（3） 实验结果与讨论
体内抗肿瘤结果如表3所示。本发明提供的阿托伐他汀纳米颗粒（实验室组1-7）与PD-1抑制剂联用后的抗肿瘤效果（＞75%）明显优于单PD-1抑制剂组（33.45%）及其他组别。因此，本发明所提供的阿托伐他汀纳米颗粒对肿瘤免疫治疗具有增效作用。并且，当没有抗肿瘤药物（实验组9）、非化疗药物（实验组12）处理肿瘤细胞以及抗肿瘤药物浓度太低导致细胞存活率高于90%（实验组10）时，抑瘤率相比单PD-1抑制剂组（33.45%）没有明显提升。
表3 阿托伐他汀纳米颗粒联合PD-1抑制剂对荷瘤小鼠移植瘤瘤重和和抑瘤率结果
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒，其特征在于：其包括肿瘤细胞来源的生物成分和阿托伐他汀，其中肿瘤细胞来源的生物成分为肿瘤细胞用抗肿瘤药物进行预处理后得到的。
2.根据权利要求1所述的用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒，其特征在于：所述阿托伐他汀纳米颗粒的粒径在120-300 nm之间。
3.如权利要求1或2所述的用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将肿瘤细胞用抗肿瘤药物进行预处理；
2）收集步骤1）处理后的肿瘤细胞，加入阿托伐他汀溶液重悬得到肿瘤细胞混悬液；
3）将步骤2）得到的肿瘤细胞混悬液通过挤出机进行挤出，得到细胞过滤液；
4）对细胞过滤液离心得到所述的阿托伐他汀纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤1）中所采用的肿瘤细胞为非人源肿瘤细胞。
5.根据权利要求3所述的用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤1）中，抗肿瘤药物的添加浓度为使细胞与抗肿瘤药物共培养预处理12h后存活率为80-90%。
6.根据权利要求3所述的用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述抗肿瘤药物为化疗药物。
7.根据权利要求3所述的用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤2）中，肿瘤细胞混悬液中细胞量为5~8 ×106cells/mL。
8.根据权利要求3所述的用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤3）中，通过挤出机使细胞混悬液依次通过10 μm，2 μm，1 μm，0.45 μm滤膜，得到细胞过滤液。
9.根据权利要求3所述的用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤4）中，细胞过滤液以10,000g离心10分钟，弃沉淀，上清液以150,000g离心120分钟，收集沉淀重悬后即得到所述的阿托伐他汀纳米颗粒。
10.如权利要求1或2所述的用于肿瘤免疫治疗的阿托伐他汀纳米颗粒在制备肿瘤免疫治疗增效剂的应用。
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