CN117169505A - 一种结直肠癌治疗靶点和血清标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物及其应用，已筛选出能够用于结直肠癌精准治疗的药物靶点和早期筛查的生物标志物为以下蛋白质中的一种或多种：ADH1B、ARRDC1、ANGPTL2、GATM、GTF2H4、MGME1或LILRB2。为结直肠癌的临床诊治提供了新思路，有助于改善结直肠癌患者的预后。诊断血清标志物表现出较高的灵敏度、特异度、准确度和诊断效能，效果优于传统的血清标志物CEA和CA19‑9，促进结直肠癌和癌前病变的早期筛查及诊治。

Description

一种结直肠癌治疗靶点和血清标志物及其应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，尤其是涉及一种结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物及其应用。

背景技术

目前，结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）已成为世界范围内发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤，死亡率仅次于肺癌。在中国，结直肠癌发病率和死亡率仍在持续上升，已成为癌症相关死亡最高的消化道恶性肿瘤。尽管结直肠癌的诊断和治疗较以往有了较大的改进，然而，总体生存率仍不理想，晚期结直肠癌患者5年生存率不到20%，给患者家庭和社会带来了严重的医疗经济负担。根据腹部不适、排便性状改变或便血等临床症状诊断时，结直肠癌往往已进展至不可逆转的阶段。因此，早期筛查结直肠癌和癌前病变，并针对特定靶点实施精准治疗对改善患者预后和减轻社会医疗负担具有非常重要的意义。

结直肠癌早期筛查方式多样，包括结肠镜检查、粪便潜血试验、血清学肿瘤标志物等。理想的筛查方法应该具有高依从性、高敏感度和特异度，具有微创性并保持成本效益。结肠镜联合镜下组织活检是诊断结直肠癌的金标准，但由于是侵入性检查，有一定的出血、穿孔风险，要求内镜医师有丰富的内镜下操作经验，限制了结肠镜在临床筛查中的普及推广。粪便潜血试验被推荐作为结直肠癌无创性筛查的方法之一，无创、价格低廉也容易被患者接受，但由于敏感度和特异度低、需要重复筛查、存在许多假阳性等局限性，导致患者对粪便潜血试验的依从性大大降低。血清学筛查是大众普遍可接受的一种无创性筛查方式，消化科门诊部、体检中心等应用非常广泛。胃肠道疾病常用的血清学筛查指标包括CEA、CA19-9等，上述常用血清学筛查指标已临床使用了近数十年，得到了临床医师及患者的统一认可，目前仍未有新型血清筛查指标可超越。然而，在临床实际工作中，可观察到部分结直肠癌、癌前病变患者并未出现上述指标的异常升高，即敏感度有限，因此，临床中亟需一种结直肠癌新型、非侵入性、价格低廉、高灵敏度和特异度的诊断血清标志物，预测结直肠癌或癌前病变，做到早期诊断和精准治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物及其应用，以解决现有技术中存在的常用血清筛查指标敏感度有限，特异性较低的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物，为选自以下蛋白质中的一种或多种：ADH1B（乙醇脱氢酶）、ARRDC1（含捕获子结构域的蛋白1）、ANGPTL2（血管生成素样蛋白2）、GATM（甘氨酸脒基转移酶）、GTF2H4（一般转录因子IIH亚基4）、MGME1（线粒体基因组维持外切酶1）和LILRB2（白细胞免疫球蛋白样受体B2）。

优选地，所述治疗靶点和诊断血清标志物的蛋白为ANGPTL2蛋白。

优选地，所述治疗靶点和诊断血清标志物的蛋白为LILRB2蛋白。

本发明还提供了一种结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物的应用，其特征在于，ADH1B、ARRDC1、ANGPTL2、GATM、GTF2H4、MGME1和/或LILRB2蛋白在结直肠癌病理状况筛查、诊断及治疗的药物中的用途。

所述结直肠癌的病理状况包括结直肠癌、息肉、腺瘤。

进一步地，所述蛋白的筛选工具包括基于超高效液相色谱质谱联用的蛋白质组学技术、生物信息学分析、免疫组织化学染色法及酶联免疫吸附测定法。

优选地，采用免疫组织化学染色法对ANGPTL2和LILRB2蛋白表达进行定量检测。

优选地，采用酶联免疫吸附测定法对LILRB2蛋白血清浓度进行定量检测。

进一步地，所述ANGPTL2蛋白在结直肠癌组织中上调，是正常对照组织蛋白量的4.55倍。

进一步地，所述LILRB2蛋白在结直肠组织中上调，是正常对照组织蛋白量的5.5倍。

进一步地，所述LILRB2蛋白的血清浓度在结直肠癌早期筛查中的应用：当LILRB2血清浓度≥4557pg/ml时，提示可能存在腺瘤≥1cm、绒毛状或绒毛管状腺瘤、重度不典型增生、高级别上皮内瘤变等结直肠癌前病变，当LILRB2血清浓度≥5256pg/ml时，提示可能已进展至结直肠癌。

采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的一种结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物及其应用，一方面，为未来结直肠癌的治疗提供更多的选择。ANGPTL2蛋白和LILRB2蛋白可作为精准治疗靶点，可以提高结直肠癌治疗效果，改善耐药性；另一方面，与传统的血清标志物相比，LILRB2蛋白血清浓度筛查结直肠癌和癌前病变具有高灵敏度和特异度，具有良好的诊断效能，在当前提倡的分级诊疗模式下，更有助于结直肠癌的早筛及早诊。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a为ADH1B蛋白的总体生存曲线；

图1b为ARRDC1蛋白的总体生存曲线；

图1c为GATM蛋白的总体生存曲线；

图1d为GTF2H4蛋白的总体生存曲线；

图1e为MGME1蛋白的总体生存曲线；

图1f为LILRB2蛋白的总体生存曲线；

图1g为ANGPTL2蛋白的总体生存曲线；

图2为LILRB2蛋白表达量；

图3a为LILRB2蛋白表达与神经受累之间的相关性；

图3b为LILRB2蛋白表达与脉管受累之间的相关性；

图3c为LILRB2蛋白表达与分化程度之间的相关性；

图3d为LILRB2蛋白表达与浸润深度之间的相关性；

图3e为LILRB2蛋白表达与淋巴结转移之间的相关性；

图3f为LILRB2蛋白表达与远处转移之间的相关性；

图3g为LILRB2蛋白表达与TNM分期之间的相关性；

图4为ANGPTL2蛋白表达量；

图5a为ANGPTL2蛋白表达与肿瘤大小之间的相关性；

图5b为ANGPTL2蛋白表达与脉管受累之间的相关性；

图5c为ANGPTL2蛋白表达与分化程度之间的相关性；

图5d为ANGPTL2蛋白表达与浸润深度之间的相关性；

图5e为ANGPTL2蛋白表达与淋巴结转移之间的相关性；

图5f为ANGPTL2蛋白表达与远处转移之间的相关性；

图5g为ANGPTL2蛋白表达与TNM分期之间的相关性；

图6为健康对照者、结直肠腺瘤及结直肠癌患者的LILRB2蛋白血清浓度；

图7为LILRB2蛋白血清浓度诊断进展期腺瘤（结直肠癌前病变）的诊断效能；

图8a为LILRB2蛋白血清浓度与传统血清标志物CEA、CA19-9在诊断结直肠癌方面，灵敏度、特异度、准确度的对比；

图8b为LILRB2蛋白血清浓度与传统血清标志物CEA、CA19-9在诊断结直肠癌方面受试者工作特征曲线及曲线下面积的对比。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的解释说明。

实施例1

如图1a-图1g所示，筛选出结直肠癌的候选治疗靶点和诊断血清标志物,具体实验步骤：

采集结直肠癌组织和配对的癌旁组织样本，各样本加入30 μL 溶剂 A（A: 0.1%甲酸水溶液）制成悬浮液，取出9 μL加入1 μL 10×iRT肽段，混合后用纳米LC分离，经在线电喷雾串联质谱分析。整套系统为串联EASY-nano-LC 1200的Orbitrap Fusion LumosTribrid 质谱仪（Thermo Fisher Scientific, MA, USA)。共上样4μL样品（分析柱：Acclaim PepMap C18, 75 μm x 25 cm），以90 min的梯度分离样品，柱流量控制在250 nL/min，柱温为55°C，梯度从4%的B相起始, 平衡3分钟，在82分钟以非线性梯度升高到50%，1分钟内升高到95%，维持7分钟。质谱仪在数据非依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：（1）MS: 扫描范围 (m/z)：350–1200; 分辨率：120,000; Normalized AGC target：250%; 最大注入时间：100ms。（2）HCD-MS/MS: 分辨率：50,000; Normalized AGC target：200%; 最大注入时间：86ms; 碰撞能量：33。（3）可变窗口采集，设置了60个窗口，设置重叠串口，每个窗口重叠1m/z。采用Spectronaut 15.0默认参数（BGS Factory Settings（default））对数据进行分析。序列数据库为uniprot-homo sapiens (version201907, 20428 entries) 数据库。在所有鉴定蛋白质中，差异表达蛋白筛选标准：t-检验分析后取P值＜0.05，差异倍数绝对值＞2的蛋白。

采用CPTAC蛋白质数据库进行生存分析，筛选结直肠癌预后差异蛋白。下载CPTAC数据库中结直肠癌患者的蛋白定量检测值、临床结局、总生存期和无进展生存期数据，根据临床结局分组为生存组和死亡组，利用R语言代码鉴定预后相关蛋白，将差异表达蛋白与预后相关蛋白取交集，得到结直肠癌预后差异蛋白。R语言代码如下：

setwd("D:\\biowolf\\83CPTAC\\06.diff") #设置工作目录

inputFile="sampleExp.txt"#输入文件

pFilter=0.05#p值临界值

logFCfilter=0#logFC临界值

conNum=160#sample1组样品数目

treatNum=58#sample2组样品数目

#读取输入文件

outTab=data.frame()

group=c(rep(1,conNum),rep(2,treatNum))

data=read.table(inputFile,sep="\t",header=T,check.names=F,row.names=1)

data=as.matrix(data)

#差异分析

for(i in row.names(data)){

geneName=i

rt=rbind(expression=data[i,],group=group)

rt=as.matrix(t(rt))

tTest<-t.test(expression ~ group, data=rt)

pvalue=tTest$p.value

conGeneMeans=mean(data[i,1:conNum])

treatGeneMeans=mean(data[i,(conNum+1):ncol(data)])

logFC=treatGeneMeans-conGeneMeans

conMed=median(data[i,1:conNum])

treatMed=median(data[i,(conNum+1):ncol(data)])

diffMed=treatMed-conMed

if( ((logFC>0)&(diffMed>0)) | ((logFC<0)&(diffMed<0)) ){

outTab=rbind(outTab,cbind(gene=i,conMean=conGeneMeans,treatMean=treatGeneMeans,logFC=logFC,pValue=pvalue))

}

}

#输出所有蛋白的差异情况

write.table(outTab,file="all.xls",sep="\t",row.names=F,quote=F)

#输出差异表格

outDiff=outTab[( abs(as.numeric(as.vector(outTab$logFC)))>logFCfilter&as.numeric(as.vector(outTab$pValue))<pFilter),]

write.table(outDiff,file="diff.xls",sep="\t",row.names=F,quote=F)

#输出差异蛋白表达

heatmap=rbind(ID=colnames(data[as.vector(outDiff[,1]),]),data[as.vector(outDiff[,1]),])

write.table(heatmap,file="diffProteinExp.txt",sep="\t",col.names=F,quote=F)

基于上述超高效液相色谱质谱联用的蛋白质组学技术及生物信息学分析，筛选出结直肠癌的候选治疗靶点和诊断血清标志物，选自以下蛋白质中的一种或多种：ADH1B（乙醇脱氢酶）、ARRDC1（含捕获子结构域的蛋白1）、ANGPTL2（血管生成素样蛋白2）、GATM（甘氨酸脒基转移酶）、GTF2H4（一般转录因子IIH亚基4）、MGME1（线粒体基因组维持外切酶1）和LILRB2（白细胞免疫球蛋白样受体B2）。

实施例2

如图2、图3a-图3g、图4、图5a-图5g所示，采用免疫组织化染色法对ANGPTL2蛋白和LILRB2蛋白进行定量检测，具体步骤如下：

1）石蜡切片制备及脱蜡水化：采集结直肠癌组织和配对的癌旁组织，将组织放入10%福尔马林液中固定3-4小时,后将组织放入包埋盒中进行脱水，依次进入75%酒精1.5h-95%酒精1.5h-95%酒精1h-无水乙醇1.5h-无水乙醇1h-二甲苯1h。打开包埋机,开启冷台、组织槽进行工作，将脱水后的组织连同包埋盒放入机器组织槽中,滴入液体石蜡，后放到冷台上冷却。经过固定、脱水、浸蜡包埋过程，组织蜡块制备完毕。打开切片机，调整切片厚度，切割成4μm石蜡切片备用。染色前需对石蜡切片进行脱蜡及水化，依次将切片放入二甲苯15min-二甲苯15min-二甲苯15min-无水乙醇15min-90%乙醇5min-80%乙醇5min-70%乙醇5min-蒸馏水3分钟*3次。

2）热抗原修复：组织切片置于盛满Tris-EDTA抗原修复缓冲液（pH 9.0）的修复盒中进行抗原修复，用微波炉或锅加热煮沸，温度控制在96-98℃，保温15分钟，最后室温自然冷却。此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于pH7.4的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3）阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液中，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4）血清封闭非特异性位点：在组化圈内滴加3%牛血清白蛋白均匀覆盖组织，室温封闭30min，阻断非特异性抗原抗体反应。

5）加一抗：甩掉封闭液，用吸水纸吸干表面水珠即可，在切片上滴加一抗20μl（LILRB2抗体与PBS溶液的体积比为1:50或ANGPTL2抗体与PBS溶液的体积比为1:200），切片平放于免疫组化湿盒内4℃孵育过夜。抗体稀释采用PBS溶液。

6）加二抗：室温复温30min，玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片甩干、用吸水纸吸干表面水珠后在圈内滴加与HRP标记抗兔二抗覆盖组织，室温孵育50min。

7）显色：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，用吸水纸吸干表面水珠。10mM Tris-HCl (pH7.6) 9mL +3-二氨基联苯胺+0.3%(W/V) NiCl2 或CoCl2 1mL，显色时加入5-10mL 30%H2O2混匀，0.05%的DAB显色液配制完成。在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液100μL，显微镜下控制显色3min左右，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色反应。

8）复染细胞核：苏木素复染3min，自来水洗，1%盐酸酒精分化3秒，自来水冲洗，0.5%氨水返蓝，流水冲洗。

9）脱水封片：将切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5min-无水乙醇 5min-无水乙醇 5min-正丁醇5min-二甲苯 5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来晾干半天即可，封片胶封片。

10）光学显微镜下观察及分析。

实验结果显示，与正常对照组织相比，两者在结直肠癌组织中显著高表达。LILRB2蛋白表达量是正常对照组织的5.5倍，且与结直肠癌低中分化（P=0.03）、脉管受累（P<0.001）、神经受累（P=0.002）淋巴结转移（P<0.001）、远处转移（P=0.009）、更晚的临床分期（P<0.001）及不良预后（P=0.045）显著相关;而ANGPTL2蛋白表达量是正常对照组织的4.55倍，与结直肠癌大小（P=0.013）、低中分化（P=0.003）、脉管受累（P=0.002）、淋巴结转移（P<0.001）、远处转移（P=0.001）、更晚的临床分期（P<0.001）及不良预后（P=0.004）显著相关。经验证，两者可作为结直肠癌潜在的精准治疗靶点。

实施例3

如图6、图7、图8a和图8b所示，采用酶联免疫吸附测定法对LILRB2蛋白血清浓度进行定量检测，按Human LILRB2 ELISA Kit试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下：

1）准备所有试剂：人CD85d捕获抗体10X 600μL、人CD85d检测抗体10X 600μL、人CD85d冻干重组蛋白 2瓶、抗体稀释剂CPI 6mL、样品稀释剂 12mL、冲洗缓冲液PT 10X20mL、TMB底物溶液 12mL、终止溶液 12mL、96微孔板及封板膜。

2) 加样：同时做空白孔、倍比稀释（按说明书进行，本试剂盒标准品浓度梯度为0pg/ml、62.5pg/ml、125pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、4000pg/ml）的标准品孔，加稀释3.3倍的待检血清样品100μl于已包被的待检测反应孔中。

3）温育洗涤：用封板膜封板后置37℃孵育1-2 h，弃去液体，每孔加入300μL 10X冲洗缓冲液PT，浸泡1-2min，在吸水纸上拍干，重复3-5遍。

4）加酶标抗体：将300µL 10X人CD85d捕获抗体和300µL 10X人CD85d检测抗体与2.4mL抗体稀释剂CPI混合，搅拌均匀，配制成3ml酶标抗体工作液。于各孔中加1：5稀释好的酶标抗体工作液100 μl。

5)温育洗涤：用封板膜封板后置37℃孵育1h，弃去液体，洗涤同步骤3。

6）加显色底物：于各孔中加入TMB底物溶液100 μl，37℃避光反应10～30min，直到按说明书倍比稀释的标准品孔出现明显的颜色梯度为止。可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：依据所呈颜色的深浅，反应孔内颜色越深，阳性程度越强。也可测光密度（OD）值：于ELISA检测仪450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于说明书规定的阴性对照OD值的3倍，即为阳性。

7）终止反应：于各反应孔中加入终止溶液100 μl，颜色由蓝色变为黄色。

8）结果判读：在酶标仪上于450nm处，以空白对照孔调零后测每个孔的OD值。根据标准品的浓度和OD值做标准曲线，然后根据标准曲线方程计算出样本浓度，结果乘以样本稀释倍数。

实验结果显示，LILRB2血清浓度诊断结直肠癌前病变的截断值为4557pg/ml，敏感度为78.95%，特异度为77.78%，准确率为78.38%，AUC值为0.84（0.71，0.96），P=0.0005。

LILRB2血清浓度诊断结直肠癌的的截断值为5256pg/ml，敏感度为89.74%，特异度为88.89%，准确率为89.63%，AUC值为0.95（0.89，1.00），P＜0.0001。而传统指标CEA的灵敏度、特异度、准确度、AUC值分别为42.2%、94.4%、49.6%、0.79（0.73，0.85），CA19-9的灵敏度、特异度、准确度、AUC值分别为22.2%、100%、33.3%、0.89（0.84，0.94）。由此可见，LILRB2蛋白血清浓度诊断结直肠癌和癌前病变均具有较高的灵敏度、特异度、准确度及诊断效能，优于传统的血清标志物CEA和CA19-9。经验证，LILRB2可作为结直肠癌潜在的新型、非侵入性、高灵敏度和特异度的筛查标志物。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物的应用，其特征在于，治疗靶点和诊断血清标志物为乙醇脱氢酶ADH1B、含捕获子结构域的蛋白1 ARRDC1、血管生成素样蛋白2ANGPTL2、甘氨酸脒基转移酶GATM、一般转录因子IIH亚基4 GTF2H4、线粒体基因组维持外切酶1 MGME1和白细胞免疫球蛋白样受体B2 LILRB2中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物的应用，其特征在于，ADH1B、ARRDC1、ANGPTL2、GATM、GTF2H4、MGME1和/或LILRB2蛋白用于结直肠癌病理状况筛查、诊断及治疗的药物中。

3.根据权利要求2所述的结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物的应用，其特征在于，所述结直肠癌的病理状况包括结直肠癌、息肉和/或腺瘤。

4.根据权利要求2所述的结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物的应用，其特征在于，采用免疫组织化学染色法对ANGPTL2和LILRB2蛋白表达进行定量检测。

5.根据权利要求2所述的结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物的应用，其特征在于，采用酶联免疫吸附测定法对LILRB2蛋白血清浓度进行定量检测。

6.根据权利要求2所述的结直肠癌治疗靶点与诊断血清标志物的应用，其特征在于，所述LILRB2蛋白在结直肠癌组织中的含量是正常对照组织的5.5倍。

7.根据权利要求2所述的结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物的应用，其特征在于，所述ANGPTL2蛋白在结直肠组织中的含量是正常对照组织的4.55倍。

8.一种结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物，其特征在于，

所述治疗靶点和诊断血清标志物为选自以下蛋白质中的一种或多种：乙醇脱氢酶ADH1B、含捕获子结构域的蛋白1 ARRDC1、血管生成素样蛋白2 ANGPTL2、甘氨酸脒基转移酶GATM、一般转录因子IIH亚基4 GTF2H4、线粒体基因组维持外切酶1 MGME1和白细胞免疫球蛋白样受体B2 LILRB2。

9.根据权利要求8所述的结直肠癌治疗靶点和诊断血清标志物，其特征在于，所述治疗靶点和诊断血清标志物的蛋白为ANGPTL2蛋白或LILRB2蛋白。