CN117147883A

CN117147883A - Amh生物探针、amh生物探针保护液及amh检测试剂盒

Info

Publication number: CN117147883A
Application number: CN202310940611.3A
Authority: CN
Inventors: 王丁杨; 喻誉; 吴衡
Original assignee: Xingtong Medical Technology Suzhou Co ltd
Current assignee: Xingtong Medical Technology Suzhou Co ltd
Priority date: 2023-07-28
Filing date: 2023-07-28
Publication date: 2023-12-01
Anticipated expiration: 2043-07-28
Also published as: CN117147883B

Abstract

本发明揭示了AMH生物探针、AMH生物探针保护液及AMH检测试剂盒，其中AMH生物探针的针体上偶联抗体的部分包覆有保护层，保护层是由AMH生物探针保护液烘干后形成，AMH生物探针保护液包括纯净水、酸、环糊精、蔗糖、PC300及吐温20，其中，AMH生物探针保护液的PH值在3.0‑6.5之间，酸的摩尔浓度在0.02～0.1摩尔/升之间，AMH生物探针保护液中，环糊精的质量体积百分比在1.0%～20%，蔗糖的质量体积百分比在5～20%之间，PC300的体积百分比在0.05～0.2%之间，吐温20的体积百分比在0.05～0.5%之间。本发明采用特制的保护液后，生物探针的抗湿能力显著提高，从而稳定性极大改善，保护期可达到40天，同时，生物探针的反应性也显著提高。

Description

AMH生物探针、AMH生物探针保护液及AMH检测试剂盒

技术领域

本发明涉及医疗器械领域，尤其是AMH生物探针、AMH生物探针保护液及AMH检测试剂盒。

背景技术

抗缪勒管激素(Anti-MüllerianHormone,AMH)是一种属于转化生长因子β(TGF-β)家族的二聚体糖蛋白，由卵巢窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞分泌的一种糖蛋白，不受下丘脑控制，也不受促性腺激素影响，在整个月经周期中变化不大，可以在任何时间抽血检查。

AMH是评估卵巢功能、反应卵巢的真实年龄、了解卵泡的库存量的黄金指标。AMH高一般见于多囊卵巢综合征的患者，卵巢颗粒细胞瘤中AMH也升高。AMH降低则表示女性生育力下降，比如卵巢早衰。做好AMH检测，可有效防控卵巢功能相关疾病。

AMH生物探针为高纯度SiO2材质，经3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane，APTS)修饰后其表面带入氨基，氨基可与蛋白质等进行共价偶联，从而实现探针偶联(包被)抗体，成为检测试剂盒的固相载体。

APTS通过Si-O-Si共价偶联至SiO2探针上，APTS修饰层中的硅原子在受到氨基、氢氧根、水等亲核试剂的进攻时，硅的电子云密度增加Si-O-Si键强度减弱，在水、乙醇等溶剂的协同作用下Si-O-Si键易发生断裂从而导致APTS从二氧化硅表面解离。

因此，在实际加工时，经APTS气相沉积修饰生物探针后，在生物探针表面包被鼠抗人AMH抗体，再在保护液中浸泡30秒后取出，经干燥后该生物探针作为AMH检测试剂盒的固相载体组分被使用。

目前保护液的组分为中性磷酸盐缓冲液(保护液中磷酸盐的摩尔浓度为0.1M)、防腐剂、Tween-20与蔗糖。

这种探针保护液没有针对Si-O-Si键的保护，因此探针害怕潮湿环境，在日常环境中不宜长时间存储，须将试剂盒存储于干燥环境下(湿度低于30％)，对于日常样本检测来说，存储困难且麻烦。

因为生物探针的贮存环境十分干燥，拆封后空气中的湿度对于生物探针来说过高，这时候在空气中水分子的作用下，Si-O-Si键容易慢慢断裂导致APTS从SiO₂上脱落，从而AMH抗体也会一起脱落，导致试剂盒测试时信号下降过大，结果不准确。

发明内容

本发明的目的就是为了解决现有技术中存在的上述问题，提供一种AMH生物探针、AMH生物探针保护液及AMH检测试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

AMH生物探针，包括针体，所述针体上偶联抗体，所述抗体包覆于保护层中，所述保护层是由AMH生物探针保护液烘干后形成，所述AMH生物探针保护液包括纯净水、酸、环糊精、蔗糖、PC300及吐温20，其中，所述AMH生物探针保护液的PH值在3.0-6.5之间，所述AMH生物探针保护液中，所述酸的摩尔浓度在0.02～0.1摩尔/升之间，所述环糊精的质量体积百分比在1.0％～20％之间，所述蔗糖的质量体积百分比在5～20％之间，所述PC300的体积百分比在0.05～0.2％之间，所述吐温20的体积百分比在0.05～0.5％之间。

优选的，所述AMH生物探针中，所述酸是醋酸、焦磷酸、柠檬酸、硝酸中的至少一种。

优选的，所述AMH生物探针中，所述环糊精是α环糊精、β环糊精、γ环糊精中的至少一种。

优选的，所述AMH生物探针中，所述酸是柠檬酸，所述柠檬酸的摩尔浓度为0.05摩尔/升。

优选的，所述AMH生物探针中，所述环糊精是γ环糊精，所述γ环糊精的质量体积百分比为15％。

优选的，所述AMH生物探针中，所述AMH生物探针保护液的PH值为4。

优选的，所述AMH生物探针中，所述AMH生物探针保护液通过如下步骤制备得到：

量取预定量的纯净水，根据配比获取酸并将所述酸添加至量取的纯净水中，通过搅拌使酸完全溶解后得到第一溶液；

根据配比称取环糊精并添加至所述第一溶液中，通过搅拌使环糊精完全溶解后得到第二溶液；

根据配比称取蔗糖并添加至第二溶液中，通过搅拌使蔗糖完全溶解后得到第三溶液；

根据配比量取吐温20并加入所述第三溶液中得到第四溶液；

根据配比量取PC300并加入第四溶液中得到第五溶液；

向所述第五溶液中加入纯净水，至溶液体积接近目标体积后，搅拌至溶液呈澄清状态得到第六溶液；

向所述第六溶液中添加氢氧化钠溶液得到PH值在3.0-6.5之间的第七溶液；

向所述第七溶液中添加纯净水至溶液体积达到目标体积得到所述AMH生物探针保护液。

AMH生物探针保护液，包括纯净水、酸、环糊精、蔗糖、PC300及吐温20，其中，所述AMH生物探针保护液的PH值在3.0-6.5之间，所述AMH生物探针保护液中，所述酸的摩尔浓度在0.02～0.1摩尔/升之间，所述环糊精的质量体积百分比在1.0％～20％之间，所述蔗糖的质量体积百分比在5～20％之间，所述PC300的体积百分比在0.05～0.2％之间，所述吐温20的体积百分比在0.05～0.5％之间。

优选的，所述AMH生物探针保护液中，所述AMH生物探针保护液的PH值为4，所述AMH生物探针保护液中，所述酸为柠檬酸，其摩尔浓度为0.05摩尔/升，所述环糊精为γ环糊精，其质量体积百分比为15％，所述蔗糖的质量体积百分比为15％，所述PC300的体积百分比为0.05％，所述吐温20的体积百分比为0.05％。

试剂盒，包括如上任一所述的AMH生物探针。

本发明技术方案的优点主要体现在：

本发明的AMH生物探针采用特制的保护液，保护液采用蔗糖对抗体进行保护，同时保护液的黏度提高，能够有效增加针体从保护液中取出后表面粘附的保护液的量，从而在保护液干燥后，极大地提高了保护层的厚度，提高了抗湿能力；进一步，通过酸来提高氢质子的供给能力，让针体表面的自由氨基质子化，从而增加了Si-O-Si键的牢靠度，采用特制的保护液后，生物探针的抗湿能力显著提高，对存储环境的湿度的要求更低，更容易存储，且稳定性极大改善，保护期可达到40天，同时，生物探针的反应性也显著提高。

本发明通过对酸、环糊精的具体选择，结合对用量、PH值的选择，有效实现了保护液功效的整体拔高，实现了最佳的保护效果。同时通过对配比的设计能够在相对较低的成本下实现保护液的配置。

具体实施方式

本发明的目的、优点和特点，将通过下面优选实施例的非限制性说明进行解释。这些实施例仅是应用本发明技术方案的典型范例，凡采取等同替换或者等效变换而形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

下面对本发明揭示AMH生物探针进行阐述，其包括针体，所述针体上偶联抗体，所述抗体包覆于保护层中，所述保护层是由AMH生物探针保护液烘干后形成，所述AMH生物探针保护液包括纯净水、酸、环糊精、蔗糖、PC300及吐温20，其中，所述AMH生物探针保护液的PH值在3.0-6.5之间，所述AMH生物探针保护液中，所述酸的摩尔浓度在0.02～0.1摩尔/升之间，所述环糊精的质量体积百分比在1.0％～20％之间，所述蔗糖的质量体积百分比在5～20％之间，所述PC300的体积百分比在0.05～0.2％之间，所述吐温20的体积百分比在0.05～0.5％之间。

所述AMH生物探针保护液通过如下步骤制备得到：

根据配比量取吐温20并加入所述第三溶液中得到第四溶液；

根据配比量取PC300并加入第四溶液中得到第五溶液；

配置时，可以根据要配置的保护液的体积和具体配比来确定各材料的具体用量，下文中将以按照最优配比配置1升保护液为例进行说明，此处暂不赘述。

本发明通过对大量不同配比的保护液进行研究，从而确定了较优的保护液的PH值、具体的材料及材料的配比，在配置不同的保护液时，配比中PC300和吐温20对应的百分数为体积百分数，蔗糖、环糊精对应的百分数为质量体积百分数。

经过研究得出，所述酸可以是醋酸、焦磷酸、柠檬酸、硝酸中的至少一种。最优的，所述酸是柠檬酸，之所以采用柠檬酸，是因为发明人通过研究后发现：APTS的解离主要是由未质子化的自由氨基所引起的，自由氨基的自催化作用加速了Si-O-Si键的水解，从而导致了APTS的解离，其解离机制：

因此让生物探针表面的自由氨基质子化是增加Si-O-Si键的牢靠度的有效方法。而柠檬酸是三元酸，同时是有机酸，在保护液中，其有更强的供氢能力，从而能够更好地使自由氨基质子化，进而使保护液具有更大的保护力度。

具体研究时：按照如下表(1)的配比配置得到传统保护液以及含有不同酸的保护液：

表(1)：

将浸泡过不同保护液的不同生物探针烘干后置于密闭高湿环境中(湿度大于等于99％)，在第0天、第2天、第5天、第7天分别用不同的生物探针对低、中、高浓度的AMH较准品进行测试，AMH校准品是通过校准品粉末(抗原粉末)与校准品稀释液配置而成，以配置25ng/mL浓度的AMH校准品为例，先称量50毫克的校准品粉末，用校准品稀释液溶解得到1mg/ml(质量体积比)的校准品母液(50ml)。把校准品母液再用校准品稀释液进行稀释(体积比)，稀释40000倍，得到25ng/mL浓度的AMH校准品工作液。其中，校准品稀释液是通过BSA(牛血清白蛋白)、氯化钠、PC300及纯净水配置得到，具体是按照：质量体积百分比0.9％的氯化钠；质量体积百分比0.5％的BSA；体积百分比0.05％的PC300及纯净水配置得到，具体的配置过程为已知技术，此处不作赘述。每一个浓度的AMH校准品复测3次，记录光量值RLU，若变化幅度超过20％可以停止实验跟踪，具体测试结果如表(2)。

表(2)：

从上述表(2)中可以看出：较传统保护液(A保护液)，SiO₂材质的生物探针在浸泡过含有柠檬酸的保护液(C保护液)之后，在高湿环境中抗湿能力更好，即柠檬酸对探针的保护力度最大，因此在保护液中最优采用柠檬酸。

进一步，发明人研究发现：柠檬酸的摩尔浓度是影响保护液的保护力度的重要因素之一，因此，通过对保护液中柠檬酸的不同摩尔浓度进行研究发现，柠檬酸的摩尔浓度在0.02m摩尔/升～0.1摩尔/升时，其保护力度较好。更优的，发明人研究确定：柠檬酸的摩尔浓度选择为0.05摩尔/升。

具体实验时：

按照表(3)的保护液配方配置得到含有不同摩尔浓度的柠檬酸的保护液。

表(3)：

按照上述相同的方法进行实验测试，具体的实验测试过程此处不作赘述，得到的测试结果如下表(4)。

表(4)：

从上述表(4)可以看出，柠檬酸的摩尔浓度在0.1摩尔/升与0.05摩尔/升时，浸泡这两种保护液的生物探针的抗湿性能接近，均好于柠檬酸的摩尔浓度为0.02摩尔/升的保护液，进一步，从成本考虑，柠檬酸的摩尔浓度选择为0.05摩尔/升。

所述环糊精是α环糊精、β环糊精、γ环糊精中的至少一种，发明人通过研究发现，所述环糊精为γ环糊精时，保护液的保护效果更佳。

具体研究时，是按照表(5)的配比配置传统保护液及在传统保护液中加入不同环糊精得到新的保护液。

表(5)：

按照上述相同的方法进行实验测试，具体的实验测试过程此处不作赘述，得到的测试结果如表(6)。

表(6)：

从上述表(6)可以看出，含有α环糊精、β环糊精、γ环糊精的保护液的保护效果整体上较传统保护液(保护液J)都有改善，并且，含有γ环糊精的保护液相对于含有其他两款环糊精的保护液的抗湿效果和反应效果更好。

进一步，通过对所述γ环糊精的质量体积百分比对保护性的影响进行研究可以确定：所述γ环糊精的质量体积百分比为15％时，能够具有最佳的保护效果且成本最低。

具体研究时，按照如下表(7)的配比配置含有不同质量体积百分比的γ环糊精的保护液。

表(7)：

按照上述相同的方法进行实验测试，具体的实验测试过程此处不作赘述，得到的结果如表(8)所示。

表(8)：

从上述表(8)可以看出：γ环糊精的质量体积百分比在10％与5％的时候，生物探针抗湿性能没有其他两个浓度的好，所以舍去。而γ环糊精的质量体积百分比在15％与20％的时候，生物探针的抗湿性能差不多，从成本考虑，选择15％浓度的γ环糊精。

发明人研究发现，由于Si-O-Si键在碱性环境下十分脆弱，因此，较优的，使所述保护液为酸性环境，同时，发明人发现抗体在强酸环境下容易失活，因此，较优的，所述保护液的pH值选择在3.0到6.5之间。发明人进一步研究发现：当所述保护液的PH值为4时，具有更佳的保护效果。

具体研究时，按照表(9)的配比配置传统保护液及具有不同PH值且含柠檬酸的保护液。

表(9)：

按照上述相同的方法进行实验测试，具体的实验测试过程此处不作赘述，得到的测试结果如表(10)所示。

表(10)：

从表(10)可以看出，当保护液的pH值在3.0和4.0时，浸泡后得到生物探针测得的RLU的变化幅度较低，但是，当保护液的PH值在3.0时，生物探针测得的RLU也明显低于其他PH值时测得的光亮值RLU，反应性已下降。

通过上述分析可以看出，酸的类型、酸的摩尔浓度、PH值、环糊精的类型及环糊精的质量体积百分比中每一个的合理选择都会使新的保护液的性能相对传统保护液有所提高，因此，本发明的保护液的最优配比如下：

保护液的pH值为4.0，其中，柠檬酸的摩尔浓度为0.05M，蔗糖的质量体积百分比为15％，γ环糊精的质量体积百分比为15％，Tween-20的体积百分比为0.05％，PC300的体积百分比为0.05％。

下面以根据上述最优配比配置1L保护液为例进行保护液的配置说明，其具体的配置过程如下：

取一个洁净的1000mL烧杯，先加入约700mL纯净水，用电子天平称取9.6070克柠檬酸(厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A501702-0500)，将柠檬酸全部倒入700mL纯净水中，用洁净的玻璃棒搅拌至完全溶解得到第一溶液。

再用电子天平称取150克γ环糊精(厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A600350-0025)，将γ环糊精全部倒入烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解得到第二溶液。

再用电子天平称取150克蔗糖(厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A610498-0500)，将蔗糖全部倒入烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解得到第三溶液。

取1000微升规格的移液器，吸取500微升PC300(厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A600823-0500)，缓慢注入溶液中并来回吹打，确保吸头中的PC300全部进入溶液从而得到第四溶液。

再取1000微升规格的移液器，吸取500微升吐温20(厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A600560-0500)，缓慢注入溶液中并来回吹打，确保吸头中的吐温20全部进入溶液从而得到第五溶液。

加纯净水至液面接近1000mL刻度线处，然后用玻璃棒搅拌至溶液澄清透亮得到第六溶液。

用6M氢氧化钠溶液调节pH至4.00±0.01得到第七溶液

加纯净水至1000mL刻度线处，玻璃棒搅拌均匀得到AMH生物探针保护液。

按照上述相同的方法进行实验测试，具体的实验测试过程此处不作赘述，得到的结果如表(11)所示。

表(11)：

从上述表(11)可以看出，采用最优的配比后，生物探针的反应性(测得的光亮值RLU)整体明显拔高，且抗湿性能较单个组分优化后也有进一步提高，极大地改善了生物探针的使用寿命和测试的有效性和可靠性。

进一步，通过对生物探针的机载稳定性、反应性、保护液长期储存后保护效能进行测试，同样可以证明采用本发明最优配方的保护液时具有更佳的效果。

具体测试时，可以取20例临床样本，20例临床样本分别是AMH高值血浆/血清4份，临床测值在20ng/ml左右；AMH中值血浆/血清4例，临床测值在6ng/ml左右；AMH低值血浆/血清8例，4例临床测值在2ng/ml附近，4例临床测值在0.5ng/ml附近；AMH最低检出限附近的血浆/血清4例，临床测值在0.2ng/ml。就等于是AMH全线性范围内的抗湿性能都得到了验证。每例临床样本分装出8份，每份约200微升，冻存于-20℃冰箱。

测试时，是将试剂盒拆封后置于仪器上，处于随时可使用状态，在该状态下用试剂盒测试对同一例临床样本存放第0、3、7、14、22、30、40天的样本份分别进行检测，对存放不同天数的样本份的测试结果与存放第0天的样本份的测试结果进行比较，并确定出偏差比例，当偏差比例大于等于10％时，所累计的时间即为机载稳定性的时间。当结果偏差大于10％时，可以停止实验跟踪，测得的结果如下表(12)、(13)。

表(12)：本发明保护液的机载稳定性测试表，单位：ng/mL

表(13)：传统保护液的机载稳定性测试表，单位：ng/mL

从上述表(12)、(13)可以看出：传统保护液对AMH生物探针的保护期限约为7～10天，本发明保护液的保护期限约为40天，保护时长有显著提升，保守估计提升300％。

在进行生物探针反应性验证时，取标准曲线的7个定标点，每个点复测两次，比较传统保护液与本发明的保护液的生物探针对每个点的临床样本进行检测确定的RLU(光量值)的均值，测得的结果如表(14)。

从上表(14)中可以看出，本发明保护液比传统保护液在探针反应性上有显著提高，平均提升约有65％，说明本发明保护液对试剂性能的提升有非常大的帮助。

在进行保护液长期储存后保护效能验证时，是将本发明保护液与传统保护液密封静置于4℃环境中，在第6个月、第12个月时取出两种保护液进行AMH生物探针包被、烘干，具体的测试过程参照机载稳定性的实验过程，此处不作赘述。此时，选择的临床样本数为10例，具体的测试结果如表(15)-(18)。

表(15)：本发明保护液在存储第6个月时的长期储存后保护效能验证结构，单位：ng/mL。

表(16)：传统保护液在存储第6个月时的长期储存后保护效能验证结构，单位：ng/mL。

表(17)：本发明保护液在存储第12个月时的长期储存后保护效能验证结构，单位：ng/mL。

表(18)：传统保护液在存储第12个月时的长期储存后保护效能验证结构，单位：ng/mL。

从上述表(15)-(18)中可以看出，本发明保护液的长期储存后保护效能显著优于传统保护液的长期储存后保护效能。

实施例2

本实施例揭示了一种试剂盒，包括上述实施例的AMH生物探针。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.AMH生物探针，包括针体，所述针体上偶联抗体，所述抗体包覆于保护层中，所述保护层是由AMH生物探针保护液烘干后形成，其特征在于：所述AMH生物探针保护液的PH值在3.0-6.5之间，所述AMH生物探针保护液包括纯净水、酸、环糊精、蔗糖、PC300及吐温20，其中，所述酸的摩尔浓度在0.02～0.1摩尔/升之间，所述环糊精的质量体积百分比在1.0%～20%之间，所述蔗糖的质量体积百分比在5～20%之间，所述PC300的体积百分比在0.05～0.2%之间，所述吐温20的体积百分比在0.05～0.5%之间。

2.根据权利要求1所述的AMH生物探针，其特征在于：所述酸是醋酸、焦磷酸、柠檬酸、硝酸中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的AMH生物探针，其特征在于：所述环糊精是α环糊精、β环糊精、γ环糊精中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的AMH生物探针，其特征在于：所述酸是柠檬酸，所述柠檬酸的摩尔浓度为0.05摩尔/升。

5.根据权利要求4所述的AMH生物探针，其特征在于：所述环糊精是γ环糊精，所述γ环糊精的质量体积百分比为15%。

6.根据权利要求1-5任一所述的AMH生物探针，其特征在于：所述AMH生物探针保护液的PH值为4。

7.根据权利要求1-6任一所述的AMH生物探针，其特征在于：所述AMH生物探针保护液通过如下步骤制备得到：

根据配比量取吐温20并加入所述第三溶液中得到第四溶液；

根据配比量取PC300并加入第四溶液中得到第五溶液；

8.AMH生物探针保护液，其特征在于：所述AMH生物探针保护液的PH值在3.0-6.5之间，所述AMH生物探针保护液包括纯净水、酸、环糊精、蔗糖、PC300及吐温20，其中，所述酸的摩尔浓度在0.02～0.1摩尔/升之间，所述环糊精的质量体积百分比在1.0%～20%之间，所述蔗糖的质量体积百分比在5～20%之间，所述PC300的体积百分比在0.05～0.2%之间，所述吐温20的体积百分比在0.05～0.5%之间。

9.根据权利要求8所述的AMH生物探针保护液，其特征在于：所述AMH生物探针保护液的PH值为4，所述酸为柠檬酸，其摩尔浓度为0.05摩尔/升，所述AMH生物探针保护液中，所述环糊精为γ环糊精，其质量体积百分比为15%，所述蔗糖的质量体积百分比为15%，所述PC300的体积百分比为0.05%，所述吐温20的体积百分比为0.05%。

10.试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-7任一所述的AMH生物探针。