CN117159724A - 一种脂质体-dna水凝胶复合给药系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含复合脂质体和水凝胶的给药系统。具体地,本发明提供了一种脂质体‑水凝胶复合给药系统,所述的脂质体包括复合脂质体,和负载所述复合脂质体的水凝胶;其中,所述的复合脂质体包括作为活性成分的免疫抑制剂组分和脂质材料。本发明的给药系统中的复合脂质体还包括免疫抑制剂,具体地,所述的免疫抑制剂可以为他克莫司(FK506)、环孢素A、硫唑嘌呤(AZA)、吗替麦考酚酯(MMF)、糖皮质激素。

Description

一种脂质体-DNA水凝胶复合给药系统及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药材料领域。具体地,本发明涉及一种脂质体-水凝胶复合给药系统
背景技术
在移植技术飞跃式的发展下,各类移植患者的术后并发症呈现出显著的改善,因而患者术后的生存率有明显提高。但是,单纯靠医生超高的手术技术并不能长期解决患者术后免疫排斥的问题。为了保护移植器官及患者,移植术后口服免疫抑制剂是必然的。移植术后常用的免疫抑制剂包括了他克莫司(FK506)、环孢素A、硫唑嘌呤(AZA)、吗替麦考酚酯(MMF)、糖皮质激素等。
FK506(他克莫司,tacrolimus)是一种强效免疫抑制剂。1984年,日本藤泽制药有限公司从筑波山的土壤中分离出一株放线菌(Streptomyces tsukubaensis No.9993株),在其发酵培养基中发现了FK506。其具有独特的化学结构,分子量为804.02。FK506为脂溶性药物,其溶解性质与环孢素A相似,不易溶于水和己烷,但极易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醚和丙酮。作为目前器官移植术后常用的一线免疫抑制剂,他克莫司的常规给药途径包括口服、注射、滴眼及皮肤外用(软膏),尤其是以口服他克莫司胶囊为主。然而,口服剂他克莫司仍有一些问题,而且对一些特殊人群,如婴幼儿或不能进食的患者不友好。P-gp将肠道他克莫司的外排、肠上皮细胞CYP450表达个体基因强度差异、肝脏首过效应及肠道状态(有无进食)等高度影响口服剂他克莫司的生物利用度,故目前他克莫司口服剂型的生物利用度波动较大,从4%到89%(平均25%),因此,患者的血药浓度不稳定,虽然有成熟的治疗药物监测(TDM),医生仍然无法准确地判断药物的确切有效剂量。
综上所述,本领域迫切需要开发新的免疫抑制剂给药系统。
发明内容
针对以上问题,一个理想的他克莫司的给药系统,应该拥有包括以下的好处:1.多种规格;2.作用可持续时间较长;3.能把携带的药物引入血液,而不在局部聚积;4.可控的药物释放速率,可控的血药浓度,不引起机体药物中毒或浓度不足。5.使用方便,无繁琐的操作。
本发明确立了FK-Lip@DNA hydrogel双载体的制作方法,成功用脂质体包封脂溶性的FK506,然后再借用DNA水凝胶的自组装功能包裹FK506-Lip,通过在特定环境的自分解以控制FK-Lip的释放速度,将FK506释放到血液。
在本发明的第一方面,提供了一种脂质-水凝胶复合给药系统,其特征在于,包括复合脂质体,和负载所述复合脂质体的水凝胶;其中,所述的复合脂质体包括:
(a)作为活性成分的免疫抑制剂组分;和
(b)脂质材料,所述的脂质材料选自下组:卵磷脂(PC)、脑磷脂(PE)、mPEG-PE、mPEG-DPPE、mPEG-HA-PC,或其组合。
在部分实施方式中,所述的脂质材料为卵磷脂。
在部分实施方式中,所述的卵磷脂为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。
在部分实施方式中,所述的免疫抑制剂选自下组:他克莫司(FK506)、环孢素A、硫唑嘌呤(AZA)、吗替麦考酚酯(MMF)、糖皮质激素,或其组合。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂为他克莫司。
在部分实施方式中,所述的免疫抑制剂与所述的脂质材料的物质的量比为:1:0.1-1:50,较佳地为1:0.5-1:20,更佳地为1:1-1:10,最佳地为1:2-1:8。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂的浓度为0.1-100mM;较佳地为0.5-50mM;更佳地为1-30mM。
在部分实施方式中,所述的复合脂质体的平均粒径为10-1000nm。
在另一优选例中,所述的复合脂质体的平均粒径为20-500nm。
在部分实施方式中,所述的水凝胶为DNA水凝胶。
在另一优选例中,所述的DNA水凝胶用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ ID No.2(即H2)所示的序列进行凝胶化从而形成的。
在另一优选例中,所述的DNA水凝胶是通过如下方法制备的:在SEQ ID No.3(即I)作为引发链下,用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ ID No.2(即H2)所示的序列进行凝胶化从而形成的。
在另一优选例中,所述的制备方法中,(H1/H2)与引发链I的摩尔比为n(H1/H2):n(I)=20-20,0000:1,较佳地为n(H1/H2):n(I)=30-15,0000:1。
在另一优选例中,所述的制备方法中,(H1/H2)与引发链I的摩尔比为n(H1/H2):n(I)=30-70:1。
在本发明的第二方面,提供了一种如本发明第一方面所述的给药系统的用途,其特征在于,用于制备用于减弱免疫排斥的药物。
在另一优选例中,所述的药物为透皮微针剂型。
在本发明的第三方面,提供了一种制备如本发明第一方面所述的给药系统的方法,其特征在于,所述的方法包括步骤:
(1)用含有免疫抑制剂的第一溶液与含有脂质材料的第二溶液混合,在缓冲液中进行自组装从而形成复合脂质体;
(2)在含有所述的复合脂质体的水性体系中,制备水凝胶,得到所述的给药系统;或者,将所述的复合脂质体与含有水凝胶的第三溶液混合,得到所述的给药系统。
在另一优选例中,所述的水凝胶是用如下方法制备的:在SEQ ID No.3(即I)作为引发链下,用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ ID No.2(即H2)所示的序列进行凝胶化,从而形成所述的水凝胶。
在本发明的第四方面,提供了一种复合脂质体,其特征在于,包括:
(a)作为活性成分的免疫抑制剂组分;
(b)脂质材料;所述的脂质材料选自下组:卵磷脂(PC)、脑磷脂(PE)、mPEG-PE、mPEG-DPPE、mPEG-HA-PC,或其组合。
在另一优选例中,所述的脂质材料为卵磷脂。
在另一优选例中,所述的卵磷脂为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂选自下组:他克莫司(FK506)、环孢素A、硫唑嘌呤(AZA)、吗替麦考酚酯(MMF)、糖皮质激素,或其组合。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂为他克莫司。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂与所述的脂质材料的物质的量比为:1:0.1-1:50,较佳地为1:0.5-1:20,更佳地为1:1-1:10,最佳地为1:2-1:8。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂的浓度为0.1-100mM;较佳地为0.5-50mM;更佳地为1-30mM。
在另一优选例中,所述的复合脂质体的平均粒径为10-1000nm。
在另一优选例中,所述的复合脂质体的平均粒径为20-500nm。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为FK506-脂质体-DNA水凝胶的制备示意图。
图2为FK506-脂质体-DNA水凝胶在小鼠皮肤移植应用的示意图
图3(a)为Avanti脂质体挤出器的组装。图3(b)为滤过后的FK506-脂质体照片。
图4为PKH26染色的FK506-脂质体与PKH67染色的Jurkat细胞共培养24小时后的荧光显微图(400x)。膜细胞和细胞核被染成绿色,FK506脂质体被染成红色。(a)PKH26的红色通道,(b)PKH67的绿色通道,(c)两通道共聚图。
图5为FK506-脂质体通过负染色法的TEM成像。
图6为FK506-脂质体SEM成像。
图7为发夹链H1、发夹链H2、引发链I及FK506-脂质体配制成的DNA水凝胶照片。
图8为四种不同配比制作出来的DNA水凝胶的SEM成像。
图9为FK506-脂质体-DNA水凝胶及FK506溶液体外释放曲线。
图10显示了各类合成材料、FK506-脂质体及FK506-脂质体-DNA水凝胶对Jurkat细胞存活比的影响
图11显示了FK506及FK506-脂质体-DNA水凝胶对Jurkat细胞传代的影响。(a)给药后24小时;(b)给药后48小时;(c)给药后72小时。红色为对照组,蓝色为FK506组,橘色为FK-Lipo@DNA hydrogel组
图12为FK-Lipo@DNA hydrogel的SEM成像,显示了FK506-脂质体附着在水凝胶壁上。
图13为显示FK-Lipo@DNA hydrogel的SEM成像。可见FK506-脂质体附着在水凝胶壁上。
图14为小鼠供体皮肤获取的照片。
图15为C57BL/6小鼠接受皮肤移植及水凝胶植入(移植部位对侧)的照片。
图16为不同组小鼠皮肤移植模型两周内变化的照片。上排为阴性对照组术后第1、5、7、11及14天的移植物肉眼变化;中排为阳性对照组术后第1、5、7、11及14天的移植物肉眼变化;下排为实验组术后第1、5、7、11及14天的移植物肉眼变化。
图17显示了小鼠皮肤移植模型两周内移植物的病理改变。上排分别为阴性对照组术后第5、7及11天的移植物病理变化;中排分别为实验组术后第5、7及11天的移植物病理变化;下排分别为阳性对照组术后第5、7及11天的移植物病理变化(HE×10)。
图18显示了小鼠皮肤移植模型两周内移植物的免疫组化病理(CD4+)改变。上排为实验组,中排为阳性对照组,下排为阴性对照组(IHC×10)。
图19显示了小鼠皮肤移植模型两周内移植物的免疫组化病理(CD8+)改变。上排为实验组,中排为阳性对照组,下排为阴性对照组(IHC×10)。
图20显示了小鼠皮肤移植模型两周内移植物的免疫组化病理(CD31)改变。上排为实验组,中排为阳性对照组,下排为阴性对照组(IHC×10)。
图21显示了小鼠皮肤移植模型两周内移植物的免疫组化病理(ki67)改变。上排为实验组,中排为阳性对照组,下排为阴性对照组(IHC×10)。
图22显示了不同组的移植物生存率(%)。
图23显示了实验组及阳性对照组的FK506血药浓度比较。
图24实验组、对照组及不干预组的各个细胞群在移植术后不同时段的分布比较。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究,首次开发了一种脂质材料包裹免疫抑制剂并附着于水凝胶的脂质体-水凝胶复合给药系统。本发明的脂质体-水凝胶复合给药系统包括FK-506、脂质材料和DNA水凝胶。该给药系统能够通过脂质材料包裹形成脂质体,将脂溶性的免疫抑制剂附着于DNA水凝胶,提高了药物释放可可控性。
复合脂质体及其制备
本发明中,采用他克莫司与脂质材料复合形成复合脂质体,从而改善他克莫司服药后的生物利用度。
具体地,在本发明中,采用他克莫司与选自下组的脂质材料进行复合自组装,从而形成复合脂质体:卵磷脂(PC)、脑磷脂(PE)、mPEG-PE、mPEG-DPPE、mPEG-HA-PC,或其组合。在优选的情况下,所述的脂质材料为卵磷脂,更优选地为DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱,1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。
DOPC是一种磷脂,在微粒、脂质体和其他类型的人工膜的生成中通常单独使用或与其他组分一起使用。DOPC拥有两性分子,一端为亲水的含氮或磷的头,另一端为疏水(亲油)的长烃基链,可以与蛋白质、糖脂、胆固醇等等其他子共同构成脂双分子层,融入为细胞膜的结构。DOPC的分子式C44H84NO8P,其分子量786.113。DOPC有有黏性块状易吸潮,需-20℃保存,同时做好密封和遮光。它不易溶于水,但易溶于氯仿。DOPC制作脂质体的方法文献上已经有大量报道,方法简单,成功率高,因此适合作为本发明中复合脂质体的脂质材料成分。
所述的复合脂质体中,所述的免疫抑制剂与所述的脂质材料的物质的量比为:1:0.1-1:50,较佳地为1:0.5-1:20,更佳地为1:1-1:10,最佳地为1:2-1:8。
脂质-水凝胶复合给药系统
DNA水凝胶是以DNA为成分的三维亲水网络,可以吸水并在水溶液中膨胀。根据其组成成分,DNA水凝胶可分为纯水凝胶或混合水凝胶,两者都可以通过物理自组装或化学交联形成。通过不同的设计原理,目前已开发出各种尺寸的DNA水凝胶,包括大块水凝胶、微凝胶和纳米凝胶。DNA纳米凝胶是大小以纳米为单位的颗粒水凝胶,它将DNA水凝胶与纳米颗粒的优点结合在一起。由于DNA链是可编程的、互补的和化学可修改的,因此,可以灵活地操纵它们以形成具有独特几何形状的各种DNA构建块,从而形成高度可预测和结构化的DNA网络。此外,DNA水凝胶内的3D支架提供了机械刚性,并提供了大量的结合位点,从而提高了其作为固定纳米颗粒或分子组分基质的功能。然而,有的研究者设计出“智能水凝胶”,此类水凝胶的物理化学稳定性将随着周围环境的触发而改变,因此,这些“智能”构建体在生物传感和生物医学领域受到了研究者额外的关注。
本发明中,采用DNA水凝胶负载本发明的复合脂质体,从而形成脂质-水凝胶复合给药系统,从而完成FK506的可控释放。一种优选的DNA水凝胶系统是用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ ID No.2(即H2)所示的序列交联形成的。
在另一优选例中,所述的DNA水凝胶是用如下方法制备的:在SEQ ID No.3(即I)作为引发链下,用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ ID No.2(即H2)所示的序列交联形成的。
在另一优选例中,所述的制备方法中,(H1/H2)与引发链I的摩尔比为n(H1/H2):n(I)=20-20,0000:1,较佳地为n(H1/H2):n(I)=30-15,0000:1。特别地,在(H1/H2)与引发链I的摩尔比为n(H1/H2):n(I)=30-70:1的情况下,制备得到的水凝胶具有最佳的理化性质。
本发明的主要优点包括:
(1)本发明利用DOPC包封FK506,其在生物学和结构上与天然脂质相似,具有高度的生物相容性,并以高纯度合成
(2)由于DNA链具有可编程性、互补性和化学可修饰性,因此可以灵活操纵它们以形成具有独特几何形状的各种DNA构建块,从而形成高度可预测和结构化的DNA网络。
(3)DNA水凝胶良好的生物相容性好、力学性能可调控、相变可控,并且制备方法简单。
(4)由于本发明给药系统的可塑性,可以制成微针剂型,避免口服剂型的弊端,并且给药更方便,可以制成多种浓度规格。
(5)本发明的给药系统可持续作用时间较长,120小时后仍可测到血里药物浓度,可以避免服药过于频繁引起的服药依从性降低,并且不会导致局部聚积。
(6)本发明的给药系统可以有效控制药物释放速率,血药浓度波动小,不容易引起机体药物中毒或浓度不足。
实施例
实施例1:FK506溶液及脂质体溶液配制
1.1FK506样品溶液的配制
FK506母液配制:将FK506粉末用分析天平称重50mg,将50mg的FK506粉末倒入4ml的EP管中,用移液器吸取1ml无水乙醇,移至容器中溶解FK506配制成50mg/ml(62.19mM)的FK506母液。混匀,静置10分钟。不同FK506浓度样品的配制:按浓度配制的要求,从FK506母液中抽取一定量的液体至离心管,再用一定量的无水乙醇稀释至目标容积作为工作液。例如:
母液的MV=样品的MV
62.19mM(x)=20mM(250μl)
x=(20*250)/62.19
=80.4μl
x为需从FK506母液吸取的容积(μl)。以此类推配制其他浓度的FK506样品溶液。(表1.1)
1.2DOPC脂质体样品溶液的配制
母液配制:将DOPC粉末用分析天平称重50mg,将50mg的DOPC粉末倒入4ml容器中,用移液器吸取1ml氯仿,移至容器中溶解DOPC配制成50mg/ml(63.61mM)的DOPC母液。混匀,静置10分钟。不同DOPC浓度样品的配制:按浓度配制的要求,从DOPC母液中抽取一定量的液体至玻璃容器内,再用一定量的氯仿稀释至目标容积作为工作液。例如:
母液的MV=样品的MV
63.61mM(y)=20mM(250μl)
y=(20*250)/63.61
=78.6μl
y为需从DOPC母液抽取的容积(μl)。以此类推配制其他浓度的DOPC样品溶液。
表1.1按FK:DOPC比例配制不同浓度的FK-脂质体
1.3FK506-脂质体制备
将不同比例浓度的FK506(见上表1.1)加入相应DOPC样品管里,配制不同比例的FK506-DOPC混合液。所有样品混匀后,用氮气轻柔缓慢风干。将风干后的样品(管壁可见一层含有DOPC脂质薄膜)放置在真空离心浓缩仪用真空干燥模式下继续干燥4小时。主要目的为去除剩余的液体。在室温下,加入1ml缓冲溶液(TAE-Mg2+)水合,用磁珠搅拌2小时。当出现均匀乳白色液体时,即为大小不一的FK506-脂质体。
1.4制备大小均匀的FK506-脂质体样品
检查及安装好Avanti脂质体挤出器后,用缓慢的力道推挤一侧已抽取FK506-脂质体样品的注射器活塞,将样品推挤到另一侧空的注射器内,然后来回挤出至少31次直至浅蓝色透明液体。(图3(a)Avanti脂质体挤出器的组装。(b)滤过后的FK506-脂质体呈淡蓝色。)将挤出好的FK506-脂质体样品装入玻璃容器内备用。
实施例2:FK506-脂质体结果验证
2.1FK506-脂质体粒径及zeta电位检测
使用动态光散射(DLS)技术,采用Zetasizer Nano ZS(英国Malvern仪器有限公司)测定脂质体的平均直径和粒径分布。使用的软件是制造商(英国Malvern仪器有限公司)提供的DTS Nano 6.12版。将样品按1:100比例稀释,所有测量均在25℃下进行,通过考虑1.020的介质粘度和1.335的介质折射率。结果以脂质体悬浮液的平均直径(Mean±SD)表示。
Zeta-电位是脂质体表面电荷、界面上的任何吸附层以及脂质体悬浮介质的性质和组成的函数。Zeta-电位不能直接测量,但可以使用理论模型和实验确定的电泳迁移率或动态电泳迁移率来计算。使用Zetasizer Nano ZS测定脂质体的zeta电位。将样品置于配备有金电极的标准毛细管电泳池中。将脂质体悬浮液按1:50比例稀释以避免多重散射效应,然后直接放置到模块中;所有测量均在25℃下进行,结果显示为脂质体悬浮液的平均zeta-电位(Mean±SD)。
2.1.1FK506-脂质体粒径及zeta电位实验步骤
1.FK506-脂质体样品的准备
1)粒径样品:用移液器吸取10μl FK506-脂质体样品,用双蒸按1:100比例水稀释至1ml(10μl样品+990μl双蒸水)。
2)Zeta电位样品:用移液器吸取20μl FK506-脂质体样品,用双蒸按1:50比例水稀释至1ml(20μl样品+980μl双蒸水)。
2.样品准备好了后,按Zetasizer Nano ZS开机要求开机,打开相关软件,然后上样检测FK506-脂质体的粒径及Zeta-电位。
2.1.2FK506-脂质体粒径及zeta电位检测结果
FK506-脂质体粒径及zeta电位检测结果如下表(表2.1a及2.1b)
表2.1a FK506-脂质体粒径(nm)
表2.1b FK506-脂质体zeta电位(mV)
上述5个不同浓度的样品均经过100nm聚碳酸酯膜过滤后,其粒径均位于101.4±8.856nm-116.0±7.765nm范围内,提示了脂质体有效的经过过滤后基本出现大小均一的体积,可减少后面实验的误差。不同浓度的FK506-脂质体均表现出无明显差异的zeta电位(P>0.05),提示了zeta电位不受浓度影响。FK506-脂质体zeta电位结果提示其具有稳定性,粒子间电荷作用大,不易相互吸引而发生凝聚。
2.2FK506浓度测定及包封率
2.2.1包封率
采用ELISA法作为测定FK506浓度的方法。ELISA法检测FK506浓度具有灵敏度高、特异性强的特点,其科学有效地保证结果的准确性。同时,ELISA方法简单,需要的设备少,能够比较快速检测样品中FK506的浓度。ELISA方法检测FK506浓度的步骤多、周期长,测定结果易受外界因素影响,故存在一定的误差。为了保证检测数据的准确性,尽可能保证统一的研究环境、操作规范、仪器设备、样品的处理等。
通过检测脂质体的包封率可以了解不同比例浓度脂质体的制作效率,并可从中选择一种包封率高的FK506-脂质体作为下一步合成FK-Lipo@DNA hydrogel做准备。通过超速离心的方法将脂质体甩到离心管底部,然后用破乳剂破膜,破膜后再用ELISA法检测FK506浓度。首先将制备的FK506-脂质体添加到超速离心管中,并在4℃下以170000×g离心120分钟。弃去含有游离FK506的上清液,收集离心管底部的沉淀物,用缓冲溶液(PBS)重悬,用20μl X-100(1%)破坏脂质体膜,以释放包封的FK506。通过ELISA法检测破乳后液体中FK506的浓度。包封率可通过以下公式计算:
Ctotal:脂质体中药物总量。制作FK506-脂质体用的FK506浓度。
Cout:脂质体中实际包封的药物。
2.2.2FK506浓度测定
根据制造商的说明,使用FK506 ELISA试剂盒(南京森贝伽生物技术有限公司)测定脂质体中的FK506。将50μl的标准品溶液加入标记好的微孔(需要预设B0及空白孔),将破乳后的样品加取50μl加入样品孔。在所有孔中加入50μl的抗FK506抗体酶结合物。轻轻晃动反应板5秒钟后放入温育箱中37℃温浴30分钟。然后甩掉孔中液体,用洗液洗涤微孔板5次,最后一次在吸水纸上拍打以完全除去微孔中液体。立即用微量移液器在每个微孔中先加入50μl显色液A,然后再加50μl显色液B;轻微晃动反应板使之彻底混匀。放入温育箱中37℃温浴10分钟。然后每孔中加入50μl终止液,混匀。最后在酶标仪的450nm下检测吸光度,读取结果。
2.2.3FK506-脂质体包封率结果
在不同FK:DOPC比例的情况下,分别选用1mg、0.5mg及0.25mg的FK506制备FK506-脂质体,以包封率为评估标准,考察FK506对纳米颗粒的影响。结果见表2.2.1,通过结果可知,FK:DOPC比例对包封率有影响。
表2.2.1不同比例浓度对FK506-脂质体的影响
2.3细胞摄取实验
Jurkat细胞被选择作为细胞摄取实验细胞。Jurkat细胞是一种悬浮CD3+T细胞。常用于研究急性T细胞白血病、T细胞信号传导及病毒表达的各种趋化因子受体,特别是HIV表达的永生化人T淋巴细胞系。它在生物学研究上具有十分广泛的应用,例如应用Jurkat细胞研究脂蛋白在环孢素(CsA)和他克莫司的运输和细胞摄取中的作用。Jurkat细胞株生长速度快,可以使用含牛血清的RPMI-1640培养液培养。
Jurkat细胞培养到指定数量后,将经过PKH26荧光染色标记的FK506-脂质体加入到提前经PKH67荧光染色标记的细胞培养基中作用,然后在荧光显微镜下观察Jurkat细胞摄取脂质体的情况。
2.3.3细胞摄取实验结果
通过图4结果得知FK506-脂质体可在24小时内被Jurkat细胞摄取。
2.4FK-脂质体形态学检查
脂质体的大小和分布对其在药物或诊断的功能有重要的影响。透射电子显微镜(TEM)是目前了解纳米颗粒表征最常用的技术,特别是脂质体的超微结构,有时可结合扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)和其他技术。脂质体样品必须以特殊的方式制备以便其在电子显微镜中经受住高真空并保持稳定。有三种主要技术可以处理脂质体样品,包括负染色TEM、浸入式冷冻(也称为冷冻EM)和冷冻断裂。每种方法都有其优点和缺点,并导致信息略有不同。
通过TEM和负染色法研究脂质体的微观结构,然后再采用SEM及喷金法研究脂质体三维形态结构。
图5显示FK506-脂质体通过负染色法的TEM成像。FK-506脂质体样品形态均匀,大小相近,可见脂质体为单层囊泡结构,分布密集,故可作为药物载体适合用于下一步和水凝胶结合实验。
图6显示FK506-脂质体SEM成像。FK506-脂质体样品形态均匀,大小相近,表面不光滑,可见疑似FK506晶体结构嵌合,分布密集,认为FK506与脂质体成功包封。
实施例3:FK506-脂质体-DNA水凝胶的制备
3.1DNA水凝胶材料溶液配制
①发夹链H1及H2的配制
实验用的所有寡核苷酸均购自上海三工生物科技有限公司,并通过HPLC纯化。所有寡核苷酸的序列列于表3.1中。
表3.1DNA序列
②构造发夹结构
为了制备用于线性HCR和C-HCR过程的DNA发夹,将购买的链(H1、H2、H1或H2-I)在95℃水浴下保持5分钟,然后用冰快速退火至4℃。使用1×TAE-Mg2+缓冲液溶解H1和H2链。将5×SSC缓冲液用于H1和H2-I链。
③DNA水凝胶的制备
当制备水凝胶时,H1和H2的浓度比引发剂I的浓度高50倍到10000倍,并且它们溶解在体积为30μl的1×TAE-Mg2+缓冲液中。将混合物在37℃保温下保持过夜以进行凝胶化。例如,在制备含有3.4wt%DNA的DNA水凝胶样品的典型程序中,使用5.6μl H1(5.39mM)、7.4μl H2(4.03mM)、2.4μl I(250μM)和5.6μl 1×TAE-Mg2+缓冲液来制备混合物。如需在针筒内合成水凝胶,则先把注射器活塞拔出,再用细长移液器吸头将微离心管中的混合物吸出再注入针筒内,然后重新置入注射器活塞。待水凝胶形成后,在比水凝胶位置较高的针筒处切开针筒,然后推动活塞,推出水凝胶。(图7)
3.2FK506-脂质体-DNA水凝胶的配比
用以下列表(表3.2)显示的四种发夹链及引发链配比方案制作DNA水凝胶。
表3.2四种发夹链及引发链配对方案
H1:5.39mM;H2:4.03mM:I:250μM
通过固定包封的FK506-脂质体浓度(选择包封率高、FK506浓度高的脂质体),用不同配比配制DNA水凝胶。经过在37℃温度下保持过夜后观察,以肉眼观察及拍摄SEM来评估水凝胶的成形情况。图8示四种不同配比的DNA水凝胶,肉眼可见成形的水凝胶有形状、不易塌陷、不流动的特点。在SEM下可观察不同配方的水凝胶形成的网孔大小情况,根据对以上不同配比DNA水凝胶的观察,其中以H1/H2 1mM I 1:50配比的水凝胶网孔较适宜制作包封脂质体的DNA水凝胶。(图8)
实施例4:FK506-脂质体-DNA水凝胶结果验证
4.1 FK506-脂质体-DNA水凝胶体外释放实验
准备24孔costar transwell 3421(带滤膜5μm)培养皿,先将400μl 1×TAE加到第孔中,然后把含有10mM浓度的FK506-脂质体-DNA水凝胶放置Transwel l小室透明膜嵌套里,然后,将100μl 1xTAE缓冲液也加到Transwell小室透明膜嵌套里。注意确保TAE缓冲液水平线超过水凝胶最顶端,将所有的水凝胶浸泡在缓冲液里,将孔板置37℃、5%CO2温箱保温。同法将FK506溶液放置在另一孔中的Transwel l小室透明膜嵌套里,也将100μl 1xTAE缓冲液也加到Transwell小室透明膜嵌套里,并同样在37℃、5%CO2温箱保温。分别于1小时、2小时、4小时、8小时、1天、2天、3天、4天、5天后更换孔里的缓冲液,将孔中吸出的缓冲液用等量的1%Triton-X破膜后,取100μl封装,-20℃冰箱保存,备测FK506浓度。(见表4.1a)
表4.1a FK506-脂质体-水凝胶体外释放实验取样计划表
通过图9示FK506-脂质体-DNA水凝胶体外释放曲线可以看出FK506-脂质体-DNA水凝胶在TAE缓冲液中浸泡后1个小时就有FK506释出,刚开始时FK506随释放增快,在24小时达到高峰后,释放量随着浸泡时间延长呈平缓的增加,直至实验观察期结束时(120小时),仍有FK506在释放,24小时释放量为1.97±0.01ng/ml,而累积释放量达到了71.50ng/ml,仍维持在较高水平释放。而FK506溶液在TAE缓冲液中浸泡后24小时就开始显著减少至测出的浓度精准度下降,故此后结束检测。
表4.1b体外释放实验TAE浸出液FK506释放量
4.2体外细胞毒性实验
采用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测水凝胶或脂质体的合成材料、脂质体及DNA水凝胶对细胞的增殖影响。MTT是一种检测细胞存活和增殖的方法。MTT的实验原理为活细胞中线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶水的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan),并沉积在细胞中,而无生命的细胞无法实现。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处可测其光吸收值,可间接反映活细胞数量。细胞增殖越多越快,则吸光度越高;细胞毒性越大,则吸光度越低。通过对水凝胶、脂质体或水凝胶合成材料的检测,可以了解它们对细胞的影响。注意在进行酶联仪测定之前其中一专设组细胞加入20%二甲基亚砜(DMSO)作为阳性对照。
通过对体外细胞毒性研究,如表4.2及图10所示,DNA水凝胶、脂质体及水凝胶合成材料在与人Jurkat细胞孵育的3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-四氮唑溴化物(MTT)测定中显示出可忽略的细胞毒性特点。
表4.2各类材料对细胞增殖的影响
4.3体外细胞药物实验
主要是通过比较FK506-脂质体-DNA水凝胶及FK506在体外对细胞有无抑制增殖活化作用。首先先对Jurkat细胞培养,培养过程中对其加入CFSE活细胞染色剂,培养一段时间后加入测试的样品,然后通过观察Jurkat细胞传代情况可以了解FK506对细胞的影响。CFSE能够轻易穿透细胞膜,在活细胞内聚积并与胞内蛋白共价结合,水解后的CFSE释放出荧光物质,这些共价结合的荧光物分子很少从细胞内脱落。CFSE标记后的细胞用于体内观察可以长达数周。因此,CFSE常被用来做活细胞检测试验和用荧光电镜观察细胞长期活动的试验。CFSE标记的细胞的激发和发射波长分别为500nm和520nm。
通过观察药物干预后24、48及72小时的Jurkat细胞传代情况,分析药物对细胞增殖活化的抑制作用(图11)。
通过对Jurkat细胞的传代观察,发现给药后24小时的三组Jurkat细胞(对照组、FK506组及FK-Lipo@DNA hydrogel组)并未出现明显的差异。在给药后48小时,对照组的Jurkat细胞有明显向左移的倾向,提示Jurkat细胞已经有传代的现象,而FK-Lipo@DNAhydrogel组及FK506组较对照组落后提示FK506药物的释放已经开始抑制Jurkat细胞的活化及增殖活动。Jurkat细胞的活化及增殖抑制作用在给药后72小时更为明显,提示FK506在体外达到一定的浓度后对细胞有显著的抑制作用。这提示了FK506在体内可以有抑制T细胞增殖及活化的作用。
4.4FK506-脂质体-DNA水凝胶体形态表观
本实验通过扫描电子显微镜(SEM)观察FK506-脂质体-DNA水凝胶的结构特征。SEM的检测需要将FK506-脂质体-DNA水凝胶制作成脱水后的冻干状态。经过冻干脱水后的样品可显示出典型的3D交联形态。
图12显示FK506-脂质体-DNA水凝胶SEM成像。通过图12可清楚见到水凝胶内部的网状结构,网状结构孔隙大,孔隙内可隐约见到FK506-脂质体附着在网状支架壁上。证实了DNA水凝胶可携带FK506-脂质体。
4.5流变学检测
使用Kinexus ultra+流变仪(英国Malvern)进行两组不含药水凝胶及FK506-脂质体-DNA水凝胶的流变学检测,该流变仪配备了20mm平行板几何形状,间隙尺寸为0.2mm。测量温度固定在25℃。以1Hz的固定频率从0.01%至1000%应变进行振荡应变扫描测量。频率扫描测量在1%应变下进行。用1%的交变应变和1000%的应变以1Hz的固定频率进行三步时间扫描。在1%的固定应变下进行温度扫描测量。
水凝胶的机械性能对其功能和应用非常重要。流变学检测来定量机械强度的表征。从图13中可以看出,对于含有3.4wt%DNA水凝胶的样品(1mM H1和H2),频率扫描实验中,其剪切储存模量(G′)显著高于剪切损失模量(G″),证实了其真实的凝胶性质。为了研究其强度是否会随时间变化,进行了振荡时间扫描测试,结果表明该水凝胶是稳定的,没有发生结构重排。此外,取决于样品中加了药物,所形成的水凝胶的强度也不同。对于相同3.4wt%的DNA水凝胶,纯DNA水凝胶的G′在整个频率扫描范围内达2080Pa,但当DNA水凝胶内加入FK506-脂质体时,G′逐渐减少到1560Pa。值得注意的是,与报道的含有相似数量DNA的所有含药物的DNA水凝胶相比,本发明的样品具有更好的机械强度。FK506-脂质体-DNA水凝胶的振荡应变扫描测试揭示了可逆的水凝胶溶液-水凝胶状态转变,FK506-脂质体-DNA水凝胶的应力值显著高于纯DNA水凝胶的应力值,加入药物后的DNA水凝胶增加了其的弹性和黏性特征。
实施例5:小鼠皮肤移植模型的建立
选择BALB/c小鼠为供体,用异氟烷麻醉小鼠后,剃干净背部毛发,用10%聚维酮碘消毒,从臀部至颈部采集供体背部皮肤。移植皮肤获取后,将移植皮肤放在持续低温的培养皿内。在显微镜下,使用细组织剪刀从背部移植皮肤分离出结缔组织、脂肪组织和肉质肌。在无菌条件下,从分离好的移植皮肤分别剪出15mm×15mm的移植物,用于受体10mm×10mm至15mm×15mm的移植物床。将移植物保存在无菌磷酸盐缓冲盐水浸泡过的纱布上,放在冰上的皮氏培养皿中低温保存。
选择C57BL/6小鼠为受体,用异氟烷麻醉小鼠后,剃干净移植部位毛发,用10%聚维酮碘消毒,剪开10mm×10mm至15mm×15mm正方形的皮肤。将移植物放置在移植物床上,避免沿边缘折叠。在每个边缘的角部和中间缝合移植物,缝合结束后,使用粘性创可贴贴紧手术部位。密切监视小鼠生命体征情况。平稳后放回鼠笼。
对于需要植入FK-Lipo@DNA水凝胶小鼠,移植部位缝合结束后,剃掉小鼠背部移植部位对侧的毛发,用10%聚维酮碘消毒,剪开10mm的小口,钝性游离皮下结缔组织。将已制备好的FK-Lipo@DNA水凝胶植入皮下,缝合关闭切口。使用粘性创可贴贴紧两侧手术部位。(见图15)
阳性对照组为小鼠移植后1天给予1mg/ml FK506按小鼠1.35ug/g/d灌胃。阴性对照组为无任何药物干预的移植后小鼠。定期取血测血药浓度,最后取皮肤移植物行HE及免疫组化观察小鼠移植皮肤的病理改变,定期取脾脏行细胞流式法了解移植后免疫细胞的变化。
实施例6:FK-Lipo-DNA hydrogel药效检测
不干预组小鼠在皮肤移植后第5-10天出现急性排斥反应。移植物的边缘出现肿胀和红斑。然后出现移植物干燥、收缩和结痂形成。随着移植时间越长,移植物表现为移植物体积明显缩小、脱毛、色素沉着等变化,最终移植物完全分离、脱落,移植部位逐渐缩小,周围皮肤向移植部位生长,局部形成瘢痕。实验组及对照组出现免疫排斥时间较不干预组晚,实验组在一个水凝胶剂量的治疗下开始出现免疫排斥的情况在平均术后的第7天,而对照组在持续每天FK506灌胃的条件下并未在观察期期间出现明显排斥现象。(图16)
实验组及阳性对照组皮肤移植小鼠的皮肤HE染色的组织病理(图17)在术后第5天未见到大量炎性改变,表皮未见增厚,表皮细胞未见明显水肿,表皮内及真皮内未见明显炎性细胞浸润及成纤维细胞的增生。而在术后第7天,实验组移植物开始出现急性免疫排斥,表皮及真皮层可看见炎性改变,移植物表皮增厚、水肿,表皮内及真皮内可见炎性细胞浸润,可见成纤维细胞增生,毛囊等结构减少。阳性对照组移植物在术后第7天未见明显免疫排斥表现。实验组移植物在术后第11天的基本出现急性炎性改变,移植物表皮增厚、水肿明显,表皮上皮细胞明显减少,大量的成纤维细胞形成,真皮层可见到大量的淋巴细胞及单核细胞,毛囊等其他皮肤结构明显减少。
实验组、阴性对照组及阳性对照组皮肤移植小鼠的皮肤免疫组化染色的组织病理(图18、19、20、21)在术后第5天未见明显CD4+及CD8+淋巴细胞浸润,通过CD31及ki67染色可见移植后5天仍保留明显的微血管及基底细胞。实验组移植物在术后第7天出现了炎性细胞浸润,但未见有明显的CD4+及CD8+淋巴细胞浸润,微血管及基底细胞较前减少,提示免疫排斥急性炎性改变的开始。而阳性对照组未见有明显的改变。实验组术后第11的移植物与阴性实验组相似,真皮层可见明显CD4+及CD8+淋巴细胞浸润,且CD31及ki67的染色明显减少,微血管及基底细胞基本上已消失。阳性对照组仍可见CD31及ki67染色的微血管及基底细胞,未见明显CD4+及CD8+淋巴细胞浸润。
通过定期对小鼠皮肤移植物变化的观察,利用精准比对移植物当时面积(长×宽,mm2)与移植后移植物即刻面积,得出占原面积的百分比,即是移植物存活率。
通过图22得知,不干预组小鼠移植物平均在第12天基本均已被排斥,而对照组小鼠移植物平均在21天出现排斥反应,实验组小鼠平均在14天出现大量移植物丧失,在21天出现完全排斥。
通过采取小鼠尾静脉血离心后的血清来检测FK506血药浓度。实验组移植小鼠术后当天的第5、6、7及8小时取血,然后在术后第1、2及3天早上取血检测血药浓度。阳性对照组移植小鼠在当天FK506灌胃后隔天,即术后第1天在给药后每1个小时取血,即C1至C8,之后每天给药前取血观察血药浓度变化(表6.1)。所得数据绘成折线图(图23)。
表6.1实验组(FK-Lipo@DNA水凝胶治疗组)及阳性对照组(FK506灌胃治疗组)的FK506血药浓度(ng/ml,x±SD,n=54)
图24提示实验组小鼠经过FK-Lipo@DNA hydrogel的治疗其血药浓度在整个治疗过程中显示血药浓度较低且波动较小,而阳性对照组的小鼠血药浓度刚开始时波动较大,且整体血药浓度水平也较高。这提示了血药浓度在较低的水平下,也能达到抗免疫排斥的效果,因而可避免FK506血药浓度过高引起的受体肾毒性作用。血药浓度的持续平稳可避免血药浓度峰谷现象,降低毒性反应,也可降低取血及调整药物剂量的频率,提高受体的舒适度。
流式细胞学检测采取分别在术后第五天、第七天、第九天及第十一天,取移植小鼠的脾脏,经过组织研磨、消化、离心、染色等一系列方法获取抗体-染料标记的特定的细胞群,以分析相关的细胞群在特定时间的分布。选择观察CD3+T细胞、CD4+及CD8+淋巴细胞在每一个观察时间的分布,以了解该群免疫细胞在实验组、对照组及不干预组不同时期的活动情况。通过对CD25的观察,可以了解移植后IL-2在FK506的影响下的变化,小鼠移植后在排斥的刺激下CD25可在24小时内上调,并在几天内保持升高。有研究证实T细胞活化后上调的最早标志物里包括了CD69,CD69在排斥早期会有升高,通过观察该指标,可以了解T细胞在早期活化或被抑制的情况。
通过对各组移植后小鼠不同时段细胞流式的分析(图24),可以了解到三组的T细胞在移植初期(术后第5天)的分布无显著性差异(P<0.05)。CD4+CD69+T细胞在移植后第5天有显著的升高,提示T细胞早期的活化,治疗组(包括实验组及阳性对照组)明显比不干预组较低提示FK506有抑制T细胞活化的效果(图24(e))。移植术后第7天的不干预组CD3+、CD4+、CD69+有显著增加,治疗组的小鼠体内因被FK506抑制而较不干预组较低。三组CD8+T细胞未见有显著差异(P>0.05)。三组的在术后第7天的CD69+较第5天有显著的减少(图24(e))。术后第9天,不干预组的移植物出现明显的急性排斥反应,这体现在明显增加的CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+,与治疗组比较有显著的差异(P<0.05)。移植术后第11天,实验组出现CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD25+的增加提示因水凝胶效果减弱引起的急性免疫排斥反应。不干预组的各个标记的T细胞分布在术后第11天开始下降考虑移植物已完全被排斥,无需更多的T细胞介导。
实施例7DNA水凝胶包裹FK-506实验
由于FK-506的疏水性(亲脂性),其在预聚物溶液中或在水凝胶的亲水相中的不溶解性,发明人研究发现常规的水凝胶合成过程中是不能捕获和包裹FK-506。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种脂质-水凝胶复合给药系统,其特征在于,包括复合脂质体,和负载所述复合脂质体的水凝胶;其中,所述的复合脂质体包括:
(a)作为活性成分的免疫抑制剂组分;和
(b)脂质材料,所述的脂质材料选自下组:卵磷脂(PC)、脑磷脂(PE)、mPEG-PE、mPEG-DPPE、mPEG-HA-PC,或其组合。
2.如权利要求1所述的给药系统,其特征在于,所述的脂质材料为卵磷脂。
3.如权利要求1所述的给药系统,其特征在于,所述的卵磷脂为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。
4.如权利要求1所述的给药系统,其特征在于,所述的免疫抑制剂选自下组:他克莫司(FK506)、环孢素A、硫唑嘌呤(AZA)、吗替麦考酚酯(MMF)、糖皮质激素,或其组合。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂为他克莫司。
5.如权利要求1所述的给药系统,其特征在于,所述的免疫抑制剂与所述的脂质材料的物质的量比为:1:0.1-1:50,较佳地为1:0.5-1:20,更佳地为1:1-1:10,最佳地为1:2-1:8。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂的浓度为0.1-100mM;较佳地为0.5-50mM;更佳地为1-30mM。
6.如权利要求1所述的给药系统,其特征在于,所述的复合脂质体的平均粒径为10-1000nm。
在另一优选例中,所述的复合脂质体的平均粒径为20-500nm。
7.如权利要求1所述的给药系统,其特征在于,所述的水凝胶为DNA水凝胶。
在另一优选例中,所述的DNA水凝胶用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ IDNo.2(即H2)所示的序列进行凝胶化从而形成的。
在另一优选例中,所述的DNA水凝胶是通过如下方法制备的:在SEQ ID No.3(即I)作为引发链下,用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ ID No.2(即H2)所示的序列进行凝胶化从而形成的。
在另一优选例中,所述的制备方法中,(H1/H2)与引发链I的摩尔比为n(H1/H2):n(I)=20-20,0000:1,较佳地为n(H1/H2):n(I)=30-15,0000:1。
在另一优选例中,所述的制备方法中,(H1/H2)与引发链I的摩尔比为n(H1/H2):n(I)=30-70:1。
8.如权利要求1-7任一项所述的给药系统的用途,其特征在于,用于制备用于减弱免疫排斥的药物。
在另一优选例中,所述的药物为透皮微针剂型。
9.一种制备如权利要求1-7任一项所述的给药系统的方法,其特征在于,所述的方法包括步骤:
(1)用含有免疫抑制剂的第一溶液与含有脂质材料的第二溶液混合,在缓冲液中进行自组装从而形成复合脂质体;
(2)在含有所述的复合脂质体的水性体系中,制备水凝胶,得到所述的给药系统;或者,将所述的复合脂质体与含有水凝胶的第三溶液混合,得到所述的给药系统。
在另一优选例中,所述的水凝胶是用如下方法制备的:在SEQ ID No.3(即I)作为引发链下,用如序列SEQ ID No.1(即H1)和SEQ ID No.2(即H2)所示的序列进行凝胶化,从而形成所述的水凝胶。
10.一种复合脂质体,其特征在于,包括:
(a)作为活性成分的免疫抑制剂组分;
(b)脂质材料;所述的脂质材料选自下组:卵磷脂(PC)、脑磷脂(PE)、mPEG-PE、mPEG-DPPE、mPEG-HA-PC,或其组合。
在另一优选例中,所述的脂质材料为卵磷脂。
在另一优选例中,所述的卵磷脂为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂选自下组:他克莫司(FK506)、环孢素A、硫唑嘌呤(AZA)、吗替麦考酚酯(MMF)、糖皮质激素,或其组合。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂为他克莫司。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂与所述的脂质材料的物质的量比为:1:0.1-1:50,较佳地为1:0.5-1:20,更佳地为1:1-1:10,最佳地为1:2-1:8。
在另一优选例中,所述的免疫抑制剂的浓度为0.1-100mM;较佳地为0.5-50mM;更佳地为1-30mM。
在另一优选例中,所述的复合脂质体的平均粒径为10-1000nm。
在另一优选例中,所述的复合脂质体的平均粒径为20-500nm。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000055176A2 (en) * 1999-03-12 2000-09-21 Human Genome Sciences, Inc. 49 human secreted proteins
CN105232462A (zh) * 2015-11-06 2016-01-13 中南大学湘雅医院 一种他克莫司类脂质体及其凝胶和制备方法
CN107281497A (zh) * 2017-07-10 2017-10-24 上海交通大学 基于dna水凝胶的功能性核酸保护性载体及其制备方法、应用
CN108024962A (zh) * 2015-09-09 2018-05-11 曼丽国际有限公司 用于治疗癌症的雷帕霉素和雷帕霉素衍生物的稳定的脂质体制剂
CN113825495A (zh) * 2018-10-11 2021-12-21 阿利维奥治疗学股份有限公司 用于智能释放的不可注射水凝胶调配物
CN115177582A (zh) * 2022-06-20 2022-10-14 山东省药学科学院 一种具有生物黏附性的他克莫司纳米脂质体眼用制剂及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000055176A2 (en) * 1999-03-12 2000-09-21 Human Genome Sciences, Inc. 49 human secreted proteins
CN108024962A (zh) * 2015-09-09 2018-05-11 曼丽国际有限公司 用于治疗癌症的雷帕霉素和雷帕霉素衍生物的稳定的脂质体制剂
CN105232462A (zh) * 2015-11-06 2016-01-13 中南大学湘雅医院 一种他克莫司类脂质体及其凝胶和制备方法
CN107281497A (zh) * 2017-07-10 2017-10-24 上海交通大学 基于dna水凝胶的功能性核酸保护性载体及其制备方法、应用
CN113825495A (zh) * 2018-10-11 2021-12-21 阿利维奥治疗学股份有限公司 用于智能释放的不可注射水凝胶调配物
CN115177582A (zh) * 2022-06-20 2022-10-14 山东省药学科学院 一种具有生物黏附性的他克莫司纳米脂质体眼用制剂及其制备方法

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