CN117164441A - Ilicicolin B的制备及其在抗MRSA中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Ilicicolin B的制备及其在抗MRSA中的应用。本发明以5‑甲基间苯二酚和3,7,11‑三甲基‑2,6,10‑十二烷三烯‑1‑醇为原料，通过傅克烷基化反应和Vilsmeier反应即可得到天然产物Ilicicolin B，该方法简单便捷，无需复杂设备，且产物纯度、收率较高。本发明证实，Ilicicolin B对MRSA具有较好的抑制活性，其通过抑制MRSA的胞外聚合物中蛋白质和多糖的产生，进一步抑制生物膜的形成，从而提高MRSA对抗菌药物的敏感性，延缓MRSA耐药性。并且Ilicicolin B与环丙沙星具有协同作用，可有效治疗慢性/脓肿性创面感染。

Description

Ilicicolin B的制备及其在抗MRSA中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Ilicicolin B的制备及其在抗MRSA中的应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是一种高致病性微生物，在社区和医院环境中造成越来越多的传染性发病率和死亡率。随着甲氧西林的广泛使用，金黄色葡萄球菌很容易发展成耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)。MRSA会导致感染性心内膜炎、肺炎、骨髓炎、关节炎及皮肤和组织感染等疾病，使得金黄色葡萄球菌的感染越来越难治疗。MRSA从发现至今感染几乎遍及全球，已成为医院和社区感染的重要病原菌之一。因此，有必要寻找新的尤其是抗耐药菌感染的抗生素。

关于细菌耐药机制的研究，传统的观点为(1)产生灭活酶；(2)靶点结构改变；(3)改变膜通透性；(4)药物外排泵。近年来，大量研究资料表明绝大多数慢性感染与微生物在宿主体内形成的生物膜密切相关，生物膜的药物耐受则是导致感染治疗失败或预后差的主要原因。在临床上，生物膜可以在生物及非生物表面附着，如心脏瓣膜、骨骼、牙齿及各种医疗设备。在细菌生物膜的保护下，细菌可以增强自身对抗生素、环境压力及宿主免疫系统攻击的耐受能力，使细菌耐药性提高10-1000倍。因此，MRSA生物膜的研究为开发新型抗菌药物奠定了重要基础。

大量报道表明，天然提取物和天然产品为基础的抗生物膜剂比化学合成的同类产品更有效，副作用更小。几类天然化合物如酚类、萜类、凝集素、生物碱、多肽具有高抗生物膜特性。例如，大麻酚(Cannabigerol，CBG)可减少金黄色葡萄球菌的生物膜形成。因此，天然化合物成为开发抗生物膜剂的突出选择。Ilicicolin B是从海洋真菌Stachybotrys sp.菌株MF347中提取的化合物，是一种烯基化芳香醛类化合物，分子量为356.5，结构式如式Ⅳ所示。Ilicicolin B具有抗革兰氏阳性菌作用，安全性较好，结构简单特点。

现有技术中，Bin Wu等人在《Spirocyclic Drimanes from the Marine FungusStachybotrys sp.Strain MF347》中公开了Ilicicolin B的结构式，并表明Ilicicolin B对临床相关的MRSA表现出抗菌活性。但Ilicicolin B对MRSA的作用机制本领域技术人员目前尚不清楚，有待进一步的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明进一步探索了Ilicicolin B对MRSA的作用机制，发现Ilicicolin B通过抑制生物膜的形成，从而控制细菌耐药性，提高抗菌药物的敏感性。本发明为控制MRSA发展提供了有力保障，且对MRSA感染而导致的各类疾病的治疗药物的开发提供了技术支持，具有重要意义。

本发明的目的之一在于提供一种Ilicicolin B的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

Ilicicolin B的制备方法，所述Ilicicolin B的结构式如式Ⅳ所示；所述方法为：以式Ⅰ化合物和式Ⅱ化合物为原料，在路易斯酸的作用下发生傅克烷基化反应制得式Ⅲ化合物(步骤1)；所述式Ⅲ化合物在DMF和POCl₃溶液的作用下发生Vilsmeier反应制得所述Ilicicolin B(步骤2)；

进一步，所述式Ⅰ化合物的化学名称为5-甲基间苯二酚；式Ⅱ化合物的化学名称为3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烷三烯-1-醇。

进一步，反应式如下：

进一步，所述傅克烷基化反应中，所述路易斯酸在0℃条件下滴加；所述路易斯酸为BF₃Et₂O。

进一步，所述式Ⅰ化合物、式Ⅱ化合物和路易斯酸的摩尔比为1.25：1：0.03。

进一步，所述傅克烷基化反应的反应温度为25±2℃，反应时间为3小时；所述Vilsmeier反应的反应温度为25±2℃，反应时间为18小时。

进一步，步骤1中，所述式Ⅰ化合物和式Ⅱ化合物的溶剂为二氯甲烷。

进一步，步骤1中，所述傅克烷基化反应所得产物经过二氯甲烷萃取、洗涤、干燥、过滤、减压蒸发，硅胶柱层析纯化，得到所述式Ⅲ化合物。

更进一步，干燥剂为Na₂SO₄。

更进一步，所述硅胶柱层析的条件为：SiO₂，己烷/乙酸乙酯＝10:1，重复两次。

进一步，步骤2中，所述Vilsmeier反应在装有磁性搅拌棒和橡胶隔膜的玻璃瓶中进行；所述玻璃瓶在反应前先进行真空/充氮循环3次。

进一步，步骤2中，将所述式Ⅲ化合物和DMF加入反应瓶后，将反应瓶放入冰浴中(温度约为0℃)，然后往反应瓶中滴加POCl₃溶液约5分钟。

进一步，步骤2中，用饱和NH₄Cl溶液和乙酸乙酯淬灭反应，然后分离相。

进一步，分离所得水相经萃取、干燥、过滤，真空浓缩，硅胶柱层析纯化，制得所述Illicolin B。

更进一步，所述水相用乙酸乙酯萃取；结合的有机物采用Na₂SO₄进行干燥。

更进一步，所述硅胶柱层析纯化条件为：SiO₂，己烷/乙酸乙酯＝8:1。

本发明的目的之二在于提供一种Ilicicolin B在制备抑制MRSA生物膜的形成的抗生物膜剂中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

Ilicicolin B在制备抑制MRSA生物膜的形成的抗生物膜剂中的应用。

进一步，所述Ilicicolin B通过抑制MRSA的胞外聚合物中蛋白质和多糖的产生来抑制生物膜的形成。

本发明的目的之三在于提供一种Ilicicolin B在制备提高抗菌药物对MRSA的敏感性的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种Ilicicolin B在制备提高抗菌药物对MRSA的敏感性的药物中的应用。

进一步，通过利用所述Ilicicolin B抑制MRSA生物膜的形成，进而降低MRSA的耐药性，提高所述抗菌药物对MRSA的敏感性。

进一步，所述抗菌药物包括环丙沙星、万古霉素中的任一种或多种。

本发明的目的之四在于提供一种Ilicicolin B与抗菌药物的协同应用在制备抗MRSA的药物中的应用，所述抗菌药物包括环丙沙星。

本发明的目的之五在于提供一种用于治疗MRSA感染相关疾病的的药物组合物。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

所述药物组合物包括Ilicicolin B抗菌药物；所述抗菌药物为环丙沙星、万古霉素中的任一种或多种；所述疾病包括皮肤慢性或脓肿性创面感染。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。

本发明的有益效果在于：

1.本发明研究发现，Ilicicolin B通过抑制MRSA的胞外聚合物中蛋白质和多糖的产生，进一步抑制生物膜的形成，从而提高了MRSA对抗菌药物的敏感性，延缓了MRSA耐药性。本发明为新型抗MRSA生物膜药物的研发提供了新的借鉴。

2.本发明证明了Ilicicolin B与环丙沙星等抗菌药物联合应用可有效抑制MRSA生长，且抑制效果优于单一成分的效果叠加。即本发明研究证实了Ilicicolin B与环丙沙星在抗MRSA感染中具有良好的协同作用。

3.本发明研究发现，Ilicicolin B可用于治疗MRSA感染所导致的皮肤慢性/脓肿性创面感染，且不易发展快速的耐药性。抗菌活性实验证明，Ilicicolin B及对MRSA的最小抑菌浓度为2-4μg/mL。

4.本发明还提供了一种Ilicicolin B的制备方法，本发明以5-甲基间苯二酚和3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烷三烯-1-醇为原料，通过傅克烷基化反应和Vilsmeier反应即可得到天然产物Ilicicolin B，该方法较现有的从海洋真菌菌株中进行提取的方法更加简便，且无需复杂设备，即可获得收率较高的目标产物。

附图说明

图1为实施例1制得的Ilicicolin B的核磁共振波谱图；

图2为实施例4中Ilicicolin B的抗生物膜测试结果图；

图3为实施例5中Ilicicolin B对细菌生物膜胞外聚合物(EPS)的实验结果图；

图4为实施例6中Ilicicolin B对小鼠脓肿性创面感染的治疗作用(CFU)的结果图；

图5为实施例6中治疗组小鼠在感染期间的体重减轻情况的统计图；

图6为实施例7中Ilicicolin B对MRSA的耐药性测试结果图。

具体实施方式

下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

本发明实施例中，所有实验耗材均为常规生化试剂厂商处购买得到。

本发明实施例中，所有定量实验均设置至少3次以上的重复实验。

本发明实施例中，抗菌活性测试所用菌株信息见表1。

表1.菌株信息

上述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株仅用于化合物抗菌活性等实验的验证，不作为本发明的关键内容，本领域技术人员如果需要重复实验，可以自行获取适当的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株进行验证。

实验例1、Ilicicolin B的制备

(1)傅克烷基化反应：在50mL二氯甲烷中加入化合物1(2.73g,11.24mmol,1.25eq)和化合物2(2.00g,8.99mmol,1.0eq)的搅拌溶液。在0℃条件下，滴加BF₃Et₂O(38.3mg,0.26mmol,0.03eq)，室温下搅拌3小时。反应混合物用水稀释，并用二氯甲烷萃取，有机相用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤，减压蒸发。用硅胶柱层析法(SiO₂，己烷/乙酸乙酯＝10:1，重复两次)纯化得到化合物3。

(2)Vilsmeier反应：一个装有磁性搅拌棒和橡胶隔膜的10mL玻璃瓶进行真空/充氮循环(3次)，然后充入步骤(1)制得的化合物3(200mg,0.6mmol,1eq)和DMF(1.0mL)。将反应瓶放入冰浴中，然后将预先制备的POCl₃溶液往反应瓶中滴加5分钟。反应加热至室温，加热18小时。用饱和的NH₄Cl溶液(10mL)和乙酸乙酯(10mL)淬灭反应，然后分离相。水相用乙酸乙酯(2×10mL)萃取。结合的有机物在Na₂SO₄上干燥，过滤，真空浓缩。采用硅胶柱层析法对原油进行纯化(SiO2，己烷/乙酸乙酯＝8:1)，得到所需产物Illicolin B；产量约为90.0mg，产率为42％。

结果：本实施例通过质谱数据与已发表的数据进行比较，证实了该化合物结构。Ilicicolin B的核磁共振波谱图如图1所示，其结构表征数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.76(s,1H),10.08(s,1H),6.21(s,1H),6.16(s,1H),5.27(t,J＝7.2Hz,1H),5.10–5.05(m,2H),3.41(d,J＝7.2Hz,2H),2.49(s,3H),2.18-2.05(m,5H),2.03-1.94(m,3H),1.81(s,3H),1.68(s,3H),1.59–1.57(comp.m,6H)。

实施例2、实施例1制得的Ilicicolin B的抗菌活性测定

采用肉汤稀释法(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI，2017)检测实施例1制得的Ilicicolin B对测试菌株的最小抑菌浓度(MIC)。具体步骤如下：用MHB肉汤培养基37℃摇床培养金黄色葡萄球菌标准菌株以及16株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株。培养6-8h后，用MHB肉汤培养基调整菌液浓度为1×10⁶CFU/mL；Ilicicolin B用DMSO进行化合物配置，再按照2倍稀释法依次稀释，得到浓度梯度化合物溶液；取96孔板，先加入已调整好浓度的菌悬液(每孔97.5μL)，再分别加入不同浓度的化合物溶液(每孔2.5μL)，以等体积的DMSO作为阴性对照，以广谱抗生素环丙沙星(Ciprofloxacin，Cip)作为阳性对照；37℃静置培养18-24小时，根据CLSI标准，利用酶标仪在OD₅₉₅ nm处读取数据，96孔板内抑制细菌生长的最低浓度即MIC。

结果：实验结果见表2，该结果表明，Ilicolin B对所有测试菌株的抗菌作用相似，MIC在2-4μg/mL，与阳性对照相当或强于阳性对照。尤其对于MRSA 1331和MRSA 1139，表现出对环丙沙星耐药，MIC分别在16μg/mL和8μg/mL，而Ilicolin B对这两株多重耐药菌敏感，仍然保持在2μg/mL，结果说明Ilicolin B具有优异的抗多重耐药革兰氏阳性菌的能力。

表2.Ilicicolin B对金黄色葡萄球菌的抗菌作用

实验例3、Ilicolin B和抗菌药物的协同作用

本实施例采用棋盘法检测Ilicolin B与不同抗生素的协同作用，其中，抗菌药物选择万古霉素、环丙沙星，测试菌株选用MRSA 3393。棋盘法具体步骤如下：用MHB肉汤培养基37℃摇床培养MRSA 3393。培养6-8小时后，用MHB肉汤培养基调整菌液浓度为1×10⁶CFU/mL。Ilicolin B用DMSO溶解，得到浓度为128μg/mL的化合物溶液。抗生素用水溶解，得到浓度为128μg/mL的抗生素溶液。取96孔板，每孔加入100μL MHB肉汤培养基。最后一行每孔加入100μL配置好的Ilicicolin B溶解，按照2倍稀释法，自第8行稀释至第二行；第一列每孔加入100μL配置好的抗生素溶液，2倍稀释法稀释至第10列。每孔再加入100μL调整好的菌液，37℃静置培养18-24小时，根据CLSI标准，利用酶标仪在OD₅₉₅nm处读取数据，观察Ilicicolin B和不同抗生素联用抑制细菌生长时，它们的最小抑菌浓度。

分级抑菌浓度FIC指数计算公式如下：

FIC指数＝MIC(A组联合)/MIC(A组单用)+MIC(B组联合)/MIC(B组单用)

当FIC指数小于0.5时，两种药为协同作用；当FIC指数为0.5～1时，两种药为相加作用；当FIC指数大于l且小于2时，两种药为无关作用；当FIC指数大于2时，两种药为拮抗作用。

结果：实验结果见表3，该结果表明，Ilicicolin B可与环丙沙星联用，对MRSA3393的MIC值降低2-8倍。Ilicicolin B与环丙沙星的FIC指数低于0.5，结果表明Ilicicolin B和环丙沙星对MRSA具有良好的协同作用。

表3.化合物Ilicicolin B与环丙沙星/万古霉素联合抗菌作用

实施例4、Ilicicolin B的抗生物膜测试

本实施例采用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 3393为测试菌，以万古霉素做为对照，进行Ilicicolin B对细菌生物膜清除作用的测试。具体步骤如下：按照实施例2培养细菌MRSA 3393，5000rpm，离心5min，弃上清，用含0.5％葡萄糖的TSB培养基重悬，稀释细菌，将细菌浓度调节至10⁶CFU/mL。吸取98μL菌液至96孔板中，分别加入不同浓度药物2μL，至最终化合物浓度分别为MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC。阴性对照为等体积DMSO，空白对照为100μL的培养基，每组做3个复孔。放入37℃恒温培养箱中孵育16小时后，弃上清，用PBS洗两次，放置10min进行风干。每孔加入50μL甲醇，生物膜固定5min，弃上清，放置10min进行风干，每孔加入50μL的0.2％结晶紫浸染，染色5min，弃结晶紫，放置至风干。用PBS进行数次清洗，清洗至空白孔基本没有颜色。将乙醇和DMSO按照1：1进行混合后，吸取100μL加入96孔板中，震荡5min后，使用酶标仪读取OD₅₉₅波长，读取数据。

生物膜抑制率(％)＝[(OD_对照组-OD_实验组)/OD_对照组]×100％

当生物膜抑制率在50％以上时，表明化合物具有显著生物膜抑制作用。

结果：如图2所示，在不存在和存在不同浓度Ilicicolin B(1/16MIC至MIC)的情况下形成的生物膜的结晶紫定量显示出剂量依赖性的抗生物膜活性。在MIC浓度下，由于细菌的生长水平受到影响，导致生物膜的形成收到严重抑制。而在0.25-1μg/mL(1/8-1/2MIC)浓度下，浮游细菌的生长没有收到影响，但是Ilicolin B能抑制至少50％生物膜的形成，化合物浓度越高，生物膜抑制率也随之升高。因此，本实验强调了Ilicicolin B对生物膜形成的强烈抑制作用。

实施例5、Ilicicolin B对生物膜EPS的作用

本实施例以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 3393为测试菌株，首先对经过Ilicicolin B处理过的细菌的胞外聚合物(EPS)进行提取。具体步骤如下：按照实施例2培养细菌MRSA 3393，LB培养基调整菌液浓度到1×10⁶CFU/mL，加入Ilicicolin B至化合物终浓度为1/8-1/4MIC作为实验组，加入等体积PBS作为阴性对照组。37℃下孵育24小时，10000rpm离心10min，分别收集沉淀和上清(细胞游离培养上清，CFCS)。沉淀用PBS洗涤两次，然后用等渗缓冲液(10mM Tris/HCl pH8.0，含10mM EDTA和2.5％ NaCl)在4℃状态下孵育24小时，将悬浮菌液旋涡离心(10000rpm，10min)。将上清液与CFCS混合，加入三倍体积预冷丙酮。混合物在4℃下处理24小时。最后，混合物在10000rpm下离心10min，抽提液真空干燥并保持干燥。为了量化EPS中蛋白质和碳水化合物的含量。采用总糖含量测定试剂盒(Cat)测定多糖浓度，在微孔板读卡器上测定500nm处的混合物。用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，根据试剂盒说明书进行操作，在595nm处读取数据。

结果：如图3所示，在1/8～1/2MIC浓度范围内，Ilicicolin B对EPS总蛋白的抑制作用分别为7％、18％和33％。此外，在Ilicicolin B的存在下，多糖含量下降了14-23％。然而，经过Ilicicolin B处理后的细菌含量与对照组相似。上述结果表明Ilicicolin B的策略是通过抑制EPS中蛋白质和多糖的产生来抑制生物膜的形成。

实施例6、Ilicicolin B治疗小鼠脓肿性创面感染

本实施例以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 3393为测试菌株，选择27-30g的ICR雌性小鼠作为实验对象，进行Ilicicolin B对小鼠脓肿性创面感染测试。具体步骤如下：提前一天对每只小鼠右腿上的毛利用剃毛刀和使用化学脱毛剂去除。按照实施例2培养细菌MRSA 3393，用无菌PBS洗涤细菌2次，重新悬浮并调整菌液浓度到5×10⁷CFU/mL。使用胰岛素针将细菌(100μL)注射到右大腿肌肉中。感染1小时后，将不同浓度Ilicicolin B和万古霉素以及阴性对照液(100μL)直接皮下注射到感染部位。随后分别于感染后12、24、36、48和60小时进行治疗。每天监测感染的进展情况，称量小鼠体重变化。在感染第4天，对小鼠实施安乐死，取每只动物的感染部位皮肤样本，并在2mL的无菌PBS中匀浆5分钟，按照10倍稀释法，PBS稀释涂板计数，然后37℃静置培养24小时，数方格板菌落数，通过连续稀释测定细菌计数。

结果：如图4所示，在小鼠脓肿创面感染中，Ilicicolin B实验组能够明显减少小鼠体内细菌负担，细菌数量减少约10至100倍。Ilicicolin B以剂量依赖的方式有效地根除细菌。与对照组相比，20mg/kg剂量的Ilicicolin B可清除100倍以上的细菌。Ilicicolin B(10mg/kg)使感染的细菌数量降低约10倍，与万古霉素组(20mg/kg)相似。在感染期间，所有治疗组小鼠的体重减轻情况相似，参见图5。最终，实验证明Ilicicolin B可以治疗小鼠脓肿创面感染。

实施例7、Ilicicolin B的细菌耐药性测试

本实施例以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 3393为测试菌株，以广谱抗菌剂环丙沙星做为对照，进行Ilicicolin B对细菌耐药性测试。具体步骤如下：将MRSA 3393用LB培养基于37℃培养6小时，调整菌液浓度至1.0×10⁶CFU/mL，按照上述实施例2的步骤对化合物进行MIC测定，用环丙沙星作为对照组，用酶标仪测定OD₅₉₅，此为第0代。取5mL ep管，向ep管中加入1mL MH-Ⅱ培养基，选择96孔板上长菌的第一个孔，从中取1μL菌液加入含有MH-Ⅱ的培养基中，再往里加入浓度为1/2×MIC的化合物，放入37℃摇床中，进行传代培养。培养16～24小时后，对传代的菌液进行MIC测定，再重复以上步骤，继续传代培养，共培养30代。每天观察细菌的生长情况，检测细菌对化合物的MIC的变化，判断其耐药性。

结果：如图6所示，环丙沙星对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 3393的抑制活性从第10代之后开始显著降低，第10代时环丙沙星的抗菌能力与第0代相比，活性至少降低了64倍，表明环丙沙星已经对MRSA 3393产生明显耐药；而Ilicicolin B传代至第30代，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 3393的抗菌活性几乎保持不变，说明化合物Ilicicolin B在短时间内对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 3393的低药物诱导性，暗示了IlicicolinB的在抗多重耐药金黄色葡萄球菌具有明朗的开发前景。

最后说明的是，鉴于Ilicolin B对所有测试菌株的抗菌作用相似，因此实施例3-7中仅选用其中一种菌株进行测试，采用上述除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 3393之外的其他菌株进行测试，实验结果是一致的。以上优选实施例仅用以说明发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.Ilicicolin B的制备方法，其特征在于，所述Ilicicolin B的结构式如式Ⅳ所示；所述方法为：以式Ⅰ化合物和式Ⅱ化合物为原料，在路易斯酸的作用下发生傅克烷基化反应制得式Ⅲ化合物；所述式Ⅲ化合物在DMF和POCl₃溶液的作用下发生Vilsmeier反应制得所述Ilicicolin B；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述傅克烷基化反应中，所述路易斯酸在0℃条件下滴加；所述路易斯酸为BF₃ Et₂O。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式Ⅰ化合物、式Ⅱ化合物和路易斯酸的摩尔比为1.25：1：0.03。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述傅克烷基化反应的反应温度为25±2℃，反应时间为3小时；所述Vilsmeier反应的反应温度为25±2℃，反应时间为18小时。

5.Ilicicolin B在制备抑制MRSA生物膜的形成的抗生物膜剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Ilicicolin B通过抑制MRSA的胞外聚合物中蛋白质和多糖的产生来抑制生物膜的形成。

7.Ilicicolin B在制备用于提高MRSA对抗菌药物的敏感性或延缓MRSA耐药性的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗菌药物包括环丙沙星、万古霉素中的任一种或多种。

9.Ilicicolin B与抗菌药物的协同应用在制备抗MRSA的药物中的应用，其特征在于，所述抗菌药物包括环丙沙星。

10.用于治疗MRSA感染相关疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括Ilicicolin B和抗菌药物；所述抗菌药物为环丙沙星、万古霉素中的任一种或多种；所述疾病包括皮肤慢性或脓肿性创面感染。