CN117143241A - 与人整合素蛋白itgav/itgb8特异性结合的单克隆抗体 - Google Patents

与人整合素蛋白itgav/itgb8特异性结合的单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及与人整合素蛋白ITGAV/ITGB8特异性结合的单克隆抗体。本发明通过杂交瘤细胞技术筛选获得了与人整合素蛋白ITGAV/ITGB8特异性结合的单克隆抗体，其具有高亲和力、高特异性的特点，能够抑制TGFβ信号的转导，阻断TGFβ与αvβ8的结合，从发挥抗肿瘤的作用。实验表明：当配体Biotinylated‑Latent‑TGFβ工作浓度为0.25 ug/mL时，本发明所述的抗体具有一定的阻断活性。

Description

与人整合素蛋白ITGAV/ITGB8特异性结合的单克隆抗体
技术领域
本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及与人整合素蛋白ITGAV/ITGB8特异性结合的单克隆抗体。
背景技术
整合素是位于细胞表面的一类糖蛋白，是细胞表面重要的黏附分子和信号传导功能受体结合，可实现神经细胞与周围基质及细胞件的相互作用和信息传递。整合素由α和β两种亚基组成，共分为3个亚家族：β1、β2和αv族整合素。αv族整合素亚家族成员有5个，其中αvβ8主要在脑、肺、肾及胎盘中表达。
αvβ8全称 Integrin alpha-V beta-8 (ITGAV:ITGB8)。近年来研究表明，αvβ8是位于细胞表面的主要TGF-β受体，通过对表达β8细胞与检测TGF-β活性细胞共培养系统的研究发现，β8可激活TGF-β，金属蛋白酶抑制剂可阻断β8激活TGF-β的作用。这提示，β8可能通过金属蛋白酶介导的蛋白水解作用激活TGF-β。TGF-β是一种分子量为25kD的同源二聚体蛋白，最早在肿瘤细胞培养基中分离发现。TGF-β在肿瘤发生过程中有双重作用。在肿瘤形成早期,TGF-β 主要通过触发癌细胞的细胞停滞和凋亡程序,从而抑制肿瘤的生长;在肿瘤发展过程中,TGF-β 对肿瘤细胞的抑制增殖作用会降低甚至消失,并分泌出大量的 TGF-β,而此时的 TGF-β 就能成为肿瘤细胞生长的促进因子。因此，αvβ8通过激活TGFβ信号通路，在肿瘤免疫中起到负调控的作用。
此前，Stephen L. Nishimura团队发文证明αvβ8肿瘤细胞中高表达，在TME中，肿瘤上的αvβ8与免疫细胞上的L-TGFB互作，促使CD4+T细胞向iTreg细胞分化，通过Treg的调控从而实现免疫逃逸。现有文献证明αvβ8在多种肿瘤细胞中有表达，例如：αvβ8在人肺腺癌细胞COLO699，人卵巢癌细胞OVCAR3中高表达。通过阻断αvβ8与TGF-β的结合，便能够起到治疗肿瘤的作用。目前针对αvβ8在研的抗体药物主要为阻断活性抗体，但目前αvβ8抗体特异性不足，无法实现很好的阻断效果。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供与人整合素蛋白ITGAV/ITGB8特异性结合的单克隆抗体，以期能够阻断 αvβ8 与L-TGFβ的结合。
本发明提供的抗体：
其重链的3个CDR区中至少一个具有如SEQ ID NO:1~3所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80%（优选85%、90%、95%、98%或者99%）序列同一性的序列。
一些实施例中，其重链的CDR1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； CDR2具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列； CDR3具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
一些具体实施例中，其重链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示； CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示； CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。即，其重链的三个CDR区分别为：SYWMH、NINPSNGGTNYNEKFKS、NFDY。
其轻链的3个CDR区中至少一个具有如SEQ ID NO:4~6所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80%（优选85%、90%、95%、98%或者99%）序列同一性的序列。
一些实施例中，其轻链的CDR1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列； CDR2具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列； CDR3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
一些具体实施例中，其轻链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示； CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示； CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。即，其轻链的三个CDR区分别为：RASQSVSTSTYSYIH、YASNLES、QHTWEIPFT。
更具体的，本发明所述的抗体中：其重链可变区具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
一些实施例中，本发明所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
作为优选，本发明所述的抗体为嵌合抗体，其重链恒定区为人IgG、人IgA、人IgD、人IgM或人IgE，其轻链的恒定区为κ型或λ型。一些实施例中，本发明所述抗体的重链的恒定区为人IgG1，轻链的恒定区为κ型。
本发明所述的抗体为与人整合素蛋白ITGAV/ITGB8特异性结合的单克隆抗体，其具有高亲和力、高特异性的特点，能够抑制TGFβ信号的转导，阻断TGFβ与αvβ8的结合，从发挥抗肿瘤的作用。
进一步的，本发明还提供了与所述抗体相关的生物材料，包括：
编码抗体的核酸、含有所述核酸的表达单元，含有所述核酸的表达载体，含有所述表达载体的宿主和/或基因组中整合有如前所述核酸的宿主。
本发明中，所述核酸为编码抗体轻链可变区的核酸，或者编码抗体重链可变区的核酸。其为DNA或RNA，可为单链也可为双链。核酸可以是例如载体（如表达或克隆载体）的一部分，或一个片段或多个片段的组合。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。所述RNA形式为由基因转录获得的mRNA等。
本发明中，所述表达单元，包括所述编码抗体的核酸和启动子、终止子。其中还可以包括具有调控功能的元件。
本发明中所述的表达载体适用于抗体在宿主中的表达，或者如前所述核酸的存储或扩增。一些实施例中所述表达载体包括骨架载体和如前所述的核酸，或者包括骨架载体和如前所述的表达单元。所述骨架载体为pcDNA3.1、AbVec2.0-hIgG1、pComb3XTT、pComb3、pFUSE-hIgG4-Fc2、pComb3Xlambda、pEE12.4、pEE6.4、pCHO1.0、pComb3XSS、pFUSE-hIgG1e1-Fc2、pcDNA3.1-hIgG1-Fc2、pFUSE-hIgG1-Fc2、pFUSE-mIgG1-Fc2、pTT5_hIgG1.G1m3或pTT5_hKappa.Km3中的任一种或多种。
本发明所述的宿主用于抗体的制备和表达，也可用于所述核酸的保存或扩增。一些实施例中，所述宿主为真核生物或原核生物的细胞，例如，所述宿主为动物细胞、真菌细胞或细菌细胞。例如，所述动物细胞为昆虫细胞或哺乳动物细胞，所述真菌细胞为酵母菌细胞，所述细菌细胞为大肠杆菌。本发明中，以HEK-293细胞为例进行抗体的制备。
更进一步的，本发明还提供了如前所述抗体的制备方法，包括：培养如前所述的细胞、诱导抗体的表达。本发明所述的制备方法，还包括对诱导产物进行分离和纯化的步骤。
更进一步的，本发明还提供了如前所述的抗体、和/或如前所述的生物材料在制备治疗TGFβ信号通路相关疾病的药物中的应用。
或者，本发明还提供了如前所述的抗体、和/或如前所述的生物材料在制备治疗癌症的药物中的应用。
本发明中，所述癌症为TGFβ信号通路相关的癌症，例如，所述癌症为肺腺癌、卵巢癌、膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌。
更进一步的，本发明还提供了治疗癌症的药物，其包括如前所述的抗体、和/或如前所述的生物材料。
更进一步的，本发明还提供了一种药物组合物，其包括如前所述抗体和至少一种肿瘤的治疗剂。
所述肿瘤的治疗剂以注射剂为主，不仅限于注射剂，可以与免疫检查点类抗肿瘤药物联用如PD1,PDL1,CTLA4等；顺铂类，紫杉醇，皮质醇类等化药联用；亦可用放疗后治疗等。
本发明所述的药物中，还包括药学上可接受的辅料。
本发明所述的药物为口服制剂或注射剂。所述注射剂为注射用粉针剂或注射液剂。
更进一步的，本发明还提供了治疗TGFβ信号通路相关疾病的方法，其包括给予本发明所述的药物。本发明所述方法中，给予的方式包括注射或口服。
本发明通过杂交瘤细胞技术筛选获得了与人整合素蛋白ITGAV/ITGB8特异性结合的单克隆抗体，其具有高亲和力、高特异性的特点，能够抑制TGFβ信号的转导，阻断TGFβ与αvβ8的结合，发挥抗肿瘤的作用。实验表明：当配体Biotinylated-Latent-TGFβ工作浓度为0.25 ug/mL时，本发明所述的抗体具有一定的阻断活性。
附图说明
图1示10只小鼠免疫血清分别与人αvβ8蛋白和人αvβ6蛋白的ELISA结合；
图2示嵌合抗体与293-human-αvβ8过表达细胞的结合结果；
图3示嵌合抗体与293-mouse-αvβ8过表达细胞的结合结果；
图4示嵌合抗体与293-cyno-αvβ8过表达细胞的结合结果；
图5示嵌合抗体与293-human-αvβ6过表达细胞的结合结果；
图6示配体Biotinylated-Latent-TGFβ与受体293-human-αvβ8结合活性结果；
图7示嵌合抗体FACS水平的阻断结果。
具体实施方式
本发明提供了与人整合素蛋白ITGAV/ITGB8特异性结合的单克隆抗体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology（Ausubel）。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。
抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α，γ（IgG1，IgG2，IgG3，IgG4），δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”（大约25kDa或大约214个氨基酸）包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ（大约330个氨基酸）。
“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。
术语“嵌合抗体”系指以下抗体，其中的可变区序列来自一物种而恒定区序列来自另一物种，例如可变区序列来自小鼠抗体而恒定区序列来自人抗体的抗体。通过使用基因重组技术可以制备根据本发明的嵌合抗体或其片段。例如，所述嵌合抗体可以通过克隆重组DNA来生产，所述重组DNA包含启动子和编码根据本发明的非人尤其是鼠单克隆抗体可变区的序列、以及编码人抗体恒定区的序列。由这种重组基因编码的本发明嵌合抗体将是，例如，鼠-人嵌合体，该抗体的特异性由来源于鼠DNA的可变区确定，并且其同种型由来源于人DNA的恒定区来确定。对于制备嵌合抗体的方法，例如，可以参考文件Verhoeyn et al.（BioEssays, 8:74, 1988）。
术语“单克隆抗体”系指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。本发明中，所述的“抗人αvβ8单克隆抗体”是指嵌合的αvβ8抗体，包含鼠源的可变区和人源的恒定区。
本发明中，所述与具有至少80%序列同源性的序列为在原序列的基础上，经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个。
术语 “质粒载体”、“质粒”或“表达载体”是指能够扩增与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及整合入已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“质粒载体”或“表达载体”。
术语“细胞”或“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。所述细胞的构建可以通过本领域已知的方法，例如电穿孔、化学转染（例如DEAE-葡聚糖）、转化、转染以及感染和/或转导（例如用重组病毒）将载体引入到宿主细胞中。
所述药物中含有至少一种功能成分，还包括可药用的载体。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS（磷酸盐缓冲液）、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3%甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。
术语“治疗剂”表示能够起到治疗作用（例如治疗、预防、缓解或抑制任何疾病和/或病症）的任何物质或实体（entity），其包括但不限于：化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、热治疗剂（thermally therapeutic agent）等。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，HEK293购自ATCC,我们通过慢病毒包装技术，构建过表达细胞株：293-human-αvβ8、293-mouse-αvβ8、293-Cyno-αvβ8和293-human-αvβ6：
CHO-K1细胞购自ATCC，通过慢病毒包装技术构建过表达细胞株：CHO-human-αvβ8和CHO-mouse-αvβ8。
人αvβ8（human-αvβ8）是二聚体，有两个序列登记号1）UniProtKB - P06756(ITAV_HUMAN)；2）UniProtKB - P26012 (ITB8_HUMAN)，
猴αvβ8（Cyno-αvβ8）是二聚体，有两个序列登记号1）UniProtKB - A0A2K5WCD3(A0A2K5WCD3_MACFA)；2）UniProtKB - G7P0S0 (G7P0S0_MACFA)，
鼠αvβ8（mouse-αvβ8）是二聚体，有两个序列登记号1）UniProtKB - P43406(ITAV_MOUSE)；2）UniProtKB - Q0VBD0 (ITB8_MOUSE)，
人αvβ6（human-αvβ6）是二聚体，有两个序列登记号1）UniProtKB - P06756(ITAV_HUMAN)；2）UniProtKB - P18564 (ITB6_HUMAN)。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一、动物免疫
用胞外段的重组人异源二聚体αvβ8蛋白（ITGAV:Phe31-Val992&ITGB8: Glu43-Arg684）免疫，共免疫3次，小鼠选择6-8周龄雌性Balb/c小鼠5只（11381~11385），SJL小鼠5只（11386~11390），体重18-20g ，免疫前两天腹腔注射100ug CD25抗体，两天后每只老鼠用50ug 重组αvβ8蛋白（Human ITGAV/ITGB8，Acro，Cat# IT8-H52W4）与弗氏完全佐剂（CFA）混合物通过腹腔注射进行初次免疫； 14天后进行第2针免疫，第2次免疫前7天腹腔注射100ugCD40抗体， 2次免疫方法用25ug 重组αvβ8蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）混合物进行免疫；第3次免疫间隔21天，用25ug 重组αvβ8蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）混合物进行免疫；从第二次免疫开始，免疫后1周进行眼眶取血，获得的血清进行抗原特异性滴度检测。
（一）血清滴度抗原结合检测
用重组人αvβ8蛋白和人αvβ6蛋白(Human ITGAV/ITGB6，Acro，IT6-H52E1)进行血清ELISA结合试验。具体地，将1ug/ml 人αvβ8蛋白和1ug/ml 人αvβ6蛋白分别包被在96孔板中，100ul/孔，4℃孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用2%BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育2小时；孵育后用1xPBST洗三次，加入梯度稀释的血清并在37度孵育1小时；孵育后1xPBST洗三次后，加入1:5000稀释的山羊抗鼠IgG Fcγ片段特异性HRP抗体（Jackson ImmunoResearch，115-005-008），37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1N HCl终止反应，用Spectra M5e仪器检测OD450nm读值。
如图1所示：10只小鼠免疫血清分别与人αvβ8蛋白和人αvβ6蛋白的ELISA结合；结果显示，经过3次人αvβ8蛋白免疫后，小鼠血清对两种抗原均有特异性结合，结合αvβ8蛋白能力均强于αvβ6，通过OD450对应吸光度Ratio(αvβ8/αvβ6)判断Balb/c小鼠中编号为#11383、#11384的血清对αvβ8抗原的应答特异性较强，SJL小鼠中编号为#11388、#11390的血清对αvβ8抗原的应答特异性较强。
二、杂交瘤抗体的产生
（一）杂交瘤上清的初步筛选
1）杂交瘤上清的初步结合筛选
根据以上血清滴度的检测结果，共做两次融合筛选，R1选择编号为#11383、#11384的两只Balb/c小鼠进行加强免疫后取脾脏和淋巴结，研磨后将获得的细胞与鼠骨髓瘤细胞(SP20)进行电融合，经HAT培养基培养10天后进行杂交瘤上清的筛选。首先用ELISA方法进行人αvβ8蛋白(正筛)和人αvβ6蛋白（负筛）的结合筛选，试验方法：人αvβ8与αvβ6蛋白进行384孔板包被，1ug/ml，40ul/孔，4℃过夜孵育，洗涤并封闭后加入杂交瘤上清30ul孵育2h后进行结合检测。最终筛选到817个特异性结合人αvβ8，不结合人αvβ6的多克隆，其中有67个克隆与人猴鼠αvβ8蛋白均有交叉结合反应。
R2选择编号为#11388、#11390的两只SJL小鼠进行加强免疫后取脾脏和淋巴结，研磨后将获得的细胞与鼠骨髓瘤细胞(SP20)进行电融合，经HAT培养基培养10天后进行杂交瘤上清的筛选。首先用ELISA方法进行人αvβ8蛋白(正筛)和人αvβ6蛋白（负筛）的结合筛选，试验方法：同上。最终筛选到995个特异性结合人αvβ8，不结合人αvβ6的多克隆，其中有41个克隆与人猴鼠αvβ8蛋白均有较强的结合。
2）杂交瘤上清的初步阻断筛选
将ELISA结合试验选出来的108个克隆进行阻断试验的评估。具体方法，将重组人αvβ8蛋白包被在96孔板中，1ug/ml，100ul/孔，4℃孵育过夜。洗涤封闭后，每孔加入50ul杂交瘤上清和50ul 终浓度为0.025ug/ml 的重组人生物素化的Latent TGFβ1蛋白混合物并在37度孵育2小时。洗涤后加入1:5000稀释的山羊抗鼠IgG Fcγ片段特异性HRP抗体，孵育后洗涤，每孔加入100ul TMB底物显色，并用等体积的1N HCl终止反应，读取OD450nm吸光值。抑制率(%)=(OD450Max-OD450Sample)/ (OD450Max-OD450Mini)*100。最终筛选到71个抑制率大于40%的克隆。
（二）杂交瘤上清的亚克隆筛选
根据杂交瘤上清的初步ELISA结合和阻断试验筛选，选择71个多克隆进行亚克隆，再通过单克隆FACS结合及ELISA阻断活性验证，确定21个候选分子进行序列调取，最终选定克隆9A8制备嵌合抗体。
表1抗体9A8的可变区序列
三、人鼠嵌合抗体的生产和鉴定
（一）候选克隆基因的提取
1）杂交瘤细胞中总RNA的提取和cDNA合成
将单克隆杂交瘤细胞培养至对数生长期后，收集细胞(约5E6个细胞/克隆)，利用NucleoSpin® RNA Plus (MN，Cat# 740984.250)提取杂交瘤细胞中的总RNA。使用1ug提取的RNA，通过HiScript® III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme，Cat#R323-01)进行cDNA的合成。
2）抗体VH和VL序列的基因扩增和T载体克隆
以合成的cDNA为模板，利用兼并引物Primer A +S mix (含重轻链通用引物primer A和鼠hIgG1，2a，2b，3恒定区引物及鼠kappa特异性引物)和Ex Taq酶(TaKaRa，Cat# RR902A)对cDNA进行特异性扩增，PCR反应体系及循环如下。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up(MN， Cat# 740609.250)回收目的片段。
然后利用Solution I (TaKaRa，Cat# 6022Q)将回收片段克隆到pMD19-T(TaKaRa，Cat# 3271)载体上，将克隆好的质粒通过热刺激的方法转化进感受态细胞DH5α(Yestern，Cat# FYE607-80VL)并将其均匀涂布在含氨苄的2YT固体平板上，将平板送至测序公司Genewiz进行测序，测序引物为通用引物PMAL-C2X-R。
（二）候选克隆人鼠嵌合表达载体的构建、表达和纯化
1）表达载体的构建
分析抗体VH和VL测序序列，选择抗体测序正确的TA克隆质粒，使用抗体VH/VL通用引物mix（含表达载体信号肽），在高保真酶PrimeSTAR (TaKaRa，Cat# R045)和引物作用下扩增目的片段（PCR程序如下），电泳后利用胶回收试剂盒（MN，Cat# 740609.250）回收目的片段。
反应体系如下：
回收片段在重组酶（Vazyme，Cat# C112-02）作用下插入到相应线性化载体（pTT5_hIgG1.G1m3/ pTT5_hKappa.Km3）；将重组后的载体转化进感受态细胞DH5α中（Yestern，Cat# FYE607-80VL）并将其均匀涂布在含氨苄的2YT固体平板上，将平板送至测序公司Genewiz进行测序，测序引物为pTT5-F。
2）嵌合抗体的表达和纯化
分析测序序列，扩增以上测序正确的质粒并将重轻链质粒以2:3的比例用PEI试剂（Polysciences， Cat#24885） (1ug质粒：4ug PEI) 转染至密度为2E6/ml的HEK293细胞中，将转染的细胞放置37度，5%CO2轨道培养箱中培养5-7天。 将培养液5000rpm离心20min，取上清并用0.22um滤器过滤，用rProtein A琼脂糖填料的纯化柱（GE Healthcare Bio-sciences，17127903）进行纯化。首先用1xPBS（pH7.4）平衡纯化柱，将过滤的培养上清上样到纯化柱，再用1xPBS（pH7.4）洗涤纯化柱后，用洗脱溶液（100mM Gly-HCl pH2.2）将样品洗脱下来，并用1M Tris-HCl，pH 9.0溶液中和洗脱样品。将中和后的样品用1xPBS（pH7.4）置换，用0.22um滤器过滤除菌，并用Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc)测定纯化抗体的浓度，备用。
（三）人鼠嵌合抗体的特异性结合鉴定
293-humanαvβ8/293-cynoαvβ8/293-mouseαvβ8/293-humanαvβ6 过表达细胞株构建
质粒验证
HEK293T细胞（DMEM+10%FBS）以1E6/孔细胞铺6孔板；
过夜，观察细胞汇合度约为80%进行转染（2E6=100%）。转染前对HEK293T进行换液（注意动作轻柔）。转染时准备A溶液（125ul Opti-MEM+2.5ug plasmid+5ul P3000）和B溶液（125ul Opti-MEM+3.75ul Lipo3000），将A溶液加入B溶液室温孵育15min。
将孵育好的溶液加入换液后的HEK293T细胞中，细胞随后放入37℃，5% CO2 细胞培养箱中，培养48-72h后进行表达检测。
病毒包装
病毒包装细胞-HEK293 T细胞（DMEM+10%FBS）铺入10cm dish，7E6/dish；
过夜，观察细胞汇合度约为80%进行转染（1.6E7=100%）。转染时准备A溶液（8ugDNA+6ug 辅助质粒1+2ug 辅助质粒2+500ul Opti-MEM）和B溶液（32ul Polo3000+500ulOpti-MEM），将A溶液加入B溶液室温孵育15min。
将孵育好的溶液加入HEK293 T细胞中，细胞随后放入37℃，5% CO2 细胞培养箱中培养6-16h后换液，加入含有5%FBS的DMEM继续培养至转染48h后收毒；
病毒感染前一天（即转染24h后）感染细胞铺6孔板：HEK293 T细胞2E5/孔，3T3细胞2E5/孔，过夜后细胞汇合度为50-60%；
48h后收毒：收集10cm dish上清，用Lenti-X GoStix Plus kit检测上清是否有病毒产生并将其收集起来。剩余细胞加入含有5%FBS的DMEM继续培养24h等待72h收毒；
72h收毒：操作方法同2.6，收毒后的产毒细胞经处理后扔掉。
细胞感染
48h感染：将48h收毒样品用0.45um滤膜过滤，后用100KD MWCO的超滤离心管浓缩，3500rpm，离心40min（浓缩后的体积约为200uL为佳）。浓缩后的病毒用含有5%FBS，8ug/ml polybrene的DMEM培养基重悬后加入被感染细胞孔中（1mL/孔），4h后补加1mL含有5%FBS的DMEM培养基。
72h感染：重复48h感染步骤；
继续感染24h后细胞换液（DMEM+10%FBS），48h后用Puro/Hygro进行加压（抗生素种类和用量根据过表达细胞而定）。
待过表达细胞状态稳定后（死亡状态趋于稳定）进行压板（约4块）。
约2周后挑选单克隆过表达细胞，检测细胞表达情况。
2）抗人αvβ8嵌合抗体与人αvβ8特异性结合以及与鼠，猴αvβ8交叉结合活性的评估
用过表达293-Human-αvβ8，293-Cyno-αvβ8，293-Mouse-αvβ8，293-Human-αvβ6进行抗体的FACS结合实验，其中293-Humanαvβ6作为Blank细胞。具体地，取对数生长的293过表达细胞株，离心并丢弃培养上清，将离心下来的细胞用1xDPBS洗三次，以2E5/孔铺96孔板，嵌合抗体用DPBS稀释，工作浓度30ug/mL,3倍稀释，共7个梯度，嵌合抗体与细胞4℃孵育2h后，1500rpm/min 离心5min，弃上清，PBS洗1遍，加入1:1000稀释的二抗（AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific，#jackson Cat No:109-006-098），4℃孵育30 min后离心弃上清，PBS清洗2次后，每孔加入30ul PBS充分混匀后，IQue Screener PLUS上机检测样品。
结果分析，图2-4结果： 9A8嵌合抗体与293-human-αvβ8 过表达细胞结合能力较强，并且有猴鼠交叉结合活性；图5结果：3个抗体均特异性结合human-αvβ8，不与human-αvβ6结合(图中2F9和7H1示另外两株抗体的活性，作为对照)。
（四）人鼠嵌合抗体的阻断鉴定
1）人Biotinylated-Latent-TGFβ（AcroBiosystems,Cat# LAP-H82Q6）蛋白与293-human-αvβ8过表达细胞株的FACS结合活性实验
具体地，取对数生长的293-human-αvβ8过表达细胞和293-T细胞，离心并丢弃培养上清，将离心下来的细胞用1xDPBS洗三次，以2E5/孔铺96孔板，Biotinylated-Latent-TGFβ用DPBS稀释，工作浓度5ug/mL,2倍稀释，共11个梯度，与细胞4℃孵育2h后，1500rpm/min 离心5min，弃上清，PBS洗1遍，加入1:1000稀释的二抗Allophycocyanin (APC) Streptavidin（Jackson，Cat#016-130-084），4℃孵育30 min后离心弃上清，PBS清洗2次后，每孔加入30ulPBS充分混匀后，IQue Screener PLUS上机检测样品（图6）。
结果分析：人Biotinylated-Latent-TGFβ蛋白与293-human-αvβ8过表达细胞株结合EC50值为0.1838ug/mL，根据本实验结果，选择配体Biotinylated-Latent-TGFβ阻断工作浓度为0.25 ug/mL。
2）嵌合抗体阻断活性分析
用FACS方法评估嵌合抗体对293-human-αvβ8过表达细胞株和人Biotinylated-human-L-TGFβ1（AcroBiosystems,Cat# LAP-H82Q6）蛋白结合的阻断作用。具体地，将293-human-αvβ8细胞以每孔2E5/孔铺96孔板，嵌合抗体用DPBS稀释，工作浓度30ug/mL,3倍稀释，共11个梯度，嵌合抗体与细胞4℃孵育30min后，每孔加入等体积的0.5ug/mLBiotinylated-L-TGFβ蛋白即工作浓度为0.25ug/mL，设置一个PBS孔作为背景扣减，混匀后4℃孵育90min。11500rpm/min 离心5min，弃上清，PBS洗1遍，加入1:1000稀释的二抗Allophycocyanin (APC) Streptavidin（Jackson，Cat#016-130-084），4℃孵育30 min后离心弃上清，PBS清洗2次后，每孔加入30ul PBS充分混匀后，IQue Screener PLUS上机检测样品。结果表明，当配体Biotinylated-Latent-TGFβ工作浓度为0.25 ug/mL时，2F9、9A8具有一定的阻断活性（图7）。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.抗体，
其重链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示； CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示； CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
其轻链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示； CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示； CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，
其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，其为嵌合抗体，其重链的恒定区为人IgG1，轻链的恒定区为κ型。
4.生物材料，其包括如下I）~IV）中的任意一项：
I）、编码权利要求1~3任一项所述的抗体的核酸;
II）、含有I）所述的核酸的表达载体;
III）、含有II）所述表达载体的宿主；
IV）、基因组中整合有I）所述的核酸的宿主。
5.权利要求1~3任一项所述抗体的制备方法，包括：培养权利要求4所述的宿主、诱导所述抗体的表达。
6.权利要求1~3任一项所述的抗体和/或权利要求4所述的生物材料在制备治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为TGFβ信号通路相关的癌症。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述癌症为肺腺癌、卵巢癌、膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌。
8.治疗癌症的药物，其包括权利要求1~3任一项所述的抗体和/或权利要求4所述的生物材料。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，还包括肿瘤的治疗剂为免疫检查点类抗肿瘤药物、顺铂类药物，紫杉醇类药物或其衍生物，或为皮质醇类治疗剂。
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