CN117157384A - 用于产生血管化组织的新型组织培养系统和降低的重力培养方法 - Google Patents

用于产生血管化组织的新型组织培养系统和降低的重力培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117157384A
CN117157384A CN202180091251.3A CN202180091251A CN117157384A CN 117157384 A CN117157384 A CN 117157384A CN 202180091251 A CN202180091251 A CN 202180091251A CN 117157384 A CN117157384 A CN 117157384A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tissue
tissue culture
culture
spherical
culture vessel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180091251.3A
Other languages
English (en)
Inventor
T·张
M·塞基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN117157384A publication Critical patent/CN117157384A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/22—Transparent or translucent parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/10—Rotating vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

提供了组织工程领域中的制品和相关方法。提供了球形容器，所述球形容器去除了常规培养容器中发现的有害机械特征，从而促进形成大型功能性组织所必需的细胞间相互作用。所述球形容器可以采用再现血管的结构，从而为可移植组织的生长和具有微血管网络的高度功能性实质的形成提供基质。另外，公开了涵盖在模拟或实际微重力下培养的方法，其中去除了干扰大型功能性组织有效形成的破坏性机械诱因。通过这些系统和方法，可以在体外产生适合于移植的高度血管化且功能性的类器官、器官和组织。

Description

用于产生血管化组织的新型组织培养系统和降低的重力培养 方法
相关申请的交叉引用：本申请要求于2020年11月20日提交的名称为“组织球体(Tissue Orb)”的美国临时专利申请序列号63/116,632的优先权权益，所述申请的内容特此通过引用并入。
关于联邦资助的研究或开发的声明：本发明是根据由国家航空航天局(NationalAeronautics and Space Administration)授予的授权号16-16ROSBDFP-0030和由国家科学基金会(National Science Foundation)授予的授权号1830768在政府支持下完成的。政府享有本发明中的某些权利。
背景技术
本领域强烈需要功能性组织来增强或替代人体中衰竭、患病或受损的器官和功能性组织。通过感染、有害突变、创伤、氧化损伤或衰老，身体的基本功能性组织受到损害或功能失调，最终导致器官衰竭。目前，终末期器官衰竭的唯一有效疗法是移植，而供体器官的严重短缺导致每年数千人死亡，以及随之而来的器官非法交易、移植旅游和剥削弱势群体等社会问题。因此，在本领域有对功能性组织替代物的强烈需求。
组织培养和工程可以潜在地满足对替代器官的巨大医学需求。理论上，通过使用合适的细胞群和适当的诱因和培养条件，功能性组织可以离体生长并移植到受试者体内，以增强或替代衰竭的器官。事实上，通过目前的方法，培养中的细胞可以被诱导自组装成小的三维类器官，所述类器官再现了一些体内形式和功能，通常大小不大于500μm。然而，仍然存在一个阻碍离体产生的合成器官的临床应用的巨大瓶颈：缺乏在厚组织体积内产生功能性微血管网络的有效策略。在本领域中仍然需要在代谢活跃的实质细胞之间产生相互连接的微血管网络，从而产生可以移植到宿主血管上的大型(例如，在厘米尺度上)宏观组织构建体的方法。
本文公开的系统为本领域提供了对产生功能性器官替代物的问题的新颖解决方案。本文公开的发明通过使用新颖的培养容器设计和在低重力或类似条件下培养，从而促进高质量组织的三维细胞自组织来满足上述需求。
发明内容
在第一方面，本发明的范围涵盖新型球形组织培养容器。本公开的发明人已经确定，包括角、平面和其它此类特征的标准培养容器孔将通过产生干扰组织形成诱因并引起畸变的优先附着位点和诱因来有害地影响组织形成。通过使用球形容器，去除了对组织形成产生负面影响的机械特征，并实现了形成大型功能性组织所需的细胞间相互作用。
在第二方面，本发明的范围涵盖具有再现血管的结构的新型培养容器。如下所述，本发明的培养容器利用用血管生成剂功能化的中心中空导管。这种结构为可移植组织的生长和具有微血管网络的高度功能性实质的形成提供了基质，所述微血管网络可以为易于移植的中心大血管提供营养。
在第三方面，本发明的范围涵盖在模拟或实际微重力下培养组织的方法。本公开的发明人已经确定，在正常重力下的组织培养会产生干扰大功能性组织有效形成的机械诱因。通过在降低的重力下培养组织并使用本发明的新型容器，可以去除破坏性诱因，并且使细胞自由地自我组织并形成关键的微观解剖关系，所述微观解剖关系实现了在体内发现的自然发育路径。
附图说明
图1A、1B和1C.图1A-1C描绘了本发明的实施方案，其中球形孔通过将包括半球形孔的两个透明材料块接合而形成。图1A描绘了本发明的半球形块元件，所述半球形块元件包括包含半球形孔或空隙的矩形材料块。所述块进一步包括若干通道，所述通道包含将形成中心导管输入的通道、将形成中心导管输出的通道、将形成辅助输入通道的通道和将形成辅助输出通道的通道。图1B描绘了被配置为接合的第一块和第二块以及中心导管。图1C描绘了形成具有中心导管以及辅助输入和输出通道的球形孔的接合块。
图2A、2B、2C、2D、2E和2F.图2A-2F描绘了本发明的实施方案，其中球形孔通过将形成组织球体的两个半球形主体接合而形成，其中每个半球形主体容纳在支撑块中。图2A描绘了单个半球形半球体(demiorb)。图2B描绘了接合以形成球形培养容器的一对半球体。图2C描绘了被配置为容纳图2A的半球形半球体的单个支撑块。图2D描绘了当容纳在支撑块中时的半球形半球体。图2E描绘了容纳在支撑块内的一对半球体，所述支撑块被配置为围绕中心导管接合。图2F描绘了图2E的当接合以在内部产生球形孔(不可见)时的两个支撑块。
图3A和3B.图3A描绘了包括基本上管状的主体的本发明的中心导管。图3B描绘了由细胞支架结构包裹的本发明的中心导管。
图4A和4B.图4A描绘了通过本发明的设备和方法进行的肝脏类器官或肝组织的分化的过程。图4B描绘了在微重力下产生的自组装类器官和常规基质胶生长的类器官的细胞产生的白蛋白。
具体实施方式
部分I.组织球体
本发明的新型培养容器将在本文中称为基于其球形孔的“组织球体”。本文中使用的组织球体涵盖任何球形培养容器，即，其中可以温育培养基和细胞的容器，并且其中所述容器包括球形或基本上球形的孔或内部容积。如本文所使用的，对“球形孔”的提及可以涵盖内部容积，所述内部容积包括具有基本上球形或球状体几何形状的空隙或空间，所述基本上球形或球状体几何形状没有角、边、平面和突起。在各个实施例中，“球形”可以指完美球体、不完美球体、球状体或椭球体，如扁平球体或椭圆形球状体。本发明的组织球体。所述孔由球形壁或外壳限定。
因此，在一个实施例中，本发明的范围涵盖组织培养系统，其中组织培养系统包括组织培养容器，其中组织培养容器包括：具有基本上球形的几何形状的内部容积，所述基本上球形的几何形状没有角、边缘、平面和突起；并且组织培养容器进一步包括进入内部容积的两个或更多个端口，其中两个或更多个端口包括第一端口和第二端口，并且其中第一端口和第二端口被配置为收纳导管的相对端部，如下所述。
容纳中心导管的通道.在主要实施方案中，组织球体与中心导管一起使用，如下所述。在此类实施方案中，组织球体将包括进入内部容积的两个或更多个端口，其中两个或更多个端口包括第一端口和第二端口，并且其中第一端口和第二端口被配置为收纳导管的相对端部。端口是指组织培养容器的外壁中的开口，通过所述开口可以进入内部容积，例如与外部元件流体连接。
在主要实施方案中，端口被配置为通道。在一个实施例中，培养容器包括第一导管通道和第二导管通道，其中第一导管通道和第二导管通道被配置为收纳或容纳中心导管的相对端部。这些通道用作中心导管的端部的锚定点，并且还用作培养基流过中心导管的输入端口和输出端口。在一种实施方案中，通道由互补的半圆柱形通道形成，所述半圆柱形通道在接合时形成圆形管状通道，如下面的示例性实施例中所述。也可以使用如正方形或不规则形状的通道等替代性几何形状。可替代地，中心通道可以通过在容纳球形孔的主体上钻孔来形成。
在主要实施例中，第一中心导管通道和第二中心导管通道在球形孔的相对极对齐，从而形成横穿球形孔的几何中心的线性通路，以容纳线性中心导管。然而，也可以使用离轴通道和非线性配置。
辅助端口.除了两个导管端口外，本发明的培养容器还可以进一步包括一个或多个辅助端口。辅助端口包括孔容积中的开口，通过所述开口可以将材料(例如生长培养基)引入和/或从孔中取出。因此，在一个实施例中，本发明的范围涵盖培养容器，所述培养容器包括球形内部容积并且进一步包括三个或更多个端口，其中第三个或更多个端口包括进入组织培养容器的内部容积的辅助端口。在一个实施例中，本发明的组织培养容器包括包含辅助输入端口的一个或多个端口和包含输出端口的一个或多个辅助端口。在主要实施方案中，所述端口与用于使材料流入和流出组织培养容器的内部容积的元件连接。
在主要实施方案中，端口被配置为通道。在一种实施方案中，组织球体包括包含输入端口的第一辅助通道和包含输出端口的第二辅助通道，通过所述端口可以将生长培养基或其它材料引入和从球形孔中取出。例如，图1A-C中描绘的组织球体包括两个辅助通道，所述两个辅助通道可以用作输入端口和输出端口。在一些实施例中，输出端口装配有防止细胞和细胞聚集体从球形孔中逸出的筛网、网状物、过滤器或其它制品。例如，孔隙大小在1μm-100μm的范围内的过滤元件可以用于防止细胞或类器官从孔中损失。示例性过滤元件129在图1C中描绘。
组织球体配置.本发明的组织球体可以被配置为任意数量的不同制品。在一些实施方案中，本发明的组织球体可以形成为单个零件或材料。例如，在一个实施例中，组织球体包括由单个零件组成的中空球形壳。在其它实施方案中，组织球体被配置为接合以产生具有球形孔的组织培养容器的两个或多个零件的组合件。在主要实施方案中，本发明的组织球体由接合以形成水密球形孔的两个或更多个互补零件形成。例如，在一种实施方案中，将包括半球形凹陷或空隙的两个块接合以形成其中具有球形孔的主体。在另一实施方案中，将两个半球形物体(“半球体”)接合以形成中空球体。
说明性实施例1.本发明的说明性实施例在图1A-1C中描绘。在此实施方案中，组织球体通过将包括半球形孔的两个相同透明零件接合而形成，其中一旦接合，两个制品就形成在其中包括球形孔的实心块。
图1A描绘了包括围绕半球形孔或凹陷102的平坦表面107的块101。在此说明性实施例中，存在多个半圆柱形(二等分圆柱形)通道。第一半圆柱形通道103和第二半圆柱形通道104存在于半球形孔的相对极处。这些相对的通道将在组装后形成第一圆柱形通道和第二圆柱形通道，其中这些第一通道和第二通道容纳中心导管的相对端部，如下所述。在此说明性实施例中，所述块进一步包括另外的半圆柱形通道：第一辅助半圆柱形通道105，所述第一辅助半圆柱形通道当与互补通道组装时将形成与球形孔连接的输入通道；以及第二辅助半圆柱形通道106，所述第二辅助半圆柱形通道当与互补通道组装时将形成与球形孔连接的输出通道。
图1B描绘了两个块101和111，所述两个块是相同的并且被布置成围绕中心导管400接合。中心导管300的长度大于块101的半球形孔102和块111的半球形孔112的直径，使得中心导管的每个端部401和402将从球形孔中突出，并将被包裹在通过将块101的通道103和104与块111的通道113和114夹在一起形成的通道123和124内或夹在所述通道123和124之间。
图1C描绘了图2B的两个块101和111，其中所述块已对称地对齐并在表面107和117处接合以形成单个组合件120。组合件包括中心球形孔122。组合件进一步包括第一导管通道123和第二导管通道124，所述第一导管通道和所述第二导管通道各自包括与球形孔122连接并延伸到组合件120的边界的管腔，其中导管通道在球形孔122的相对极上对齐，从而包封中心导管300。组合件进一步包括用作球形孔122的输入端口的第一辅助通道125和包括自球形孔122起的输出通道的第二辅助通道126，通过所述输入通道和输出通道可以将培养基和其它材料引入到球形孔。
说明性实施例2.图2A-2E的替代性实施方案描绘了组织球体的替代性实施方案。在此实施方案中，组织球体通过将两个半球形半球体接合以形成其中包括球形孔的中空球形容器而形成。
图2A描绘了包括限定半球形空间202的球形壳201的单个半球体。位于半球体的相对极处的第一半圆柱形管203和第二半圆柱形管204从所述壳突出。
图2B描绘了两个半球体201和211，所述两个半球体接合以形成球形球体220，所述球形球体在其中包括球形孔222。图2B的球体进一步包括在球形壳的相对极处突出的第一圆柱形管223和第二圆柱形管224，所述第一圆柱形管和第二圆柱形管是通过将块201的第一半圆柱形管203和第二半圆柱形管204以及块211的第一半圆柱形管213和第二半圆柱形管214联结形成的。
在图2A-2F中描绘的说明性实施例中，半球体各自被容纳在支撑块中以促进其对齐和联结。图2C描绘了支撑块301，所述支撑块包括矩形主体，所述矩形主体具有平坦上表面307，所述平坦上表面具有被配置为收纳半球体的半球形凹陷302或空腔。支撑块进一步包括用于收纳紧固件330的孔308。支撑块进一步包括开口，所述开口包括用于成像装置接近球形孔的观察端口309。图2D描绘了座落在支撑块301内的半球体201。
图2E描绘了被配置为围绕中心导管400接合的两个支撑块301和311，所述两个支撑块各自容纳半球体201和211。
图2F描绘了两个支撑块301和311的最终组合件，所述两个支撑块通过使用紧固件330接合以形成组合件320。支撑块容纳对齐并接合以形成球形孔(不可见)的两个半球体，通过第一通道232和第二通道(不可见)进入所述球形孔，所述通道容纳所包封的中心导管400的相对端部(401和402，不可见)。可以通过支撑块的端口319来观察所包封的球体221。
水密密封.在本发明的组织培养容器中，形成球形孔的组合件可以通过任何合适的手段接合。块或支撑块可以包括用于收纳如螺钉或螺栓等紧固件的孔，并且可以通过使用例如如图2E和2F中的此类紧固件进行接合。可替代地，可以通过用夹持元件将块夹持在一起来将块接合。为了保持液体培养基，两个或更多个零件必须以基本上防水的密封形式接合。防水密封可以通过使用如硅酮、环烯烃共聚物、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯和本领域已知的其它密封剂等密封剂来实现或增强。可替代地，包括橡胶或其它聚合物材料的垫片可以安置在所接合零件的边界处。优选地，联结是容易可逆的，以便可以回收培养容器孔的内容物。
组织球体材料.包括球形孔的组织球体的主体可以包括用于细胞培养的任何合适材料。细胞不易粘附的材料是优选的。示例性材料包含例如玻璃、硅酮、金属、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、环烯烃共聚物或本领域已知的其它此类材料。
在主要实施例中，组织球体由透明或半透明材料制成，以促进组织球体的孔的成像。例如，PDMS是基本上透明的。
在主要实施方案中，限定球形孔的材料由合适的细胞培养材料制成。在替代性实施例中，限定球形孔的材料包括第一基础材料，所述第一基础材料提供结构支撑并限定球形孔的轮廓，其中孔表面涂覆有第二细胞培养材料，以赋予孔表面期望的性质，如生物相容性和防止细胞粘附。
在一些实施例中，组织球体被容纳在支撑块中，例如如图2A-2F中所描绘的。在此类实施方案中，支撑块可以包括任何材料。示例性材料包含聚合物材料，如聚丙烯或聚碳酸酯或金属，如铝或钛。在一些实施例中，支撑块由透明或半透明材料制成，以促进组织球体的孔的成像。在一个实施例中，支撑块包括一个或多个开口，通过所述一个或多个开口可以对所包封的球形孔进行成像。支撑块可以进一步包括配件或其它结构以便于连接到微流体元件，如用于管道的配件。
组织球体的组件可以通过如模制、机加工、冲压或印刷等标准技术制造，以产生期望大小和形状并具有如用于中心导管的进入通道和用于微流体的端口等其它特征的半球形壳或孔。
大小和规模.本发明的培养容器可以有利地在广泛的大小范围内缩放。例如，球形培养孔的直径的范围可以为1mm至100mm或更大，例如，5mm、10mm、20mm、50mm、75mm、100mm或更大。在实验环境中，较小的培养容器可以用于使用于药物测试或其它应用的实验组织生长。在治疗环境中，可以使用较大的培养容器，以例如用于可移植组织的形成，例如孔直径在10cm至100cm范围内的容器。
中心导管.在主要实施方案中，组织球体与中心导管组合使用。中心导管是基本上管状的制品，其包括血管或再现血管的结构和功能的合成结构。在一些实施方案中，中心导管用作培养细胞将在其上聚结形成有组织的组织的基质。在生长的类器官中，中心导管可以进一步为分支血管网提供成核位点。通过使生长培养基流过中心导管，中心导管也将充当生长组织的营养来源，从而促进所述生长组织的血管化。中心导管可以包括管状结构，所述管状结构跨球形孔的直径延伸到相对的导管通道，例如图1C中描绘的通道123和124。
在一种实施方案中，中心导管包括如血管等生物材料，例如外植血管或通过组织培养制成的合成血管。在一个实施例中，外植血管包括支架或其它支撑主体以为其提供结构。
在主要实施例中，中心导管包括被配置为再现血管的结构和功能的制品。中心导管通常将包括生物相容性微孔材料，所述生物相容性微孔材料促进流过导管管腔的溶液与在导管上和周围生长的细胞之间的材料交换。在一般实施方案中，如下所述，将中心导管或其一部分以及其周围生长的组织移植到受体体内。因此，中心导管通常将包括适合长期植入体内的生物相容性材料，或可生物降解和/或可生物吸收的材料。
在一个实施例中，导管包括如网状物等医用织物，例如织造、编织或其它多孔织物。示例性导管材料包含聚对苯二甲酸乙二醇酯(Dacron(TM))、聚乙交酯(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-共-乙交酯(PLGA)、聚丙烯腈、聚四氟乙烯(PTFE)、聚己内酯、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、明胶甲基丙烯酸酯(GelMA)、微纺丝和本领域中用于医学植入物的其它材料。网状物孔隙大小可以改变，经选择用于导管内部与生长在外表面的细胞之间的最佳材料交换。示例性孔隙大小或孔隙率值例如在0.5μm-100μm的范围内。
在主要实施方案中，导管的外表面和/或任选的内表面用一种或多种生物活性分子功能化。在主要实施例中，所述一种或多种生物活性分子是促血管生成剂。示例性促血管生成剂包含血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF模拟物、骨膜素、硫酸甲基丙烯酸软骨素、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、血小板源性生长因子(PDGF)、血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血管生成素(Ang)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和肿瘤坏死因子(TNF)。生物活性分子可以以例如在10ng/ml至100mg/ml的范围内的任何浓度沉积。
导管表面可以包括促进组织成核或促进期望的细胞分化过程的另外的生物分子，例如细胞外蛋白，包含但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、巢蛋白、透明质酸、糖胺聚糖和蛋白聚糖。在一些实施方案中，中心导管用脂质、碳水化合物或其它生物分子功能化。
例如，可以通过本领域已知的缀合化学将生物分子缀合到导管的外表面和/或内表面。可替代地，生物分子可以在调配用于连续释放涂覆到导管表面上或输注到导管材料中的药剂的药物洗脱材料中提供。示例性材料包含聚合物或水凝胶，如由胶原蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、明胶甲基丙烯酸酯(GelMA)、透明质酸、琼脂糖、甲基纤维素和其它材料制成的水凝胶。
在主要实施方案中，使用单个管状导管。应当理解，本发明的范围涵盖其它配置，如使用两个或更多个导管、分支导管和再现各种血管架构的其它布置。
细胞支架.在一些实施方案中，中心导管进一步包括一个或多个包括细胞支架的结构。例如，细胞支架可以围绕中心导管形成或以其它方式与之接合。细胞支架可以实现多种功能，包含为培养细胞提供成核位点，引导或限定生长的类器官的形式，或为类器官的形成提供细胞来源。细胞支架将包括基质材料，并可以进一步包括其中接种的细胞。
细胞支架可以包括任何所选配置，包含球形配置、不规则配置或由所培养的类器官复制的器官的形状。在一些实施例中，通过模制形成支架。在一些实施例中，支架包括使基质材料保持期望的形状的模板结构。
示例性基质材料包含适合于用细胞接种的多孔材料。示例性材料包含：胶原材料，如重构的1型胶原海绵或微纤维胶原海绵或水凝胶；蛋白聚糖；基于藻酸盐的基质；壳聚糖；聚已酸内酯；陶瓷/胶原复合支架；如由赖氨酸-二异氰酸酯合成的聚氨酯支架等聚合物材料；基于植物的基质材料，例如纤维素、半纤维素和/或木质素；以及上述材料的混合物。
在一些实施例中，支架在培养之前用细胞接种。例如，在开始培养之前，支架可以在细胞悬浮液中温育。细胞可以以任何合适的密度接种，例如以在每mm3基质材料10,000至100,000个细胞的范围内，例如在每mm3基质材料20,000至40,000个细胞的范围内的密度接种。例如，细胞支架可以装载有所选数量的细胞，例如根据支架的大小和所选细胞密度，介于100万与1000万个细胞之间。
本发明的培养系统.本发明的组织球体可以用于培养系统。本发明的培养系统将包括用于促进组织球体中细胞培养、促进组织球体中培养细胞的取样和成像，并且在一些实施例中提供用于细胞生长的微重力环境的设备的组合。
在使用中，组织球体的中心导管将与外部元件流体连接，所述外部元件将使培养基溶液流过中心导管。培养系统元件可以包含：将组织球体的端口或通道与液体培养基贮存器连接的管道；用于附接管道的连接装置；泵；流量调节器；取样设备；以及流体系统的其它组件。
可以基于所使用的细胞类型和所形成的目标组织选择液体培养基。生长培养基的实例包含：杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)、伊格尔氏最低必需培养基(EMEM)、RPMI、Ham's F-12、mTeSR(TM)(Gibco)、肝细胞培养基(TM)(龙沙生物科学(LonzaBiosciences))、内皮基础培养基(TM)或内皮基础培养基-2(TM)(龙沙生物科学)或本领域已知的其它培养基。这些培养基可能包含另外的补充剂和因子，包含营养分子、矿物质、激素、小分子激动剂或抑制剂、生长因子和细胞因子/趋化因子。
本发明的培养系统可以包括第一液体培养基，所述第一液体培养基被引入到培养容器的孔中，中心导管浸没在所述第一液体培养基中。球形孔内的培养环境可以通过经由一个或多个辅助端口(例如，输入端口、输出端口，例如被配置为将球形孔空间与外部微流体或微流体元件(例如，泵、液体培养基贮存器、废物收集容器、调节器、分析设备和取样设备)连接的通道)输入和取出培养基来控制。通过这些输入通道和输出通道，可以将新鲜培养基输注到培养环境中，并将生物活性分子引入到生长细胞的细胞外环境中，例如生长因子、营养物、药物和其它促进或操纵组织发育和功能的药剂。在一个实施例中，孔中的液体培养基在1-3天的时间段内逐渐和平缓地交换。在一些实施方案中，第一液体培养基是分化培养基。可以依次引入不同类型的分化培养基来驱动容器中细胞结构的分化。
在一些实施例中，流过中心导管的液体培养基可以包括培养孔的第一液体培养基。可替代地，流过中心导管的液体培养基可以包括第二液体培养基组合物。在一个实施例中，选择第一液体培养基的组合物来再现分化组织的细胞外环境的各方面，并且选择第二液体培养基来再现血液的各方面。
对于流过导管的液体培养基或第二液体培养基，其可以通过包括液体培养基源(贮存器)的元件和用于使培养基流过中心导管的另外的元件(例如泵、流量调节器等)流过所述导管。溶液可以以在体内针对对应器官发现的生理速率和压力流过导管。例如，本发明的系统可以针对赋予有助于紧密连接的形成和血管屏障的建立的生理剪切应力(3-5dyn/cm2)或促进血管生成发芽的增加的剪切应力(10-15dyn/cm2)的流速进行配置。可以在培养过程的不同阶段期间使用不同的流速。在一些实施方案中，对流量进行调节，使得其在培养周期开始时是间歇性的，在接近培养周期结束时进展为连续流。
本发明的培养系统被配置成使得可以对培养容器孔的内部容积进行成像。在此类实施方案中，球形孔的壁将包括透明或光学透射材料，或将包括由此类材料构成的一个或多个窗口。支撑块可以包括光学透射材料或者可以包括开口，通过所述开口，成像组件可以接近组织球体。在一些实施方案中，本发明的培养系统包括集成成像设备。成像设备包含显微镜检查设备，例如被配置用于实时活细胞延时光显微镜检查、荧光显微镜检查和/或其它类型荧光显微镜检查的设备。
部分II.在降低的重力下的培养.
本发明的范围涵盖用于形成如血管化宏观组织和类器官等血管化细胞培养产物的方法。形成细胞培养产物的培养过程可以在正常重力下执行。
然而，在本发明的主要实施方案中，在组织球体中的培养过程的一部分或整个培养过程在降低的重力的条件下进行。本公开的发明人已经确定，在正常重力下，培养细胞的持续沉降破坏了使得能够形成具有高度血管化的厚组织的生化诱因。相比之下，当在降低的重力下培养时，聚结和生长的组织保持悬浮，从而促进随机的细胞间相互作用以及与中心导管血管或血管模拟物的相互作用，从而实现体内样发育。在降低的重力下，产生了低湍流、低剪切应力和3维空间自由的层流条件，从而有利地使细胞能够自缔合。
如本文所使用的，“降低的重力条件”涵盖其中重力减弱、消除或不存在的任何操作环境。在各个实施例中，降低的重力条件意指相当于小于1g引力的条件，例如0.9g、0.8g、0.7g、0.6g、0.5g、0.4g、0.3g、0.2g、0.1g或小于0.1g。在一个实施例中，降低的重力意指零重力或失重，即零平均重力或自由落体状态。
模拟微重力.在第一实施方案中，本发明的培养方法在包括模拟微重力的降低的重力条件下进行。模拟微重力可以通过使用被配置为再现降低的重力状态(例如平均重力矢量为0g的模拟微重力)的设备来实现。
在第一实施例中，所述设备包括旋转壁容器(RWV)。RWV是旋转生物反应器，其中反应器内流体的持续旋转产生了内容物持续下降的状态，从而减弱了重力的影响。示例性RWV包含高纵横比旋转容器(HARV)和慢转侧向容器(STLV)。
在另一实施方案中，通过使用本领域已知的随机定位机(RPM)来实现降低的重力。随机定位机涵盖安装在两个同心框架内的培养容器，使得容器可以围绕两个独立的轴线旋转，从而使得能够在不断变化的朝向和复杂的3维矢量上旋转，使得容器内部的重力矢量平均值为零，从而抵消环境重力的影响。
本发明的范围进一步扩展到可以衰减或去除重力影响的任何其它设备，包含回转器和磁悬浮设备。
在太空中操作.在另一实施方案中，组织球体在太空中操作，即在轨道上或以其它方式远离地球表面操作。例如，在一个实施例中，培养过程在环绕地球轨道运行的平台(如国际空间站、卫星或其它轨道航天器)上以零重力执行。在人造卫星的轨道高度处仍然存在着相当大的引力。例如，在国际空间站的轨道高度约409km处，地球的引力为0.9g。然而，轨道飞行器经历持续的自由落体，从而有效地创造了失重或零重力的条件。在一个实施例中，培养过程在重力低于地球的地外物体，例如月球基地(0.167g)上执行。
部分III.使用方法和组织产生
本发明的范围涵盖从祖细胞产生类器官和其它组织培养产物的方法。在一般实施方案中，本发明的方法可以涵盖基本上如下的过程：
将适合于形成所选细胞培养产物的祖细胞引入到本发明的培养容器的球形内部容积中，其中培养容器填充有第一液体培养基；
使第二液体培养基流过中心导管；以及
执行将所选生物分子依次引入到培养容器的球形容积的第一液体培养基和/或流过中心导管的第二液体培养基中；
其中所选生物分子的依次引入是在适合于形成所选细胞培养产物的方案中执行的；并且
其中产生包括宏观血管化多细胞体的细胞培养产物。
本发明的范围将被理解为涵盖所列举方法的变化，包含另外的步骤的执行或以不同顺序执行步骤。
组织培养产物.通过本发明的方法产生的“组织培养产物”可以涵盖类器官、组织、器官和其它多细胞制品中的任一种。本发明的方法可以有利地用于产生宏观血管化多细胞结构，所述宏观血管化多细胞结构包括有组织的并且具有包括一个或定义良好的血管和/或毛细血管床的明确的血管系统的组织或组织样多细胞体。在一个实施例中，通过CD31染色和观察有组织的血管来评估血管性。在一个实施例中，血管性通过微血管密度(MVD)的免疫组织化学估计来评估。例如，超过所选阈值的MVD值可以用于确定血管状态，例如，大于5个微血管/mm2、大于10个微血管/mm2、大于20个微血管/mm2、大于30个微血管/mm2、大于50个微血管/mm2或大于100个微血管/mm2的评分可以用作指示充分血管化的阈值。
在一个实施例中，血管化细胞培养产物是具有足够血管性的宏观多细胞结构，其中如果将所述宏观多细胞结构移植到活受试者的血管上，则所述结构将在体内持续存在和/或发挥功能。在一个实施例中，血管化细胞培养产物是适合于移植到活受试者体内的宏观多细胞结构。在一个实施例中，血管化细胞培养产物是功能性多细胞结构，例如，能够执行如肺、心脏组织、肝脏组织、肾脏组织、肌肉组织、脑组织或其它组织等天然组织的一种或多种生物功能的功能性多细胞结构。
本发明的细胞培养产物可以包括任何大小的类器官、组织和其它结构。在主要实施方案中，细胞培养产物是宏观的。例如，细胞培养产物的示例性大小可以在100μm-500μm的范围内，更大的结构大小为500μm
至5mm，并且更大的结构大小在5mm至5cm或更大的范围内。
培养方法.在一种实施方案中，本发明的范围涵盖通过例如借助于使用任何组织培养容器在降低的重力条件下培养细胞来产生宏观血管化多细胞结构的方法。在此实施方案中，在降低的重力条件下的培养涵盖在培养过程的任何部分或整个培养过程中对培养细胞施加降低的重力条件。在各个实施例中，可以通过用于实现模拟微重力的设备(例如旋转壁容器、随机定位机、回转器和磁悬浮设备中的任一种)施加降低的重力条件。在其它实施例中，通过在太空中或在具有比地球更低重力的地外物体(例如月球)上培养细胞来实现降低的重力条件的施加。
在一种实施方案中，本发明的范围涵盖通过在球形或基本上球形的组织培养容器内培养细胞来产生宏观血管化多细胞结构的方法。在一些实施例中，球形或基本上球形的组织培养容器包括中心导管，所培养的细胞沉积或聚集在所述中心导管上。
在另一实施方案中，本发明的范围涵盖通过利用球形或基本上球形的组织培养容器培养细胞来产生宏观血管化多细胞结构的方法，其中在培养过程的一部分或整个培养过程中对生长细胞施加降低的重力条件。在各个实施例中，可以通过用于实现模拟微重力的设备(例如旋转壁容器、随机定位机、回转器和磁悬浮设备中的任一种)或通过在太空或地外物体中执行培养过程的一部分或整个培养过程，将降低的重力条件的施加应用于本发明的球形培养容器。
在利用本发明的球形组织球体的本发明的一般过程中，执行以下步骤：通过围绕中心导管将两个半球形元件接合，将中心导管引入到球形容器或以其它方式包封在其中；其中中心导管包括用细胞接种的细胞支架，和/或将祖细胞群引入到球形容器；开始使生长培养基流过中心导管；以及任选地在降低的重力条件下培养。
如本领域已知的，可以通过在培养条件下的一系列操纵来促进组织发育以促进组织形成。在形成具有已建立微血管系统的功能性类器官或组织后，可以打开组织球体以提取形成的组织，以用于实验或临床用途。
祖细胞可以包括多能细胞，或从多能细胞衍生的分化细胞，如胚胎细胞或诱导多能干细胞。也可以使用从培养得到的或源自供体(包含自体供体)的原代成人细胞。在一个实施例中，利用组织外植体。通过本领域已知的方案，所选祖细胞混合物将基于期望的最终产物。例如，在肝脏组织的形成中，人类诱导多能干细胞(iPSC)衍生的肝细胞、脐静脉内皮细胞(HUVEC)和间充质干细胞(MSC)的混合物可以用于提供在成熟类器官中发现的脉管系统、肝细胞和细胞外基质的前体。细胞可以以单细胞、细胞聚集体、类器官、组织外植体、前述的混合物或任何其它形式引入。
祖细胞可以在密封容器之前引入到中心导管和/或球形培养孔中，可以在密封之后通过输入通道引入，或者可以在粘附于中心导管的细胞负载支架结构中提供。细胞可以以任何合适的密度接种，例如以在每ml液体培养基10,000至500,000个细胞的范围内，例如在每ml液体培养基20,000至100,000个细胞的范围内的密度接种。
本发明的范围涵盖任何类型组织的形成。例如，可以产生以下类型的组织：肝脏、肾脏、胰腺、前列腺、肺、心脏、甲状腺、肠、乳腺、前列腺、脑(例如海马、小脑、大脑、视神经等)、肌肉、胰腺、真皮和本领域已知的任何其它组织、器官或类器官类型。
将基于所选的要形成的组织来选择培养基。示例性培养基包含本领域已知的标准生长和分化培养基。培养基组成可以通过一系列步骤进行操纵，以促进组织的定向分化和生长。例如，生长因子或化学诱因可以基于经过的时间或发育里程碑的实现添加到生长培养基中和从生长培养基中取出。此类因子可以通过流过中心导管的溶液引入或通过培养孔输入端口引入到细胞外环境。可以目测地监测组织的发育，或通过输出端口取样的细胞渗出物中标志物的出现来监测组织的发育。可替代地，细胞材料可以通过经由包括取样端口的辅助端口引入的活检仪器进行取样，所述活检仪器例如针、打孔器或其它取样仪器，例如引入在内窥镜导管上的仪器等。
可以通过调节通过中心导管的培养基的流速或通过经由孔输入和输出端口通过细胞外环境的培养基的流速来进一步操纵培养条件以促进组织形成。流动可以是间歇性的或连续的。在一个实施例中，通过中心导管的流动在类器官形成的早期是间歇性的，并且随着初始组织结构聚结并分化为更厚的功能性组织而转变为连续流动。
在一些情况下，培养在正常重力下执行。如果施加降低的重力，则此类降低的重力条件可以连续地或间歇地施加。例如，在一些实施方案中，整个培养过程都是在降低的重力条件下执行的。在其它实施方案中，在某些发育窗口期间施加了降低的重力。在一些实施方案中，重力降低的量值在接近培养过程结束时逐渐减小，以使组织适应环境1g重力。
培养过程在形成具有一种或多种所选属性的血管化多细胞结构时完成。在一个实施例中，所选属性是一种或多种发育生物标志物的出现。例如，可以通过辅助输出端口对孔中的液体培养基或流过中心导管的液体培养基进行取样，并且然后对所述液体培养基进行测定是否存在指示期望的发育终点的生物标志物。在一些实施例中，所选属性是功能性属性，其中液体培养基和/或多细胞结构被测定其功能性能力，例如所选组织类型的代谢、酶促或其它生物活性。多细胞结构可以例如通过经由孔中的取样端口去除活检或其外植体测定。在一些实施例中，所选属性是大小，其中类器官或组织在达到所选大小时从培养容器中收获，所述所选大小例如通过直径、体积或其它尺寸进行评估。
肝脏类器官形成.在一种实施方案中，本发明的容器、系统和方法通过本领域已知的方案用于形成肝脏类器官或组织。在一个实施例中，根据以下顺序实施分化方案，如图4A中所描绘的：
阶段0：将祖细胞引入到组织球体。在一个实施例中，祖细胞在围绕中心导管形成的细胞支架中供应。祖细胞可以包括多能细胞或多种细胞类型的混合物。在一个实施例中，祖细胞包括诱导多能干细胞、脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的混合物；
阶段1：祖细胞最初在补充有激活素的培养基中生长；
阶段2：在约五天后和/或在定型内胚层形成和/或转录因子SRY盒17(SOX17)和叉头盒2(FOXA2)显著表达后，停用激活素，并且向培养基中补充骨形态发生蛋白(BMP)和成纤维细胞生长因子(FGF)；
阶段3：在约五天后和/或在观察到肝脏和/或肝细胞核因子4α(HNF4α)显著表达后，停用BMP和FGF，并且向培养基中补充肝细胞生长因子(HGF)；
阶段4：在约五天后和/或在观察到肝母细胞，和/或甲胎蛋白(AFP)和白蛋白的显著表达后，向HGF培养基中进一步补充制瘤素M(OSM)；
阶段5：在约五天后和/或在观察到肝细胞，和/或酪氨酸转氨酶(TAT)和细胞色素P450酶(CYP)的显著表达后，可以允许类器官进一步生长和成熟，或者可以从组织球体中取出类器官以用于移植或其它用途。
替代性实施方案.在替代性实施方案中，使用任何组织培养容器(例如包括非球形孔或内部容积的培养容器)来执行降低的重力组织培养过程。在此实施方案中，可以利用具有任何几何形状的孔的任何类型的培养容器。在此实施方案中，在培养过程的一部分或整个培养过程期间降低培养细胞上的重力足以使得能够产生血管化细胞培养产物，而不管培养孔的几何形状如何。在示例性实施方案中，一般方法包括产生血管化细胞培养产物的方法，所述方法包括
将适合于形成所选细胞培养产物的祖细胞引入到含有液体培养基的培养容器中；
执行将所选生物活性分子依次引入到所述培养容器的所述液体培养基中；
其中所选生物活性分子的所述依次引入是在适合于形成所述所选细胞培养产物的方案中执行的；
其中产生包括宏观血管化多细胞体的细胞培养产物；并且
其中所述组织培养容器内的所述细胞在培养过程的一部分或整个培养过程期间经受降低的重力或失重状态。
上述方法可以任选地采用液体培养基所流过的中心导管，所述中心导管如上文针对球形容器中的培养方法所述的那样配置。
在本发明的一些实施方案中，利用球形培养孔执行培养过程，但不使用中心导管。在一些情况下，培养细胞聚集成有组织的血管化多细胞结构是在没有血管或血管模拟物的情况下实现的。在培养过程的一部分或整个培养过程期间，此培养可以在正常重力下进行或者在针对培养细胞的降低的重力下进行。
部分V.通过本发明的方法产生的组织的用途.
在一些实施例中，通过本发明的设备或方法产生的组织包括适合于移植到受试者体内的多细胞结构。此类组织可以通过本领域已知的手段，在促进宿主与植入组织之间血管连接的条件下或通过促进宿主与植入组织之间血管连接的技术进行手术植入。在一些实施例中，宿主血管被移植到组织的中心导管或其它血管元件上。在此类实施例中，中心导管结构保留在组织中并被移植到受试者的血管上。在此类实施方案中，中心导管将包括适合长期植入体内的生物相容性材料，或可生物降解和/或可生物吸收的材料。
在主要实施例中，受体是需要器官移植的人类受试者。在一些实施例中，受体是包括如宠物或家畜等兽医受试者的非人类动物。在一些实施例中，受体是测试动物。在一些实施例中，组织包括作为异种移植物引入测试动物体内的人类细胞，例如，包括适合于异种移植细胞的免疫受损模型的测试动物。
在一些实施例中，通过本发明的方法和设备产生的组织包括用于研究不同处理对组织发育的影响的实验平台，作为天然器官的代替物。在这些实施方案中，组织可以在组织形成期间或之后暴露于不同的药剂，以测试这些药剂对各种参数的影响，如毒理学、生理学、功能或其它因素。所关注的药剂可以涵盖任何组合物，如药物、药物候选物、生长因子、配体、激素、免疫因子(如细胞因子或趋化因子)、潜在毒素、污染物、病原体或免疫细胞。在一个实施例中，例如通过向中心导管输注例如含所选药剂的药物洗脱组合物如水凝胶，在组织形成开始和/或器官形成期间引入所关注的药剂。在另一实施方案中，通过流过导管的培养基将药剂提供给发育中的组织，以通过循环系统模拟药剂的递送。在一些实施方案中，通过输入端口将测试药剂提供给培养孔的细胞外培养基。在一些实施例中，在组织形成并从培养容器中提取后，将药剂引入组织。
在一些实施例中，组织包括疾病模型，所述疾病模型包括具有突变或诱导功能障碍的组织。所述组织可以用作用于观察病理过程或测试治疗干预的平台。
在一方面，本发明的范围涵盖通过本发明的方法产生的产物。在一种实施方案中，本发明的范围涵盖通过使用包括球形孔的培养容器产生的细胞培养产物。在一种实施方案中，本发明的范围涵盖通过使用包括球形孔和安置在其中的液体培养基所流过的中心导管的培养容器产生的细胞培养产物。在一种实施方案中，本发明的范围涵盖通过在降低的重力条件下培养细胞而产生的细胞培养产物。在一种实施方案中，本发明的范围涵盖在降低的重力条件下使用包括球形孔的培养容器产生的细胞培养产物。在各种实施方案中，通过方法所获得的产物是多细胞血管化结构，如类器官、组织或器官，例如其选自由以下组成的组：
实例.
实例1.在组织球体内生成肝类器官
在生物安全柜中无菌地组装具有直径为2cm的球形内孔的组织球体，并以50,000个细胞/ml的液体培养基密度装载HepG2人肝细胞癌细胞系。将组织球体固定到随机定位机(RPM)，并且在37℃和5％ CO2的温育器内在模拟微重力(平均重力矢量0-g)条件下培养。在3天后，大小范围为100μm-200μm的自组装的HepG2类器官在组织球体内形成，并且通过明场显微镜检查可见。此实例证明了在微重力下组织球体内的培养创造了有利于类器官和组织自组装的环境。
实例2.间充质干细胞(MSC)附着到组织球体中心导管.
将直径2cm的组织球体原型与微孔聚己内酯中心导管无菌组装在一起。将人骨髓源性间充质干细胞(MSC)以400,000个细胞/ml在类器官培养基中培养，所述类器官培养基由1:1的肝细胞培养基(TM)(龙沙生物科学)和内皮细胞生长培养基-2(TM)(龙沙生物科学)构成并补充有20ng/ml肝细胞生长因子、10ng/ml制瘤素M和2.5μM地塞米松(dexamethasone)。将球体组合件放置在RPM内以模拟微重力，并在37℃和5％CO2的温育器中培养2天。在培养周期结束后，从球体中取出中心导管，并且通过荧光显微镜检查分析所述中心导管。通过鬼笔环肽针对细胞骨架和通过DAPI针对细胞核的染色显示，MSC附着并涂覆在组织球体内的中心导管上(图F)。此实例证明了在微重力条件下，MSC能够在组织球体中心导管上聚结，并用作其它细胞类型在其上建立的基质细胞和/或周细胞。
实例3.微重力自组装的肝脏类器官的功能和血管化
将人诱导多能干细胞(iPSC)衍生的肝祖细胞在类器官培养基中以500,000个细胞/ml的密度在正常重力下和在使用RPM施加的模拟微重力下培养。常规iPSC衍生的肝脏类器官也在基质胶或iPSC衍生的肝脏单层的顶部上生成。培养三周后，测定类器官的肝脏基因的表达、白蛋白的产生和血管结构。
如通过下一代mRNA测序(RNA-seq)所确定的，在微重力下产生的类器官具有>150X的肝细胞富集功能和细胞类型特异性基因上调。
经过3周的培养，微重力自组装的肝脏类器官产生的每个细胞白蛋白水平持续且显著高于常规的基质胶类器官。白蛋白产生是肝细胞功能的重要度量。在第14天和第22天，通过微重力自组装的肝脏类器官产生的白蛋白水平与体内人肝细胞产生的水平相当，如图4B中所描绘的。
如通过共聚焦显微镜检查和针对CD31和HNF4α的染色所评估的，iPSC衍生的肝祖细胞、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和MSC在模拟微重力下在类器官培养基中以10:10:1的比率共培养形成了多谱系肝脏类器官，其中内部内皮细胞组织类似血管网络。这些实例证明了，人类干细胞衍生的肝脏类器官在微重力下自组装，并且比常规基质胶依赖性类器官功能更强，同时表现出内部微血管组织。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和出版物在本文中通过引用并入，其程度如同每个独立的专利申请或出版物被专门地且单独地指示通过引用并入。所公开的实施例是为了说明而不是限制的目的而呈现的。虽然本发明已参考其所描述的实施例进行了描述，但本领域技术人员将理解，可以在不脱离作为整体的本发明的精神和范围的情况下对本发明的结构和元件进行修改。

Claims (28)

1.一种组织培养系统，其包括
球形组织培养容器，所述球形组织培养容器包括：
具有基本上球形的几何形状的内部容积，所述基本上球形的几何形状没有角、边缘、平面和突起；以及
进入所述内部容积的两个或更多个端口，其中所述两个或更多个端口包括第一端口和第二端口，并且其中所述第一端口和所述第二端口被配置为收纳导管的相对端部。
2.根据权利要求1所述的组织培养系统，其中
所述球形组织培养容器的所述球形内部容积是通过将包括半球形容积的互补主体接合而形成的。
3.根据权利要求2所述的组织培养系统，其中
形成所述组织培养容器的所述球形内部容积的两个互补主体中的每个互补主体包括其中具有半球形凹陷的材料块。
4.根据权利要求2所述的组织培养系统，其中
形成所述组织培养容器的所述球形内部容积的两个互补主体中的每个互补主体包括半球形半球体。
5.根据权利要求2所述的组织培养系统，其中
形成所述组织培养容器的所述球形内部容积的两个互补主体中的每个互补主体安装在支撑块中。
6.根据权利要求1所述的组织培养系统，其中
所述组织培养容器包括透明材料。
7.根据权利要求1所述的组织培养系统，其中
所述组织培养容器包括进入所述组织培养容器的所述内部容积的一个或多个辅助端口。
8.根据权利要求7所述的组织培养系统，其中
进入所述培养容器的所述内部容积的所述一个或多个辅助端口包括与用于使材料流入和流出所述组织培养容器的所述内部容积的元件连接的至少一个输入端口和一个输出端口。
9.根据权利要求1所述的组织培养系统，其进一步包括
导管，所述导管横穿所述容器的所述内部容积；
其中所述导管包括：包括生物相容性材料的血管或管状主体；
其中所述导管进一步包括内部管腔；并且
其中所述导管的所述端部与液体培养基源和用于使培养基流过所述导管的元件连接。
10.根据权利要求9所述的组织培养系统，其中
所述导管包括医用织物。
11.根据权利要求9所述的组织培养容器，其中
所述导管用生物活性分子功能化。
12.根据权利要求11所述的组织培养容器，其中
所述生物活性分子包括血管生成剂。
13.根据权利要求1所述的组织培养容器，其中
中心导管包括细胞支架。
14.根据权利要求1所述的组织培养系统，其进一步包括
机械组件，所述机械组件被配置为旋转，使得所述培养容器内部容积经历降低的重力或失重状态。
15.根据权利要求13所述的组织培养系统，其中
所述机械组件包括随机定位机、回转器或磁悬浮设备。
16.一种产生血管化细胞培养产物的方法，所述方法包括
将适合于形成所选细胞培养产物的祖细胞引入到根据权利要求1至14中任一项所述的培养容器中，其中所述培养容器填充有第一液体培养基；
使第二液体培养基流过中心导管；以及
执行将所选生物活性分子依次引入到所述培养容器的球形容积的所述第一液体培养基和/或流过中心导管的所述第二液体培养基中；
其中所选生物活性分子的所述依次引入是在适合于形成所述所选细胞培养产物的方案中执行的；并且
其中产生包括宏观血管化多细胞体的细胞培养产物。
17.根据权利要求15所述的方法，其中
所述组织培养产物是选自由以下组成的组的制品：类器官、组织或器官。
18.根据权利要求16所述的方法，其中
所选类器官、组织或器官类型选自由以下组成的组：肝脏、肾脏、胰腺、胰腺、肌肉、前列腺、肺、心脏、甲状腺、肠、乳腺、前列腺、肌肉、脑和真皮组织。
19.根据权利要求16所述的方法，其中
所选组织类型是肝脏。
20.根据权利要求15所述的方法，其中
所述组织培养容器内的所述细胞在培养过程的一部分或整个培养过程期间经受降低的重力或失重状态。
21.根据权利要求19所述的方法，其中
所述培养容器通过机械组件旋转以产生降低的重力或失重状态。
22.根据权利要求20所述的组织培养系统，其中
所述机械组件包括随机定位机、回转器或磁悬浮设备。
23.根据权利要求10所述的方法，其中
所述降低的重力或失重状态是通过在太空中执行所述培养过程的一部分或整个培养过程来实现的。
24.一种产生血管化细胞培养产物的方法，所述方法包括
将适合于形成所选细胞培养产物的祖细胞引入到含有液体培养基的培养容器中；
执行将所选生物活性分子依次引入到所述培养容器的所述液体培养基中；
其中所选生物活性分子的所述依次引入是在适合于形成所述所选细胞培养产物的方案中执行的；
其中产生包括宏观血管化多细胞体的细胞培养产物；并且
其中所述组织培养容器内的所述细胞在培养过程的一部分或整个培养过程期间经受降低的重力或失重状态。
25.根据权利要求23所述的方法，其中
所述培养容器通过机械组件旋转以产生降低的重力或失重状态。
26.根据权利要求23所述的组织培养系统，其中
所述机械组件包括随机定位机、回转器或磁悬浮设备。
27.根据权利要求24所述的方法，其中
所述降低的重力或失重状态是通过在太空中执行所述培养过程的一部分或整个培养过程来实现的。
28.根据权利要求14所述的方法，其中
所述培养容器进一步包括液体培养基所流过的中心导管。
CN202180091251.3A 2020-11-20 2021-11-19 用于产生血管化组织的新型组织培养系统和降低的重力培养方法 Pending CN117157384A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063116612P 2020-11-20 2020-11-20
US63/116612 2020-11-20
PCT/US2021/060170 WO2022109319A1 (en) 2020-11-20 2021-11-19 Novel tissue culture systems and reduced gravity culture method for the production of vascularized tissue

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117157384A true CN117157384A (zh) 2023-12-01

Family

ID=81709837

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180091251.3A Pending CN117157384A (zh) 2020-11-20 2021-11-19 用于产生血管化组织的新型组织培养系统和降低的重力培养方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230407220A1 (zh)
EP (1) EP4247936A1 (zh)
CN (1) CN117157384A (zh)
WO (1) WO2022109319A1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2155519A1 (de) * 1971-11-09 1973-05-17 Kraftwerk Union Ag Radiallager
DE4229325C2 (de) * 1992-09-02 1995-12-21 Heraeus Instr Gmbh Kulturgefäß für Zellkulturen
US6642019B1 (en) * 2000-11-22 2003-11-04 Synthecan, Inc. Vessel, preferably spherical or oblate spherical for growing or culturing cells, cellular aggregates, tissues and organoids and methods for using same
WO2013128630A1 (ja) * 2012-03-02 2013-09-06 株式会社日立製作所 細胞培養容器、それを用いた細胞培養装置および細胞培養方法
KR101822784B1 (ko) * 2016-01-21 2018-01-30 충북대학교 산학협력단 신경혈관단위-온-칩 및 그 칩의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20230407220A1 (en) 2023-12-21
WO2022109319A1 (en) 2022-05-27
EP4247936A1 (en) 2023-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Doryab et al. Advances in pulmonary therapy and drug development: Lung tissue engineering to lung-on-a-chip
Kang et al. Alginate microencapsulation for three-dimensional in vitro cell culture
US20200164109A1 (en) Methods of producing multi-layered tubular tissue constructs
KR102417995B1 (ko) 탈세포화된 기관 및 조직에 대한 마이크로입자 및 내피 세포의 용도
JP2019517808A (ja) 細胞培養装置及び方法
CA2599823C (en) Reverse-flow perfusion of three-dimensional scaffolds
US20100297233A1 (en) Oscillating cell culture bioreactor
JP7055386B2 (ja) 細胞培養用流体チップ、培養容器及び培養方法
KR20150063077A (ko) 개선된 수명 시간 및 항상성을 갖는 다기관 칩 장치
JPH11502712A (ja) フィルターデバイス
NL2011895C2 (en) Fluidic device and perfusion system for in vitro tissue reconstruction.
US20070243574A1 (en) Vascular mimic for drug and device evaluation
Asnaghi et al. Trends in biomedical engineering: focus on Regenerative Medicine
US7439057B2 (en) Convective flow tissue assembly
Mansouri et al. Advances in removing mass transport limitations for more physiologically relevant in vitro 3D cell constructs
WO2019237061A1 (en) A 3d bioprinted perfusable platform for high-throughput disease modeling and drug screening
Obregón et al. Bioreactors in tissue engineering
CN116004388A (zh) 一种微流控芯片及体外三维类器官模型构建方法
CN117157384A (zh) 用于产生血管化组织的新型组织培养系统和降低的重力培养方法
WO2019167951A1 (ja) 培養装置、２種類以上の細胞構造体を構築する方法及びオンチップ臓器デバイス
Thangadurai et al. Emerging perspectives on 3D printed bioreactors for clinical translation of engineered and bioprinted tissue constructs
JP6751587B2 (ja) 培養装置及び培養方法
Chandrasekaran et al. Functional analysis of encapsulated hepatic progenitor cells
EP4163364A1 (en) Cell culture method
Sämfors et al. Design and biofabrication of a leaf-inspired vascularized cell-delivery device

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination